PRINCIPLES OF GENE

MANIPULATION AND GENOMICS

NUCLEIC ACIDS : 1-7 (8). BÖLÜMLER

RECOMBINANT DNA : 7(8)-26. BÖLÜMLER

1
 2. BÖLÜM
TEMEL TEKNİKLER

2
Giriş

İn vitro Gen manipulasyonu için ilk uygulamalar aşağıdaki tekniklerin gelişmesiyle birlikte 1970’li
yılların başlarında ortaya çıkmıştır.
• Escherichia coli’nin genetik transformasyonu
• DNA moleküllerinin kesilmesi ve yapıştırılması
• Kesme ve yapıştırma işlemlerinin görüntülenmesi

Bu gelişmelerin önemini daha iyi anlayabilmek için, öncelikle başarılı bir gen manipülasyon
prosedürünün can alıcı noktaları üzerinde yoğunlaşmalıyız.

İn Vitro Gen Manipulasyonu Rutin Olarak Yapılmadan Önce Üç Teknik Sorun

Çözülmek Zorundaydı.
Modern gen manipülasyon yöntemleri ortaya çıkmadan önce , bir DNA parçasını prokaryotik ve
ökaryotik hücrelere aktarmak için bir çok çalışma yapılmıştı. Fakat genel anlamda, çok az ilerleme
kaydedildi. Bunun nedenlerini sıralayacak olursak:
Farz edelim ki aktardığımız DNA alıcı hücreler tarafından alınıyor. Burada iki temel zorluktan
bahsetmek mümkündür. İlki, transformasyonun belirlenmesinin gen ekspresyonuna bağlı olmasıdır,
başarısızlık doğru transkripsiyon ve translasyon olmamasından olabilir. İkincisi ve daha önemlisi
aktarılan DNA’nın transforme olmuş hücrelerde korunamamasıdır. Eğer konağa aktarılan DNA konak
genomuna entegre olursa, bir sorun çıkmaz (Bu entegrasyonun meydana gelmesiyle oluşan
mekanizma tam olarak aydınlığa kavuşmamıştır ve genellikle yaygın görülen bir durum değildir).
Fakat bu durum, aktarılan DNA’nın konak hücrenin genetik materyaline birleşmesiyle ortaya çıkar
ve konak genomunun bir parçası gibi çoğalır. Bununla beraber aktarılan DNA’nın entegrasyonunda
hata oluşursa, muhtemelen aktardığımız DNA konak hücrenin bir sonraki jenerasyonunda
kaybedilecektir. Bunun nedeni basittir. DNA molekülleri replike olabilmek için bir replikasyon orijini
içermelilerdir ve bu replikasyon orjini bakteri ve virüslerde her genom için sadece bir tanedir. Bu tip
moleküllere repliconlar adı verilir. DNA fragmentleri replikon değillerdir ve replikasyon olmadığında
konak hücrede kaybolacak ve tekrar ifade edilmeyeceklerdir. Şuna da dikkat etmemiz gerekir ki, eğer
DNA molekülü bir replikasyon orjini içeriyorsa, bu yabancı bir konak hücresinde fonksiyon
göstermeyebilir.
Bunlara ek olarak son bir problem daha vardır. Eğer rekombinant DNA alanında yapılan ilk
çalışmalardan bazıları devam ettirilseydi, hücre içine alınan DNA’nın zamanla hücrede – detaylı bir
şekilde-nasıl bir etkileşim meydana getireceğini anlamak için bir yöntem gerekli olurdu. Özellikle,
aktarılan DNA’nın konak DNA’sına entegre olarak korunduğu durumlarda, bu aktarılan DNA dizisini

3
(konak genomuna ait diziler) çevreleyen konak hücrenin DNA dizisini haritalamak için bir metod
gerekli olurdu.

Birçok Temel Teknik Çoğu Gen Klonlama Deneylerinde Yaygın Olarak Kullanılmaktır.
Eğer DNA fragmentleri replike olmamışsa, yapılacak en iyi şey onları uygun bir replikona
bağlamaktır. Böylesi replikonlar vektörler ya da klonlama araçları olarak bilinirler. Küçük plazmitler
ve bakteriyofajlar kendi replikasyon orjinlerine sahip oldukları için uygun vektörlerdir. Böylece
konak hücre genomuna entegre olmaya gerek duymazlar ve DNA’ları hiç kayıp olmaksızın kolayca
izole edilebilir. Farklı plazmitler ve fajlar; vektörler olarak kullanılırlar, Bölüm 4 ve 5’te detaylı
olarak üzerinde durulacaktır. Bu noktada şunu söylemek yeterlidir, vektör olarak uygun olan ve ilk
kullanılan plazmitler ve fajlar ilk olarak sadece E. coli’de bulunmuştur. Ayrıca konak hücreye
aktarılacak DNA’yı taşıması için bir vektörü kullanmakda çok önemli bir özelliktir: Yabancı DNA yı
taşıyan vektörleri transformasyon yapılmış konak hücresinden saflaştırmak için kullanışlı basit
metodlar vardır. Bu sayede vektör sadece replikon fonksiyonu sağlamaz, aynı zamanda konak hücre
DNA’sından aktardığımız DNA’nında kolaylıkla çok miktarda saflaştırılmasına izin verir.
Vektöre sokulan yabancı DNA’daki karmaşık moleküller bazen Mitoloji deki KİMERA yla
benzerliğinden dolayı DNA kimera’ları olarak isimlendirilir (KİMERA yılan kuyruğuna, aslan başına
ve insan vücuduna sahip olan yaratık). Böylesi bileşiklerin yapımı yani yapay rekombinant
moleküllerin yapımı, genetik mühendisliği veya gen manipülasyonu olarak isimlendirilir, çünkü
biyokimyasal araçlarla yeni genetik kombinasyonlar yaratmak için büyük bir potansiyele sahiptir. Bu
yöntem moleküler klonlama veya gen klonlanması olarak da isimlendirilmektedir, çünkü karışık
moleküllerden oluşan genetik olarak benzer organizmalar kolaylıkla büyütülebilir ve büyük
miktarlarda üretilebilirler, ayrıca karmaşık moleküllerin çoğaltılması ve herhangi bir gen ürününün
direk sentezi de yapılabilir.
Teorik olarak vektöre istediğimiz DNA’yı klonlamak çok basit gibi görünse de, bir vektör için
öncelikle aşağıdaki şartlar rahatlıkla sağlanmalıdır.
• Vektör DNA’sı saflaştırılabilmeli ve iç kısımlarından kolaylıkla kesilebilmeli
• İnsert DNA, yapay rekombinantlar oluşturması için vektör içine sokulabilmeli.
• DNA Ligasyon metodları başarıyla yapılabilmeli. (DNA moleküllerinin kesilmesi ve
birleştirilmesi için kullanılan metodlar çok karmaşıktır, bunlar ayrıntılı olarak Bölüm 3’te
anlatılacaktır).
• Kesme ve birleştirme reaksiyonları kolaylıkla görüntülenmelidir, bu da agaroz jel
elektroforeziyle gerçekleştirilir.
• Son olarak, yapay rekombinant DNA E .coli’ye veya diğer konak hücresine (transformasyon
ile) tanıtılmalı.

4
Jel elektroforez ve E. coli’nin transformasyonu için detaylı bilgi gelecek bölümde ele alınacaktır. İyi
bilindiği gibi, ilk olarak 1972 yılında yapılan gen klonlama deneyinde, gen klonlama deneylerinin hızlı
bir şekilde ilerlemesini sağlayan ve aynı zamanda kullanışlı olan zorunlu teknikler ortaya çıkmıştır.

Jel Elektroforezi Farklı Nükleik Asit Moleküllerini Boyutlarına Bağlı Olarak Ayırmak
İçin Kullanılır.
DNA moleküllerini kesme ve birleştirme işlemlerindeki ilk uygulamalar Sükroz Gradiyentinde
çökelme hızı kullanılarak görüntülendi. Fakat bu işlemlerin yerini Jel-Elektroforez tamamıyle aldı. Jel
Elektroforezi sadece analitik bir metod değil aynı zamanda rutin olarak spesifik DNA fragmentlerinin
saflaştırılmasındaki hazırlık aşamalarında da kullanılmaktadır. Kullanılan bu jel agarozdan ya da
poliakrilamidden oluşur. Agaroz jel-elektroforezi birkaç yüz bazdan 20 kilobaza kadar olan
boyutlardaki DNA fragmentlerini ayırmak için uygundur (Şekil 2.1). Poliakrilamid jel ise daha küçük
DNA fragmentlerini ayırmak için tercih edilir.
DNA moleküllerinin jel-elektroforezi esnasında moleküler boyutlarına göre ayrılmasından sorumlu
mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır (Holmes and Stellwagwn 1990). DNA moleküllerinin
moleküler ağırlığa bağlı olarak yapılan ayırma yöntemlerinde; DNA’nın kullandığımız jelde oluşan
porlara olan göçünün önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir, çünkü serbest çözeltideki DNA’nın
elektroforetik hareketi moleküler ağırlıktan bağımsızdır. Bir Agaroz jel polimerik bileşiklerden
oluşmuş kompleks bir sistemdir ve bu polimerik bileşiklerin ortalama por boyutları kullanılan
agarozun konsantrasyonuna, tipine ve kullanılan tampona göre değişir. İlk başlarda DNA’nın jel
içerisindeki hareketinin bir yılan hareketine benzediği düşünülmüştü. Fakat jelden geçen boyanmış
moleküllerin gerçek-zamanlı floresans mikroskopisi incelendiğinde daha ince dinamiklerin olduğu
görüldü (Schwartz and Koval 1989). DNA molekülleri uygulanan alanın istikametindeki gerilmeyle
esnek bir hareket sergiliyorlar ve sonra yoğun küreler şeklinde büzülüyorlar. Daha büyük por
boyutuna sahip jelde daha büyük DNA küre şeklinde ilerleyebiliyor ve böylece daha büyük DNA
molekülleri ayrılabiliyor. Küre haline gelmiş DNA molekülleri porlardan geçebilirken, normal DNA
molekülleri sadece yılan hareketi yaparak geçebiliyorlar. Bu mekanizma yaklaşık 20 kilobaz boyuttaki
molekülleri ayırmak için kulanılır, daha büyük molekülleri ayırmak için Pulsed-Field Gel
Electroforesisi (PFGE) kullanılılır.

5
PFGE’de 10 megabaz büyüklükteki moleküller, agaroz jeller kullanılarak ayrılabilirler. Bu DNA’nın
belirli aralıklarla hareket yönünün değiştirilmesiyle sağlanır, bu değişiklikler jele göre elektrik
alanının oryantasyonundaki düzenli değişikliklerle yapılır. Elektrik alanın oryantosyanındaki her
değişiklikte, DNA’nın yeni yöne hareket etmeden önce kendi ekseninde tekrar toplanması gerekir.
Yönelim, yoğunluk ve uygulama süresi gibi elektrik alan parametreleri, farklı alanların her biri için
bağımsız olarak ayarlanır ve seçilir böylece DNA’nın net göçü jelde belirli olur. Her bir elektrik alanı
tarafından uyarılan hareketin yönü arasındaki farklılık Tekrar Yönelim Açısı olarak isimlendirilir ve
bu açıya bağlı olarak, başlatılan her elektrik alanı için DNA hareket yönünü değiştirerek dönmelidir.
PFGE’nin büyük bir dezavantajı, ilk başlarda tanımlandığı gibi, örneklerin düz bir çizgide
koşamamasıdır. Buda sonraki analizi zorlaştırır. Elektrik alan değişimi için iyileştirilmiş metodların
gelişmesiyle bu problemin üstesinden gelinmiştir. Bunlardan en popüleri CHEF (contour-clamped
homogenous electrical-field electroforesis) tir (Chu et al. 1986). İlk CHEF tipli sistemlerde tekrar
yönelim açısı 120° olarak belirlendi. Fakat daha yeni sistemlerde tekrar yönelim açısı değişkenlik
gösterebilir. Mesela tüm maya genomunun haritalanması için yapılan çalışmalarda 106° ‘ lik bir tekrar
yönelim açısı kullanılmış ve böyle bir açıyla hareketin çok daha hızlı olduğu bulunmuştur (Birren et
al. 1988). Yaklaşık 200-300 kilobazlık DNA fragmentleri genomik çalışmalarda rutin olarak
yürütülebilir ve bu fragmentler birkaç saat içerisinde 90° ‘lik veya daha az bir tekrar yönelim açısı
kullanılarak CHEF sistemleri ile ayrılabilirler (Biren and Lai 1994).

6
Aaij ve Borst (1972)’un belirttiğine göre DNA moleküllerin göç oranı molekül ağırlıklarının
logaritmasına ters orantılır. Sonuç olarak, Southern (1979 a.b) hesaplanan fragment uzunluğu veya
DNA’nın iki yönlü hareketine karşı moleküler ağırlığının, yarı-algoritmik bir alandan daha geniş bir
açı üzerindeyken düz bir çizgi verdiğini göstermiştir. Her halukarda, DNA fragmentleri boyutları
bilinen marker’larla yürütülürler. Bu marker’lar bizim bilinmeyen DNA’nımızın boyutunu
belirlememize yardım ederler. Jel elektroforezinin önemli bir avantajı da DNA bantlarının yüksek
duyarlılıkta kolaylıkla belirlenebilmesidir. Alışıldığı üzere, DNA bantları Etidyum bromür’ün
bazların arasına girerek hidrojen bağlarına bağlanmasıyla kolayca boyanır (Şekil 2.3) ve çok az
miktarda 0,05 µg DNA bile ultraviyole ışık altında rahatlıkla görüntülenebilir. Etidyum bromürün
önemli bir dezavantajı çeşitli laboratuar çalışmaları için mutajenik olmasıdır ve sonuç olarak
TM
potansiyel bir kanserojendir. Bu problemi çözmek için SYBR Safe denilen yeni bir boya
geliştirilmiştir.

Jel elektroforez, farklı boyutlardaki DNA fragmentlerini belirlemeye ek olarak bir DNA molekülünün
farklı moleküler konfigürasyonlarını ayırmak için de kullanılabilir. Bunun örnekleri 4. Bölümde
verilmiştir. Jel elektroforez, aynı zamanda jel reterdasyon (geciktirmesi) ve bant shift çalışmalarındaki
7
protein-nükleik asit etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir. Bu da genellikle elektroforetik
harekette azalmaya neden olan DNA fragmentlerine bağlanan bir proteinin incelenmesine dayanır.
Çalışma genellikle çift zincirli lineer DNA fragmentlerine proteinin eklenmesini, çıplak ve kompleks
DNA’nın ayrılmasını ve görüntülenmesini içerir. Elektriksel hareketin fiziksel temeli ve
uygulamalarına Lane et al. (1992) ın review in den ulaşabilirsiniz.

Blotlama, nükleik asitlerin jelden zara transferi için kullanılır.

Blotlama, spesifik nükleik asit sekanslarının izolasyonu ve kuantifikasyonunda uygulanılır.
Ayrıca bulaşıcı hastalıkların teşhisinide içermektedir.
Nükleik asit blotlama ve hibridizasyon prosedürünün genel açıklaması Şekil 2.4 gösterilmiştir.
DNA bir membran üzerine aktarılarak sabitlenir ve daha sonra bunlar hibridizasyon deneylerinde
hedef olarak kullanılırlar.
Temel Blotlama prosedürleri:
• Jellerden nükleik asitlerin membrana aktarılması
• Dot ve Slot blotlama
• Koloni ve plak blotlama

Şekil 2.4 Nükleik asit blotlama ve Şekil 2.5 Tipik kapillar blotlama cihazı
hibridizasyonun genel açıklaması.

Southern Blotlama DNA’nın bileşimlerini analiz edebilmek için agaroz jelden zarlara
transfer etmek için kullanılan bir metottur.
Blotlamanın orijinal metodu verilmiş bir RNA veya DNA sırasına tamamlayıcı olan bir agaroz
jelde fragmentleri tutmak için Southern (1975, 1979b) tarafından geliştirildi. Bu prosedürde agaroz jel
bir depo içindeki transfer tamponuna batırılır ve üzerine filtre kağıt ve ağırlık konur (Şekil 2.5).
Hibridizasyon membranı kağıt havlu yığını ile jel arasındadır. Kağıt havlular transfer tamponunu jel
boyunca tüp hareketiyle çekerler. DNA molekülleri zarda hareketsiz bırakılır ve tampondan jele

8
akarak taşınır. Kullanılan membran malzemesi nitroselülozdur fakat zarın fazla kırılgan olması
sakıncalıdır.
Büyük DNA fragmentleri kısa parçalardan daha fazla bir transfer zamanı gerektirir. Daha
büyük fragmentlerin diğerleriyle aynı zamanda transfer etmek için elektroferezlenmiş DNA’a
alkaliden sonra depürinasyon (0,25 mol/l HCl) yapılır böylece DNA fragmentleri kısalır.
Denatürasyonla bazlar açık hale gelir ve problar bazlara bağlanabilir. Sonunda jel blotlamadan önce
nötralizasyon solüsyonuna konulur. Alternatif bir metot pozitif yüklü naylon zar kullanımıdır.
Transferden sonra, 80ºC’lik fırında membran tutalarak nükleik asit bağlanır. Nitroselülozun
kolay tutuşma doğası yüzünden vakumlu fırınlar kullanılır. Alternatif tespit metodu çapraz birleştirme
ültraviyolesinden yararlanır. Bu metot naylon zarların yüzeyindeki pozitif yüklü amino grupları ve
DNA’daki timin tortularının küçük bir bölümü arasında çapraz bağlanmanın oluşmasına
dayanmaktadır. Optimal tespit periyodunu belirlemek için kalibrasyon deneyi yapılır..
Zar oligodeoksinükleoit tek iplikli DNA ya da etiketli RNA solüsyonuna yerleştirilir. Zardaki
DNA ile etiketlenmiş nükleik asitlerin hibridizasyonu için en uygun şartlar seçilir. Komplement
sekansı bulmak ve yerleştirmek için kullanılan etiketlenmiş nükleik aside prob denir. Hibridizasyon
reaksiyonundan sonra çözülmüş radyoaktivitenin uzaklaştırılması için zar yıkanır.Southern Blotlama
metodu oldukça hassastır. Kompleks genomdaki bir kopya gen sekansı etrafında haritalanmış
restriksiyon alanları için Southern Blotlama uygulanmaktadır (Şekil 2.6).

Northern Blotlama RNA analizi için kullanılan Southern Blotlamanın bir çeşididir.
Southern’in tekniği önemli fakat RNA‘nın nitroselüloza bağlanamadığı bulunduğundan beri
jel elekfrofeziyle ayrılmış RNA‘nın blot-transferi için direkt olarak uygulanamıyor. Alwine et al.
(1979) RNA bantlarının jelden kovalent bağlanabildikleri kimyasal reaktif kağıda transferi yöntemini
bulmuştur. Aminobenziloksimetil kağıdın diazotizasyonuyla reaktif kağıt hazırlanır.
Radyoetiketlenmiş DNA problu hibridizasyonda RNA görünür. Hibridizasyon bantları
otroradyografikte yerleştirilir. RNA bantları uygun şartlar altında nitroselüloz membranların
blotlanabilmektedir.

9
Şekil 2.6 Southern metoduyla toplam genomik DNA’da varsayılan bir gen sekansı etrafında
restriksiyon haritası yerleştirilmesi.

Western Blotlama proteinlerin akrilamid jelden zara transferinde kullanılır.

Western Blotlama poliakrilamid jelden nitroselüloz ya da naylon zara elektroforezlenmiş
proteinlerin transferini gerektirir. Özel protein-ligand etkileşmelerinden bağlı proteinler elde edilir.
Antikorlar, özel antijenleri bulmak için kullanılır. Lektin, glikoproteinleri tanımak için kullanılır. Prob
tag ya da radyoaktiviteyle etiketlenmiş olmalıdır. Prob etiketlenememişse ikinci bir antikor kullanılır.
İkinci moleküller türe özel antikor, Staphylococcus aureus‘un A proteini ya da streptavidin olabilirler
ve flüoresans, enzim ya da radyo aktiviteli yollarla etiketlenebilir. Etiketlenmiş ikinci molekülün farklı
problar için genel bulucu olarak geliştirilebilir.

Blotlama sürecini basitleştirmek ve hızlandırmak için birkaç teknik bulundu.

Kapillar blotlama, orijinal blotlama tekniği olarak kullanılırdı fakat bu günlerde blotlama
SDS-poliakrilamid jelden zara polipeptidlerin elektroferetik transferiyle yapılıyor. Düşük por alanlı
poliakrilamid jelden DNA ya da RNA transfer etmek için elektroforetik transfer kullanılır. Ayrıca
agaroz jelle de kullanılabilir. Hızlı elektroforetik transfer yöntemi yüksek akıma ihtiyaç duyar ve bu da
yüksek bir ısıtmayla sonuçlanır. Bunu önlemek için dış soğutma sistemi gerekir. Vakumlu blotlama
kapiller ve elektroforez metotlarına göre daha avantajlıdır.

E. Coli’ye DNA Aktarımı, Birçok Gen Manipülasyon Deneyi İçin Zaruri Bir Önşarttır
E. coli’ye transformasyonu başarmak için yapılan ilk teşebbüsler başarısız olmuştur ve
genellikle E. coli’nin transformasyona karşı koyduğuna inanılmıştır. Bununla birlikte, Mandel ve Higa

10
(1970) E. coli hücrelerinin CaCl2 ile muamelesinden sonra bakteriyofaj lambda DNA’sını hücre
içerisine aldığını gösterdiler. Birkaç yıl sonra Cohen ve arkadaşları (1972) CaCl2 ile muamele edilmiş
E. coli hücrelerinin de plazmit DNA’sını verimli bir şekilde aldığını gösterdiler. Sadece recBC-
mutantlarına lineer bakteriyel DNA transformasyonu yapılacağı düşünülürken, hemen hemen bütün E.
coli suşlarına, verimlilik derecesi değişse de, plazmit DNA’nın aktarılabileceği anlaşılmıştır (Cosloy
and Oishi 1973). Sonraları Hoekstra ve arkadaşları (1980) recBC+ hücrelerine lineer DNA
aktarılabileceğini gösterdiler, fakat transformasyondaki verim recBC- hücrelerine göre sadece % 10
kadardı. recBC- hücrelerine lineer DNA nın transformasyonu tek bir koşulda mümkün olmaktadır, bu
da hücrelerde sbcA veya sbcB mutasyonları yapılarak hücrelerin rekombinasyon yeterliliğine sahip
olmaları ile sağlanır. recBC geninden oluşan proteinin bir ekzonükleaz olması recBC+ hücrelerdeki
halkasal ve lineer DNA’nın transformasyon verimliliğindeki farklılığı açıklar.
Gelecek bölümde de görüleceği üzere, çoğu bakteri, verimlilği ve transformasyonu etkileyen
restriksiyon sistemlerini içerir. Bu restriksiyon sistemlerinin tam fonksiyonu tam olarak bilinmemesine
rağmen, yabancı DNA’nın tanınmasında ve degredasyonunda bir rol oynadıkları düşünülüyor. Bunun
sonucu olarak restriksiyon sisteminden yoksun bir E. coli hücresi transformasyonda yaygın olarak
kullanılır.
E. coli’nin transformasyonu çoğu klonlama deneylerinde önemli bir adım olduğundan dolayı,
mümkün olduğunca bu işlemin etkili yapılabilmesi arzu edilir. Bu alanda çalışan birçok kişi
transformasyondaki verimliliği etkileyen faktörleri açıklamışlardır. Kalsiyum iyonlarının bulunduğu
bir ortamda ve düşük sıcaklıkta (0-5°C), E. coli hücrelerinin ve plazmit DNA’nın birbirlerini kuvvetli
bir şekilde etkiledikleri bulunmuştur. Son adım olarak, kesinlikle gerekli olmamasına rağmen, bir ısı
şoku (37-45 °C) transformasyon için önemlidir. Kalsiyum iyonlarına ek olarak bir çok diğer faktörün,
özellikle bazı metal iyonlarının transformasyonu pozitif yönde artırdığı gösterilmiştir.
Çok basit olarak izah edilecek olursa, E. coli ile yapılan kısmen verimli bir transformasyon
prosedüründe, hücreler log fazında iken yaklaşık 1010 hücre 50 mmol/l buz soğuğu kalsiyum klorür de
çözülür, ardından 30 dakika buz üzerinde tutulur. Daha sonra plazmit DNA (0,1 µg) tansformasyon
için kompetan (yetenekli) hale gelmiş olan küçük hacimlerdeki (0,2 ml) E. coli hücrelerine eklenir ve
30 dakika buz üzerinde inkübasyona bırakılır. Buzdan alınır alınmaz 2 dakika 42°C’de şok uygulanır.
Sonraki adımda hücreler genellikle besleyici bir ortama transfer edilir ve bir süre inkübasyona bırakılır
(30 dakika ila 1 saat arası) ki plazmitin ifade ettiği fenotipik özellikler ortaya çıksın. Bu fenotipik
özellik genellikle yaygın olarak kullanılan bir antibiyotik direncidir ve plazmit içeren hücreler için
seçiçi bir marker olarak kullanılır. Sonunda hücreler seçiçi bir ortama alınır. Böylesi bir
transformasyon prosedürünün neden etkili olduğu tam olarak anlaşılamamıştır (Huang and Reusch
1995). Bilinen şudur ki, CaCl2 hücre duvarını etkiler ve hücre yüzeyine DNA’nın bağlanmasından
sorumlu olarak işlev görür. DNA’nın hücre içine alınmasındaki asıl etki kısa ısı şokunun uygulandığı
evredir.

11
 Hanahan (1983) transformasyonun verimliliğini etkileyen faktörleri tekrar gözden geçirmiştir,
ve birçok E. coli K12 suşuna uygulanabilen optimum verim için birtakım şartlar geliştirmiştir. Tipik
olarak, µg’da 107 ila 109 transforme edilmiş hücre verimi, kullanılan E. coli suşuna ve metoda göre
elde edilebilir (Liu and Rashidbaigi 1990). Gönül isterki, çok fazla miktarda kompetant hücre yapalım
ve bunları sonraki kullanımlar için dondurucuda saklayalım. Maalesef, Hanahan prosedürüne göre
yapılan kompetant hücreler depolandıkları zaman kompetant özelliklerini hızlı bir şekilde kaybederler.
Inoue ve arkadaşları (1990) kompetant hücre hazırlama şartlarını optimize etmişlerdir. Kompetan
hücreleri 40 günden fazla bir süre -70 °C de saklayabilmiş ve hücrelerden µg’da 1-5x109 verim elde
etmişlerdir. Aynı zamanda kompetantlık DNA hazırlanmasında ortaya çıkan tuzlardan en az düzeyde
etkilenmiştir.
E. coli’de homolog olmayan kaynaklardan alınan, DNA’yı degrede eden ve transformasyon
vermini azaltan birçok enzimatik aktivite vardır (Bölüm 3). Büyük boyutlu DNA’ların
transformasyonundaki verim küçük boyutlu DNA’lara göre daha azdır. Çok sayıda klon gerektiren gen
klonlama deneylerinde bile böylesine iyileştirilmiş transformasyon prosedürleri olsa da bu
prosedürlere pek de itimat edilemez. Transformasyon veriminin düşük olması sorunundan kaçmak için
kullanılan bir yaklaşımda rekombinant DNA’yı in vitro koşullarda virüs partikülleri içine
paketlemektir. Bu yaklaşımın dikkate değer bir uygulaması 5. Bölümde detaylı olarak anlatılacak olan
kosmidlerin kullanımıdır. Diğer bir yaklaşım ise aşağıda tanımlanan elektroporasyondur.

Elektroporasyon, Hücreleri Transformasyon İçin Kompetant Hale Getirmeden Dna’yı

Hücre İçine Sokmak Demektir
Elektroporasyon E. coli’yi de içine alan birçok bakteri, bitki ve hayvan hücrelerine klonlanmış
genleri sokmada basit ve hızlı bir yöntemdir. Bu teknik Zimmerman ve Vienken tarafından bulunan
orijinal bir tekniktir. Bu teknikte hücreye yüksek voltajlı elektrik uygulanarak hücre plasma membranı
uyarılır. Bu uygulamalar sonucu bazı sonuçlara ulaşılmıştır, elektrik soku uygulandığı zaman, hücreler
dış kaynaklı DNA’yı in vitro ortamdaki sıvıdan hücre içine alırlar. Bu hücrelere DNA aktarımı
aralıksız devam edebilir ve eğer transforme edilen DNA üzerinde uygun bir marker taşınıyorsa, bu
hücreler seçilebilir. Elektroporasyonun verimliliğini etkileyen birçok faktör vardır. Bunlar; sıcaklık,
çeşitli elektriksel-alan parametleri (voltaj, direnç ve kapasite), DNA’nın topolojik formu ve çeşitli
konak-hücre faktörleridir (genetik altyapı, büyüme şartları). Bu faktörlerin bazıları Hanahan ve
arkadaşlarının review inde ayrıntılı olarak anlatılmıştır.
E. coli’ye uygulanan elektroporasyon CaCl2 metodu ile karşılaştırıldığında, plazmitlerin
tarnsformasyon verimliliği 109 cfu/ug olarak bulunmuştur. Çok yakın geçmişte, Zhu ve Dean (1999) ın
rapor ettiğine göre, tRNA içeren DNA’nın tekrar santrifüj edilerek plazmit DNA transformasyonunda
10 kat daha fazla verimli olduğu görülmüştür. Rutin CaCl2 metodunda, DNA molekülünün boyutunun
artışıyla verimlilik hızlı bir şekilde düşer ve DNA boyutu 50 kilobazı geçtiğinde hemen hemen hiç
verim kalmaz. DNA boyutu elektroporasyon verimini de etkilerken, yine de 240 kilobaz büyüklükteki

12
DNA moleküllerinden 106 cfu/ug verim almak mümkündür. Bu önemlidir, çünkü genom haritalama ve
sekanslama çalışmalarının çoğu büyük DNA fragmentleri kullanılarak yapılır (Bölüm 17).

Rekombinant DNA İçeren E. Coli Hücrelerinden Diğer Organizmalara Transformasyon

Yapma, Genlerin Farklı Konaklarda Çalışılmasına İmkan Tanır.
Klonlama çalışmaları için uygun konak olarak sıklıkla E. coli kullanılmasına rağmen,
transformasyon yetenekleri hala çözülmemiş daha başka birçok organizma şu anda kullanılmaktadır.
Gram pozitif bakterilerde bu alanda kullanılan iki önemli grup Bacillus spp.’ler ve aktinomisetlerdir.
Bacillus subtilis’in doğal olarak kompetan olduğu uzun zamandır bilinmektedir ve bu yüzden bu
organizma üzerinde yeterli derecede çalışma yapılmıştır. Bunun sonucu olarak, Bacillus subtilis,
özellikle alternatif prokaryotik klonlama konağı olarak ilgi çekmektedir. Bu organizmanın
transformasyonundaki önemli özellikler 10. Bölümde detaylı olarak ele alınmıştır. Burada önemli bir
özellik Bacillus subtilis’in protoplast transformasyonunun mümkün olmasıdır bu da transformasyon
frekansının iyileştirilmesine neden olan bir tekniktir. Benzer bir teknik Akinomisetlere
transformasyonda kullanılır, ve son çalışmalarla transformasyon frekansının oldukça artırılabileceği
gösterilmiştir, bu da lipozomlardaki DNA’nın yakalanması ve daha sonra konak hücre membranına
yapışmasıyla elde edilir.
Daha sonraki bölümlerde elektroporasyonla ökaryotik hücrelere DNA aktarılmasının yollarını
tartışacağız. Hayvan hücrelerinde sadece hücre membranının geçilmesi gerektiğinden
transformasyonda büyük bir problem ortaya çıkmaz. Mayanın transformasyonunda ise protoplastlar
gereklidir (Hinnen ve ark.1978). Daha yüksek yapılı bitkilerde geliştirilen bir strateji ile DNA, ya
bitki virüslerinde paketlenir ya da bitki hücrelerine DNA aktarıcı olarak bakteriyel bir bitki patojeni
kullanılır. Aynı zamanda bitki hücrelerinden hazırlanan protoplastlar transformasyon için yeteneklidir.
Daha başka dikkate değer bir yaklaşımda bitki ve hayvan hücrelerine tabanca ile yapılan
mikroenjeksiyon yöntemidir. (Klein & Fitzpatrick-McElligott 1993).
Maya, bitki, bakteri hücrelerinin protoplastları ve hayvan hücreleri transformasyona
lipozomlar yoluyla duyarlıdır (Deshayes ve ark. 1985). Katyonik yağlardan hazırlanan lipozomların
kullanımıyla basit bir transformasyon sistemi geliştirilmiştir (Felgner ve ark. 1987). Küçük tek
tabakalı araçlar üretilir. Solusyondaki DNA eş zamanlı olarak verimli bir şekilde bu lipozomlarla
karıştırılır. Artı yüklü lipozomlar sadece DNA ile kompleks oluşturmazlar aynı zamanda kültür
edilmiş hayvan hücrelerine de bağlanırlar. Muhtemelen plazma membranıyla birleşerek
transformasyonda etkili olurlar. Lipozomların kullanımı lipofection denilen bir transformasyon ve
transfeksiyon sistemidir.

13
Polimeraz Zincir Reaksiyonu, Biyologların DNA’yı Manipule Ettiği ve Analiz Ettiği
Önemli Bir Olaydır
PCR moleküler biyolojide oldukça önemlidir. Reaksiyon kolayca yapılır ve spesifik DNA
sekanslarını çoğaltmayı sağlar. Temel bir prensipten yola çıkarak gen teknolojisinde kullanılmak üzere
çeşitli teknikler geliştirildi. En önemlisi, PCR’da fetal doku örnekleri kullanılarak doğum öncesi tanı
sağlanabilmektedir. PCR’a dayalı prosedürlerin hassas olması nedeniyle adli tıpta DNA profil
çalışmalarında kullanılmaktadır. PCR’a benzer sonuçlar üreten birçok prosedür bulunmaktadır fakat
yaygın olarak kullanılmamaktadır.

Şekil 2.7:Polimeraz zincir reaksiyonu.

1.döngüde, denature edilen hedef bölgesinin
karşına iki primer bağlanır ve DNA polimeraz
tarafından uzatılır. 2. döngüde, 1. döngüden
yeni ve orijinal zincirler ayrılır. Primerler, yeni
zincirlere hibridize olur. 3. döngüde çift zincirli
DNA molekülleri aynı işleme tabi tutulur.

PCR prensip olarak oldukça basittir

İlk olarak temel PCR’ı düşünmemiz gerekir.
PCR, iki oligonükleotid primer içerir. Bu
primerler 17–30 nükleotid uzunluğundadır ve
çoğaltılan DNA sırasına bağlanırlar. Primerler,
DNA’nın denatürasyonundan sonra karşılıklı
olarak denatüre olan zincirlere bağlanırlar.
DNA polimeraz bu primerlere bağlanarak DNA
zincirinin sentezini sağlar. Oluşan çift zincir
DNA tekrar denatüre edilir. Denatüre olan
zincirlere tekrar primerler bağlanır ve uzama
gerçekleşir. 22 döngüden sonra yaklaşık 106
amplikon oluşması beklenir. (Şekil 2.8).

14
 Çift zincirli hedef
Döngü sayıları moleküllerin sayısı
1 0
2 0
3 2
4 4
5 8
6 16
7 32
8 64
9 128
10 256
11 512
12 1024
13 2048
14 4096
15 8192
16 16,384
17 32,768
18 65,536
19 31,072
20 262,144
21 524,288
22 1,048,576
23 2,097,152
24 4,194,304
25 8,388,608
26 16,777,216
27 33,554,432
28 67,108,864
29 134,217,728
30 268,435,456

Şekil 2.8:Döngü sayılarına göre amplife olmuş hedef bölgelerinin sayısı

İlk PCR çalışmalarında Klenow DNA polimeraz kullanılmaktaydı ve sıcaklıkla denatürasyon

adımından dolayı her döngüde enzim ilave edilmek durumundadır. Thermus aquaticus bakterisinden
izole edilen Taq DNA polimeraz enziminin kullanılmasıyla bu sorun ortadan kaldırılmış oldu. Taq
DNA polimeraz yüksek sıcaklıklara dayanıklı bir enzimdir, bu nedenle PCR sırasında tekrar tekrar
ilave edilmesine gerek yoktur. Dahası uzama reaksiyonu daha yüksek sıcaklıklarda yapılarak primer
bağlanma spesifikliği tehlikeye atılmaz. Sıcaklığa dayanıklı enzimlerle uygun termal cycling programı
kullanılarak PCR çok kolay bir şekilde yapılabilir.
Son gelişmelerin amplifikasyon zamanını kısalttığı görülmektedir. Bu sistemlerde küçük
hacimli cam borular kullanılır. Bu cam borular, hibridleşme ve denatürasyon zamanını azalttı.
PCR çok basit olmasına rağmen, pratikte reaksiyon verimini etkileyen çeşitli değişkenler
vardır. Özellikle başlangıç materyali olarak nadir örnekler ya da adli tıp örnekleri kullanıldığında PCR

15
oldukça önemlidir. PCR’ı etkileyen faktörler analiz etmek için Pavlov ve arkadaşlarının yaptığı
çalışmaya bakılmalıdır. Doğal örneklerde PCR’ı etkileyen birçok faktör bulunmaktadır. Bu faktörleri
yok etmek için gerekli faktörler Bickley ve Hopkins tarafından yayınlanan bir makalede
belirtilmektedir.

Kutu 2.3. PCR Çok Basit Bir Şekilde Hedef Sırayı Çoğaltabilir
Reaksiyon tek bir tüpte gerçekleştirilir ve Thermal cycler’a yerleştirilir. İnsan genomik DNA’sını
çoğaltmak için gerekli bileşenler aşağıda verilmiştir. Reaksiyon 100μl’liktir.
Genomik DNA, 0.1-1 μg
Primer 1, 20 pmol
Primer 2, 20 pmol
20 mmol/l Tris-HCI, pH 8,3
1.5 mmol/l MgCI2
50 mmol/l dNTP
2unite Taq polimeraz

Reaksiyon şartları aşağıdadır

Denatürasyon 94oC, 0,5 dakika
Primer bağlanması 550C 1,5 dakika
Uzama 72oC, 1 dakika

Böyle bir reaksiyon 2–3 saat sürebilir. Optimum bağlanma sıcaklığı kullanılan primerlere göre
değişir. Sıcaklık arttıkça Tris-HCI’nin pH’ı düşer. Thermal cycle sırasında pH 6,8–7,8 arasında değişir.

RT-PCR mRNA sekansını DNA’ya çevirebelir

DNA’nın kalıp olarak kullanıldığı PCR’ın esasında ısı kararlı polimeraz kullanılır ve bu
yüzden çoğaltılan DNA miktarı sınırlanır. RNA’nın çoğaltılmasını gerektiren pek çok uygulama
bulunmaktadır. Gelişim evrelerine bağlı olarak dokularda meydana gelen genlerin ekspresyon
seviyelerindeki değişimlerin analiz edilmesi veya mRNA’dan meydana getirilen DNA’nın
(komplementer veya cDNA) klonlanması bunlara örnek olarak verilebilir. RNA’yı çalışırken, PCR’la
çoğaltma işlemi için, öncelikle mRNA’nın ısı kararlı polimeraz tarafından kullanılabilmesi için
DNA’ya çevrilmesi gerekmektedir. Bu işlem ters transkripsiyon olarak adlandırılır ve bu yüzden
kısaca RT-PCR olarak gösterilir.
Avian myeblastosis virüsü (AMV) ve ya Moloney murine leukemia virüsü (MuLV), DNA
üretmek için RNA’yı kalıp olarak kullanarak ters transkripsiyon yapar. Tek zincir cDNA’nın sentezi
için uyarlanmış çeşitli strateji mevcuttur (Bakınız bölüm 6).

16
Şekil 2.9. Tek zincirli cDNA’nın sentezinin üç adımı. (a) Random primet: (b) oligo d(T) primer: (c)
sekans spesifik primer.

Uzun DNA fragmentlerini çoğaltmak için basit PCR etkili değildir

Çeşitli gen manipulasyonu çalışmalarında uzun DNA fragmentleri kullanılmaktadır. basit PCR
ise küçük fragmentler çoğaltılacağı zaman iyi sonuç verir. Çoğaltma verimi ve dolayısıyla çoğalan
ürün, çoğalacak kısmın uzunluğu 5kb’nin üzerine çıkılınca önemli derecede azalır. Uzun fragment
sentez edilirken meydana gelen bu düşüş, istenilen sekansın bir sonraki döngünün substratına uygun
olmayacak şekilde kısmi sentezine sebep olur. Bu durumda, ürün jelde yürütüldüğünde smear
oluşacağı için fark edilir.
Barnes (1994) ve Cheng (1994 a.b) daha büyük DNA sentezlenmesi etkileyen faktörleri
araştırdı ve bu etkileri sınıflandırdı. Bunlardan en etkili olan Taq polimeraz’ın 3’-5’ ekzonükleaz
(okumayı düzelten) aktivitesine sahip olmamasıydı. Muhtemelen, Taq polimeraz zincire yanlış bir
deoksinükleotid trifosfat eklediğinde, zincirin uzaması yavaşlar ya da tamamen durur. Bu problemlerin
üstesinden gelebilmek için, okumayı düzeltme kapasitesine sahip ikinci bir ısı kararlı polimeraz
reaksiyon tüpüne eklenir. Düzeltme kapasitesine sahip ısı kararlı DNA polimerazlar Tablo 2.1’de
listelenmiştir.

Tablo 2.1. 5’→3’ ekzonükleaz aktivitesine

sahip thermostable DNA polimerazların
kaynakları

17
Bir PCR’ın başarısı, reaksiyonda kullanılacak değişkenlerin seçimine bağlıdır
PCR’ın spesifikliğini kullanılan primerler belirler. Etkili primerlerin seçiminde şu faktörler
önemlidir;
• Primerlerin uzunluğu 17-30 nükleotid arasında olmalıdır.
• Yaklaşık %50 GC içeriği idealdir. Uzun primer seçiminde yüksek GC içeriği istenir ki Tm
değeri de yüksek olsun.
• Tek bir nükleotidin uzun tekrarlar ( üç veya dörtten daha fazla) oluşturmasından kaçınılmalı.
• Sekonder yapılar oluşturan primerler istenilmez.
• İki primer birbirinin komplementeri olmamalıdır.
Optimal koşullarda bile primerlerin hepsi eşit etkinlikte olmamasına rağmen, istenilen bölgeye
hedeflenen primerlerin en önemli özelliği, çalışmalarda kullanılmak üzere oluşturulabilmeleridir.
Klasik PCR’da hot-start protokolü kullanılır. Bu protokol şu basamakları içerir: ilk döngünün
denatürasyon basamağından sonra DNA polimeraz ilave edilir ve ilk döngünün annealing (primer ve
kalıp hibritleşmesi) basamağı, ya annealing sıcaklığının üstünde ya tam annealing sıcaklığında ya da
annealing sıcaklığına çok yakın bir sıcaklıkta gerçekleştirilir. Hot-start PCR’da, nispeten düşük
sıcaklıklarda gerçekleştirilen PCR’larda oluşan problemlerden bazıları oluşmaz. Düşük sıcaklıklarda,
istenilen primer hibritasyon sıcaklığının altında (45-60ºC’nin altında), yanlış eşleşmiş primerler
oluşacak ve polimeraz muhtemelen DNA üzerinde herhangi bir yeri çoğaltacaktır. İlk çoğaltma
işleminde, yanlış eşleşen primerler hedeflenmeyen bölgede kararlıdırlar. İlk döngü boyunca çoğaltılan
DNA yanlış eşleşen primerlere benzer bölgelere sahipse, bu primerler sonraki döngülerde de etkili bir
şekilde hibritleşecek ve istenmeyen ürünlerin çoğaltılmasına sebep olacaktır.
Hot-start protokole alternatif bir yol, Taq polimeraz antikorlarının kullanılmasıdır. Bu
antikorlar Taq polimeraza bağlanarak inaktifleştirirler, yüksek sıcaklıklarda Taq polimerazdan
ayrılırlar ve polimeraz aktifleşir, modifiye edilmiş bir Taq polimeraz olan AmpliTaq-GoldTM 95ºC’
den sonra aktifleşir (Birch, 1996). SELEX metodu, Taq DNA polimerazı spesifik bir sıcaklıkta inaktif
eden başka bir metottur. Bu metotta polimeraz, polimeraza iyi bir substrat olmayan 70 monemerden
oluşan bir primerle geridönüşümlü olarak inaktif edilir (Dang & Jayasena 1996). İstenmeyen ürünlerin
çoğalmasını en aza indirmek için nested primerlerin kullanıldığı bir strateji geliştirildi. Bu stratejide ilk
PCR ürünleri, ikinci PCR için kalıp olarak kullanılır ve ilk PCR’da oluşan ürünün içerisine tekabül
eden primerler ikinci PCR için kullanılır. İlk PCR sonucu oluşan DNA’ya spesifik olan ikinci PCR da
kullanılan primerlere internal yani nested primer denir. Bundan dolayı bu nested primerler ilk PCR’da
oluşan DNA’nın içerisindeki bir bölgeyi seçici bir şekilde çoğaltır. Bundan dolayı, ikinci primerlerle
hibritleşebilen sekansları içeren istenmeyen ürün oluşma şansı çok düşüktür. Taq DNA polimeraz’ın
3’-5’ yönünde proofreading (düzeltme) ekzonükleaz aktivitesi yoktur. Bu eksiklik, PCR’la çoğaltılan
DNA’nın bazı yerlerinde nükleotidlerin yanlış eşleşmesi yüzünden, doğru olmayacağını gösterir
(Eckert & Kunkel 1990). Bu problemi kısmen de olsa çözebilmek için, sıcaklığa dayanıklı DNA

18
polimerazlar sentezlenen DNA sekansının doğruluğunu arttırmak için geliştirilmiştir. Fakat
günümüzde hala Taq DNA polimerazlar PCR’da en çok kullanımı olan enzimlerdir. Bazı
uygulamalarda özellikle çoğaltılmış cDNA klonlamalarında, PCR esnasında oluşabilecek mutasyonları
tespit etmek için, klonlanan ürünün nükleotid sekansını kontrol etmek önemlidir. Amplifikasyon
reaksiyonunun doğruluğu, birbirinden bağımsız aynı kalıp üzerinden çoğaltılan birkaç molekülü
klonlayıp, sekanslattıktan sonra birbiriyle karşılaştırarak tespit edilebilir.

Özel ekipmanların kullanımıyla PCR sayımını yapmak mümkündür.

Başlangıç materyallerinin miktarını ölçmek için avantajlı olan bazı PCR uygulamaları vardır.
Teorik olarak başlangıç materyalleri (hedef dizi) ve PCR ürün miktarları arasında kantitatif bir ilişki
vardır. Higuchi PCR ürünlerini çoğalmış olarak ölçmek için etidyum bromür kullanmıştır.
Amplifikasyon ürünleri etidyum bromür bağlanmış çift zincirli DNA miktarını arttırır. Sonuç olarak
fluorasan altında artan miktarlar görülür. Şekil 2.10’da dönüş sayısına göre flourasandaki artış grafiği
çizilmiştir. Bu grafik ile PCR kinetik analizi yapmak mümkündür. Bu, dönüş sayısının
sabitlenmesinden sonra ürün yığın analizinden daha memnun edicidir.

Şekil.2.10 Real-time PCR ‘ın kullanılmasıyla elde edilen tipik DNA amlifikasyon çiziminin sistematik
gösterimi.

Üç aşamaya sahip reaksiyon profili Şekil 2.10’da gösterilmiştir. Birinci aşamada floresans
miktarının anahattın üzerine çıkmadığı sırada bir faz oluşturmuştur. İkinci basamakta, yeterli miktarda
ürün fazın üzerinde birikmiştir ve floresansda ürüne göre artmıştır. CT parametresi başlangıçta tayin
edilen miktar geçildiğinde döngü sayıları şeklinde ifade edilmiştir.
Yalnız CT varsayıldığında, amplifikasyon reaksiyonun denklemi;
Tn=TO(E)n
döngü→n, Tn→döngüdeki hedef dizinin miktarı, TO→başlangıçta bulunan hedef miktarı ve E ise
amplifikasyon etkinliğini göstermektedir. Son aşamada ise ürün birikiminin olmadığını gösterir.
CT değeri, hedef DNA’nın başlangıştaki konsantrasyonuna bağlıdır: Çoğu döngülerin düşük
konsantrasyonları değerin belli bir yere (thresholda) ulaşmasını sağlar. (Şekil 2.11). Eğer hedef
DNA’nın bir milyon kopyası ile reaksiyona başlanırsa, 1,9 reaksiyon etkinliğine sahip olur ve
yukarıda gösterilen denklemle sinyalin 14. döngüde olduğu görülebilir. Diğer bir taraftan reaksiyona

19
1000 kopya sayısı ile başlanırsa ilk sinyalin 25. döngüde olduğu hesaplanır. CT’ye karşı ilk hedef
kopya sayısının logaritmasıdır ve -1/log E’lik meyile sahiptir.

Şekil 2.11:Başlangıçtaki DNA konsantrasyon etkisi artan fluoresans aracılığla kontrol edilir.
Deneylerdeki C değerleri, kopya sayılarının hesaplanmasına izin verir ve reaksiyon
verimliliğini de gösterir. Eğer her PCR ürünü her döngüde replike olursa reaksiyondaki maksimum
etkinlik ikidir. Etkinlik önemlidir ve aşağıdaki sebepler etkinliği azaltır;
PCR inhibitörünün varlığı
DNA fragmentlerinin varlığı spesifik olmayan priming olaylara sebep olur.
Uygun olmayan amplikon, primer, ve probların seçimi

Kantitatif PCR reaksiyonlarında, floresans üretmenin çok farklı yöntemleri vardır

Kantitatif PCR’ın geliştirilmesi için yapılanan ilk çalışma, etidyum bramürün cift zincirli
DNA’ya bağlandığında, oluşturmuş olduğu arttırılmış floresansının kullanılmasıdır. Etidyum bromüre
alternatif olarak SYBR Gren I kullanılabilir. Bu boya, çift zincirli DNA’nın küçük oluğuna bağlanır ve
bu bağlanma sayesinde, floresans miktarı 100 kattan daha fazla artış gösterir. Etidyum bromür ve
SYBR Gren I boyasının, spesifik olan ve olmayan PCR ürünlerine aynı derecede bağlanmaları ve
ayrıca primer dimerlerine de bağlanabilmeleri problem oluşturmaktadır. Bu problemi çözmenin yolları
olmasına rağmen, spesifik amplifikasyon problarının kullanılması alternatif bir yoldur.
En geniş kullanılan prob sistemi, TaqManTM’dir. Bu sistemde kullanılan prob, 5’ ucunda
haberci bir floresans boyasını ve 3’ ucunda da bu boyayı emebilen bir quencher boyasını bulunan bir
oligonukleotidtir. Bu prob kesilmemeişken yani sağlamken, haberci boyanın yaydığı floresansı emici
boya emer, bu nedenle emici boyanın haberci boyaya olan yakınlığı, haberci boyanın yaydığı
folerasans miktarını azaltır. Hedef sekans mevcutsa; bu prob, primer bölgerinden birisinin aşağı
kısmına bağlanır. Primer uzatılılırken, Taq polimerazın 5’ nükleaz aktivesi sayesinde bu prob kesilir
(Şekil 2.13). Bu probun kesilmesiyle, haberci boya emici boyadan ayrılır ve haberci boyanın yaydığı
floresans miktarı artar. Bu kırılma, probu hedef zincirden uzaklaştırır ve primer uzamasının kalıp
zincirin sonuna doğru devam etmesine izin verilir. Her döngüde, ilave haberci boya molekülleri, kendi

20
problarından kesilerek ayrılır ve buda üretilen kopya miktarıyla orantılı olarak floresansın
yoğunluğunu arttırır.
Floresans yoğunluğunu da ölçebilen PCR aletlerinin geliştirilmesi, PCR’ın ilerleyişini gerçek
zamanda gözleyebilmemizi mümkün kıldı. Bu olay, DNA’nın ölçülmesine dayalı PCR
yaklaşımlarında kökten değişikliklere yol açtı. Reaksiyonlar, döngü boyunca bir ürün çoğaltılmasının
ilk belirlendiği noktayla karakterize edilir. Hedef sekansın kopya sayısı ne kadar yüksekse, o kadar
kısa zamanda floresansta önemli bir artış meydana gelir. Eğer sırası bilinmeyen örneklerle çalışacaksa;
hedef sıranın miktarını belirlemek için, hedef sıranın farklı başlangıç kopya sayılarını kullanarak
standart bir eğrinin hazırlanması gerekmektedir.
Scorpion problar ve moleküler işaretler, TaqMan sistemine alternatif olarak geliştirilmiş iki
prob sistemidir. TaqMan’de, probun kırılmasıyla floresans oluşurken, bu yöntemler de ise probun
hibridize olması sonucunda floresans meydana gelmektedir. Moleküler işaretler, bir ucunda florophore
(floresans yayan kısım) ve diğer bir ucunda da floresans quencher (floresansı emen kısım) taşıyan
firkete şeklindeki oligonükleotitlerdir. Firkete yapısı mevcutken, floresans yayılamaz, ancak prob
hedef sekansa bağlanınca konformasyonel değişikliğe uğrar ve floresans yayılmaya başlar (Şekil 2.14).
Scorpion problarıda firkete yapısına sahip bir oligonükleotittir. Ancak Scorpion probları, moleküler
işaretlerden farklı olarak 3’ uçlarında tamamlayıcı bir sıraya sahiptirler. Bu 3’ tamamlayıcı sıra, primer
gibi davranarak PCR reaksiyonlarında uzatılır (Şekil 2.15). Denatürasyondan sonra, prob sekansı
hedef sekansa bağlanır ve floresans yayılması meydana gelir. Scorpion prob yönteminin, hızlı cycling
koşullarında yapılması daha iyi sonuçalar vermektedir. Çünkü, Scorpion prob bağlanması, birinci tür
kinetik çeşidiyken, moleküler işaretler ikinci tür kinetiğe uymaktadır.
Floresans poblarının en büyük avantajı, bu problar, her biri karakteristik bir renk oluşturan
çok çeşitli florophorler kullanılarak oluşturulabilirler. Bu sayede, bir karışımdaki iki hedef sekansının
nisbi miktarları belirlenebilir. (Şekil 2.16).

Şekil 2.13. Real-time

kantitatif PCR.

21
 Şekil 2.14. Moleküler işaretlerinin mekanızması.
Hedef DNA’nın yokluğunda, florophore
(pembe), quencher’a (gri) yakın olduğu için
floresans meydana gelmez. Bu prob, hedef
sekansa bağlanınca, probun gövdesi çözülmeye
zorlanır. Bunun sonucunda, florophore ve
quencher uzamsal ayrılması gerçekleşir ve
floresans meydana gelir.

Şekil 2.15. Scorpion probların

mekanizması.

22
Şekil 2.16: Farklı fluoresans boyalarıyla işaretlenen spesifik probların kullanılarak iki DNA örneğinin
konsantrasyon ilişkisi belirtilmiştir.

Günümüzde Gen Parçalarında Olduğu Gibi Tüm Genomun Amplifikasyonu Da

Mümkündür.
PCR özel olarak hedeflenmiş dizilerin amplifikasyonunu sağlayan bir tekniktir fakat son
zamanlarda tüm genomun (WGA) amplifikasyonu için uyarlanmıştır. Geleneksel PCR ‘ın aksine,
WGA’nın amacı minumum amplifikasyon eğilimiyle tüm genomu temsil etmektir. Bu, İnsan Genomu
çalışmalarında, belirli lokasyonların veya allellerin bozulması ve kaybolması olmaksızın 3 milyar
bazın amplifikasyonu anlamına gelir. Günümüze kadar, 5 farklı WGA metodu geliştirilmiştir ve
bunların her birinin özellikleri Tablo 2.2. de karşılaştırılmıştır. Bunlardan dördü, doğruluk payı az olan
sadece kısa uzunluktaki (<1000) ürünlerin oluşmasını sağlayan PCR çeşitleridir (Egholm 2003). Buna
bağlı olarak, bu metodlar yaygın olarak benimsenmemişlerdir. PCR içermeyen, Çoklu Öteleme
Amplifikasyonu (MDA) denilen alternatif bir metod geliştirilmiştir (Dean ve rak. 2002; Hosono ve
ark. 2003).

23
 MDA’da kalıp DNA, yer değiştiren zincirin senteziyle ortaya çıkan aşırı dallanma
mekanizmasıyla tekrar ve tekrar replike olur (Şekil 2.17). Yani, polimeraz yeni kopyaların ötelenmesi
ile eşzamanlı olarak kalıbın yeni kopyalarını oluşturur. MDA, bakteriyofaj Ф 29 dan elde edilen DNA
polimerazın 2 anahtar özelliğinin avantajını kullanan izotermik bir metotdur. Bu özelliklerden ilki, bu
polimerazın primere bağlanıp her seferinde 70.000 nükleotit eklemesidir, ve bu özellik MDA‘nın
neden uzun DNA ürünleri oluşturduğunu açıklar. İkincisi ise, sadece 106-107 de 1 hata oranı veren
aşırı derece yüksek doğruluklu bir polimeraz olmasıdır.

24
Tablo 2.2. Yaygın olarak kullanılmakta olan WGA methodunu kullanımının karakteristiklerileri

Method MDA PEP İPEP DOP LL-DOP-PCR

DNA miktarı
(her 100µl’de reaksiyon 80µg 40µg ND 1-6µg ND
Reaksiyonda ölçü-
lebilir hacim var yok yok yok yok
DNA ürününün uzunluğu 2000-≥100,000 100-1000 100-1000 100-1000 500->10,000
Lokuslar arası
amplifikasyon oranı <6-kat 103 ND 106 103
DNA polimerazın <10-6 3.10 -1.10 ~10-5
-4 -5
3.10-4 -10-5
hata yapma oranı
Tek hücrede gösterilen
amplifikasyon ND + + + ND
Parafin yerleştirilmiş
dokuda amplifikasyon
uygunluğu - o + + + ND

25
 3. BÖLÜM

DNA MOLEKÜLLERİNİN KESİLMESİ VE

YAPIŞTIRILMASI

26
DNA moleküllerinin kesimi
1970 den önce, yeknesak noktalarda DNA'yı özel bir noktadan kesmek için herhangi bir metod
yoktu. Kullanılabilecek metotların hiçbiri spesifik değildi. Mevcut endonükleazlar çok az bir bölgeye
spesifikti ve kimyasal metodlar çok küçük DNA fragmentleri üretirdi. Her aşaması kontrol
edilebilecek tek metod ise DNA’nın mekanik kesiciler ile muamele edilmesidir. Uzun, zayıf
lif şeklinde uzantı oluşturan çift yönlü DNA molekülleri, solüsyon içinde güçlü kesiciler
tarafından rijid ve kolay bir şekilde kırılmıştır. Sonikasyonla DNA’yı yaklaşık 300 nükleotit
çifti uzunluğu kadar küçültebilir. Daha kontrollü kesme, blender ile yüksek hızda başarılabilir.
Tipik olarak, 30 dakikada 1500 rev/min hızda DNA yaklaşık 8 kilo baz büyüklükte parçalara
kesilir (Wensink ve arkadaşları 1974). Kırılma, DNA dizisi için rastgele bir yerde meydana
gelir. Kullanılan prosedüre bağlı olarak oluşan fragmentlerin uçları, kısa tek zincirli bölgeleri
içerir.
1960'larda, faj biyologları konak restriksiyon ve modifikasyonunun fenomeninin temel
biyokimyasını aydınlatmıştır. Bu çalışmanın sonucu, Meselson ve Yuan tarafından
Escherichia coli K12 restriksiyon endonükleazlarının saflaştırılması ile olmuştur (1968). Bu
endonükleazlar; büyük ve farklı fragmentlerde modifiye olmamış DNA'ları kestikleri için,bu
endonükleazlar tanınan hedef DNA'nın kesilmesine sebep olmuşlardır. Enzim belli bir tanıma
dizisine bağlandığında, kesim bu bölgenin birkaç kilobaz uzağında rastgele olarak meydana
gelir (Yuan ve arkadaşları 1980). Birçok araştırmadan sonra, çok basit davranan bir enzim
olan Hemophilus influenzae'nın enziminin keşfi ile 1970’de başarı ile elde edilmiştir (Kelly &
Smith 1970, Smith & Wilcox 1970). Yani, enzim bir çift yönlü DNA da belirli bir hedef diziyi
tanır ve tanımlanmış uzunlukta fragmentler ve diziler elde etmek için bu dizinin içerisinden
polinükleotit zinciri kırar.
Restriksiyon ve modifikasyon sistemlerinin bulunması iki ucu keskin bir kılıç gibidir.
Bir taraftan, DNA manipulasyonu için zengin kullanışlı enzim kaynağıdır. Diğer taraftan, bu
sistemler, klonlanılan konaklarda rekombinant DNA kazancını önemli bir derecede
etkileyebilir. Bu nedenle, restriksiyon ve modifikasyonun bazı bilgileri gereklidir.

27
Restriksiyon ve Modifikasyon (R-M) sistemlerinin 4 farklı tipi bilinir, fakat sadece bir
tanesi gen manipulasyonunda yaygın olarak kullanılır
R-M sisteminin en az 4 farklı çeşidi tanımlanmıştır: TipI, TipII, TipIII ve TipIIs.Tablo 3.1 de
aralarındaki önemli farklar özetlenmiştir.
ilk olarak TipI sistemİ karakterize edilmiştir ve bunun tipik örneği E.coli K12 suşudur. Aktif
enzim iki restriksiyon alt birim; iki modifikasyon ( metilasyon) altbirimi ve bir tanıma alt biriminden
oluşur. Bu alt birimler hsdR, hsdM, ve hsdS genlerinden oluşur. Hem metilasyon hem kesim
reaksiyonları için hem ATP ve hem de S-adenozilmetiyonin kofaktörüne ihtiyaç duyar. Tanıdıkları
dizi oldukça uzundur, fakat simetri gibi bir durum yoktur. Enzim modifiye olmamış DNA'yı, tanıma
dizisinin belirli bir mesafe ötesinden keser. Kesimi yapan aynı enzim, metilasyon da yaptığı için hedef
DNA kesilmeden öncede modifiye edilebilir. Bu özellikler nedeniyle gen manipulasyonları için TipI
sistemi çok az bir değere sahiptir (ayrıca 3.1 kutusuna bakınız).

E.coli suşlarında, R ve M sisteminin bulunması, rekombinantların elde edilmesini etkiler.

TipIII enzimler simetrik tanıma dizilerine sahiptirler, fakat diğer taraftan TipI sistemine benzer ve
moleküler biyoloji teknikleri açısından çok az değere sahiptirler.
Kullanılan R-M sistemlerinin bir çoğu tipII dir. TipI ve TipIII sistemlerine göre sayısız
avantajlara sahiptir. İlk olarak kesim ve modifikasyon farklı enzimlerle gerçekleştirilir. Bu nedenle,
DNA'yı modifiye etmeden de kesmek mümkündür. İkinci olarak, restriksiyon aktivitesi ATP ve S-
adenozilmetiyonin gibi kofaktörlere ihtiyaç duymaz. Bu da bunların kolay kullanılmasını sağlar. TipII
enzimlerin en önemli özelliği genellikle DNA'yı belirli simetrik dizilerden (palindromik) tanıması ve
bu bölgelerin içinden kesmesidir. Bu enzimlerden bir çoğu DNA'da zig zaglı kesimler yapar. Bu zig
zaglı kesim TipII sistemlerini daha kullanışlı yapar.
TipIIs sistemleri, TipII sistemlerine benzeyen makromoleküler yapılara ve kofaktörlere
sahiptir. Aslında; restriksiyon bölgesinin, tanıma bölgesinden uzakta olması TipIIs sistemlerinin
kullanışlılığını sınırlar.

28
 R-M sistemlerinin TipI'den TipIII'e kadar olan sınıflandırılması uygundur, fakat yeni keşifler
gerektiren modifikasyonlara gerek duyabilir. Örneğin, Eco571 sistemi hem restriksiyon hem de
modifikasyon aktivitesine sahip tek bir polipeptitten oluşur (Petrusyte ve arkadaşları 1988). Diğer
restriksiyon sistemleri yukarıdaki sınıflandırmanın dışındadır. Örneğin mcr ve mrr sistemleri (bakınız
sayfa 43) ve homing endonükleazlar ya da sonraki intronlar veya inteinlerden orjinlemiş çift zincirli
deoksiribonükleazlar (DNaz'lar) (Belfort & Roberts 1977). Bunlar büyük asimetrik tanıma bölgelerine
sahiptirler ve standart endonükleazlardan farklı olarak tanıma bölgesindeki bazı dejenerat dizileri
tolere edebilirler.

KUTU 3.1 Restriksiyon: bakteri genetiğinndeki fenomenden biyolojik evrime doğru

Konak kontrollü restriksiyon ve modifikasyon ile alakalı iki olay da ,bir konak hücredeki
fajların tek bir faj büyüme döngüsü yeni oluşan virüslerin konak spektrumunu değiştirir.Virüs iki
konak hücrede verimli bir şekilde çoğalamayabilir.Bu virüsün konak spektrumu sınırlıdır.Bu virüsün
modifikasyonu, mutasyondan kesinlikle farklıdır. Çünkü, bu özellik virüsün çoğaldığı konak hücre
tarafından empoze edilmiştir fakat kalıtımsal değildir. Faj başka bir konak hücrede
büyütüldüğündeyse; modifikasyon kaybolabilir. 1950'lilerde, restriksiyon ve modifikasyon birçok
virülant ve ılımlı fajı (lizojenleri şekil verme yeteneği)ve çeşitli bakteri türlerini etkileyen genel bir
fenomen olarak tanımlandı.
Arber ve Dussoix, bu olayın moleküler esaslarını aydınlattılar. Faj λ’sının restriksiyon konak
hücredeki faj DNA’sının hızlı bir şekilde parçalanmasıyla gösterdiler. Ayrıca Restriksiyona dirençli
olmayan faj DNA’sının değişmesi ile modifikasyonun ortaya çıktığını gösterdiler. DNA çift
sarmalındaki zincirden bir tanesinin modifiye edilmesinin restriksiyonu engellemek açısından yeterli
olduğunu gösterdiler.Müteakip deneyler, modifikasyon işleminde DNA'nın metillendiğini ortaya
çıkardı.
1960'lardaki ayrıntılı genetik analizler restriksiyon ve modifikasyondan sorumlu bakteriyal
genlerin (E.coli K ve B'de) bu iki olayın ikililiğini destekledi. Hem restrüksiyon hem de modifikasyon
kusurlu bakteri mutantları ve sadece restrüksiyon kusurlu bakteri mutantları izole edilebildi. R+M-
mutantlarının izole edilememesinin sebebi konağın kendi DNA'sını koruyucu modifikasyonu
yapamamasıdır. Bu da intihar sayılır.
Restriksiyon sistemi olmayan hücre DNA’sını parçalar. biyokimyası, E.coliK'dan endonükleaz
restriksiyonunun izolasyonu daha da ilerletildi (Meselson &Yuan 1968). E.coliK ve E.coliB'den elde
edilen restriksiyon endonükleazlar DNA'daki özel yapılar için önemli örneklerdir fakat bu tipI
enzimlerin özellikleri şimdi biliniyor ve komplekstir. Fajlardaki tanıma bölgeleri haritalanabilmekle

29
birlikte (Murray ve arkadaşları 1973) DNA dizisi üzerinde kesilen dizileri belirleyen çalışmalar
başarısızdır (Eskin &Linn 1972, Murray ve arkadaşları 1973b).
Hamilton smith tarafından Hemophilus influenzae Rd’den restriksiyon endonükleazın ve T7
faj DNA’sının (Kelly & Smith 1970) kestiği dizinin nükleotit dizi sırasının açıklaması bir dönüm
noktası olmuştur. Bu enzim HindII olarak bilinir. Substrat olarak T7 DNA'nın seçimi iyidir, çünkü
bakteri bol olarak ikinci bir tipII restriksiyon enzimi olan HindIII de içerir. Şanslıdır ki, HindIII T7
DNA'yı kesemez ve bu yüzden saflaştırılırken HindIII kontaminasyonu olmuşsa HindII için herhangi
bir sorun olmaz (Old ve arkadaşları 1975). HindII’nin keşfinden sonra çeşitli diğer restriksiyon
endonükleazları karakterize edildi. EcoRI bunların arasında en önde gelendir (Hedgepeth ve
arkadaşları, 1972) ve bunlar çok hızlı bir şekilde DNA rekombinasyon deneylerinde kullanıldı.
1960'lara kadar ortalarında, restriksiyon ve modifikasyon sistemi bakteri genetiği (bak,
örneğin, Hayes 1968,) alanında önemli ve ilginç bir olay olarak bilindi, fakat biyolojide restriksiyon
enzimlerinin bu denli şaşırtan etkisini kim bilebilirdi.

Restriksiyon endonükleazların adları bunların kaynakları hakkında bilgi sağlar

Çok sayıda restriksiyon ve modifikasyon sistemlerinin keşfi düzenli bir terminoloji ile
adlandırılır. Smith ve Nathans (1973) tarafından uygun bir sistem önerilmiştir ve bunun basitleştirilmiş
versiyonu bugün kullanılmaktadır. Temel özellikleri şunlardır:
• Üç harfli bir kısaltma oluşturmak için cins isminin ilk harfi, tür isminin ilk iki harfi ile
kimliklendirilir. Bu kısaltmalar ise genellikle italik yazılır.
• Kaynak belirli bir suş ise bu da belirtilir.
• Bir suş birden fazla R-M sisteminr sahip olduğunda bunlar roma rakamıyla tanımlanır.

Tablo3.2'de bazı örnekler verilmiştir.

Homing endonükleazlar benzer şekilde intronlar tarafından kodlanıyorsa "I" ön ekini alır ( örneğin,
I-CeuI ) intein endonükleazlar ise "PI-" ön ekine sahiptirler ( örneğin, PI-PspI ). Restriksiyon ve
metilasyon aktiviteleri arasında ayrım gerekiyorsa, sırasıyla "R" ve "M" ön eklerini alırlar.
Örneğin, R.SmaI ve M.SmaI.

30
 Tanıdığı ve kestiği bölge

I-CeuI

PI-PspI
Restriksiyon enzimleri DNA'yı simetri bölgesinden keser ve farklı enzimler farklı
dizileri tanır

Tümünde olmamakla birlikte bir çok tipII restriksiyon endonükleazlar DNA'yı tanır ve
rotasyonel simetrili 4-8 bazdan oluşan nükleotit dizisinin belirli bir noktasından DNA’yı keser. Her iki
yönden de okunabilen bu gibi diziler palindromlar olarak adlandırılır. Örneğin, R.EcoRI ve M. EcoRI
restriksiyon ve modifikasyon enzimlerinin tanıma dizileri aşağıdaki gibidir:
5′-G A A: T T C-3′
3′-C T T: A A G-5′
Simetri ekseni

Enzimin kestiği nokta"/" işareti ile gösterilir ve nükleotitler genellikle yıldız (*) işaretiyle işaretlenen
yeri metillerler. EcoRI için, bunlar şu şekilde gösterilir:

5′-G/AA*T T C-3′
3′-C T T A*A/G-5′
Kolaylık için 5' 3' yönündeki tek zincir DNA ile bu diziler şu şekilde gösterilebilir:

5′-G 5′-AATTC-3′
3′-CTTAA-5′ G-5′

EcoRI zigzaglı kesim yapar ve 5' yapışkan ( sarkık ) uç üretir.

Bu DNA fragmentleri üst üste gelen 5' uçları arasındaki hidrojen bağı ile birleştirilebilir veya
bu fragmentler moleküller arası reaksiyon ile halka haline getirilebilir. Bu nedenle fragmentlere
yapışkan uçlar denir. Esas itibariyle, farklı kaynaklardan DNA fragmentleri yapışkan uçlar vasıtasıyla
birleştirilir.
TipII enzimlerin tümü hedef bölgelerini EcoRI gibi kesmez. Bazı PstI (CTGCA/G) gibi
endonükleazlar 3' sarkık fragmentler oluştururken, SmaI (CCC/GGG) gibi olan diğerleri küt ya da düz
uçlar oluşturur.

31
 Şekil 3.2 EcoRI ile kesilen DNA’nın uçları yapışkan uçlardır.

Tablo3.3 Bazı restriksiyon endonükleazlar ve tanıma bölgeleri

Şimdiye kadar 10.000’nin üzerinde organizmada restriksiyon enzimi belirlenmiştir. Bunlardan

3000’in üzerinde enzim izole edilmiş ve yaklaşık 200'ünün gen sırası belirlenmiştir. Bazı temsili
örnekler Tablo 3.3'de verilmiştir.

32
 Restriksiyon enzimleri ve onlarla ilgili metilazlar, kesim bölgeleri, ticari ulaşılabilirlik ve
literatür bilgisi gibi geniş kapsamlı verilere ulaşmak için New England Biolabs tarafından oluşturulan
web sitesine başvurulmalıdır (www.rebase.neb.com).
Gen sıraları farklı olan enzimler bulunmuştur, fakat çoğunun önceden bilinen enzimler ile aynı
spesifikliğe sahip olduğu ispat edilmiştir. Aynı spesifik bölgeyi, aynı yerden kesen enzimler
izoşizomerler olarak bilinir. Bilinen bölgeyi farklı noktalardan kesen enzimler de neoşizomerler
olarak adlandırılır. Bunlara örnek olarak SmaI (CCC/GGG) ve XbaI (C/CCGGG) neoşizomerleri
verilebilir.
Yüksek pH veya düşük iyon kuvveti gibi extrem koşullar altında; restriksiyon endonükleazlar
kesime meyilli benzer dizileri de keser. Spesifiklikteki bu bozulmuşluğa star aktivitesi denir. Örnek
olarak EcoRI* (EcoRI star aktivitesi) N/AATTN dizisini keser, N herhangi bir bazdır. Halbuki EcoRI
GAATTC dizisini keser.

Bir DNA molekülünün G+C içeriği, farklı restriksiyon endonükleazların hassasiyetini

etkiler.
Restriksiyon enziminin ürettiği fragmentlerin uzunluğu ve sayısı DNA içerisindeki hadef
bölgenin sıklığıyla orantılıdır. %50 G+C içeriğine sahip olan bir DNA molekülünde 4 bazın gelişi
güzel dağılmasıyla 4 bazlık tanıma bölgesi, her 44 (256) bp’de bir meydana gelir. Benzer olarak, her
46(4096) de bir 6 bazlık tanıma bölgesi bulunur ve her 48(65.536) de bir 8 bazlık tanıma bölgesi
bulunur. Uygulamada DNA, 4 bazın gelişi güzel dağılımına sahip değildir ve birçok organizma A-T
veya G-C içeriği bakımından zengin olabilir. Örneğin; memelilerin nükleer genomu G+C içeriği
%40'dır ve dinükleotit CG, istatiksel olarak beklenenden 5 kat daha azdır. Benzer olarak, çoğu A+T ce
zengin bakteriyel genomlarda CCG ve CGG üçlüleri nadir olarak bulunur ve G+C ce zengin bakterial
genomlarda CTAG dörtlüsü nadir olarak bulunur. Bu nedenle 6 bazlık tanıma bölgesine sahip olan
farklı restriksiyon endonükleazlar beklenen 4096 baz çiftinden farklı uzunluklarda fragmentler
üretebilirler (Tablo 3.4).

Tablo 3.4 Farklı kaynaklardan farklı enzimler ile DNA tarafından ortalama boyutlarda fragmentler üretilmiştir.

33
 Belirli restriksiyon endonükleazlar aynı DNA molekülünde bazı bölgelerin kesme öncelikleri
farklıdır.Örneğin λ faj DNA'sında 5 EcoRI bölgesi vardır, fakat bu bölgelerin kesim önceliği bir
diğerinden farklıdır ( Thomas & Davis 1975 ). Molekülün içindeki kesme bölgesi ucundaki bölgeye
göre 10 kat daha hızlı kesilir. λ DNA'sının içinde SacII için 4 bölge vardır, fakat molekülün
merkezindeki 3 bölge geri kalandan 50 kat daha hızlı kesilir. Üç restriksiyon enzim grubu vardır ve bu
restriksiyon enzim grupları daha da fazla dramatik bölge üstünlüğü gösterir. Bunlar NarI, NaeI ve
SacII dir. Bu enzimlerin DNA'yı kesmeden önce, onların tanıma bölgelerinin iki kopyası ile aynı anda
etkileşmeleri gerekir (Kruger 1988, Conrad & Topal, 1989 ). Bu nedenle NarI pBR322 plazmitinin 4
tanıma bölgesinin 2'sini hızlı bir şekilde keser, fakat geri kalan 2 bölgeyi nadiren keser.

Basit DNA manipulasyonları bir restriksiyon enziminin bir bölgesini başka bir enzim
bölgesine dönüştürebilir
DNA'nın iki fragmentinin birleştirilmesi için, aynı restriksiyon endonükleaz tarafından
kesilmeleri önemli değildir. Bir çok farklı restriksiyon endonükleaz bir diğeriyle uyumlu yapışkan
uçlar üretir. Örneğin, AgeI (A/CCGGT) ve AvaI (C/CCGGG) 5' sarkık ucu aynı olan moleküller
oluştururlar ve bunlar birbirleri ile yapıştırılabilir. Uyumlu yapışkan uçlu başka bir çok örnek vardır.
Buna ek olarak, eğer ligasyon ürünleri 6 baz tanıyan enzimlerin oluşturduğu yapışkan uçların
birleştirilmesi ile meydana gelmişse; ligasyon ürünleri çoğu kez 4 baz kesen endonükleazlar tarafından
yeniden kesilebilir. Bu örneğin, yukarıda belirtilen örnekteki ACCGGG hibrit bölgesi HpaII (C/CGG),
NciI (CC/GGG), veya ScrFI (CC/NGG) enzimleri tarafından kesilebilir.
Yeni restriksiyon bölgeleri, restriksiyon endonükleazlar tarafından oluşturulan sarkık uçlar
doldurulup yapıştırılarak oluşturulabilir. EcoRI tarafından üretilmiş yapışkan uçlar doldurulduktan
sonra Şekil 3.3'de gösterilmiştir. Ligasyon ürünlerinin restriksiyon bölgeleri diğer 4 enzim tarafından
tanınmıştır. Doldurulan ve yapıştırılarak oluşturulan yeni bir çok hedef bölge bilinmektedir.
Tekrar kesilebilir ligasyon ürünleri oluşturulan küt uçlu restriksiyon endonükleaz
kombinasyonlarına ait bir çok örnek vardır. Örneğin AluI (AG/CT) ile kesilerek üretilen molekül,
EcoRV (GAT/ATC) ile oluşturulan uçlarla birleştirildiği zaman ligasyon bölgelerinin bazıları GATCT
dizisine sahip olacaktır ve diğerleri AGATC dizisine sahip olmuş olacaktır. Her ikiside MboI (GATC)
ile kesilebilir.

34
Şekil 3.3 EcoRI endonükleazı tarafından üretilen tek zincir uzantılar doldurduktan ve ürünle yapıştırıldıktan
sonra 3 yeni restriksiyon endonükleaz tanıma bölgesi oluşur. Endonükleaz Tsp5091 için yeniden oluşturulmuş
molekülde, 4 bp ayrı, iki hedef bölgenin olduğuna dikkat edin.

Bir metiltransferaz, (M.SssI), ve iki nükleotitli CpG metilazı (Nur ve arkadaşları, 1985)
Spiroplasma’dan izole edilmiştir. Bu enzim, CG dizisi içeren in vitro restriksiyon endonükleaz
bölgelerini in vitro’da modifiye etmek için kullanılabilir. Diğeri endonükleaz bölünmeye hassas
olacakken, hedef dizilerin bazıları bu şekilde modifiye olmuş endonükleaz bölünme için dirençli
olacaktır. Örneğin CCGG dizisi SssI ile modifiye edilirse, HpaII'ye dirençli fakat MspI'e duyarlı
olacaktır.çünkü omurgalıları ve ekinodermleri içeren birçok hayvandan genomik DNA’danki metil
gruplarının % 90’ı CG dizisinde 5 metil sitozin olarak ortaya çıkar. M.sss vertebrat desenli diğer
kaynaklardan elde edilen DNA’ları mühürlemek için kullanılabilir.

35
Metilasyon DNA'nın restriksiyon endonükleazlar ile kesilme duyarlılığını ve DNA
transformasyonunun verimliliğini azaltabilir
E.coli nin çoğu laboratuar suşları başlıca 3 DNA metilaz içerir. İlki, metilaz dam geni
tarafından kodlanır. Bu gen GATC sekans dizisindeki adeninin N6 pozisyonuna S-
adenozilmetioninden bir metil grubu transfer eder. Dam GA*TC 256 baz da bir görünür. dcm geni
(Dcm metilaz önceden Mec metilaz olarak adlandırılırdı) tarafından kodlanan metilaz, CC*AGG ve
CC*TGG dizileri içinde içsel sitozin rezidülerini C5 pozisyonundan (Marinus ve arkadaşları 1983)
metiller. %50 GC içeren DNA içinde her 256-512 baz çiftinde iki metilleme meydana gelir. Üçüncü
metilaz, M.EcoKI'dir. Fakat bu enzimin metilleyebileceği bölge sayısı çok nadirdir ve aşağı yukarı her
8 kb de bir oluşur.
Bu enzimler iki nedenden dolayı ilginçtir. Birinci neden, ifade edilen Dcm ya da Dam metilaz
üretilen hücrelerden izole edilen DNA’ların bazı veya tüm endonükleaz bölgelerinin kesime dirençli
olması olabilir. Restriksiyon endonükleazların tanıma bölgelerinde belirli bazlar metillendiğinde bu
durum ortaya çıkar. Metilazın tanıdığı bölgeler, endonükleazın tanıdığı bölgelerle örtüşürse, ilgili
bazın E.coli metilazlardan biri tarafından metillenme ihtimali vardır. Örneğin, Dam+ E.coli 'den izole
edilen DNA Sau3AI olmasa da MboI tarafından kesilmeye tamamen dirençlidir, her ikisi de GATC
dizisini tanır. Benzer olarak, her ikisi de CCATGG dizisini tanımasına rağmen, bir Dcm+ suşundan
izole edilen DNA, EcoRII tarafından değil ama BstNI tarafından kesilir. Klonlamada kullanılan çoğu
E.coli suşunun Dam+ ve Dcm+ olduğunu belirtmekte yarar var ve fakat bu genlerin her ikisi açısından
da mutant suşların mevcut olduğunu ifade etmekte yarar var (Marinus ve arkadaşları 1983).
İkinci neden ise, plazmit DNA’sının modifikasyon durumunun özel bazı şartlarda
transformasyon frekansına etkili olabilmesidir. Dam ile modifiye edilmiş plazmit DNA’sı Dam-
E.coli’ye transfer edildiğinde veya dcm modifiye edilmiş plazmit DNA’sı diğer türlere transfer
edildiğinde transfer verimliliği düşer. DNA, E.coli’den başka bir türe transfer edilmek durumundaysa
dam veya dcm metilazı olmayan hücrelerde üretilmiş DNA’yı kullanmak en iyisidir. Daha sonra
görüleceği üzere kısa,doğru tekrarlı dizileri içeren DNA’ları kalıcı olarak klonlamak zordur.konak
hücre rekombinasyon kusurlu da olsa tekrar eden birimler DNA2dan kolayca çıkabilir.bununla birlikte
delesyon mekanizmasında DNA metilasyonu rol alıyor gibidir.çünkü dam mutantlarda delesyon
olmaz.

36
Rekombinant Dna İçin Konak Olarak Kullanılan E.coli Suşlarında, Restriksiyon
Sistemlerini Yok Etmek Önemlidir
Yabancı DNA bir E.coli konağı içine atılınca, o konak hücre içindeki restriksiyon sistemleri
buna saldırılabilir. Bu sistemlerin önemli bir özelliği; konağa giren DNA’nın akıbetinin DNA’nın
dizisine ve geçmişine bağlı olmasıdır. Buna bağlı olarak, DNA dizileri kesilebilir veya kesilmeyebilir.
DNA’nın replikasyon sonrası modifikasyonu genellikle hedef sıra içindeki adenin veya sitozinin
metilasyonu şeklindedir. DNA’nın metillenmesi, onu kendi konağının restriksiyon sistemlerine karşı
dayanıklı yaparken farklı restriksiyon sistemlerine karşı koruyamaz.
Restriksiyon sistemleri yabancı DNA tarafından istilaya karşı doğal bir savunma sağlar.
Bunun için, restriksiyon sistemi kusurlu E. coli K12 kullanmak gereklidir. Örneğin; memeli DNA’sı
bir plazmit vektör içine yapıştırılır, Eco K restriksiyon kusurlu konağa aktarılırsa gelen DNA
kesilmez; hatta Eco K nın kesebileceği modifiye edilmemiş bölgesi olsa bile kesemez. Eğer konak Eco
K açısından mutantsa ama modifikasyon yapabiliyorsa, gelen DNA kesilme yerine modifiye edilir ve
bu modifiye DNA aktif restriksiyon sistemi olan konağa aktarılsa bile artık kesilemez. Eco K1
restriksiyon sistemi hsdRMS geni tarafından kodlanır, hedef dizi modifikasyonlu (metilasyonlu)
değilse, o hedef diziyi keser. McrA, McrBC, Mrr endonükleazları özel yerlerden metillenmiş DNA’yı
keser. Bu üç endonükleaz CpC metilazı (M.SssI) ile modifiye olmuş DNA’yı keser ayrıca Mrr
endonükleaz özel dizilerdeki metiladeninli DNA’ya saldırabilir. Çoğu bakteri, bitki ve hayvandan elde
edilen DNA büyük oranda metillenmiştir ve eğer konağın restriksiyon aktivitesi yok edilmemişse
klonlama deneylerinde aktarılan DNA nın konaktan tekrar elde edilmesi çok düşük bir oranda
gerçekleşir. Saccharomyces cerevisiae ve Drosophila melanogaster den elde edilen DNA’da bir
problem yoktur, çünkü onların DNA’sındaki metilasyon çok azdır.
E.colide ki tüm restriksiyon sistemleri 14kb uzunluğundaki GÖÇ KONTROL BÖLGESİNDE
bulunur (Fig 3.4). Bazı suşlar bu genlerden birinde mutasyon taşır. Örneğin; DH1 ve DH5 suşlarının
hsdR geninde bir mutasyon vardır; bu yüzden bu suşlar EcoK1 endonükleaz bakımından kusurludur
ama hala DNA’da EcoK1 modifikasyonu yapabilirler. DP50 suşunun hsdS geninde bir mutasyon
vardır ve bu yüzden Eco K1 restriksiyon aktivitesine sahip değildirler. E.coli C gibi diğer suşlar ve
yaygın bir şekilde klonlamada kullanılan HB101 suşu, tüm mcrC-mrr bölgesinde delesyona sahiptir ve
bu nedenle tüm restriksiyon aktivitelerinden yoksundur.

Şekil 3.4 E.coli K12 suşunun göç kontrol bölgesi

37
 Bir Klonlama Deneyinin Başarısı, Kritik Olarak Kullanılan Restriksiyon Enziminin
Niteliğine Bağlıdır
Restriksiyon enzimleri birçok farklı ticari kaynaktan elde edilebilir. Enzim satın alınırken
temin edilen enzimin kalitesini göz önünde tutmak önemlidir. Yüksek kaliteli enzimler ekzonükleaz ve
endonükleazlardan tamamen aridir ve saf ürünlerin rutin aralıklarda bir nükleaz kontaminasyonuna
sahip olup olmadığının anlaşılması için testler yapılır (QC). Ekzonükleazların bulunmaması, özellikle
önemlidir. Eğer ekzonükleaz varsa, hibritleşebilecek sarkık uçları yavaş yavaş keser, bu yüzden
rekombinant ürünlerini keserek azaltır ya da yok eder. Kontamine fosfatazlar ise uçtaki fosfatları
keserek ligasyonu engellerler. Bu mesaj açıktır; ucuz restriksiyon enzimlerinin satın alınması, paranın
israfı demektir.
Tipik bir kalite kontolünün adımları şöyledir; DNA fragmentleri; test edilen her bir RE ile
kesilir. Bu fragmentler daha sonra yapıştırılır ve aynı RE ile tekrar kesilir. Eğer DNA fragmentinde
herhangi bir kayıp yoksa sorun yok demektir. Yani RE ekzonükleaz ve fosfataz içermez.

Şekil 3.5 PstI enziminin kalite kontrolü. DNA, endonükleazla kesilip, parçalar birleştirildi ve tekrar kesildi. He
iki kesimin de agaroze jel elektroforez üzerinde benzer bantlar oluşturduğuna dikkat edin.

Diğer bir QC testi mavi-beyaz renk analizidir. Burada başlangıç materyali teste tabii tutulan
enzim için üzerinde sadece bir adet kesme bölgesi bulunan E.coli lac Z genini taşıyan bir plazmittir,
kesme bölgesi lac Z geni içinde olmalıdır. Plazmit restriksiyon enzimiyle kesilir, yeniden birleştirilir
ve E.coli lac Z- suşuna aktarılır. Bu transformantlar β-galaksidazın substratı olan X-gal li ortamda
büyütülür. Eğer lacZ geni kesim ve ligasyondan sonra bozulmamış kalırsa; mavi bir koloni ortaya
çıkaracaktır. Yoksa beyaz koloniler oluşur. Beyaz koloni oluşumu enzim kalitesinde sorunun
göstergesidir.

DNA Moleküllerini Birleştirme

In vitro da DNA fragmentlerini birleştirmek için halen kullanılan üç metot vardır. Bunlardan
birincisi restriksiyon endonükleazların oluşturduğu sarkık uçları kovalent olarak birleştirmek için

38
DNA ligazın kullanılmasıdır. İkinci yol ise T4 fajı ile infekte edilmiş E.coli den elde edilen DNA ligaz
ile küt uçlu fragmentleri yapıştırmaktır. Üçüncüsü; fragmentlerin sonuna homopolimerik 3‘ tek zincir
kuyruklarını sentezlemek için deoksinükleotidiltransferaz enziminin kullanılmasıdır.

Kutu 3.2: α-komplementasyonu

β-galaktosidaz aktivitesi X-gal içeren besiyerlerde gözlemlenebilir. X-gal renksiz bir bileşiktir.
Fakat β-galaktosidaz ile kesildiğinde mavi indol türevi oluşur. Katı besiyeri üzerinde aktif galaktosidaz
ekspresyonu mavi koloni, ekspresyon olmaması da beyaz koloni oluşumuna neden olur. X-gal, β-
galaktosidaz oluşumunu indükleyemediğinden ortama IPTG eklenmelidir.
β-galaktosidazla α-komplementasyon moleküler genetikte çok kullanılan bir yöntemdir. α-
koplementasyon için başlangıç noktası lacZ geninin 11-41aa delesyonlu M15 E.coli mutantıdır. Bu
bakteride lac Z geni içerisinde 11-41aa silinmiştir ve β-galaktosidaz aktivitesi gösteremez. Mutant
enzimin aktivitesi in vitroda β-galaktosidaz’ın 3-92. aa’den oluşan ve siyonagen bromid peptidi olarak
adlandırılan peptit eklenerek düzeltilebilir. Koplementasyon in vivo da kanıtlanmıştır. Şöyle ki lacZ
geninin N terminal fragmentini taşıyan plazmitler, ΔM15 mutantına (lac Z geninin 11-41aa’leri silinmiş
hücreye) aktarıldığında β-galaktosidaz oluşumu, X-gal içeren ortamda mavi koloni oluşumuyla
kanıtlandı. Pratikte ise genel olarak plazmitler lacI geni ve lacZ geninin ilk 146 kodonunu taşır. Çünkü
genetik mühendisliğinin ilk döneminde lacZ’nin 146 kodonu kullanılmıştı, bunlar DNA
manipulasyonunda korunmuş fragmentlerdi ve günümüzde de kullanılmaya devam etmektedir.
Yaban tip β-galaktosidaz 1021aa ten oluşur ve 3.1 kb lik bir gen tarafından kodlanır. In vitroda
bu büyüklükte bir gen kolaylıkla manipule edilebilirken pratikte tüm genin kullanımının dezavantajları
vardır. Klonlama vektörleri ve insertlerin mümkün olabildiğince kısa olanları tercih edilir. α-
koplementasyon Z geninin tamamını içermeyen vektörlerle lac sisteminin avantajından
yararlanılmasını sağlar.

DNA Ligaz Enzimi, İn vitro'da DNA Moleküllerini Birleştirmenin Anahtarıdır

E.coli ve T4 fajı, DNA ligaz enzimi kodlar. E.coli veya T4 ile enfekte edilmiş E. coli
enzimleriyle katalizlenen reaksiyonlar benzer olmalarına rağmen, kofaktör ihtiyaçları bakımından
farklıdırlar. T4 enzimi ATP ye ihtiyaç duyarken E.coli enzimi NAD+ ya ihtiyaç duyar. Her iki
durumda kofaktör parçalanır ve enzim-AMP kompleksini oluşturur. Bu kompleks; (5’ fosfat ve 3’ OH
grubu bulunan) kalan kırığa bağlanır ve zincirde kovalent fosfodiester bağı yapar (Şekil 3. 6).

39
Şekil 3.6 DNA ligaz aktivitesi. Enzim-AMP kompleksi 3’-OH ve 5’-P grubu arasında oluşan kırığa bağlanır.
AMP fosfat grubuyla tepkimeye girer. –OH grubu uzaklaştırılarak yeni fosfodiester bağı oluşturulur. Böylece
kırık tamir edilir.
DNA ligaz kırıkları yapıştırır. Bu reaksiyon saflaştırılmış DNA ligaz varlığında in vitroda
gerçekleşir. DNA ligaz, Şekil 3.7 de gösterildiği gibi pek çok gen manipulasyonu prosedürü için temel
unsurdur.

Şekil 3.7:EcoR1 ile oluşturulan yapışkan uçlarda kovalent birleşme için DNA ligaz kullanımı.

Tek zincir kırığı olan DNA’da ligasyon için optimum sıcaklık 37°C’dir. Fakat bu sıcaklıkta
yapışkan uçlar arasındaki H bağları kararlı değildir. EcoRI’in oluşturduğu uçlar sadece 4 AT baz çifti
ile birbirine tutunur ve böyle yüksek sıcaklıkta tutunamazlar. Enzim miktarı ve uçla olan ilişkisindeki
uygunluk nedeniyle, yapışkan uçlarda ligasyon için optimum sıcaklığın deneysel olarak 4-15°C olduğu
bulunmuştur.
Ligasyon işlemi istenilen rekombinant oluşuncaya kadar yapılmalıdır. DNA konsantrasyonu
yükseltilerek rekombinant sayısı arttırılabilir. DNA miktarı az olan seyreltik solüsyonlarda linear
fragmentlerin uçlarının birleşerek halka oluşturması, molekül içi reaksiyonlar arttığından sık rastlanan

40
bir durumdur. İkinci olarak, alkalin fosfataz muamelesiyle 5‘-P grubu uzaklaştırılarak linear hale
getirilmiş plazmit vektör DNAsı, hem kendi üzerine katlanarak halka oluşturamaz hem de plazmit
dimeri oluşturamaz (Şekil 3.8). Bu durumda vektörün yapışması sadece fosfataz muamelesine maruz
kalmamış yabancı DNA‘nın (her birleşmede 5’ ucunda P sağlar) ilavesiyle olur. Her birleşmede bir
kırık yapışmaz fakat konak bakteriye transformasyonundan sonra hücresel tamir mekanizmaları
sağlam çift zincir oluşturur.

Şekil 3.8. Plazmit vektöre, klonlanmadan önce halka oluşumunu engellemek için alkalin fosfataz uygulanması

Yapışkan uçlu DNA fragmentlerinin DNA ligaz ile yapıştırılması, rekombinant oluşturmak
için nispeten etkili bir yöntemdir. Bu işlemdeki bir değişiklik T4 DNA ligazın küt uçlu DNA
moleküllerini birleştirme yeteneğidir (Sgaramella 1972). E.coli DNA ligaz, makromolekülerin yoğun
olduğu özel reaksiyon koşulları haricinde küt uçların birleşmesini yapamaz (Zimmerman&Pheiffer
1983). Küt uç yapıştırmanın en yararlı uygulaması fragmentlerin küt uçları ile linker moleküllerin
yapıştırılmasıdır. Bunun ilk örneği de bir veya daha fazla endonükleaz kesim bölgesi olan, kendini
tamamlayan dekamerik oligonükleotitlerin sentezlenmesidir (Scheller ve ark. 1977). Böyle bir molekül
Şekil 3.9’da gösterilmiştir. Bu molekül klonlanacak olan yabancı DNA’nın her iki ucuna
birleştirilebilir ve daha sonra yapışkan uçlar oluşturmak için restriksiyon endonükleazla muamele
edilir. Yapışkan uçlarla birleşecek olan vektör de aynı restriksiyon endonükleazla kesilmelidir.
Linkerin eklenmesiyle yabancı DNA’nın her iki ucunda restriksiyon enzimi için hedef bölgeler oluşur
ve bu, konak bakteride klonlama ve amplifikasyon sonrasında yabancı DNA’nın birleştirilmesini ve
tekrar eldesini mümkün kılar.

41
Farklı Zincirleri Birbirine Bağlamakta Kullanılan Adaptör ve Linkerler, Çift Zincir
Kısa DNA Moleküllerdir
Linkerde yapışkan uçlar oluşturmak için yabancı DNA’yı içten kesecek restriksiyon enzimi
kullanılabilir. Bu durumda yabancı DNA iki ya da daha çok alt birime klonlanacaktır. Bu problem için
bir çözüm başka restriksiyon enzimini tercih etmektir. Fakat yabancı DNA büyük ve birden fazla
restriksiyon enzim içeriyorsa uygun bir tercih yapılamayabilir. Diğer bir çözüm ise uygun metilaz ile
restriksiyon enzim bölgesinin metillenmesidir. Bunun bir örneği Şekil 6.2’de açıklanmıştır. Alternatif
olarak, genel çözüm yapışkan uca sahip adaptör moleküllerin kimyasal olarak sentezlettirilmesidir
(Wu ve ark. 1978) . Üzerinde bir yerde BamH1 kesim bölgesi bulunan küt uçlu yabancı bir DNA
düşününüz. Bu yabancı DNA, BamH1 ile kesilmiş bir vektöre klonlanacak olsun (Şekil 3.10). BamH1
adaptör molekülü 5’-P grubu içeren bir küt uç ve fosforillenmemiş BamH1 yapışkan ucuna sahiptir.
Adaptor yabancı DNA uçlarıyla birleştirilebilir. Yabancı DNA adaptöre eklendikten sonra 5’ ucu
fosforillenir ve vektörün BamH1 bölgesine birleştirilir. Eğer yabancı DNA, BamH1 içeren
rekombinantlardan tekrar elde edilebilirse iki fragment görülür. Ayrıca adaptör, yabancı DNA’nın
sağlam olarak tekrar elde edilebilmesini mümkün kılan farklı iki restriksiyon bölgesi içerecek şekilde
dizayn edilebilir. Adaptör ve linker arasındaki tek fark; adaptörün yapışkan uçlu, linkerin küt uçlu
olmasıdır. Adaptörlerin büyük çoğunluğuna ticari olarak ulaşılabilmektedir.

42
Şekil3.10: BamH1 adaptörünün kullanımı. Sentetik adaptörün yabancı DNA’ya eklenmesi.

Özel Kullanımlar İçin Tasarlanan DNA Moleküllerini Birleştirmek İçin Homopolimer

Kuyruk Takma Genel Bir Metottur.
DNA moleküllerinin birleştirilmesi için genel metot, komplementer homopolimer sekansların
annealing (bağlanma) özelliklerinin kullanımıdır. Böylece 3’ uca poli–A(adenin) kuyruk eklenen
sekanslarla T(timidin) eklenenler karıştırılıp dimerik halka oluşturmaları sağlanır. (şekil 3.11)

Şekil 3.11 İki DNA molekülüne komplementer homopolimer kuyruk eklemek için dana timusu terminal
deoksinükleotiltransferazının kullanılması

Timustan elde edilen terminal deoksinükleotit transferaz, benzeri bir polimerizasyon yapan
bir enzimdir ve ortamda tek deoksinükleotit trifosfat bulunduğunda sadece o nükleotiti DNA’ların 3’
ucuna ekleyecektir (Chang&Bollum 1971). DNA; λ fajı nükleazı ve Pst1 gibi enzimlerle muamele
edilerek sarkık 3’-OH uçları oluşturulduğunda, transferazlar için uygun hale gelir. Bunların yanında,
EcoRI ile oluşturulan yapışkan uçların uzatılmasını sağlayan koşullar da belirlenmiştir (Roychoudhury

43
ve ark 1976, Humphries ve ark. 1978). Terminal transferaz, detaylı bir şekilde incelenmiştir (Deng &
Wu 1981, Michelson & Orkin 1982).
Rekombinant molekül oluşturmada ilk örneklerinden birisi , λ DNA’sının bir parçasının
homopolimer kuyruk eklenerek SV40 viral DNA’sına eklenmesidir (Jackson ve ark.1972). Bu
deneyde her iki zincirin birleştikleri bölgede kalan boşlukların, in vitro’da, DNA polimeraz ve DNA
ligaz ile, kovalent bağlı halka yapı oluşabilmesi için tamir edilmiş olduğu bulunmuştur. Sonuç olarak
A-T veya G-C homopolimer metodu, E.coli’ye klonlanacak rekombinant plazmitlerin oluşturulması
işleminde yaygın olarak kullanıldı. Son dönemde çeşitli endonükleazlar ve diğer DNA’yı modife edici
enzimlerin eldesinin artışına paralel olarak, homopolimer kuyruk takma metodu da güncellenmektedir
ve bu yöntem hala cDNA klonlanmasında kullanılmaktadır.

Pcr İle Çoğaltılan DNA’nın Klonlanabilmesi İçin Özel Metodlar Gereklidir

Bilinen pek çok strateji, PCR ürünleriyle yapılan klonlamalarda başarıyı getirmemiştir. Bu
nedenle terminal transferaz aktivitesi olan polimerazlar kullanılır. Örneğin Taq polimeraz, tüm PCR
ürününlerinin 3’ ucuna en az 1 tane A takar. Bu ürünlerin uçları kütleştirilmeden birleşemezler.
Klenow benzeri DNA polimeraz uçtaki boşluğu doldurmak için kullanılabilir. Ayrıca Pfu DNA
polimeraz 3’ 5’ aktivitesiyle tek zincir sarkık uçları keser. Fakat PCR ürünleri kütleştirilip vektöre
klonlandığında bile istenilen sonuç elde edilmeyebilir. Bu problemin bir çözümü T/A klonlama
metodudur. Bu metotta PCR fragmentleri vektör DNA’sına tek 3’timidilat uzatmalarla birlikte
aktarılır ( şekil 3.12).

Şekil 3.12 Tek timidilat uzantısı oluşturmak için vektör DNA’nın kesilmesi. (a) Restriksiyon endonükleaz Hph1
tanıma ve kesme bölgeleri. (b) Hph1 ile kesilen vektör sırası

Bir PCR primeri, DNA ile hibritleşebilmesi için 5’ ucunda ekstra sıralar içerecek şekilde
dizayn edilmelidir. Bu ekstra sıralar 1. hibridizasyon basamağında yer almaz. Çünkü ilk
hibridizasyona primerin sadece 3’ ucu katılır. Fakat sonradan DNA fragmentlerinin çoğaltılması
işlemine katılır (şekil 3.13) Çünkü bu ekstra sıralar deneyde esneklik sağlamak için seçilebilir.
Bu prensibin yaygın uygulaması çoğaltılan ürünün her iki ucuna restriksiyon bölgelerinin
konulmasıdır. Şekil 3.13, uçlara HindIII ve EcoRI bölgelerinin eklenmesini göstermektedir.
Restriksiyon bölgesinin restriksiyon endonükleazlar tarafından kesilebilmesini garanti etmek için,
restriksiyon enzimi bölgeleri arasına ve restriksiyon bölgesi ile primerin 5’ ucu (oluşacak PCR

44
fragmentinin ucu) arasına 4 baz yerleştirilmelidir. Restriksiyon bölgelerinin eklenmesi, çoğaltılmış
DNA fragmentlerinin klonlanabilmesini kolaylaştıran bir metottur.

DNA Molekülleri, DNA Ligaz Olmadan da Birleştirilebilir

Tüm kesme ve birleştirme işlemleri için iki farklı protein gerekmektedir. Bunlar; bölge
spesifik endonükleaz ve DNA ligazlardır. Shuman 1994’te sadece DNA moleküllerini hem kesip hem
de yeniden birleştiren vaccinia DNA topoizomeraz enzimi kullanılarak rekombinant molekül
sentezlenebileceğini göstermiştir. Çift zincir DNA’nın ucuna yerleştirilen CCCTT vaccinia DNA
topoizomeraz kesim motifi, kararlı moleküllerin oluşmasını sağlar. Her iki ucunda CCCTT kesim
bölgesi bulunan linear DNA’lar topoizomerazlarla aktive edilebilir ve sonrasında plazmite aktarıla
bilir.
Heyman ve arkadaşları (1999) vaccinia topoizomerazını DNA fragmentlerini plazmitlere
aktarmak için kullandılar. DNA ligazla molekülleri birleştirmek için bir gecelik inkübasyon
gerekirken, topoizomerazla yapılan işlem 5 dakikada gerçekleşir. Bu ligazsız birleştirme metodu PCR
ürünlerinin klonlanması için uygundur. 3’-T ilaveleriyle linear hale getirilmiş vektör, topoizomerazla
aktive edilebilir. 3’-A uzantıları olan PCR ürünlerinde ise, ligasyon hızlı gerçekleşmektedir. Bu
ilaveten enzimin yüksek substrat spesifikliğinin neticesi olarak, düşük seviyede insörtsüz vektör
oluşur.

in vitro Rekombinasyonla Klonlanan DNA Çoğaltılabilir

Korunmuş bölge spesifik rekombinazlar, vaccinia topoizomerazın kestiği dizilerden daha uzun
olan spesifik dizilerde DNA’nın yeniden düzenlenmesini katalizleyen enzimlerdir. Bu bölgeler,
restriksiyon bölgelere benzer şekilde oluşturulan 5’ primerleri içeren PCR’la çoğaltılmış fragmentleri

45
kapsar (Şekil 3.13). Tüm bunlar çoğaltılan DNA nın vektöre klonlanması içindir (Şekil 3.14). Şu ana
kadar bu metodun iki versiyonu geliştirilmiştir. Orijinal versiyonunda rekombinasyonlar için λ
integraz (Int) kullanılır. Netice olarak insertlerin uçlarında orijinal kalıp molekülde bulunmayan diziler
bulunur. İkinci versiyonda, Flp rekombinaz kullanılır. Bu verisyonda, uç bölgeleri farklı dizi
içermeyen rekombinantlar oluşur.

Şekil 3.14:Bölge spesifik rekombinazla PCR ürününün klonlanması. Klonlanacak DNA, bölge spesifik
rekombinazın tanıma bölgelerini taşıyan primerle çoğaltılır. Amplifiye DNA, iki FRT bölgesi ve Flp rekombinaz
içeren bir vektörle karıştırılır (FRT:Flp rekombinaz bölgesi). Rekombinaz, amplifiye edilen DNA ile iki FRT
bölgesi arasındaki değişime aracılık eder.

Rekombinazlarla klonlamanın iki önemli uygulaması vardır; yeniden klonlama (recloning) ve

tekrar bir araya getirme (recombineering). Klonlanmış PCR ürününü başka bir vektöre klonlamaya
gereksinim duyulabilir ki rekombinasyon bölgelerinin varlığı bu işlemi kolaylaştırmaktadır (Şekil
3.15). Bu işlemin amacına uygun olarak özel Gateway vektörler dizayn edilmiştir. 50 kb den büyük
fragmentleri klonlamak için bu vektörler kullanılır. İn vitro da bu kadar büyük insert içeren vektörleri
manipule etmek zordur. Bu nedenle in vivo manipulasyon yapılır. Bu işleme recombineering denir ve
BAC, PAC gibi özel vektörlerle bağlantılı Cre ve Flp rekombinazları kullanılarak işlem
kolaylaştırılabilir.

46
 Şekil 3.15 Klonlanmış DNA’yı bir vektörden diğerine aktarırken rekombinazların kullanılması

Kutu 3.3: bölge spesifik rekombinazlar

Bölge spesifik rekombinazlar, spesifik dizileri olan iki DNA arasındaki çapraz çift zincir DNA
değişimi reaksiyonlarını katalizler. Hedef DNA sırası aynı DNA molekülü üzerinde ya da farklı
moleküllerde olabilir. Eğer farklı molekül üzerinde ise ve DNA moleküllerinden biri halkasal ise,

47
insersiyon gerçekleşir. Bunun en güzel örneği lizojenik dönemde λ fajının kromozomal insersiyonudur
(Şekil B3.1).

Şekil B3.1:Hedef bölge farklı DNA molekülleri üzerinde olduğunda rekombinaz aktivitesi sonuçları

Tanıma bölgesi aynı molekül üzerindeyse sonuç, DNA ların sıralanışlarına göre değişir. Eğer iki
bölge aynı yönde ise arada kalan bölge uzaklaştırılır. Zıt oryantasyonda olduklarında ise arada kalan
bölgenin yönü tersine döner (Şekil B3.2).

ŞekilB3.2:Hedef sekanslar aynı DNA üzerinde yer aldığında rekombinaz aktivitesi sonuçları.
Bölge spesifik rekombinazlar DNA değişimlerini iki farklı mekanizmayla katalizler; Int-Flp ve
resolvaz-invertaz mekanizmaları. Gen manipulasyonunda sadece, Int-Flp rekombinazlar kullanılır.
Yaygın kullanılanlar ise λ Int, Saccharomyces cerevisiae ‘den elde edilen Flp ve bakteriyofaj P1’in Cre
proteinidir. Cre ve Flp gibi rekombinazların rekombinasyon yaptıkları bölgeler (Şekil B3.3) benzerdir
ve hiçbir yardımcı protein olmadan da enzim aktiftir.

48
Şekil B3.3:Flp rekombinazların tanıma bölgesi (FRT). Bu bölge 13 bp lik üç simetrik elementten oluşur.
Bunlardan birisi (a) diğerlerinden (b ve c) farklı oryantasyonda yer alır. a ve b elementleri
rekombinasyon bölgesine ters 8 bp asimetrik sıra ile ayrılır. c elementi zorunlu değildir. Cre tanıma
bölgesi (lox P) FRT ile benzerdir. FRT’nin 13 bp’lik iki tekrarını birbirinden 8 bplik asimetrik bir bölge
ayırır.

Int gibi diğer rekombinazlarda ise, rekombinasyon bölgesinde bir homoloji vardır. Fakat bire
bir benzerlik ve aktivite için gerekli proteinler yoktur (Şekil B3.4). Ortak olarak hepsinde
karboksiterminal bölgeler vardır. Bu bölgelerde rekombinasyon boyunca protein-DNA kompleksini
oluşturan aktif tirosin sıraları bulunur. Rekombinasyonda korunmuş nükleotit kaybı veya kazanımı
görülmez.

Şekil B3.4:E.coli kromozomuna DNA integrasyonu. attP ve attB bölgeleri genel itibarıyla benzer değildir ve
sadece orta bölgedeki 15 baz benzerdir (küçük resim).

49
 4. BÖLÜM

PLAZMİT BİYOLOJİSİ VE BASİT PLAZMİT

VEKTÖRLER

50
Plazmit biyolojisi ve basit plazmit vektörler
Plazmitler yaygın bir şekilde klonlama aracı olarak kullanılırlar. Plazmitlerin
kullanımlarını ele almadan önce temel özelliklerinden bazılarını yeniden inceleyelim. Plazmitler,
ekstrakromozomal bir halde sürekli kalıtsal olarak aktarılan replikondurlar. Plazmitlerin çoğu çift
zincir halka DNA molekülleri olarak meydana gelirler. Eğer her iki DNA zinciri sağlam halka
molekülleriyse, kovalent kapalı halka veya CCC DNA olarak tanımlanır. Sadece bir zincir sağlam ise,
açık halka veya OC DNA olarak tanımlanır. Hücrelerden izole edildiklerinde, süpersarmal yapısına
sahip olanlar gibi, kovalent kapalı halkaların çift zincirlerindeki dönüş sayısında bir azalma vardır.
Çift zincir dönüşlerinde sağa dönüşlerde bozulma vardır. Süpersarmalın enzimatik dönüşümü, CCC
DNA ve OC DNA arasındaki ilişki Şekil 4.1’de gösterilmiştir. Farklı yapısal konfigürasyonlarından
dolayı, süpersarmal ve OC DNA agaroz jel elektroforezinde ayrılır. (Şekil 4.2 ve 4.3) Etidyum bromür
gibi interkalasyon yapan ajanların
ilavesi, süpersarmal DNA plazmitin
açılmasına neden olur. Eğer aşırı
miktarda EB ilave edilirse, plazmit ters
yönde süpersarmal olacaktır. Bu
gerçek, plazmit DNA’nın
izolasyonunda kullanılır.
Plazmitlerin hepsi halkasal
molekül değildirler. Lineer plazmitler
Streptomyces ve Borrelia burgdarferi
gibi çeşitli bakterilerde bulunmuştur.
Nükleaz parçalanmasını önlemek için,
linear plazmitlerin uçlarının
korunmaya ihtiyacı vardır ve iki genel
mekanizma ile korunurlar; ya, terminal
DNA firkete yapılarında sekans sonu
tekrar (terminal tekrarlar) edilir.
(Borrelia) ya da uçlar bir proteinin
kovalent olarak bağlanmasıyla
korunur. (Streptomyces) Linear plazmitlerin daha fazla detayları için Hinnebusch ve Tilly’e
başvurabilir.

51
 Plazmitler, prokaryotlarda yaygın olarak bulunur. 1x106 daltondan 200x106 daltona kadar
çeşitli boyutlardadır. Genel olarak ihmal edilebilir. Plazmitlerin bulundukları konaklara ekledikleri
fenotiplerin bazıları Tablo 4.1’ de listelenmiştir.

52
Tablo 4.1: Plazmitlerin bulundukları konaklara ekledikleri fenotipik özelliklerin bazıları
Antibiyotik dirençliliği Ağır metal direnci
Antibiyotik üretimi Bakteriyosin üretimi
Aromatik bileşiklerin degredasyonu Bitki tümörlerini indükleme
Hemolizin üretimi Hidrojen sülfid üretimi
Şeker fermantasyonu Konak kontrollü restriksiyon ve modifikasyon
Enterotoksin üretimi

Cryptic plazmitler, fenotipik özellikleri bilinmeyen plazmitlerdir. Plazmitler tra genleri

denen transfer genlerini taşıyıp taşımamalarına göre konjugatif ve non-konjugatif olarak iki büyük
sınıfa ayrılabilirler. tra genleri; bakteriyal konjugasyonun oluşmasını sağlayan genlerdir. Plazmitler
ayrıca hücre başı kopya sayısının az olmasına veya çok sayıda olmasına göre sınıflandırılabilirler.
Genellikle konjugatif plazmitler, diğerlerine göre yüksek molekül ağırlıklıdır ve kromozom başına 1
ila 3 kopya içerir. Non konjugatif plazmitler ise düşük molekül ağırlıklıdır ve kromozom başına çok
sayıda kopya olarak bulunurlar. R6K istisna bir konjugatif plazmittir ve moleküler ağırlığı 25x106
daltondur ve bir relaxed plazmit olarak muhafaza edilir.

Plazmitlerin konak seçiciliği, kodladıkları replikasyon proteinleri tarafından belirlenir:

Plazmitler kendi replikasyonları için gerekli proteinlerin sadece birkaçını kodlarlar ve pek çok
durumda da bu proteinlerin sadece birini kodlarlar. Replikasyon için gerekli diğer bütün proteinler
DNA polimeraz, DNA ligaz, helikazlar vs. konak hücre tarafından sağlanır. Plazmit tarafından
kodlanan bu replikasyon proteinleri replikasyonun gerçekleştiği ori (replikasyon orjini) bölgesine çok
yakın yerleştirilmiştir. Bu nedenle ori bölgesinin etrafında çok küçük bir bölge replikasyon için
gereklidir. Plazmitin diğer bölgeleri silinebilir ve yabancı diziler plazmite eklenebilir ve replikasyon
yine de gerçekleşir. Plazmitlerin bu özelliği çok yönlü klonlama vektörünün yapımını çok
kolaylaştırmıştır.

53
 Bir plazmitin konak seçiciliğine ori bölgesiyle karar verilir. Plazmit Col E1’den türevlenen
plazmitlerin ori bölgeleri konak seçiciliğinde bir sınırlamaya sahiptir: Bunlar sadece E.coli,
Salmonella vs. gibi enterik bakterilerde replike edebilirler. RF4 ve RSF1010’un da dâhil olduğu diğer
promiscuous (çok konaklı) plazmitler geniş bir konak spektrumuna sahiptirler. Konjugasyonla
kolaylıkla aktarılabilen RP4 tipi plazmitleri G(-) bakterilerin çoğunda replike olur. Bu tip promiscuous
plazmitler, klonlanmış DNA molekülünün genetik bilgisinin birçok konağa kolayca transfer
edilmesine imkân tanır. RSF1010 gibi plazmitler konjugatif değildir. Fakat kalıcı olarak muhafaza
edildikleri G(-) ve G(+) bakterilerin geniş bir çeşitliliğine aktarılabilirler. Ayrıca Staphylococcus
aureus’tan izole edilen plazmitlerin çoğu geniş bir konak spektrumuna sahiptir. Bunlar pek çok G(+)
bakterilerde replike edilebilirler. Geniş konak spekrumu olan plazmitlerin çoğu replikasyon için
gerekli olan proteinlerin hepsini olmasa da çoğunu kodlarlar. Bu genleri ekspres edebilirler. Bunlar,
çeşitli bakteri aileleri tarafından tanınabilmeleri için promotorlar ve bağlanma bölgeleri içermelidirler.

Şekil 4.4. Plazmidlerden türetilen Col E1’in replikasyonunun düzenlenmesi. İlk replikasyondan önce RNA II,
RNaz H ile muamele edilmelidir. “Origin” RNA primeri ve DNA arasındaki geçiş noktasını gösterir. Çoğu
zaman RNA I, RNA II’ye bağlanır ve işlemi engeller. Böylelikle kopya sayısını düzenler. PRNAI ve PRNA
IIsırasıyla RNA I ve RNA II transkripsiyonları için promotordurlar. RNA I soluk mor ve RNA II koyu mor renk
alır. Rop protein dimeri RNA I ve RNA II’nin başlangıçtaki eşleşmesini artırır.
birçok konağa kolayca transfer edilmesine olanak sağlar.

Bir hücrede bir plazmitin kopya sayısı diğer plazmitden farklıdır ve bu farklılık
replikasyonu kontrol eden düzenleme mekanizmaları tarafından belirlenir:

54
 Bir plazmitin kopya sayısı plazmit replikasyonunun başlangıcının düzenlenmesiyle
belirlenir. Başlangıcı kontrol eden 2 ana mekanizma şöyle tanımlanır:
Antisens RNA düzenlemesi
Gerekli proteinlerin iteron denen tekrar dizilerine bağlanmasıyla yapılan
düzenleme.
Halihazırda kullanılan klonlama vektörlerinin çoğu Col E1 plazmitinden türevlenen bir ori
bölgesi taşır ve kopya sayısı kontrolü antisens RNA aracılığıyla yapılır. Bu tip plazmitte DNA
replikasyonu için gerekli primer, RNA II diye bilinen 555 bazlık replikasyon orijininde bir
RNA-DNA hibriti oluşturan bir ribonükleotitdir. RNA II, RNase H ile serbest bir 3’ OH
grubu bırakacak şekilde kesilmişse ancak o zaman bir primer olarak hareket edebilir. RNA II
bu şekilde işlem görmedikçe bir primer olarak fonksiyon görmeyecek ve replikasyon
gerçekleşmeyecektir. Ayrıca replikasyon kontrolüne RNA I olarak bilinen 108 bazlık küçük
RNA molekülü de aracılık eder. Bu RNA I, RNA II gibi DNA’nın aynı bölgesinden ama
komplementer zinciri tarafından kodlanır. Böylece RNA I ve RNA II birbirlerinin
komplementeridir ve çift zincirli RNA heliks formunu oluşturmak için hibridize olabilir,
dubleks oluşturur. Bu dubleks yapı RNase H ile RNA II’nin işlenmesini engeller ve böylece
replikasyon gerçekleşmez (Şekil 4.4). RNA I plazmit tarafından kodlandığı için plazmitin
kopya sayısı fazla olduğunda RNA I de fazla sayıda sentezlenecektir. Böylece konak hücre
büyürken ve bölünürken RNA I’in konsantrasyonu düşecek ve plazmit tekrar replike olmaya
başlayacaktır.
Kopya sayısının korunmasına, RNA I’e ek olarak Rop diye bilinen, plazmit tarafından
kodlanan bir protein de yardım eder. Bir dimer formu olan bu Rop proteini RNA I ve RNA
II’nin eşleşmesini artırır. Primer işlendiği için RNA II, RNA I’in nispeten düşük
konsantrasyonlarında bile inhibe edilebilir (Rop proteini primerin uçlardan kesilmesine engel
olur). ROP geninin delesyonu ya da RNA I’deki mutasyonlar sonucunda kopya sayısında artış
görülür.
pSC101 plazmiti ve geniş konak seçiciliği olan plazmitlerin çoğunun ori bölgeleri 17
ile 22 bp uzunluğundaki iteron sıralarının 3’ten 7 taneye kadar kopyasını taşırlar. pSC101
plazmitinin ori bölgesini yakın bir yerde Rep A proteinini kodlayan repA diye bilinen bir gen
vardır. Replikasyon için gerekli, sadece kodlanmış plazmit proteini olan bu Rep A proteini
iterona bağlanır ve DNA sentezini başlatır (Şekil 4.5).
Kopya sayısı kontrolü iki önemli mekanizmayla gösterilir. İlkinde, Rep A kendi
promotor bölgesine bağlanarak kendi gen transkripsiyonunu bloklar (tıkayarak) ve kendi
sentezini kendi baskılar. Eğer kopya sayısı yüksekse Rep A’nın sentezi baskılanacaktır. Hücre

55
bölünmesinden sonra ise Rep A’nın kopya sayısı ve konsantrasyonu düşeceğinden
replikasyon yeniden başlatılacaktır. Rep A proteinindeki mutasyonlar kopya sayısının
artmasına sebep olabilir. İkinci olarak Rep A iki plazmitin iteron bölgelerine bağlanarak bu
iki plazmiti birbirine bağlayabilir. Böylece onları replikasyonun başlangıcında engellemiş
olur. Handcuffing (kelepçeleme) olarak bilinen bu mekanizmaya göre iteron plazmitlerinin
replikasyonu hem Rep A proteininin konsantrasyonuna hem de plazmitlerin kendi
konsantrasyonlarına bağlı olacaktır.

Şekil 4.5. pSC101, R1, R2 ve

R3’ün ori bölgesi, Rep A’nın
iki plazmidi kelepçelemek
için bağlandığı üç iteron
sıralarıdır (R3 için
CAAAGGTCTAGCAGCAG
AATTTACAGA). RepA IRI
ve IR2 ters tekrar dizilerine
bağlanarak kendi sentezini
kendi düzenler. Ayrıca konak
protein DnaA için bağlanma
bölgeleri ve kısımlara
ayrılmış par alanının yeri
gösterildi.

Hücrede plazmitlerin kararlı bir şekilde muhafaza edilmesi özel bir paylaşım
mekanizmasını gerektirir
Kusurlu paylaşımdan dolayı plazmitlerin kaybı, bölünmeyle ilgili kararsızlık olarak
adlandırılır. Tabi olarak mevcut olan plazmitler kararlılıklarını sürdürürler. Çünkü onlar her hücre
bölünmesinde kararlılığı sağlayarak ortaya çıkan bir paylaşım fonksiyonu yani par bölgesi içerirler.
Düşük kopyalı plazmitlerin kararlılığı için bu par bölgesi zorunludur. Yüksek kopyalı plazmitlerden
olan Col E1’de par bölgesi içerir, fakat bu par bölgesi birçok Col E1’den elde edilen pBR322 koloni
vektörlerden silinip çıkartılırlar. pBR322 gibi vektörlerin kopya sayısı genellikle yüksek olmasına
rağmen, sınırlı besin ortamı ya da diğer stres şartları plazmitsiz hücrelerin oluşumuna sebep olabilir.
pSC101gibi bir plazmitteki par bölgesi pBR322’ye klonlanabilir, sonuç olarak plazmit stabilize edilir.
Paylaşım mekanizmasında DNA süpersarmallığı da yer alır. par lokusu olmayan pSC101
türevleri, yaban tip pSC101ile karşılaştırıldığında, süpersarmallık yoğunluğunda bir azalma görülür.
Paylaşım kusurlu pSC101 mutantları ve benzeri mutasyonul akraba olmayan plazmitler, negatif
süpersarmallığı arttıran top A mutasyonlu E. coli hücrelerinde kararlı hale getirilebilir. Aksine, DNA
giraz inhibitörleri ve DNA girazdaki mutasyonlar, par kusurlu pSC101 türevlerinin kayıp oranını
arttırır.

56
 Plazmit kararsızlığı, plazmitin multimerik formlarının oluşumundan dolayı da artabilir.
Plazmitlerin kopya sayısını kontrol eden mekanizma, her bakteri sabit sayıda plazmit orijini
oluşmasını da garanti eder. Multimerik plazmitler içeren hücreler aynı plazmit orjin sayısına sahiptir
fakat plazmit sayısı daha azdır. Paylaştırma fonksiyonu bulunmuyorsa, az sayıdaki plazmit,
paylaşmada kararsızlığıa sebep olur. Bu multimerik formlar Col E1’de görülmez. Çünkü Col E1,
multimerlerin monomerlere hızlıca ayrıştığı doğal bir mekanizmaya sahiptir. Col E1 oldukça yüksek
bir rekombinejenik (cer) bölge içerir. Eğer bu cer bölgesi, bir plazmitte birden fazla ise, multimerde
olduğu gibi, konak hücrenin Xer proteini, rekombinasyonu teşvik eder ve süratle monomerleri yeniden
oluşturur.

Aynı replikasyon ve paylaştırma sistemlerine sahip plazmitler aynı hücrede muhafaza

edilemezler
İki farklı plazmitin aynı hücre içinde birlikte bulunmamasına plazmit uyumsuzluğu denir. Bu
uyumsuzluk terimi özellikle ikinci plazmitin girişi gerçekleştiğinde (varolduğunda) kullanılır, bu
durmda DNA restriksiyon sistemi kullanılmamış ise bu terim kullanılır. Karşılıklı uyumsuz plazmit
gruplar, aynı uyumsuzluk grubu altında yer alınırlar. E. coli’de 30’un üzerinde, S. aureus plazmitleri
içinde 13 tane uyuşmazlık gurubu tespit edilmiştir. Plazmitler aynı replikasyon kontrol mekanizmasına
sahip iseler uyuşmazlar. Antisens kopya sayısı kontrollü ile plazmitlerin RNAI/ RNAII bölgelerindeki
dizilerin değişimi ile plazmitlerin uyumsuzluk gruplarını değiştirmek mümkündür. Alternatif olarak,
bu plazmitler, aynı par bölgesini paylaşıyorlarsa uyumsuz olacaktırlar.

Plazmit DNA’sının saflaştırılması

Plazmit klonlanmasının açık bir şartı plazmit DNA‘sının saflaştırılmasıdır. Plazmit
DNA’larının birçoğu günümüzde rutin olarak saflaştırılmasına rağmen, kullanılan metotlar problemsiz
değildir. Şüphesiz ki en aldatıcı safha konak hücrenin parçalanmasıdır. Hücrelerin hem tam olarak
parçalanmaması hem de total dissolutionun olmaması; plazmit DNA’sının izolasyonunu çok azaltır.
En ideal durum plazmit DNA’sını kromozomal DNA ile çok fazla kontamine olmadan hücreden dışarı
çıkacak şekilde kırmaktır. Parçalanmanın yavaşça olması şartıyla, serbest haldeki kromozomal
DNA’nın çoğu çok yüksek moleküler ağırlıkta olacak ve yüksek devirli santrifüj ile çöktürülerek
hücre pelletinden uzaklaştırılabilecektir. Böylece temiz bir lizat oluşturulur. E. coli’den ve
bakterilerden memnun edici temiz lizatların üretimi özellikle büyük plazmitler izole edilecekse; şans,
sabır ve beceri kombinasyonu gereklidir.
Temiz lizatlardan saf plazmit DNA’sı izole etmek için birçok metod kullanılmaktadır. Fakat
burada yalnızca iki tanesi tanımlanacaktır. Bunlardan birincisi klasik metod olan Vinograd’dır. Bu
metod EtBr ihtiva eden CsCl solüsyonundaki temiz lizatın izopycnic santrifüjunu içerir. EtBr DNA
baz çiftleri arasına interkalar olarak bağlanır ve böylece DNA’nın açılmasına neden olur. Plazmit gibi

57
CCC DNA molekülünün serbest uçları yoktur ve sadece belli bir dereceye kadar açılırlar. Bu nedenle
EtBr bağlanması sınırlıdır. Lineer DNA, kovalent halkalara oranla daha fazla EtBr bağlar. Çünkü
DNA-EtBr kopleksinin yoğunluğu, fazla EtBr bağlandığında azalır. Daha fazla EtBr, kovalent
halkadan daha çok lineer moleküle bağlanabiliği için kovalent halka, EtBr’ün doyrulmuş
konsantrasyonlarında daha yüksek yoğunluğa sahiptir. Böylece kovalent halkalar lineer kromozomal
DNA’dan ayrılır.

Şekil.4.6 Col E1 KanR plazmid DNA’sının bir CsCl- EtBr

gradientinde isopynic santrifujla saflaştırılması

Bu günlerde plazmidlerin alınması ve saflaştırılmasında en popüler metot Birnboim ve

Doly’dir.. Bu metot dar bir pH aralığında lineer DNA’ların denaturasyonları için kullanılır. Fakat
denaturasyon, kapalı kovalent DNA’larda olmaz. Plazmit içeren hücreler lizozimle muamele
edildiklerinde hücre duvarı zayıflar. Daha sonra SDS ve sodyum hidroksitle birlikte parçalanır. Fakat
yüksek ağırlıklı molekül formlarındaki kromozomal DNA kısımları denatüre olur. Asidik sodyum
asetat ile nötralizasyonunda kromozomal DNA renatüre edilir ve çözünmeyen kümeler oluşur. Aynı
zamanda yüksek konsantrasyondaki sodyum asetat, SDS-protein kompleksinin ve RNA moleküllerinin
çökmesine neden olur. Alkalin denaturasyon basamağının dikkatlice kontrolü sağlandığında,
solusyondaki kontamine olmuş makromoleküller çökerken, CCC plazmit DNA molekülleri
solusyonda kalmayı sürdürecektir. Bu çöken maddeler santrifujle uzaklaştırılır ve plazmit etanol ile
hızlıca konsantre edilir. Eğe gerekirse plazmit DNA’sı jel filtrasyonu ile daha fazla saflaştırılabilir.
Bir çok firma plazmit DNA’sının saflığını arttırmak için kitler geliştirmişlerdir. Onların çoğu
alkalin lizisin avantajlarından faydalanır ve temizlenen lizatın başlangıç noktalarına sahiptirler. Bu
kitlerin çoğu chaotropic ajan mevcudiyetinde plazmit DNA’ya iyon değişimi için seçici olarak
bağlanırlar. Saflaştırılmış plazmit DNA’sı küçük hacimlerde yıkanıp ayrıldıktan sonra kontaminantlar
da uzaklaştırılmış olur. Guanidinium izotiosiyanat ya da herhangi bir çözücü kalıntısı kalırsa, DNA
kontamine olur ve bu kalıntılar PCR’da ve diğer enzim reaksyonlarında inhibe edici olabilir. Bu

58
problem Charge Switch™ teknolojisi ile giderilebilir. Bu teknoloji pH’ya bağımlı, iyon anahtarları
olarak hareket eden materyalleri içermektedir. Düşük pH’da bu materyaller pozitif yüklüdür ve
DNA’ya seçici olarak bağlanırlar. pH yükseldiğinde materyaller yükünü kaybeder ve DNA diğer tüm
ajanlardan ayrılır.
Plazmitlerin izolasyonunun verimliği birkaç faktör tarafından etkilenir. Bunların ilki hücre
parçalandığı anda hücredeki kopya sayısıdır. Kopya sayısını kontrol eden sistemler önceden
tanımlanmıştır fakat verime etki eden faktörler yalnızca bunlar değildir. Kopya sayısı aynı zamanda
büyüme besiyerinden, büyüme safhalarından ve konak hücrenin genotipinden de etkilenir. İkinci ve en
önemli faktör temiz lizatın alınmasına dikkat edilmesi gereken adımdır. Sonuç olarak; wild-tip end A
genin konak hücresindeki varlığı plazmitin yenilenmesini etkileyebilir. End A genin ürünü
endonukleaz 1. substrastı çift sarmallı DNA olan periplazmik proteindir. endonukleaz 1 ‘nin
fonksiyonu tam anlaşılamamıştır. endA mutasyonlu suşların arttırılmış plazmit kararlılığı ve yüksek
plazmit veriminden başka, belirgin, ayırtedici bir fenotipi yoktur. taşıyan türlerin geliştirilen
kararlılıktan daha açık fenotipi yoktur ve onlardan plazmit ürünü elde edilir.
Çoğu klonlama vektörleri, düşük moleküler ağırlıkta olmasına rağmen, bazen çok büyük
konjugatif plazmitleir kullanılması gerekli olabilir. Bu yüksek moleküler ağırlıklı plazmitler,
tanımladığmız metotlarla izole edilebilir olmalarına rağmen, elde edilecek plazmit miktaları genellikle
düşüktür. Ya bunların büyük olmasından dolayı, hücrelerden salınımı azdır ya da fiziksel yıkım
basamakları nedeniyle oluşan çeşitli zorlamalardan dolayı, kırılabilirler. Birkaç alternatif yöntem
tanımlandıki bunların çoğu Eckhardt’ın çeşitlendirilmesiydi. Bakteri fikol ve lizozim karışımında
tutuldu ve hücre duvarı zayıflatıldı. Bu örnekler sonra agaroz jel’e konuldu ki orada hücreler deterjan
ilaveleri aracılıyla parçalandı. Plazmitler elektroforez sonucu agaroz jelden çıkartılıp alınır. Agaroz jel
düşük sıcaklıkta erir ve jelden plazmitin ekstre edilmesini kolaylaştırır,.

İyi plazmit vektörlerinde bulunması gerekli özellikler

İdeal klonlama aygıtının aşağıda verilen üç özelliğe sahip olur
• düşük moleküler ağırlıklı olması
• konak hücrelerde kolaylıkla ayırt edilebilir bir karakterinin olması
• tercihen plazmitteki gen veya genlerin içinde, birçok restirksiyon enziminin sadece birtek
kesme noktasının bulunması
Vektörün düşük moleküler ağırlıklı olmasının birçok avantajı vardır. Bunlardan birincisi; plazmit ile
uğraşmak çok kolaydır. Mesela kırılmaya karşı dirençlidir ve konaktan kolaylıkla saflaştırılabilir.
İkinci olarak, düşük moleküler ağırlıklı plazmitler genellikle çok kopyalıdırlar ve bu sadece
izolasyonlarını kolaylaştırmaz aynı zamanda üzerlerine klonlanan genlerin dozajlarını da etkiler. Son
olarak, düşük moleküler ağırlıklı vektörlerde bir restiriksiyon enzimi için birden fazla kesim bölgesi
bulunma ihtimalinin az olmasıdır.

59
 Bir yabancı DNA parçası bir vektöre insört edildikten sonra, oluşan kimerik moleküller uygun
alıcı içine transforme edilmelidir. Transformasyonunun yeterliliği düşük olmasından dolayı
kimeriklerin (rekombinantların) kolaylıkla ayırtedilebilir fenotiplere sahip olması gereklidir.
Genellikle bu antibiyotiğe direnç veya vektörün taşıdığı başka bir gen dolayısıyla ya da insert edilen
DNA‘nın da bu özelliği olabilir.
Klonlamanın ilk basamaklarından birinde vektör DNA kesilir ve benzer endonükleazla ya da
aynı uçla üretilen bir DNA fragmenti bu vektöre insert edilir. Eğer vektörün endonükleaz için birden
fazla bölgesi varsa birden fazla fragment üretilecektir. Kesilen DNA’nın iki örneği sonradan
karıştırıldığında ve yapıştırıldığında, oluşan kimeraların bazısında muhtemelen vektör
fragmentlerinden biri eksik olacaktır.
Endonükleaz bölgesi bir gen içinde bulunuyorsa, restriksiyon enzimi ile kesildiğinde bu genin
etkisini yitirdiği anlaşılacak ve bu şekilde kendi kendine yapışmış bir vektör ile kimera vektör
birbirinden ayrılabilecektir. Vektör veya insört, homopolimer kuyruklama metodu ile klonlanmış ise
veya insert belirgin bir fenotip meydana getiriyorsa, kolaylıkla belirlenebilir insersiyonal inaktivasyon
yapmak mecburi değildir.

Kutu 4:1 Seçilebilir belirteçler ve bakterial vektörler ile kullanılan reporter genler;
Klonlama vektöründe markırların mantıklı seçimi rekombinant klonların analizini ve seçimini kolaylaştırabilir.
Herhangi bir klonlama yönteminde anahtar basamak, istenilen rekombinant plazmiti taşıyan transformantların
seçimidir. Transformasyonun verimliliği düşük olmasından dolayı, transforme edilen nadir hücrelerin pozitif
seçimi gerekli olmaktadır. En yaygın seçilebilir markırlar; ampicilin, kloromfenikol, tetrasiklin, streptomisin ve
kinomisin gibi antibiyotiklere dirençliliktir. Pozitif seçimin diğer bir tipi okzotrofluğu ortadan kaldırmaktır.
örneğin; eğer his B+ geni vektöre klonlanırsa, o zaman transformantlar histidinsiz besiyerinde büyür ve his B
okzotrofu hücrelerde rekombinantların seçimi kolay olur. supE (glnV olarak bilinir.) ve supF (TyrT olarak bilinir)
genler konak hücre vektörünün temel genlerinde amber (UAG) mutasyonları yok eden tRNA molekülleri
kodlar. İnaktivasyonu pozitif olarak seçilebilen başka markırlar da vardır. Bunlardan ikisi;
sacB =sacB geni levansukrozu kodlar ve onun aktivitesi % 7 ‘lik sukroz içeren besiyeride büyüyen hücreleri
öldürür.
ccdB= Konak hücreler DNA giraz (gyrA) geni açısından mutant değillerse, ccdB geni konak hücreler için
öldürücüdür.
Reportır genler; petri üzerinde büyüyen genlerin fenotipik olarak ayırabilen özellik sağlar veya gen
expresyon oranını ölçmede kullanılır. Rekombinantların analizi sırasında en çok kullanılan reportır gen β-
galaktozidazı kodlayan lacZ genidir. β-galakzidaz aktivitesinin varlığı veya yokluğu kromogenik substrat X gal ‘ı
içeren besiyeri üzerinde büyüyen hücreler tarafından kolaylıkla bulunabilir.
Aktivitesi aynı yolla belirlenebilen diğer bir gen β-glukoronidazı kodlayan gus A genidir.
Bu enzim mavi pigmenti açığa çıkarmak için MUG ‘u keser.

60
pBR322, belli bir amaca yönelik olarak yapılmış ve yaygın olarak kullanılabilen vektörlere ilk
örneklerden biridir
İlk klonlama deneylerinde, klonlama vektörleri ColE1 ve pSC101 gibi doğal plazmitler
kullanıldı. Bu plazmitler küçüktür ve yaygın restriksiyon endonükleazlar için tek bir bölgeye sahip
olmasına karşın, seçici transformatlar için sınırlı genetik markerları vardır. Bu nedenden dolayı, in
vitro da superior klonlama vektörlerinin yapımına büyük emek sarfedildi. Bu amaçla yapılan
vektörlerden kullanımı en basit ve en yaygın olan pBR322 dir. Plazmit pBR32, pMB1’in replikasyon
elementlerini içeren Col E-1 benzeri kombine bir plazmittir. Sırasıyla RSF2124 ve pSC101 ‘in ApR ve
TcR genlerini içerir. pBR322 ‘nin orjini ve onun progenitörü pBR313’tür.

Şekil 4.7 Plasmid pBR322 nin orjinleri. (a) RS72124 ve PMB1,PSC101 arasındaki sınırlar. sayılar eşsiz
EcoRI bölgelerindeki birleşme pozisyonlarını gösteriyor.(b)plasmid PBR322, R7268 nin moleküler
orjinleri 1963 de londurada izole edilmişti. ve R1 sonra yeniden isimlendirilmiştir.1,A varyasyonda
eş transfer için deprese edilmiş R1drd19 izole edildi. bu plasmidden Tn3, transposan ApR pMB3.3
den Pmb1 transpose edildi. bu plasmid küçük plasmidin şeklini yeniden düzenleyecek EcoRI
tarafından büyüklüğü azaltılır. Pmb8, sadece kolsişin immuniteyi taşır.EcoRI eşsiz EcoRI bölgesinde
pMBS ile birleşir.sonuç olarak chimeric molekuller Pmb9 ürünlerini aktive edecek EcoRI tarafından
yeniden düzenlenir.R1drd19 in Tn3 ‘ü Psf2124 şekilllendirecek colE1 transpose edecektir.Tn3
elementi pbr312 ‘i şekillendirecek pmb9 ‘u transpose eder.

Plazmit pBR322'nin baz dizisi tamamen belirlenmiştir. Yayınlanan orjinal sekans 4362 bp
uzunluğundadır.(Stutcliffie 1979). Baz dizisindeki sıfır (0) pozisyonunun EcoR1 tanıma
sekansının(GAATTC) A ve T bazları arasında olduğu kabul edilmiştir. Sekans, pozisyon 526 daki
ekstra CG bazının hesaba katılmasıyla yeniden düzenlenmiştir Böylece plazmitin büyüklüğü 4363
bp'ne çıkmıştır. Watson daha sonra yeniden düzenlemiştir.1893 ve 1915 dizilerindeki baz çiftlerinin
elimine edilmesiyle 4361 bp olduğuna karar vermiştir. pBR322 DNA’sının en kullanışlı görünümü,
restriksiyon bölgeleri bakımından karakterize edilmiş halidir. Böylece her fragmentin tam uzunluğu
hesaplanabilir. Bu fragmentler plazmit DNA’sında diğer büyüklükleri belli olmayan fragmentler için

61
DNA markerı olarak kullanılabilir.
pBR322 genomu üzerinde tek kesim bölgesine sahip 40'tan fazla enzim vardır. Bu enzimlerin
11’inin hedef bölgeleri tetraciklin dirençlilik geni içindedir (TcR) ve genin promotoru içinde iki tane
daha kesme bölgesi vardır (Cla1 ve HindIII). Ampisilin dirençlilik geni içinde 6 enzim için tek kesim
bölgesi vardır. Bu nedenle, pBR322 nin bu 19 enzimden herhangi biriyle klonlanması, ApR ya da TcR
markerlarının insertional inaktivasyonuna neden olur. Ancak diğer tek kesim bölgelerine klonlama
kolay rekombinant seçimine izin vermez. Çünkü diğer bölgelerin kesilmesi antibiyotik direnç genlerini
inaktive etmez.
Bundan sonraki manipulasyon in vitro’da olur, plazmitler E. coli hücrelerine transform edilir.
İnsersiyonlar TcR geni içerisine yapılırsa, rekombinant vektörlerin kendi üzerine yapışmış vektörlerden
ayırımı kolay olur çünkü kendi kendine yapışmış vektörler hem ApR hem de TcR dirençlidirler fakat
rekombinat vektörler ise sadece ApR dirençlidirler ve tetrasikline duyarlıdılar. Pratikte transformantlar
Ap dirençliliği ile seçilirler ve daha sonra TcS'leri tanımlamak için, Tc- içeren ortam üzerinde replica-
plating yapılır. ApR geni içerisinde insersiyon içeren türevler böylelikle kolayca seçilebilirler.
Tanımlama, ApR hücreleri tarafından üretilen β laktamaz'ın yeteneğine bağlıdır, ApR hücreleri
penisilini penilioik aside dönüştürür. Transformantlar çözünebilir nişasta ve Tc içeren zengin ortamlar
üzerinde seçilebilir. Kolonilerin olduğu petriye, iyodin ve penisilin indikatör solusyonu dökülünce, β
laktamaz üreten koloniler indikatör solusyonun rengini açarken, ApS koloniler bunu yapmaz.
ApR geni içindeki pstI bölgesi özellikle yararlıdır, çünkü kesimde oluşan 3' tetranücleotit
uzantılar terminal transferazlar için ideal subsrattırlar. Bu nedenle, bu bölge homopolymer tailing
metoduyla klonlama için mükemmel bir bölgedir. Eğer oligo(dG-dC)kuyruğu kullanılırsa, PstI bölgesi
yeniden üretilir ve insert bu enzimle kesilebilir.
Plazmit pBR322 yaygın bir biçimde klonlama aracı olarak kullanılır. Buna ilaveten
prokaryotik transkripsiyon ve translasyonu çalışmaları için kullanılan model sistemleri kullanmada da
yaygın biçimde kullanılır. Bunun yanı sıra DNA konformasyonundaki topolojik değişimlerin etkisini
araştırmada da kullanılır. pBR322’nin popularitesi yapı ve fonksiyonlarındaki bilginin
kullanılabilirliğinin sonucudur. Yapısal özellikler hakkında daha fazla bilgi almak isteyenler Balbas
et al.(1986)’ya başvurabilirler.

62
 Plazmit

pBR322’nin vektör olarak kullanılmasına örnek: promotor taşıyan DNA

fragmentlerinin izolasyonu
pBR322’nin HindIII bölgesine klonlama işlemi genellikle tetrasiklin dirençliliğinin kaybıyla
sonuçlanır. Ancak bazı rekombinantlarda, TcR’ler direnci muhafaza edilebilir ya da arttırılabilir. Bu
nedenle HindIII bölgesi kodlama sekansından daha çok promotor dizisi içindedir. İnsertional
inaktivasyon’un olup olamayacağı TcR geni için transkripsiyon başlatma yeteneğine sahip promotor
benzeri bir sıra içeren DNA’nın klonlanmış olup olmadığına bağlıdır. Widera et al. (1978) bu tekniği
fragment içeren promotorları araştırmada kullanmıştır.
E.coli promotorları içinde 4 yapısal alan tanımlanabilir. Bunlar:
*pozisyon 1; RNA sentezinin başladığı, başlangıç pürin nükleotiti
*pozisyon(-6) den (-12)’ye kadar pribnow kutusu
*-35 baz çifti etrafındaki bölge.
*-12 ve -35 baz çiftleri arasındaki dizin

63
 HindIII bölgesi, Pribnow kutusu içinde olmasına rağmen, kutu yabancı DNA’nın
insersiyonuyla yeniden oluşturulur. Bu yüzden insersiyonal aktivasyon olduğu zaman, -13’ten -40’a
kadar olan bölgenin modifiye olmuş olan bölge olması beklenir.

Geliştirilmiş vektörlerin birçoğu pBR322’den türetilmiştir

Yıllardır, özel amaçlı klonlamaları yapabilmek için pBR322’nin çok farklı türevleri
yapılmıştır. Bu plazmitlerin bazılarının özellikleri; Balbas ve arkadaşları tarafından derlenip, bir araya
getirilmiştir.
pBR322’nin geliştirilmesi üzerine yapılan ilk çalışmaların çoğu, ilave tek restriksiyon
sitelerinin ve seçilebilir markırların yerleştirilmesi üzerine yoğunlaşmıştır. Örneğin; pBR325,
Kloromfenikol’a ilave olarak Amfisilin ve Tetrasikline karşı direnç gösterir ve CmR geni içerisinde tek
bir EcoRI bölgesine sahiptir. Başlangıç olarak, her bir yeni vektör, pBR322’nin kendi üretim
basamaklarında kullanılan adımlara homolog adımlarla sentez edilmiştir. Daha sonra, pUC vektör
örneğinde olduğu gibi, daha gelişmiş vektörlerin inşası polilinkir veya çoklu klonlama bölgelerinin
(MCS) kullanılması ile basitleştirildi. MCS, pek çok farklı restriksiyon endonukleaz bölgesini taşıyan
kısa bir DNA sırasıdır. (pUC19 örneğinde olduğu gibi, bu sıra 2.8 kb’dır). MCS, klonlama için
üretilebilecek fragmentlerin üretilmesinde kullanılabilecek enzim sayısını genişleterek potansiyel
klonlama stratejilerinin sayısını arttırır. Birçok restriksiyon enzimi bölgesi, MCS bölgesinde yan yana
getirerek, ardışık olmaları sağlanır ve böylece klonlama sırasında iki enzim bölgesi arasından vektör
için gerekli dizinlerin çıkarılmasının önüne geçilir.
pUC vektörleri, aynı zamanda klonlamanın hızlı ve görsel tanımlanmasına izin veren bir
DNA sırasını içerir. MCS, β-galaktosidazın α-peptidini ve promotorlarını kodlayan lacZ sırasının
içerisine yerleştirilir. lacZ fragmentinin içine bu MCS’nin yerleştirilmesi α-peptidinin çalışmasını
engellemez (α-peptidinin görevi, tamamlamaya yardımcı olmaktır). Fakat MSC içerisine DNA
parçalarının klonlanmasıyla, α-peptidinin çalışması engellenir. Sonuç olarak; Xgal içeren besiyerleri
üzerindeki kolonilerin mavi/beyaz renk ayrımı, rekombinantların belirlenmesini sağlar. MCS genel
olarak; α-tamamlama peptidinin fonksiyonel olarak gerekli olmayan parçasını kodlayan başlangıç
kodonu ATG ile 7. kodonu arasındaki bir bölgeye yerleştirilir. Slilaty ve Lebel, mavi/beyaz renk
ayrımının, kararsız olabileceğini belirtmişlerdir. Klonlama sadece 11. ila 36. kodonlar arasına
yapıldığı zaman, güvenilir bir inaktivasyonun meydana geleceğini gösterdiler.

64
65
Bakteriyofaj λ

Bakteriyofaj λ’nın genetik organizasyonu λ’nın bir vektör olarak kullanılmasını

destekler
Bakteriyofaj λ, genetik olarak çok karmaşık olmasına rağmen kapsamlı bir şekilde
incelenmiştir. E.coli virüslerinin araştırılması ve bir vektör olarak geliştirilmesi oldukça doğaldır.
Çünkü E.coli, moleküler genetikteki pek çok araştırmanın temelini oluşturmaktadır. λ fajı’nın DNA’sı,
linear çift zincirli yapıda olup yaklaşık 48,5 kbp içerir. Sanger ve arkadaşları tarafından fajın tüm
DNA sırası belirlenmiştir. Faj DNA’sının her ucunda, 12 nükleotitden oluşan kısa tek zincirli 5’
uzantıları vardır. Bu uzantıların baz sıraları birbirlerinin tamamlayıcısıdır. Bu sayede λ DNA’sı konak
hücre içerisine aktarılınca, λ DNA‘sı halka şeklini alır. DNA’sı yapışkan uç içerir ve bu bölgelere de
cos bölgesi denir.
λ fajının fonksiyonel olarak ilişkili genleri, harita üzerinde bir arada toplanmıştır. İki pozitif
düzenleyici olan N ve Q genleri ise, diğer genlerden farklı olarak ayrı yerlerdedirler. λ’nın geleneksel
linear haritasının şekli Şekil4-10’da gösterilmiştir. λ linear haritasının solundaki genler, faj
partikülünün baş ve kuyruk proteinlerini kodlar. Merkez bölgesindeki genler ise, rekombinasyon ve
lizojenizasyon süreciyle ilgilidir. Merkez bölgesindeki genlerin çoğu, fajın büyümesi için gerekli
değildir ve bu bölgenin çıkarılması veya yer değiştirilmesi fajın büyüme döngüsünü ciddi şekilde
etkilemez. Bu bölgenin vazgeçilebilir olması, fajın vektör türevlerinin üretilmesini kolaylaştırdığı için
oldukça önemlidir. Merkezi bölgenin sağındaki genler sırasıyla: N, cro ve cI genleri, regülasyon ve
profaj bağışıklığı ile; O ve P genleri, DNA sentesiyle; Q geni geç fonksiyonel düzenlemeyle; S ve R
genleri de konak hücre lizisi ile ilgilidir. Şekil 4.11, λ’nın hayat döngüsünü göstermektedir.

Şekil 4.10- Yaban tip bakteriyofaj λ’nın tüm DNA’sı üzerindeki bazı genlerin fiziksel durumunu
gösteren λ kromozom haritasıdır.

66
 Kutu 4.2 Bakteriyofaj λ: moleküler biyoloji ve rekombinant DNA
teknolojilerinde önemli bir yeri vardır.

1950’lerin başında, Bacillus megaterium ile ilgili yapılan bazı çalışmalardan sonra,
Pasteur enstitüsünde Andre Lwoff ve arkadaşları E.coli deki lizojeni fenomenini
tanımladılar. Lizojeni, bilinen E.coli suşlarında belirlenmiştir. Fajın lizojenik enfeksiyonla
enfekte ettiği bu bakteriler, λ fajı için konaktır, faj aktif değildir bu haldeki faja “profaj” denir. Lizojenik bakteri
normal bir şekilde büyür ve lizojenik olduğu kolayca fark edilmeyebilir. Buna rağmen, Lwoff bakterileri orta
dozda ultraviyoleye maruz bırakıldığında bakterilerin büyümeleri durdu ve bakteri lizatları yaklaşık 90 dakika
inkübasyonundan sonra, bir çok faj besiyeriye salındı. Salınan fajlar λ fajıyla enfekte olmuş bakterileri enfekte
edemezler (Birden fazla fajın aynı konağı enfekte edememesi), fakat lizojenik olmayan bakteriler başka bir
virüs grubuyla enfekte olabilir.
1950’lerin ortalarına doğru profajın, E.coli kromozomuna entegre olmuş λ faj genomu içerdiği farkedildi.
Virüsün litik ve lizojenik hayat döngüleri arasındaki geçişi de Lwoff’un arkadaşları olan Jacob ve Monod tespit
etti. Bu, gen regülasyonuna artan bir dikkat kazandırmıştır.
Özellikle 1960 ve 1970’lerdeki, fajın yoğun genetik ve moleküler biyoloji analizleri, virüsleri iyi bir şekilde
anlamayı sağlamıştır. Profajın uyku halini sürdüren ve süper enfeksiyonu (birden fazla fajın aynı konağı enfekte
etmesi) engelleyen anahtar molekül fajın cI geni ürünü olan faj repressörüdür. 1967'de Mark Ptashne faj
repressörünü izole etti (Ptashne 1967a,b). Vektör olarak geliştirilmesinde moleküler genetikteki avantajları fajı
iyi bir seçenek yaptı. 1970’lerde başlayan ve bugüne kadar gelen vektörlerin geliştirilmesindeki önemli bir
gerçek, faj genomunun büyük bir kısmının enfektif döngü için gerekli olmayan fonksiyonları kodlamasıdır. In
vitro da virüs partiküllerine rekombinant DNA fajını paketleyebilme yeteneği, kütüphanelerin oluşturulması
için önemli bir gelişmedir (Hohn ve Murray 1977).
Moleküler biyolojide önemli bir dönüm noktasına, λ faj genomunun tüm sekansı yapıldığı zaman ulaşıldı. λ
faj genomu 48 502 bp’dir ve Fred Sanger ve arkadaşları tarafından belirlenmiştir (Sanger et al. 1982).

λ Bakteriyofajı Karmaşık Bir Regülasyon Sistemine Sahiptir

λ fajın kromozomlarına yabancı bir DNA’ya entegre etmek mümkündür ve bazı durumlarda yabancı
genler λ promotorları aracılığıyla etkili bir şekilde expres edilir. Bundan dolayı λ genlerinin
ekspresyonunda etkili olan kontrol devrelerine ve promotorlarına kısaca göz atmak gerekir.Litik
devrede λ transkripsiyonu erken, orta ve geç olmak üzere üç ana safhada gerçekleşir. Temel olarak
erken gen transkripsiyonu litik döngüde yapılır (lizogenik ile yarış halindedir). Orta zamanlı gen
ürünleri DNA yı replike ve rekombine eder. Geç gen ürünleri olgun faj partikülüne bu DNAyı
paketler. Duyarlı bir konağın enfeksiyonunu takiben, derhal represör geninin (c1) sağ (PR) ve sol (PL )
unda bulunan ana promotorlardan aynı anda erken transkripsiyon başlar (şekil 4.12). Bu transkripsiyon
c1 geninin ürünü tarafından baskılanabilen bir olaydır ve lizojenik bir döngüde birden fazla fajın aynı

67
konağı enfekte etmesini engeller. Enfeksiyonun erken safhasında, PL den başlayan transkripsiyon tL
de PR den başlayan tR1 de sonlanır. tR1 de sonlanamayan herhangi bir transkript tR2 de sonlanır. λ anti-
terminasyonla erken transkripsiyondan orta transkripsiyona geçer. PL den üretilen N gen ürünü bu
geçişi yönetir. Bu ürün RNA polimerazla etkileşir ve konak terminasyon proteini ρ’nun aktivitesini
durdurur ve PR ve PL transkriptleri (red geni gibi) genlerin içine ilerlesin diye dur sinyallerinin
gözardı edilmesini sağlar. O ve P orta safha için gereklidir. Erken ve orta transkriptler ve ekspresyon
tipleri çakışırlar. cro ürünü yeterli olduğu zaman biriktirilir ve PR ve PL den transkripsiyonu durdurur.
Q geni uzayan PR transkriptinin uzak bir bölümünde ekspres edilir ve enfeksiyonun orta safhasından
geç safhasına geçişten sorumludur. Bu anti terminasyonlada düzenlenir. Q ürünü özellikle kısa PR
transkriptlerin terminasyonunu engelleyerek cos bölgesine bitişik geç genlerin transkripsiyonunu
sağlar, bu sayede birçok olgun faj partikülü tamamen üretilir.

Şekil 4.11 Litik ve lizojenik , λ fajın DNA replikasyonu

68
 N ve Q nun her ikisi de pozitif regülasyonda fajın büyümesi ve plak oluşumu için önemli rol
oynar. Fakat, λ N- nin de olduğu gibi, tR2 terminasyon bölgesi nin (N-bağımsız) denilen küçük bir
delesyonla kaldırılırsa, N- bir faj, küçük bir plak üretebilir.

Şekil 4.12 λ fajın ana promotorları ve

transkripsiyonel terminasyon bölgeleri

İki tip λ faj vektörü vardır: İnsertional vektörler ve Replacement vektörler

Yaban tip λ DNA’sı, yaygın olarak kullanılan restriksiyon endonükleazlar için bir çok hedef
bölge içerir ve bu yüzden bir vektör olarak tek başına uygun değildir. Bu yüzden, yabancı DNA’nın
sokulduğu (insertional vektörler) tek bir hedef bölgeye ya da uzaklaştırılabilen (stuffer) ve yabancı
DNA ile yer değiştirebilen bir bölgeye sahip (replacement vektörler) yaban tip faj türevleri üretildi. λ
fajı, kendi DNA içeriğinden % 5 daha fazla DNA paketleyebildiğinden, genomdaki klonlama alanını
büyütebilmek için delesyonlarla vektör türevleri yapıldı. Normal büyüklüğe yakın büyüklükte plaklar
üretebilen en kısa λ DNAsı, yaban tipe göre DNAsının % 25’i delesyonla atılmıştır. Eğer çok fazla
DNA genomdan kesilip atılırsa, DNA etkili bir şekilde faj partiküllerine paketlenemez. Bu DNA’nın
faja paketlenmesinde bir avantaja dönüştürülebilir, şöyle ki; Eğer replacement tip vektörün
çıkarılabilir fragmenti fiziki olarak kesip çıkarılırsa veya çıkarılabilir fragment içinden sadece bu
fragmenti kesen ikinci bir enzim ile kesip tahrip edilebilirse, delesyona uğratılmış vektör içine uygun
büyüklükte bir fragment aldığında, plaklar oluşturabilir. Bu sayede, yabancı DNA taşıyan rekombinant
faj kolaylıkla seçilebilir.
Hem insertional hem de replacement klonlama için birçok vektör türevi, rekombinant DNA
teknolojisinin gelişiyle, ilgili bir grup araştırmacı tarafından üretildi. Bu vektörlerin çoğu EcoRI,
BamHI ya da HindIII restriksiyon enzimleri ile kullanılabilecek şekilde üretildi fakat linkerlerin insert
edilmesi ile başka enzimlerin kullanımına da açık hale getirilebilirler.

69
Geliştirilmiş özellikleriyle birçok λ faj vektörü tanımlanmıştır
Plazmit vektörler gibi gelişmiş özellikli faj vektörleri geliştirildi. Bunun birçok amacı vardır.
Bunlar;
1. Vektörlerin alabileceği yabancı DNA fragmentlerinin büyüklüğünü ve klonlanabilecek
fragmentleri hazırlarken ve klonlarken kullanılabilecek enzim sayısını arttırmak,
2. Rekombinantları pozitif olarak seçmeyi sağlayabilecek metotlar geliştirmek,
3. RNA problarının yabancı DNA insertlerinin transkripsiyonuyla kolaylıkla hazırlanabilmesini
sağlamak. Bu kromozom walking yöntemiyle kütüphanelerin taranmasını kolaylaştırır. Bu özelliğe
sahip bir vektör, λ ZAP’tır.
4. Ökaryotik cDNA insersiyonu için vektörler geliştirmek. β-galaktosidaz füzyonu olarak
cDNA’nın ekspresyonu, E.coli’de gerçekleştirilebilir. Bu tip ekspresyon vektörleri, antikor taraması
için kullanışlıdır. Böyle bir vektör örneği λgt11’dir
Burada ilk iki durum tartışılacaktır. Diğer iki durum bölüm 6’da ele alınacaktır.
λ faj türevleri maksimum kapasitesine sadece replacement tip vektörlerle ulaşır. Bunun için stuffer
(ara) fragmenti uzaklaştırmadan rekombinant pozitif klonları seçebilmek için başarılı metotlar
geliştirilmiştir. Hatta stuffer fragment fiziksel saflaştırma aracılığıyla çıkarılsa bile kontamine edici
çok az bir miktar kalabilir. Böylece rekombinantların seçimi için genetik seçim uygulanır. Bu seçimi
başarmak için kullanılan yaygın metod Spi- fenotipine bakılarak ayrım yapmaktır
Yaban tip λ, P2 fajı bakımından lizojenik olan E.coli suşlarında büyüyemez. Diğer bir deyişle, λ
fajı Spi+’dır (P2 inhibisyonuna duyarlı). λ’nın fiziksel haritasının % 64- 69’luk bir bölgesinde bulunan
red ve gam genlerinin ürünleri P2 lizojeninde büyümeyi inhibe etmekten sorumludur. Bu sebepten
stuffer fragmentinin yabancı DNA ile yer değiştirildiği rekombinantlar, fenotipik olarak Spi- dir ve P2
lizojeninde de ekim yapılarak seçilebilirler.
gam geni delesyonunun başka sonuçları da vardır. gam ürünü, λ DNA replikasyonunda çift
yönlü moddan, yuvarlanan halka moduna geçiş için bir anahtardır (Şekil 4.11). gam- faj, normalde faj
başlarına paketlenen konkatemerik linear DNA üretemez. Ancak gam- faj plaklar oluşturur; çünkü rec
ve red rekombinasyon sistemleri, dairesel DNA molekülleri üzerinde çalışarak, paketlenebilen
multimer formları oluşturabilir. gam- red- fajlar, rec+ bakterilerde plak oluşumu için tamamen rec
bağımlı değişime (rec-mediated exchance) bağımlıdır. λ DNA’sı bu rec bağımlı değişim için zayıf bir
substrattır. Bu yüzden, böyle fajlar, chi (cross over hot spot instigtor) olarak adlandırılan, rec aracılığı
ile mübadeleyi teşvik eden, bir veya daha fazla kısa DNA dizisi içermezse, küçük plaklar oluştururlar.
Yaygın replacement vektörleri’nin çoğu red- gam- klonları oluştururlar ve çünkü fajın çıkarılmayan
(değiştirilmeyen) parçası üzerinde bir chi bölges ile inşaa edilmişlerdir.
λ vektörlerinin son nesilleri (generasyonları), EMBL3 ve EMBL4’tür (Şekil 4.13). Bu vektörler
9-23 kb büyüklüğünde DNA kapasitesine sahiptir. chi+ olmalarının yanı sıra bu λ vektörleri,
kütüphane yapımını kolaylaştırmak için stuffer fragmentlerinin yanında olan polilinkerlere sahiptir.
İnsertleri olan bu fajlar, spi- fenotipi esasına göre seçilir, fakat bir farklılık vardır. Vektör, BamHI ile

70
üretilen yabancı DNA fragmentlerinin ligasyonundan önce BamHI ve EcoRI ile kesilir. Eğer küçük
BamHI-EcoRI fragmentleri polilinkerden uzaklaştırılırsa, stuffer fragment yeniden birleştirilemez.

Şekil 4.13- Bakteriyofaj λ’nın klonlama vektörleri olan EMBL3 ve EMBL4’ün yapısı. Bu iki vektörde polilinker
sıraları karşılıklı olarak sunulmuştur.

in vitro’da DNA’yı λ fajına paketleyerek, kompetent E.coli ihtiyacı elimine edilebilir.

Şimdiye kadar kompetent bakteri transfeksiyonu ile, konak bakteriye, manipule edilmiş faj
DNA’sının aktarılması durumunu tartıştık. Transfeksiyon, çıplak faj DNA’sının bakteriye
aktarılmasıdır. Herhangi bir gen-manipulasyon prosedürüne bağlı kalmadan oluşturulan λ DNA’sı
kullanıldığında, transfeksiyon µg DNA başına 105 plakla sonuçlanır. Vektör DNA’sının kesilip, içine
yabancı bir DNA yerleştirildiği bir klonlama deneyinde, plak sayısı yaklaşık 104-103 plağa azalır.
Etkili nükleik asit biyokimyasına rağmen bu azalış kaçınılmazdır. Bu, ligasyon reaksiyonunda
fragmentlerin rastgele birleşmelerinin bir sonucudur. Ancak bazı durumlarda 106 veya daha fazla
rekombinant gereklidir.
Rekombinant DNA’yı faja yerleştirme, normal faj enfeksiyonu basamakları ile konak bakteriye
DNA’nın aktarılmasını sağlar. Bu işlem transdüksiyon olarak bilinir. Deneyin detaylarına bağlı
kalarak in vitro paketleme, ligasyon reaksiyonundan sonra vektör DNA’sının µg’ı başına 106 plak
oluşturur.
Şekil 4.14, in vitro’da yapmaya ihtiyaç duyduğumuz ve normal faj büyümesi sırasında konakta
meydana gelen paketleme işlemi sırasında oluşan bazı olayları gösteriyor. Yuvarlanan halka (rolling-
circle) replikasyon mekanizması ile oluşturulan konkatamerik formdaki faj DNA’sı paketleme
reaksiyonunun substratıdır. Faj başı öncüsü (gen E ürünü olan ana kapsid proteini) ve gen A’nın
ürününün varlığında, konkatamerik DNA monomerlere parçalanır ve kapsülün içine paketlenir. cos
bölgesinde 12 baz çifti ara ile, her bir zincirde 1 olmak üzere, karşılıklı zincirlerde toplam iki kırık
oluşturarak, yapışkan uçlar üretir. Daha sonra D geninin ürünü, tamamlanmış faj başına tutunur. W ve
FII genlerinin ürünleri tam bir faj partikülü oluşturmak için, birbirinlerinden ayrı olarak paketlenmiş
baş ile kuyruğu birleştirir.
Prensip olarak, tüp içerisinde paketleme sistemi, faj-başı öncüsünü, paketleme proteinlerini ve
faj-kuyruğunu yüksek konsantrasyonda in-vitroda oluşturan bir rekombinant DNA’nın yapılmasını
sağlar. Pratikte, bu olay biri baş oluşumunun erken safhasında D geni amber mutasyonu ile bloke
edilmiş ve bu yüzden D maddesini biriktiren, diğeri ise herhangi bir baş oluşumunu engelleyecek

71
şekilde E geni amber mutasyonu yapılmış oldukça konsantre olan iki lizogen karışımından oluşan lizat
içerisinde çok etkili bir şekilde meydana getirilir (Hohn ve Murray 1977). Bu lizat karışımında,
genetik komplementasyon meydana gelir ve dış kaynaklı DNA paketlenir (Şekil 4.15). Konkatemerik
DNA’nın paketlenecek substrat olması gerekmesine rağmen, tüp içerisinde paketleme sistemi ile
kovelent olarak bağlı olmayan konkatemer olan monomerik DNA paketlenecektir (kovalent bağlı
konkatemerler, genlerin λ’nın yapışkan uçlarına bitişik klonlanmasıyla olur).

72
 Şekil 4.15 Konkatamer oluşturmuş λ DNA’sının in vitro paketlenmesi

Tüp içerisinde paketleme işleminde karşılaşılan iki potansiyel problem bulunmaktadır.

Birincisi, paketleme lizatı hazırlanırken kullanılan lizogenlerin uyarılmış profajlarının DNA’sı
paketlenebilir. Bu durum uygun genotipe sahip profajların seçilmesiyle çözülebilir. Örneğin, uyarılma,
b2 delesyonu ile inhibe edilir (Gottesmann ve Yarmonlinsky 1968) ve eğer bu kompleks reaksiyonlar
için bir imm 434 lizogenik bakterisi kullanılırsa, imm 434 bağışıklığı plak oluşumunu engelleyecektir.
Buna ek olarak, vektör hiçbir amber mutasyonu içermiyorsa, iç kaynaklı DNA’nın plak oluşturmaması
için baskılanmamış bir konak bakteri kullanılabilir. İkinci potansiyel problem ise, lizat içerisinde
uyarılmış profaj ile dış kaynaklı DNA arasında rekonbinasyondan kaynaklanmaktadır. Böyle bir

73
problemin, rekombinasyon yeteneği kusurlu lizogenlerin (red-, rec-) kullanılmasıyla ve lizatın UV ile
muamele edilmiş hücrelerden hazırlanmasıyla üstesinden gelinebilir. Böylece dış kaynaklı DNA’nın
biyolojik aktivitesi engellenmiş olur (Hohn ve Murray 1977).

Tek zincirli DNA vektörleri ile klonlama

M13, f1 ve fd halkasal tek zincirli DNA molekülüne sahip filamentli kolifajlardır. Bu
kolifajlar, E. coli’nin diğer iki vektör sınıfı olan λ fajı ve plazmid vektörleri de dahil olmak üzere
diğer tüm vektörlere karşı bir takım avantajları olduğu için klonlama vektörü olarak
geliştirilmektedirler. Ancak, filamentli fajların avantajlarını değerlendirebilmek için biyolojileri
hakkında temel bilgilerin bilinmesi gerekir.

Filamentli bakteriyofajlar onları uygun vektörler yapan birçok eşsiz özelliklere

sahiptirler
Faj partikülleri 900 nm X 9 nm boyutunda, 6407 (M13) ve ya 6408 (fd) nükleotid
uzunluğunda tek zincirli halkalı DNA içerirler. Fd ve M13’ün nükleotid dizisi belirlenmiştir ve % 97
oranında homolog olduğu gözlenmiştir. Farklılık, sıranın ötesinden ve ya berisinden izole edilen
nükleotidlerin, sekans farklılığına sebep olması ve kodonun konumunu etkilemesi sebebi ile meydana
gelir.
Filamentli fajlar, sadece, f pilusu içeren enterik bakteri ırklarını enfekte ederler. Adsorpsiyon bölgesi f
pilusunun uç kısmıdır. Fakat, faj genomunun f pilusuyla hücre içerisine aktarımı hale bilinmemektedir.
Faj DNA’sının replikasyonu konak hücre lizisi ile sonuçlanmaz. Aksine enfekte olan hücreler,
büyümeye ve bölünmeye enfekte olmayan hücrelerden daha yavaş da olsa devam ederler ve virüs
partiküllerini doğururlar. Her birey başına 1000 kadar faj partikülü ortama salınır (Şekil 4.16).
Tek zincirli faj DNA’sı dekapsidasyonun ve ardından replikasyonun birbirini takip ettiği işlemlerin
ardından hücreye girer. Replikasyonun sonucunda çift zincirli replikatif form (RF) oluşur. Kapsit
proteinleri ise sitoplazmik membrana tutunur. RF, hücre içerisinde 100 molekül olana kadar hızlıca
çoğalır. RF replikasyonu virüs tarafından kodlanan ve tek zincire bağlanan spesifik DNA
proteinlerinin birikimi yüzünden asimetrik bir hal alır. Bu proteinler virüs DNA’sına bağlanır ve
tamamlayıcı zincirin sentezine engel olur. Bu noktadan itibaren yalnızca tek zincirli virüs DNA’ları
sentezlenir. Bu tek zincirli progeni, hücre membranındaki morfogenezin ardından flamentli partiküller
olarak hücreden salınır. DNA membrandan geçerken, DNA’ya bağlanan proteinler soyulur ve kapsid
proteinleriyle yer değiştirir.

Tek zincirli DNA vektörleri özel kullanım alanlarına sahiptir

Tek zincirli DNA ile klonlama, çeşitli uygulamalarda kullanılmaktadır. Oligonükleotid
mutasyonları ve prob hazırlama metodlarında, orijinal dideoksi metoduyla dizin analizinde tek zincirli

74
DNA gerekir. Tek zincirli formdaki vektörlerin kullanılması, çift zincirli olan DNA’nın ayrılması,
klonlama ve amplifikasyonun birleştirilmesi gibi işlemler için çok ilgi çekicidir.
Filamentli fajlar tek zincirli vektörler olduklarından bazı avantajlara sahiptirler. Birincisi, faj
DNA’sının replikasyonu çift zincirli halkasal DNA (RF) aracılığıyla olur. Bu RF saflaştırılabilir ve
invitroda plasmid gibi manipüle edilebilir. İkincisi, RF ve tek zincirli DNA’nın her ikisi de uygulanan
metoda bağlı olarak, ya enfekte koloniler ya da plak oluşumuna sebep olan alıcı E.coli hücresini
transfekte edecektir. Üçüncüsü, faj partikülünün büyüklüğü viral DNA büyüklüğü tarafından kontrol
edilir ve bu yüzden paketlemede zorlanma olmaz. Gerçekte, M13 DNA’sının büyüklüğünün altı kat
fazlası kadar viral DNA paketlenmektedir (Messing vd. 1981). Sonuç olarak, bu fajlar ile klonlanacak
parçanın oryantasyonunun belirlenmesi çok kolaydır. İlgilenilen oryantasyon RF’nin restriksiyon
analizi ile belirlenebilmesine rağmen, daha kolay bir metod vardır (Barnes 1980). Eğer iki klonda
klonlanan parçayı zıt yönlerde taşıyorsa, bu tek zincirli DNA’lar aralarında hibridleşeceklerdir ve bu
agoroz jel elektroforezi ile kolayca belirlenebilir. Kültürden 0.1 ml kadar alınarak elde edilen fajlar bu
tür deneylerde kullanılabilir ve kolayca kültürün yoğunluğu belirlenir.
Özet olarak, vektör olarak filamentli fajlar, kolayca elde edilebilen tek zincirli DNA’lar içeren
partiküller üretir ve plazmidlerin sahip olduğu tüm avantajlara sahiptirler.

İyi Bir Vektör Yapmak İçin M13 Fajı Modifiye Edildi

λ'dan farklı olarak, filamentsi kolifajlar, klonlama bölgesi olarak kullanabilmek için önemli
olmayan genlere (non-essential) sahip değildirler. Buna rağmen M13’deki DNA sekansının 5498’den
6005’e kadar 507 bp’lik bir intergenik bölge içerir. Bu bölge viral ve komplementer zincirin her ikisi
için DNA replikasyon orijini içermektedir. Bugüne kadar geliştirilmiş vektörlerin çoğunda yabancı
DNA bu bölgeye sokuldu, buna rağmen gen IV’ün karboksi terminal ucuna klonlama yapmak
mümkündür. Yaban tip fajlar vektör olarak yaygın kullanıma sahip değildir. Çünkü intergenik bölge
içinde hemen hemen hiç tek kesme bölgesi içermezler (fd’de AsuI, ve M13’de AsuI ve AvaI)
M13 klonlamasının ilk örneği, genomda 10 BsuI bölgesinden biri kullanılarak yapılmıştır. Bu
bölgelerden ikisi intergenik bölgededir. Klonlama için M13RF, BsuI ile kısmi olarak kesildi ve tam
uzunluğa sahip lineer moleküller, agaroz jel elektroforezi ile izole edildi. Bu lineer monomerler,
E.coli lac regülatör bölgesi ve β galaktosidazın α peptidi için genetik bilgi taşıyan bir HindII
restriksiyon fragmenti ile küt uç ligation yapılarak yapıştırıldı. Ligasyon karışımı, β galaktosidazın α
fragmentinin delesyonunu içeren bir E.coli suşuna transforme edildi ve IPTG ve Xgal içeren ortamda
gen içi komplementasyonla rekombinant faj belirlendi. Mavi plaklardan biri seçildi ve seçilen virüs
M13mp1 olarak belirtildi.
M13mp1’in lac bölgesi içine DNA fragmentlerinin insersiyonu mavi renk plak oluşumunu
engeller. Bu rekombinantların daha kolay seçilmesini sağlar. Buna rağmen lac bölgesi AvaII, BglI ve
PvuI için sadece tek bölge içerir. PvuII için 3 bölge vardır ve EcoRI ve HindIII gibi yaygın olarak
kullanılan enzimler için genomun bütününde herhangi bir kesme bölgesi yoktur. Gronenborn ve

75
Messing, tek bir baz çifti değiştirmek için in vitro mutasyon yaptı ve lac bölgesi içinde tek bir EcoRI
bölgesi oluşturdu. Bu varyant M13mp2 olarak adlandırıldı. Bu faj türevi lac α-fragmentinin
yukarısında polilinkere sahip türevler oluşturmak için daha fazla modifiye edildi (Şekil 4.17). Bu
türevler (mp7-mp11, mp18, mp19) pUC plazmitinin Şekil 4.9’da gösterilen bütün M13 ile ilgili
kopyasıdır.

Şekil 4. 16. M13 fajının DNA replikasyonu ve yaşam siklusu

76
Şekil 4.17- Klonlama vektörü olan M13mp18’in restriksiyon haritası. M13mp18 ve M13mp19 fajı, 7249 baz
uzunluktadır ve sadece polilinker taşıyan 54. bazın oryantasyonunda farklılık vardır. Harita, restriksiyon
enzimlerinin molekülü bir veya iki kez kestiğini gösterir.

77
[Metni yazın]

5. BÖLÜM

KOZMİTLER, FAJMİTLER VE DİĞER

GELİŞMİŞ VEKTÖRLER

78
[Metni yazın]

Giriş
1970’lerde rekombinant DNA teknolojisi ilk gelişmeye başladığında sınırlı sayıda vektör vardı.
Sonraları DNA sekanslamayı kolaylaştırmak için özel bir vektör olan M13 fajı geliştirildi. Bunu
takiben en iyi örneği pBR322 olan belli bir amaç için özel yapılmış vektörler geliştirildi. Zamanla bir
seri özel vektör yapılmıştır ve bunların her birinin belirli amacı vardır. Bu zaman boyunca plazmit ve
faj vektörlerinin faydalarına dair birçok tartışmalar olmuştur. Bugün, moleküler biyologlar için birçok
vektör bulunmaktadır ve bunlar üç sebepten dolayı dikkate değerdir.
• Hem plazmit hem de faj’dan parçalar içeriyorsa phasmid, ayrıca M13 ori bölgesi içeriyorsa
phagemid olarak adlandırılırlar. Fajmitlerin en çok kullanılan tiplerinden biri cDNA
klonlaması için kullanılan λZAP vektör serisidir.
• Klonlamayı ve ekspresyonu kolaylaştıran birçok özellik bir vektörde birleştirilmiş olabilir.
• Saflaştırılmış DNA vektörleri ve bunlarla ilişkili malzemeler satın alınabilir.
Moleküler biyoloji kataloğunu açan bir biyolog, her firmanın farklı bir öneride bulunduğu, değişik
vektörlerle karşılaşır. Her bir vektörün kullanımındaki yararı açık olarak belirtilmekle birlikte,
dezavantajları nadiren belirtilir.
Klonlama vektörlerinin genel olarak iki kullanım amacı vardır: büyük DNA parçalarını
klonlamak ve genleri manipüle etmektir. Haritalama yaparken ve genomu sekanslarken çalışmayı
kolaylaştırmak için yapılacak ilk adım genomu küçük alt kısımlara ayırmaktır. Parçalar ne kadar
büyük olursa, sonuç elde etmek o kadar kolaylaşır (Bölüm 17). Bu yüzden klonlama yapılırken büyük
DNA parçaları kullanılmalıdır. Bir geni izole etmek için ve genom üzerinde yürünebilmesi için de
büyük fragmentlere ihtiyaç duyulur ve bu konu bölüm 6’da tartışılacaktır. Genellikle, istenilen genin
izole edilmesi kısmen kolaydır ve basit bir klonlama vektörü kullanılabilir. Klonlamanın ardından, bu
gen, prob ve ya protein olarak ekspres ettirilebilir, bu genin sekansı yapılabilir ve ya in vitroda
mutasyona uğratabilir. Tüm bu uygulamalar için, küçük vektörler kullanılabilir.

Büyük DNA fragmentlerini klonlamak için vektörler

Kozmitler, bakteriyofaj λ’nın içine paketlenebilen plazmitlerdir

cos bölgeleri arası 37-52 kb olacak şekilde yabancı DNA girişi olursa, λ DNA’sının faj başına
paketlemesi mümkün olur . Aslında, sadece cos bölgesinin yakınındaki küçük bir bölge paketleme
sistemi tarafından tanınması için gereklidir.
Plazmitler, λ DNA’sının cos bölgelerini içerecek şekilde yapılmıştır. Bu plazmitler kozmit
adını alır ve gen klonlama vektörü kullanılırlar. Şekil 5.1, kozmit kullanılarak yapılan bir gen
klonlamasını göstermektedir. Kozmit rekombinantlarını faj başlarına paketlemek için uygun boyutta
olanları seçmek gerekir. Biz 5 kb’lik bir kozmit vektörüne 32-47 kb yabancı DNA sokmak istiyoruz
ki bu da λ faj vektörünün kapasitesinden daha fazladır. İn vitro paketlemeden sonra, partikül uygun bir

79
[Metni yazın]

konağı enfekte etmek için kullanılacaktır. Rekombinat kozmit DNA, faj DNA’sı gibi enjekte edilir
ama normal bir plazmit gibi replike olur (faj fonksiyonlarının ekspresyonu olmadan). Transforme olan
hücreler vektörün ilaç dirençlilik geni kullanılarak seçilir.
Kozmitler, yabancı DNA’nın büyük parçalar halinde klonlanmasını sağlar. Kozmitler
ökaryotik genom fragmenlerinden kütüphane
oluşturmak için ilgi çeken vektörlerdir çünkü büyük
DNA kapasitesine sahiptirler. Bir restriksiyon
endonükleazla kısmi kesim işlemi elverişli
büyüklükte fragmentler oluşturur. Ancak kısmi
kesimle ilgili potansiyel bir sorun vardır. Bu da iki ya
da daha fazla genom fragmentinin ligasyon sırasında
bir araya gelmesiyle oluşur. Bu bize kromozomal
organizasyonun yanlış resmini gösterir. Kısmi
kesimleri boyutlarına göre fraksiyonlara ayırarak bu
problemin üstesinden gelinebilir.
DNA’yı boyutlarına göre ayırmış olsak bile yine de
komşu olmayan DNA fragmentleri bir birleşerek tek
bir insert yapabilir. Bu problem yabancı DNA
fragmentlerinin bir araya gelip yapışmasını
engellemek amacıyla defosforillenmesiyle çözülebilir.
Bu yöntem çok hassastır çünkü vektör–vektör
ligasyonu olabilir. Duplike olan vektör kararlı
değildir ve konak hücre içinde bozulur.

80
[Metni yazın]

Şekil 5.1 Kozmit vektöre klonlama şeması.

Ish-Horowicz ve Burke (1987) tarafından geliştirilen kozmit klonlama prosedüründe bu tür

zorluklar aşılmıştır. Kozmit vektör pJB8’in (Şekil 5.2) uygun işlemlerden geçirilmesiyle kendi üzerine
yapışma kapasitesi olmayan ama yabancı DNA’nın defosforillenmesine izin veren sağ ve sol vektör
uçları saflaştırılmıştır. Böylece bu metot yabancı DNA’yı boyutlandırma gereğini ortadan kaldırır ve
kısa DNA ya da çoklu vektör dizileri içeren klon oluşumlarını önler.

81
[Metni yazın]

Şekil 5.2 Ish-Horowicz ve Burke’nin kozmit klonlama şeması (1981). (a) pJB8 kozmitinin haritası. (b) Sau3A ile
kısmi kesim yapılarak oluşturulan genomik kütüphane. Bu restriksiyon endonükleazın dört nükleotitlik bir
tanıma bölgesi vardır ve BamHI ile aynı yapışkan uçları üretir.

Bu problemlere alternatif bir çözüm de kozmit c2XB’yi oluşturan Bates ve Swift

(1983) tarafından geliştirilmiştir. Bu kozmit bir BamHI insersiyon bölgesi ve birbirinden kör
uç oluşturan bir restriksiyon bölgesiyle ayrılan iki cos bölgesi taşır (Şekil 5.3). Bu kör uçların
tasarımı ligasyon reaksiyonu sırasında vektörün kendi üzerine yapışmasını engeller.

82
[Metni yazın]

Şekil 5.3 Bates ve Swift’in kozmit

klonlama şeması (1983). C2XB kör uç
oluşturan SmaI restriksiyon endonükleaz
kesim bölgesiyle ayrılmış iki cos bölgesi
içerir.

Başka vektör sistemyleri de vardır. Örneğin, pWE ve sCos serileri (Wahl vd 1987, Evans vd 1989)
gibi modern kozmid vektörler şöyle özelliklere sahiptir:
• büyüklüğüne göre seçilmemiş DNA fregmentinin basit olarak klonlanabileceği bir çoklu
klonlama bölgesi içerirler
• klonlama bölgesine bitişik faj promotorları vardır.
• klonlanan genin vektörden tek parça ayrılması için gerekli ve klonlama bölgesine bitişik olan
NotI, SacII, ve ya SfiI (nadir kesiciler, bölüm 17) bölgeleri içerirler, bu da vektörden
insertlerin kolay uzaklaştırılmasına izin verir.
Dominant seçici işaretleri kodlayan modüllerin memelilerde ekspresyonu, memeli hücrelerine
gen aktarımı için eğer isteniyorsa vektörde bulunması arzu edilir.

BAC’lar ve PAC’lar kozmitlerden daha büyük DNA fragmentleri taşıyan vektörlerdir

P1 fajı E.coli’nin genetik analizinde yaygın olarak kullanılan ılımlı bir bakteriyofajdır, çünkü
genelleşmiş transdüksiyona aracılık eder. Stenberg ve meslektaşları 100 kb kadar büyük DNA
fragmenti kapasitesi olan bir P1 vektör sistemi geliştirmişlerdir. Bu kapasite kozmit klonlarının
yaklaşık iki katıdır ama YAC klonlarından daha azdır. P1 vektörü rekombinant moleküllerin faj
partiküllerine in vitro paketlenmesinde gerekli olan bir paketleme bölgesi (pac) içerir. Vektörler iki
tane loxP bölgesi içerir. Bunlar faj rekombinaz (faj cre geninin ürünü) tarafından tanınan bölgelerdir

83
[Metni yazın]

ve E.coli konağına enjekte edildikten sonra paketlenen DNA’nın dairesel hale gelmesine sebep olur
(Şekil 5.4). Klonlar E.coli içinde kanamisin direncine göre seçilerek düşük kopya sayılı plazmitler
şeklinde devam ettirilirler. Yüksek kopya sayısı P1 litik replikonundan faydalanılarak indüklenebilir.
Bu P1 sistemi fare, insan ve Drosophila DNA’sından genomik kütüphane yapmak için
kullanılmaktadır.

Şekil 5.4 Faj P1 vektör sistemi. P1 vektörü,

Ad10 kısa ve uzun kolulunu oluşturmak için
parçalanır. Bu kollar kendi üzerlerine
yapışmayı engellemek için defosforillenirler.
Boyutlarına göre seçilmiş DNA vektör
kollarıyla yapıştırılır ve iki basamaklı işleme
hazırlanır. İlk olarak rekombinant DNA
pacase enzimiyle pac bölgesinden kesilir.
Daha sonra pacase DNA’yı faja paketlemek
için baş/kuyruk extract ile birlikte çalışır.
Sonra baş ve kuyruk birleşir. Oluşan faj
rekombinant DNA’yı konak E.coli’ye enjekte
eder. Konak cre+’dır. cre rekombinaz loxP
bölgesinde halkasal plazmit oluşturmak için
rol alır. Plazmit düşük kopya sayısında
tutulur ama P1 litik operonu uyarılarak
arttırılabilir.

Şekil 5.5 Mini-F plazmitinden orijinlenen

BAC vektörünün yapısı. oriS ve repE genleri F faktörünün
tek yönlü replikasyonuna aracılık eder. CmR
kloramfenikol direnç genidir. cosN ve loxP, sırasıyla, λ
terminaz ve P1 cre proteini için kesim bölgeleridir. HindIII
ve BamHI yabancı DNA klonlamak için kesim
bölgeleridir.

Shizuya et al. (1992), kompleks genomları

analiz etmek ve haritalamak için bir bakteriyal
klonlama sistemi geliştirmişlerdir. Bu BAC
(bakteriyal yapay kromozom) sistemi, E.coli’nin tek
kopyalı cinsiyet faktörü F’ye dayanmaktadır. Bu
vektör (Şekil 5.5) araya sokulan bölgelerin kesilip çıkarılması için birkaç G+C zengini restriksiyon
enzim bölgesi (SfiI, NotI, etc.), iki klonlama bölgesi (HindIII ve BamHI), λ cosN ve P1 loxP

84
[Metni yazın]

bölgelerini içerir. Klonlama bölgesi ayrıca RNA probları oluşturmak için T7 ve SP6 promotorları
tarafından kuşatılmıştır. Bu BAC, etkili bir biçimde E.coli’ye transforme edilebilir, bu şekilde de P1
sistemi için gerekli olan paketleme extractlarından da kaçınılmış olur. BAC’lar 300 kb’den daha
büyük insan ve bitki genomik fragmentlerini yüksek derecede kararlılıkla 100 nesilden fazla devam
ettirme kapasitesine sahiptir ve ortalama ekleme boyutu 125 kb olan genom kütüphaneleri yapmak için
kullanılmaktadır. Akabinde, Ioannou et al. (1994) P1 ve F-faktör sistemlerinin özelliklerini
birleştirerek P1’den türetilmiş yapay kromozom (PAC) geliştirdiler. Bu PAC vektörleri 100-300 kb
aralığında fragmentlerin klonlanabilmesine olanak sağlayabilmektedirler.
İlk BAC vektörü, pBAC108L, rekombinantlar için seçici bir belirteçden (marker) yoksundur.
Bu nedenle klonlar koloni hibridizasyonuyla tanımlanıyordu. Bir zamanlar bu gen manipulasyonunda
standart bir işlem iken, bugün zahmetli olduğu düşünülmektedir. Yaygın olarak kullanılan iki BAC
vektörü, pBeloBAC11 ve pECBAC1, orijinal klonlama bölgesi, içinde çoklu klonlama bölgesi taşıyan
lacZ geni ile yer değiştirilmiş pBAC108L’den türetilmiştir. pBeloBAC11, biri lacZ geninin içinde biri
de CMR geninin içinde olan iki EcoRI kesim bölgesine sahiptir. Oysa, pECBAC1 sadece lacZ geninin
içinde bulunan bir EcoRI kesim bölgesine sahiptir. BAC’lardaki daha ileri gelişmeler lacZ geninin
sacB geniyle yer değiştirilmesiyle yapılmıştır. sacB geninin inaktivasyonu konak hücrenin sükroz
içeren ortamda büyümesine izin verir (pozitif seleksiyon). Frangen et al. (1999) bu BAC’lara bir
transpozon için insersiyon bölgesi dahil ederek daha da geliştirmişlerdir. Bu da genoma sokulan ek
dizilerin klonlandıktan sonra bakteride modifiye edilmesine olanak sağlar, bu prosedür retrofitting
olarak bilinir. Retrofitting’in başlıca kullanımı basitleştirilmiş delesyonlar ve raportör genlerin
eklenmesidir. Örneğin, Al-Hasani et al.(2003) ve Magin-Lachmann et al. (2003) transfeksiyonu
kolaylaştırmak, epizomal koruma ve ökaryotik hücrelerdeki büyük genomik fragmentlerin fonksiyon
analizini yapmak için retrofittingi kullanarak BAC’ları geliştirmişlerdir.

Rekombinojenik mühendislik (recombineering), DNA klonlamayı kolaylaştırır

BAC’lar ve PAC’lar büyük uzunluktaki DNA’lar klonlanmak için kullanılan vektörlerdir
(>100kb). Bu vektörler genelde operonların tamamını veya çok büyük gen ailelerini klonlamak için
kullanılırlar. Bununla beraber oluşan klonları çalışmak çok zordur ve bunun iki sebebi vardır.
Birincisi; çok büyük plazmitleri in vitroda kırılmadan manipule etmek zordur. Bu plazmitler
bozulmadan korunabilse bile jel elektroforezinde çok sınırlı hareketleri vardır. İkincisi ise ne kadar
büyük DNA sokulmuşsa yaygın bulunan restriksiyon enzimleri için o kadar çok kesim yeri olacaktır.
Bu nedenle herhangi bir kesim ve ligasyon reaksiyonu DNA insertinin boyutunu indirgeyecektir ve
fragmentlerin karışmasıyla sonuçlanacaktır. Bu problemleri önlemek için manipulasyonları in vitro
yerine in vivo’da homolog rekombinasyon yaparak gerçekleştirmek gerekir.
Homolog rekombinasyon, iki DNA molekülü arasında genetik bilginin değişimine olanak
sağlar. Homolog bölgeler serbest olarak seçilebildiği için hedef bölgedeki herhangi bir pozisyon
spesifik olarak değiştirilebilir. Homolog rekombinasyon nadir olduğundan dolayı rekombinantı taşıyan

85
[Metni yazın]

hücreleri tanımlamak için bir seleksiyon formu gereklidir. Rekombinojenik mühendislik bu

seleksiyonu antibiyotik direçliliği ile yapmaktadır. BAC veya PAC’ın bir kısmının çıkarılması
isteniyorsa tek bir homolog rekombinasyon gereklidir (Şekil 5.6a).

Şekil 5.6 in vivo rekombinojenik engineering'in iki çeşidi.

Her ikisinde de hedef molekül BAC, PAC herhangi bir
plazmit veya E.coli kromozomu olabilir ve bozulmadan
kalır. (a) hedef molekül segmenti ile lineer DNA
molekülünün elektroporasyonla konak hücreye aktarımı. (b)
rekombinasyonla seçici genin, rekombinaz hedef
bölgelerinden (FRT veya loxP) atılması. sm, seçici gen;
lineer DNA, rekombinaz hedef bölgeleri; A ve B, homoloji
bölgeleri

Çoğu durumlarda seçici işaretin

rekombinasyon ürününde kalması istenmez. Bu
nedenle rekombinojenik engineering için iki döngüye
ihtiyaç vardır. İlk döngüde fonksiyonel elementler
ilave edilerek seçici genin entegre edilmesi ile
başlangıç ürünü oluşturulur. İkinci döngüde seçici
genin uzaklaştırılması için ekstra fonksiyonel
elementler kullanılarak en son ürün oluşturulur. Bu iş için farklı fonksiyonel elementler kullanılabilir.
Şekil 5.6b’de bunlardan bir tanesi gösterilmiştir. Cre veya FLP gibi ilgili hedefe spesifik rekombinaz
için hedef bölgeler gösterilmiştir (box 3.3’de anlatıldığı gibi). Bu durumda ilk ürün, seçilebilir bir
kaseti silen, ilgili hedefe spesifik bir rekombinaza maruz bırakılmalıdır.
Rekombinojenik mühendisliğin kullanıldığı birkaç tane yol vardır . Ama burada en yaygın
kullanıma sahip olan ve ET rekombinasyonu olarak bilinen metot anlatılacaktır. Bu metotta
rekombinasyon Rac fajından RecE/RecT veya faj λ’dadan Redα / Redβ ile yapılır. Bu iki sistem
fonksiyonel olarak eşdeğerdir. Rec E ve Red α, 5’--> 3’ ekzonükleazdır, Rec T ve Red β’da DNA’ları
hibridize etmede işe yarayacak proteinlerdir. Homolog rekombinasyon için RecE ve RecT veya Redα
ve Redβ’nin aralarında fonksiyonel interaksiyonlar gerekmektedir. Bu rekombinasyon fonksiyonlarını
sağlamanın en iyi yolu onları plazmit kodlayan genler aracılığıyla temin etmektir. (pBAD-ETγ
plazmiti). Bu plazmit RecT ve RecE genlerinin yanında faj gam genini de kodlar. Bunun yararı da gam
gen ürününün hedef kasetteki herhangi bir RecBCD-bağımlı yıkımı inhibe etmesidir.
Şekil 5.6’da gösterilen ET rekombinasyonu ile kısa homolog bölgeler taşıyan lineer hedef
DNA, elektroporasyonla BAC ve YAC plazmitleri taşıyan hücrelere aktarılırlar. Etkili bir
rekombinasyon için homolog bölgeler 35-60 nükleotit içermelidir ve bunlar seçici markerın
amplifikasyonu için, PCR primerleriyle eklenebilir. gam geninin ekspresyonunun, colE1

86
[Metni yazın]

replikasyonuyla beraber plazmitlerin normal replikasyonunu önlediği göz önünde bulundurulmalıdır.

pBAD-ETγ’nın kaybı, rekombinojenik mühendislik basamağından sonra ampisilinli ortamda
büyütülerek, baskı altında tutularak engellenebilir.

Büyük uzunluktaki DNA fragmentlerini klonlamada vektör seçimi bir takım faktörlere
bağlıdır
İnsertin olabilecek maksimum boyutu, değişik vektörlerde farklılık gösterir (tablo 5.1’de
gösterilmiştir). Önemli olan sadece insertin boyutu değildir. Kimeraların yokluğu ve delesyonlar bazen
daha da önemlidir. Pratikte bazı YAC’larda, insertler yapısal kararsızlık gösterirler veya bir klonda
birden fazla DNA parçası içerebilirler. YAC’lar (maya yapay kromozomu) haritalama ve DNA dizin
analizleri için uygun değildir ve bunları belirlemek çok zahmetlidir. Kozmitte de aynı hatalar
geçerlidir ama bunlardaki en büyük problem klonlanan DNA ardışık tekrarlar içeriyorsa ortaya
çıkmaktadır. Ardışık tekrarlar kozmite sokulabilecek insertin boyutundan birkaç kat büyükse, problem
şiddetli olur.
BAC ve PAC sistemlerinin YAC’lara göre bazı avantajları vardır. Bu avantajlar; istenmeyen kimerik
yapıların az olması, kolay kütüphane oluşturulabilmesi, manipulasyon ve insert DNA’nın
izolasyonunu kolay olması olarak sıralanabilir. BAC klonları, YAC ve kozmidlere göre insan
DNA’sının anlaşılmasında daha kullanışlıdır. Rastgele sekanslama için mükemmel substratlardır ve
doğru DNA dizin bilgileri sağlar. Dolayısıyla büyük DNA’ları BAC’lar üzerinden sekans etmek daha
güvenilirdir.

Tablo 5.1 Farklı klonlama vektörleriyle kullanılabilecek maksimum DNA insertleri. YAC’lar 213.sayfada
tartışılmıştır.
Vektör Konak İnsertin boyutu
λ faj E.coli 5-25 kb
λ kozmit E.coli 35-45 kb
P1 faj E.coli 70-100 kb
PAC E.coli 100-300 kb
BAC E.coli ≤300 kb
YAC Saccharomyces 200-2000 kb
cerevisiae
_________________________________________________________________________

87
[Metni yazın]

Özel amaçlı vektörler

M13 orijinli vektörler sekanslama için uygun olan tek zincirli DNA yapmak için
kullanılabilir
Yeni bir gen klonlandığında kimerik molekülün bir kısmını veya tamamını sekanslayarak teyit
etmek gerekir. İleride görüleceği gibi, Sanger sekanslama metodu başlangıç materyali olarak tek
zincirli DNA’ya ihtiyaç duyar. M13 vektörüne ilgilenilen geni klonlayarak tek zincirli DNA elde
edilmiştir. Bugün, ilgilenilen bölgeyi, M13 ori bölgesi ve pUC (Col E1) replikasyon orijinini içeren
fajmid vektöre klonlamak daha yaygındır. Bunun gibi vektörler normalde çift zincirli moleküller
olarak hücre içinde replike olurlar. Sekanslama için tek zincirli DNA, M13K07 gibi yardımcı bir faj
kültüre enfekte edilerek üretilebilir. Bu yardımcı faj; P15A replikasyon orijinine ve M13 ori bölgesine
sokulan kanamisin dirençlilik genine sahiptir ve gII geninde bir mutasyon taşır. M13K07 kendi
kendine replike olabilir. Bununla birlikte yaban tip replikasyon orijini taşıyan fajmid varlığında, tek
zincirli fajmid paketlenir ve fajmid DNA’sı sekanslama için kullanılır.

Ekspresyon vektörleri; klonlanmış bir genin, E.coli’de fonksiyon gören

promotorun kontrolü altına yerleştirilmesine olanak verir.
Ekspresyon vektörleri, eğer klonlanan genden RNA probları veya gen ürününden bol miktarda
üretilmek isteniyorsa gereklidir. Her iki durumda da klonlanan genin transkripsiyonu istenir.
Klonlanan geni kendi promotoru altına koymak mümkün olsa da vektöre spesifik olan promotorun
altına konulması daha iyidir. Bunun gibi vektörlerdeki promotorlara, E.coli RNA polimerazın
bağlanarak üretim sağlanabilmesi için optimize edilmiştir ve çoğu, konak hücrenin büyüme
ortamındaki değişikliklerle kolaylıkla regüle edilebilmektedir.
E.coli RNA polimerazı çok alt birimli bir enzimdir. Kor enzim, 2 aynı α alt ünitesi ile β ve β’ alt
ünitelerini içerir. Kor enzim σ altbirimi ilave edilmeden aktivite gösteremez. RNA polimeraz hangi tip
σ faktörünün olduğuna bağlı olarak farklı çeşit promotorları tanır. En yaygın promotorlar σ70 li RNA
polimerazlar tarafından tanınır. E.coli’nin σ70 promotorlarının büyük bir bölümü analiz edilmiştir ve
300’den fazlası Lisser ve Margalit’in derlemesinde (1993) bulunmaktadır. Bu promotorların
karşılaştırılması, korunmuş dizilerin formulasyonuna rehberlik etmiştir (Şekil 5.7). Transkripsiyon
başlangıç noktası +1 olarak işaretlenirse, bu korunmuş diziler -35 (5’-TTGACA-) ve -10 (5’-
TATAAT) bölgelerini içine almaktadır. RNA polimerazın transkripsiyona başlayabilmesi için bu
dizilere bağlanması gerekmektedir. Promotorun gücü (birim zamanda her bir enzim molekülü başına
sentezlenen RNA kopya sayısı), korunmuş bölgeye ne kadar yakın olduğuna bağlıdır. Promotorun
gücünü etkileyen hemen hemen bütün mutasyonlar -35 ve -10 bölgelerindedir, bu bölgelerin yanında
bulunan diğer bazlar da promotorun aktivitesini etkileyebilir (Hawley & McClure 1983, Dueschle ve

88
[Metni yazın]

ark. 1986, Keilty & Rosenberg 1987). -35 ve -10 bölgeleri arasındaki mesafe de önemlidir. Denenmiş
bütün durumlarda, 17 bp’den uzun veya kısa mesafelerin promotoru zayıflattığı görülmüştür.

Şekil 5.7 Dört doğal promotorun, iki hibrit

promotorun ve konsensus promotorun -35 ve -
10 bölgelerinin baz dizileri

Bazı bakteri promotorlarındaki -35

hekzamerinin 5’ tarafında yer alan UP
elementleri A+T’ce zengin dizilerdir ve
RNA polimerazın α alt ünitesiyle etkileşerek transkripsiyonu arttırır. Gourse ve ark. (1998)
transkripsiyonu arttıran rrn kor promotorlarında da UP dizilerini tanımlamıştır. UP, taşınabilir bir
dizidir ve bu dizi alınarak 5’ uca konmuştur ve lac promotorlarında protein ekspresyonunu 100 kat
daha arttırmıştır.

Şekil 5.8 Faktör bağımlı transkripsiyonel terminatörün

yapısı

Bir kere RNA polimeraz transkripsiyonu başlatırsa, DNA üzerinde transkripsiyon terminasyon
bölgesini bulana kadar ribonükleotit zinciri uzatacaktır. Bakteri DNA’sı iki tip transkripsiyon
terminasyon bölgesine sahiptir; faktöre bağımlı ve faktöre bağımlı olmayan. İsimlerinden de
anlaşılacağı gibi faktöre bağımlı olmayan, sadece RNA polimeraz ve DNA ile çalışır. Transkripsiyonu
sonlandırmak için başka faktöre ihtiyaç duyanlar, faktör bağımlıdır. Faktör bağımlı olmayan
transkripsiyon terminatörlerini tanımak kolaydır çünkü ortak dizilere sahiptirler. Transkripsiyon A
bazının tekrarlarının (şekil 5.8) olduğu yerde sonlanır ve mRNA’nın 3’ ucunda U baz tekrarları
görünür. Faktör bağımlı transkripsiyon terminatörleri arasındaki dizilerde çok fazla ortaklık yoktur.
Terminasyon, E.coli’nin bilinen üç terminasyon faktöründen biri ile etkileşimle gerçekleştirilir. Bu
faktörler; Rho (ρ), Tau (τ), NusA’dır. Bir çok ekspresyon vektöründe genin klonlanacağı bölgenin
arkasında faktör bağımlı olmayan terminasyon dizileri vardır.

Özel vektörler RNA problarının ve iRNA ların üretimini kolaylaştırmak için

geliştirilmiştir
Tek zincir DNA, hibridizasyon çalışmalarında sekans probu olarak kullanılabilir olmasına
rağmen RNA probları tercih edilir. Bir RNA probu yapmak için gen sekansı bir plazmite klonlanır,
purifikasyondan sonra plazmit uygun bir restriksiyon enzimiyle linear hale getirilir. Sonra plazmit, faj
RNA polimeraz ve 4 ribonükleosittrifosfat ile inkübe edilir (Şekil 5.9). Uzamayı sonlandırmak için

89
[Metni yazın]

transkripsiyon terminatörü gerekli değildir çünkü RNA polimeraz, linear plazmitin sonuna ulaşınca
DNA’dan düşer.

Şekil 5.9 Faj SP6 promotoru ve SP6 RNA polimerazı kullanarak klonlanmış bir DNA molekülünden RNA
problarının üretimi.

Faj promotoru kullanmanın üç sebebi vardır. Birincisi, bunun gibi promotorlar çok güçlüdür,
in vitro’da yüksek miktarda RNA yapabilmeyi mümkün kılarlar. İkincisi, faj promotoru E.coli RNA
polimerazı tarafından tanınmaz ve bu yüzden hücrenin içinde transkripsiyona uğramaz. Üçüncüsü,
RNA polimerazlar SP6, T7 ve T3 fajlar tarafından kodlanır. Bu RNA polimerazlar, tek bir popipeptit
olduğundan, E.coli RNA polimerazına göre çalışması daha basittir.
Eğer tek zincir DNA sırası veya RNA prob olarak planlanmışsa; o insertin her iki zincirine
karşılık gelen RNA probları hazırlamak gereklidir. Bunu yapmanın bir yolu da insertin iki
oryantasyonuna uygun iki farklı klon elde etmektir. Bir alternatif metod ise; insertin çoklu klonlama
sırasına bitişik olan iki farklı ve zıt faj promotorları arasına yerleştirildiği bir klonlama vektörü
kullanmaktır. Bu iki promotorun her biri farklı bir RNA polimeraz tarafından tanındığından dolayı,
transkripsiyonun yönünü kullanılan polimeraz belirler.
Evans et al. (1995) plazmiti daha da geliştirdi. LITMUS vektörlerinin polilinker bölgelerinin
iki yanında modifiye T7 RNA polimeraz promotor bölgesi vardır. Her bir uçtaki T7 promotoru içinde
kendine özgü ustaca düzenlenmiş bir yeknesak restriksiyon bölgesi (Bir T7 promotoru içinde SpeI or
digerinde AflII) içerir. Ustaca düzenlenmiş bu bölgelerin varlığına rağmen her iki promotor da aktiftir.

90
[Metni yazın]

Tek yönlü transkripsiyon, sağlam olan (aktif) diğer promotor tarafından başarılır (Şekil 5.10). RNA
problarının etkili bir şekilde üretilmesi ve etiketlenmesi kalıbın transkripsiyonundan önce linearize
edilmesini gerektirdiği için istenmeyen promotorun içindeki bölgenin kesimi bir adımda her iki
fonksiyonu çalıştırır. Araya giren klonlanmış parça ya bir SpeI ya da bir AflII bölgesi içerir.
Çalıştırılmak istenmeyen promotor, üzerinde kendine has r. E. bölgesinden kesilerek, etkisiz hale
getirilebilir.

Şekil 5.10: LITMUS vektörünün yapısı ve

kullanımı. (a) LITMUS vektörünün yapısı (4
polilinkerin oryantasyonu ve restriksiyyon enzim
bölgeleri). (b) LITMUS vektörüne klonlanmış bir
fragmentin farklı zincirlerini kalıp olarak
kullanarak RNA probu üretimi.

91
[Metni yazın]

RNA interferens (RNAi), bir geni post-transkripsiyonel olarak sessizleştirme işidir. Çift zincir
bir RNA hücre içine atılır, bu RNA hücredeki komplementeri mRNA’ya bağlanarak, komplementeri
RNA’nın degrede edilmesine sebep olur. Bu uygulamanın detayları sayfa 318’de tartışılmıştır. Çift
zincir RNA yapmanın en kolay yolu LITMUS gibi vektörleri kullanmaktır. Bu durumda ilgilenilen
hedef klonu içeren vektörlerden biri SpeI ve diğeri AflIII ile kesilir. Bu kesim ile üretilen DNA’lar
RNA üretiminde kalıp olarak kullanılırlar. Eğer üretilen RNA’lar in vitro da karşılaştırılırsa, çift zincir
RNA üretilmiş olur.

Güçlü ve kontrol edilebilir promotorlu vektörler, klonlanmış gen ürünlerinin

maksimum sentezi için kullanılır
Eğer klonlanmış bir genin promotoru, konak hücre RNA polimerazı tarafından tanınıyorsa,
klonlanmış gen ürününün belirlenebilir miktarda sentez edilme ihtimali yüksektir. Fakat rekombinant
DNA ile ilgilenenlerin çoğu, aşırı miktarda protein üretilmesini isterler çünkü üretilen bu proteini ya
karakterize edeceklerdir ya da ticaretini yapacaklardır. Bunun gibi örneklerde sentez yeterli değildir ve
maksimize edilmelidir. Klonlanmış gen expresyonunun düzeyini etkileyen faktörler Tablo 5.2.’de
gösterilmiş ve Baneyx (1999) tarafından incelenmiştir. Bu faktörlerden burada sadece promotor gücü
tartışılacaktır.

Tablo 5.2 Klonlanmış genin expresyonunu etkileyen faktörler.

_________________________________________________________
Faktör Sayfa
_________________________________________________________
Promotorun gücü Bu sayfada
Transkripsiyonal sonlanma 82. sayfa
Plazmid kopya sayısı 57. sayfa, 4. bölüm
Plazmid kararlılığı 59. sayfa, 4. bölüm
Konak hücre fizyolojisi 4 ve 5. bölüm
Translasyonal başlangıç sıraları Kutu 5.1, 88. sayfa
Kodon seçimi Kutu 5.1, 88. sayfa
mRNA yapısı Kutu 5.1, 88. sayfa
_________________________________________________________
Gen ekspresyonu maksimize edileceği zaman muhtemel en güçlü promotoru seçmek yeterli
değildir. Konak hücrede expresyonu etkileyen faktörler de düşünülmelidir. Birçok gen ürünü az
miktarda sentezlense bile konak hücre için toksik olabilir. Yüzeysel yapı proteinleri (Beck & Bremer
1980), temel hücre metabolizmasını düzenleyen PolA gen gibi proteinler (Murray & Kelley 1979),
sistik fibröz transmembranı iletimini regülatör proteini (Gregory et al. 1990) ve lentivirus zarf
proteinleri bunlara örnektir (Cunningham et al. 1993). Eğer bunun gibi klonlamış genlerin ekspres
edilmesine izin verilirse, toksik proteini üretemeyen mutantlar kolaylıkla seçilebilir. Bir proteinin aşırı
ekspresyonu hücre için toksik olmadığında bile yüksek düzeyde sentez hücrede metabolik bir kayba
(malzeme kaybına) sebep olur. Bu durum daha yavaş büyümeye sebep olur ve böylece kültürde

92
[Metni yazın]

klonlanmış geni daha düşük ekspres edenler veya hiç ekspres edemeyen varyantlar seçilebilir. Çünkü
bu varyantlar, ekspres edenlere göre daha hızlı büyüyeceklerdir. Yüksek seviyeli ekspresyonla ilişkili
problemleri azaltmak için kontrol edilebilen bir promotorun kontrolü altında olan klonlanmış genin
vektörü kullanılmalıdır. Problemleri aşmak için genin altına klonlanan promotor kontrol edilebilir
olmalıdır.
Klonlanan genlerin ekspresyonunu düzenlemek için bir çok farklı vektör yapılmıştır fakat hali
hazırda mevcut olanların çoğu aşağıdaki kontrol edilebilir promotorları içerir; λ, PL, T7, trc (tac) veya
BAD. Tablo 5.3, bu üç promotordan birinin kontrolü altına chloramphenicol transacetylase (CAT)
geni konulup ekspres edildiğinde, gerçekleşen ekspresyon seviyeleri görülmektedir.

Tablo 5.3 E.coli’de chloramfenicol acetyltransferaz (CAT) expresyonunun üç farklı promotor tarafından
kontrolü. CAT’nin düzeyi µg/mg toplam protein olarak ifade edilmiştir.
__________________________________________________________________________
Promotor İndüklenmemiş CAT seviyesi İndüklenmiş CAT seviyesi Oran
__________________________________________________________________________
λPL 0.0275 28.18 1025
trc 1.10 5.15 4.7
T7 1.14 15.40 13.5
_________________________________________________________________________

trc ve tac, promotorları lac ve trp promotorlarından türetilmiş hibrid promotorlardır (Brosius
1984). Bunlar her iki ebeveyn promotordan daha güçlüdür çünkü onların sekansları ortak sekansa daha
çok benzer. lac promotoru gibi, trc ve tac promotorları da laktoz ve IPTG tarafından indüklenebilir.
Bu promotorları kullanan vektörler lacO ve repressörü kodlayan lacI genini de taşır.
pET vektörleri klonlanmış gen ürünlerinin sentezini düzenlemek için faj T7 promotorlarını
kullanan ekspresyon vektörlerinin bir grubudur (Studier et al. 1990). Bir pET vektörü kullanmak için
genel strateji Şekil 5.11’de gösterilmiştir. Faj T7 RNA polimerazı üretmek için, fajın gen1 bölgesini
taşıyan E.coli suşu yapılır. Faj polimerazının sadece IPTG indüksiyonu ile sentezlemesi için bu gen
lac promotorunun downstrem bölgesine klonlanır. Yeni sentezlenen T7 polimerazı, pET plazmitindeki
yabancı geni transkribe eder. Eğer klonlanan genin ürünü toksik olursa T7 RNA polimerazın etkisini
minimize etmek mümkündür. Öncelikle pET vektör ile uyumlu (compatible) bir plazmit seçilir ve T7
lysS geni ona klonlanır. pET plazmitini taşıyan bir konak hücreye, pLysS plazmiti aktarıldığında, LysS
gen ürünü, hücre içinde çok az miktarda da bulunsa, bulunan T7 RNA polimerazına bağlanır (Studier
1991, Zhang & Studier 1997). Eğer lac operatörü, T7 promotoru ile klonlanmış gen arasına
yerleştirilirse, bu IPTG’nin yokluğunda araya giren genin expresyonunu büyük ölçüde düşürecektir.
Heterolog protein ürününün miktarındaki artış, bazen seçilmiş farklı konak hücreler kullanılarak
başarılır (Miroux & Walker 1996).
λ PL promotor sistemi, çok sıkı transkripsiyon kontrolü ile yüksek gen ekspresyonununu bir
arada bulunduran bir sistemdir. Bu, λ PL promotoru E.coli konağında bir λ cI reprössörünün kontrolü
altındadır. λ cI geninin kendisi ise, triptofan (trp) promotorunun kontrolü altındadır (Şekil 5.12).
93
[Metni yazın]

Harici triptofan yokluğunda cI geni transkribe edilir ve cI repressörü PL promotoruna bağlanır. Böylece
klonlanmış genin expresyonu engellenir. Triptofan varlığında trp repressörü cI genine bağlanır ve cI
repressörünün sentezi engellenir. cI repressörünün yokluğunda çok güçlü PL promotorundan yüksek
düzeyde expresyon vardır.

Konak hücre

Şekil 5.11 pET vektörüne klonlanmış bir genin ekspresyonun düzenlenme stratejisi. T7 RNA polimerazı için
gen (gen 1) E.coli’nin kromozomuna sokulur ve lac promotorundan transkribe edilir; böylece bu gen, sadece
teşvik edici IPTG eklenirse expres edilir. T7 RNA polimeraz sonra pET vektöründe klonlanmış geni transkribe
edecektir. Eğer klonlanan genin protein ürünü toksik ise teşvikten önce klonlanmış genin transkripsiyonunun
düşürülmesi gerekebilir. T7 lizozim, uyumlu bir plazmit olan pLysS tarafından kodlanır, herhangi bir kalıntı T7
RNA polimeraza bağlanacak ve onu etkisiz duruma düşürecektir. T7 promotoru ve klonlanmış gen arasında lac
operatörünün varlığında, klonlanmış genin transkripsiyonu IPTG teşvikçisinin yokluğunda indirgenecektir.

Şekil 5.12 λcI promotoru kullanarak klonlanmış gen ekspresyonunun kontrolü

94
[Metni yazın]

pBAD vektöründe, PL promotoru gibi, klonlanmış genin ekspresyonu çok sıkı kontrol altındadır
(Guzman et al. 1995). pBAD vektörü, araBAD (arabinoz) operonunun promotorunu ve bu
promotorun negatif regülatörünü, araC, taşır.
araC L-arabinoz ile komplex formda olan bir transkripsiyon regülatörüdür. Arabinozun
yokluğunda, araC O2’ye ve araBAD operonunun 210 bp’lik DNA halkasından (loop) oluşmuş I1 yarı
bölgesine bağlanır ve böylece transkripsiyonu engeller (Şekil 5.13). Besiyerinde büyüme için arabinoz
eklendikçe araC’ye bağlanır böylece O2 bölgesi serbest kalır. Bu DNA halkasını serbest bırakır ve
transkripsiyonun başlamasına izin verir. araC’nin I1 ve I2‘ye bağlanması, aktivatör proteini (CAP) ve
siklik adenozin monofosfat (cAMP) varlığında aktifleştirilir. Eğer besiyerine büyüme için glukoz
eklenirse, bu cAMP sentezinin represyonuna sebep olur. Bu yüzden araBAD promotorundan
expresyon azalır (Şekil 5.13). Guzman et al. (1995)’a göre pBAD vektörleri gen expresyonuna ince
ayar yapılmasına müsaade eder. Gerekli olan tek şey, besiyerinin şeker kompozisyonun
değiştirmesidir. Bununla birlikte, bazı bilim adamları buna karşı çıkar (Siegele & Hu 1997,
Hashemzadeh-Bonehi et al. 1998).
Yüksek düzeyde expresyon için dizayn edilmiş vektörlerin çoğu, E.coli expresyonu için
optimize edilmiş
translasyon başlama
sinyallerini de taşır (Kutu
5.1’e bak.).

Şekil 5.13 pBAD

promotorunun regülasyonu.
(a) Arabinozun
eklenmesinde
konformasyonel değişiklik.
(b) Konak hücrenin bir
kültürü için farklı
düzeylerde arabinoz
eklendiğinde klonlanmış gen
ürününün arttığını gösteren
western blot düzeneği.

95
[Metni yazın]

Kutu 5.1 Optimize edilmiş translasyon

Klonlanmış bir genin yüksek düzeyde expresyonu güçlü bir promotordan daha fazlasını
gerektirir. Transkripsiyon sırasında üretilen mRNA’nın etkili bir şekilde proteine çevrilmesi gerekir.
Birçok faktör, transkiripsiyonu etkilemesine rağmen, en önemlisi genin başlangıç kodonunun
upstream bölgesindeki bazlar ile ribozomun hemen interaksiyona girmesidir. Bakterilerde anahtar
dizi, ribozom bağlanma bölgesi veya Shine-Dalgarno (S-D) dizisidir. Bu sıranın 16S rRNA ile
komplementasyon (hibridizasyon) derecesi translasyon oranını etkileyebilir (De Boer & Hui 1990).
Maximum komplementasyon, 5’–UAAGGAGG–3’ sırası ile gerçekleşir (Ringquist et al. 1992). S-D dizisi
ve başlangıç kodonu arasındaki boşluk da önemlidir. Genelde 5–10, optimum 8 baz vardır. Uzunluğun
4 bp’den az olması veya 14 bp’den fazla olması tranlosyonu düşürebilir.
Traslasyon, S-D bölgesini takip eden bazların kompozisyonundan etkilenir (De Boer et al.
1983b). 4 A veya 4 T bazının varlığı durumunda en yüksek translasyon verimliliği olur. Bölge 4 G veya
4 C bazı taşıdığında translasyonun verimliliği maximum %50 veya %25 tir.
AUG start kodonundan önce gelen üçüzün içeriği de translasyon verimliliğini etkiler. β -
galaktozidaz mRNA’sının tranaslasyonu için bu üçüz bazların en elverişlisi UAU ve CUU dur. Eğer UUC,
UCA veya AGG, UAU veya CUU ile yer değiştirirse expresyon düzeyi 20 kat düşer (Hui et al. 1984).
AUG start kodonunu takip eden kodonun kompozisyonu da translasyonu etkileyebilir.
Örneğin insan γ-interferon geninin dördüncü kodonunun üçüncü pozisyonunun değişmesi expresyon
düzeyinin 30 kat değişmesiyle sonuçlanır (De Boer & Hui 1990). Birçok doğal mRNA’nın ikinci
kodonunda genel kodon kullanımından oldukça farklı bir eğilim/meyil vardır. Yüksek ekspresyon
genleri ikinci kodon olarak AAA (Lys) veya GCU (Ala)’ya sahiptir. DevIin et al. (1988) bir granülosit
klonunun ilk dört kodonu için bütün C ve G nükleotitlerini değiştirdiler ve toplam hücre protein
expresyonunda %17’lik bir artış gözlediler.
S-D bölgesi upstream dizisi belirli genlerin translasyon verimliliğini etkileyebilir. E.coli rnd
geninde 8 urasil bazı uzantısı vardır. Bu bazların değişimi mRNA düzeyini etkilemez fakat
translasyonda %95’in üzerinde düşüş görülür (Zhang & Deutscher 1992). Etchegaray and Inouye
(1999) başlangıç kodonunun downstream’inde translasyon-başlangıç kompleksinin oluşumunu
kolaylaştıran bir element belirlediler. mRNA’nın 3’ UTR (translasyona uğramayan bölgesinin) sırası da
önemlidir. Eğer bu bölge, gen içindeki diziye komplementer ise, hairpin-loop oluşabilir ve mRNA
boyunca ribozomun hareketi engellenir.
Genetik şifre dejenerattır ve bu yüzden amino asitlerin çoğu birden fazla kodona sahiptir.
Fakat, bütün genlerde, orjini ne olursa olsun, sinonim kodonlarının seçimi yaygın değildir. Kodon
kullanımındaki eğilim, iki unsura bağlıdır: Hücrede tRNA varlığı ile ilişkili olması ve primidin ile
sonlanan kodonlar arasında yaygın olmayan seçim. Ikemura (1981a) E.coli’nin bilinen 26 tane

96
[Metni yazın]

tRNAnın göreceli bolluğunu ölçtü ve tRNA bolluğu ile kodon seçimi arasında güçlü bir ilişki buldu.
Sonra Ikemura (1981b) E.coli’de en yüksek expres edilen genlerin, hücrede bolca bulunan tRNA lar
karşılığı olan kodonları içerdiğine dikkat çekti. Aksine az expres edilen genler daha çok
suboptimal(yetersiz) kodonlar kullanır. Forman et al. (1998) E.coli’de aşırı ekspres edilen bir gende,
nadir AGA konu bulunduğu zaman, (arjinin yerine) yanlışlıkla lisinin proteine girdiğine dikkat çekti.
UAA yüksek düzeyde ekspreslene genlerce tercih edilen bir kodondur. Oysaki UAG ve UGA, düşük
seviyede ekspreslenen genlerce tercih edilir, düşük seviyede ekspreslenen genlerde daha çok
bulunur.
Tranlasyonu incelemek için okuyucu Kozak (1999)’a başvurabilir.

İntronlar, Eksonlar ve Protein Splicing

RNA splicing, araya giren bir protein dizisinin kesilip çıkarılması olarak tanımlanır. Splicing
ekson fragmentlerinin ligasyonunu içerir. Bu eksonlar olgun ekson proteinini oluştururken intronlar
serbest kalır. Protein splicing, eksonlar arasında peptid yapıp yapışmasıyla sonuçlanır ve bu kendi
başına proteolizis yapan diğer formlarından farklıdır.

N-extein İntein C-extein

Splicing

N-extein C-extein İntein

Dizilerin karşılaştırılması ve yapısal analizler, C ucundaki 50 a.a’in ve intronun N ucundaki 100

a.a’in splicingden sorumlu birimler olduğunu göstermiştir. Bu iki splicing bölgesi, bağlayıcı yada
homing endonükleaz genleriyle ayrılırlar. İntron tarafından kodlanan homing endonükleaz, hücrede
bulunursa intronunu ekleme bölgesinde veya yanındaki çift zincirde bir kırık meydana getirir. Eğer
allel introndan yoksunsa bu endonükleaz aktivitesi aynı genin diğer alleli içinde intron hareketini
başlatır.

Klonlanmış Bir Gen Ürününün Saflaştırılmasını Kolaylaştırmak İçin Saflaştırma

Kuyrukları Kullanılabilir
Protein saflaştırılmasını kolaylaştırmak için kullanılan tagların, ekspres edilmiş proteinlerle
birleşmesi için çok sayıda vektör dizayn edilmiştir. Glutathion-S-transferaz, MalE proteini (Maltoz
bağlayan) ve multiple histidin birimi içeren tag örnekleri affinity kromotogrofisi ile kolaylıkla
saflaştırılabilir. Ekspres edilen gen ile tag için kodlanmış diziler spesifik bir proteazla kesilir ve
böylece tag vektörleri geliştirilir. Saflaştırmadan sonra tag proteinleri, normal proteinlerle birleşinceye
kadar spesifik proteazlardan ayrılmayabilir. Aynı zamanda tag’ların içerdiği bir protein dizisinin
kolayca analiz edilmesi mümkündür. Bu; gen aktivitesinin bilinmediği yada genel analizin elverişsiz
olduğu durumlarda, klonlanmış gen ürünlerinin analizine izin verir. Üç farklı tag örneği aşağıda
97
[Metni yazın]

verilmiştir. Yazar daha fazla detay için La Vallie ve McCoy tarafından yazılan makalelere
başvurulmasını öneriyor.
Saflaştırmada bir polihistidin birleştirme kullanmak için, ilk olarak proteolitik kesim bölgesi
ve altı histidin birimini bağlayan bölgeyi içeren genin vektör içine yerleştirilmesi gerekir. Şekil
5.14’deki örnek entrokinaz için bir kesim bölgesini gösterir. Birleşme proteinlerinin sentezi
gerçekleştikten sonra hücre parçalanır. Nükleazla muamele edilerek lizatın visikozitesi azaltılır. Sonra
lizat, seçici olarak polihistidin kuyruk bağlayan iki değerlikli hareketsizleştirilmiş nikel içeren bir
sütuna uygulanır. Kontamine olmuş herhangi bir protein yıkanıp uzaklaştırıldıktan sütundan birleşme
proteinleri ayrılır ve enterokinaz ile muamele edilerek klonlanmış gen ürünü salınır.

Sekil.5.14 Bir polihistidin dizisi içeren bağama proteini olarak klonlanan genin ekspresyonu için dizayn edilen
bir vektörün yapısı. Üç farklı varyant(A,B,C) herbirinin farklı translasyonuna sebep olur. Gölgeli diziler, üç
vektörün herbirinde yer değiştiren temel diziyi gösterir. Gölgesiz diziler (AGATCT) polilinkerlerin Bg1II kesim
bölgesini gösterir.

Klonlanladığımız genin doğru bir şekilde ifade edebilebilmesi için, translasyonun doğru okuma
çerçevesinden başlaması gerekir. Bu da üç farklı vektör kullanılarak sağlanır. Bu vektörlerin her biri
98
[Metni yazın]

farklı okuma çerçevesine sahip olan Polilinker bölgelerine sahiptir (Şekil 5.14). Enterokinaz, (asp)4lys
dizisini tanır ve lizin amino asitinden hemen sonra keser. Bu kesimin sonucu olarak, klonlanmış
genden ekspres edilen protein N terminalinde fazladan birkaç aminoasite sahip olacaktır. Eğer arzu
edilirse, kesim bölgesi ve polihistidinler ekspres edilen proteinin C terminalinde de sentezlenebilir.
Eğer klonladığımız
gen ürünü kendinde
bir enterokinaz bölgesi
içerecek olursa, o
zaman da farklı bir
kesim bölgesine sahip olan trombin ya da
faktör Xa gibi alternatif proteazlar
kullanılabilir.
Füzyon protein çalışmalarında kolaylık
sağlaması için, kısa antikor tanıma dizileri
kullanılabilir. Bu diziler, proteaz kesim
bölgesi ile afinite gösterdiği bölge arasında
bulunacak bir kuyruk içinde DNA dizisine
sokulabilirler. Bazı tanınabilir epitoplar Tablo
5.4 de verilmiştir. Bu antikorlar Western Blot
kullanılarak, uygun epitopları taşıyan füzyon
proteinlerini saptamak için kullanılabilir. C
terminalinde oluşacak bir histidin kuyruğunun
hem çalışma hem de saflaştırma aşamaları için
bazı etkilerinin olacağına da dikkat etmek
gerekir.

Biotin hücre metabolizmasında önemli

etkiye sahip birçok karboksilaz için esansiyel
bir kofaktördür. Bu enzim komplekslerindeki
biotin, biotin karboksilaz taşıyıcı protein
üzerindeki özel bir lizin aminoasitine kovalent
olarak bağlanır.
Taşıyıcı proteinlerin bir parçası ile birlikte
üretilen (füzyon) proteinleri E. coli’de Biotin
Ligazlar tanır. Biotin Ligaz, birA geni
tarafından kodlanır ve ATP bağımlı bir

99
[Metni yazın]

reaksiyonla, biotin kovalent olarak bağlanır. Ekspres edilen füzyon proteini Streptavidin Affinity
Kromatografisi kullanılarak saflaştırılabilir ( Şekil 5.15).
E. coli hücre içinde biotinlenen tek bir protein ekspres eder. Bu protein rekombinant füzyon
proteinlerinin affinite saflaştırılmasında çok iyi bir şekilde kullanılır, fakat doğal yapısındayken
streptavidini bağlamaz. Füzyon proteinlerinde biotin bulunmasının ek bir avantajı vardır. Bu avantaj
biotinin streptavidine bağlanan enzimlerle belirlenebilmesidir.
Yukarıda tanımlanan affinite saflaştırma sistemleri önemli bir dezavantaja sahiptir. Bu dezavantaj son
aşamada hedef proteini affinite kuyruktan ayırmak için bir proteazın gerekli olmasıdır, ayrıca bu işlem
yapıldıktan sonra da kullandığımız bu proteazı solüsyondan uzaklaştırmamız gerekir. Chong ve
arkadaşları (1997, 1998) bu dezavantajları içermeyen tek bir saflaştırma sistemi tanımlamışlardır
Bu sistem Saccharomyces cerevisae VMA1 geninden elde edilen bir protein splaysing elementini yani
bir intein kullanır (Kutu 5.2). İntein, β-Merkaptoetanol, Sistein veya Ditiyotreitol gibi tiyoller
varlığında ve düşük sıcaklıkta N terminal ucunda kendi kendini kesmesi için modifiye edilir. Hedef
proteini kodlayan gen bir vektörün çoklu klonlama bölgesi (MCS) içerine yerleştirilir, böylece inteini
kodlayan genin N terminali ile hedef proteinin C terminali arasında bir füzyon oluşturulur. Bacillus
circulans’ın küçük kitine bağlanan domain proteinini kodlayan (5 kDa) DNA dizisi, affiniti
saflaştırması için inteinin C terminus tarafına eklenir (Şekil 5.16).

100
[Metni yazın]

Yukarıda bahsedilen sistem IPTG ile indüklenebilen bir T7 promotörünün altına yerleştirilir.
İndüklenen hücrelerden elde edilen ham ekstraktlar bir Kitin Kolonundan geçirildiğinde, füzyon
proteinleri kolona bağlanırken bütün kontamine proteinler kolondan yıkanarak uzaklaştırılır. Daha
sonra füzyon proteini bir tiyolle inkübe edilir ve içine kesim bölgesi yerleştirilmiş inteinin tiyolle
etkileşimi sağlanır. Böylece kitin bağlı intein domaini kolona bağlı kalırken hedef protein kolondan
serbest bırakılır.

Ekspres Edilen Proteinlerin Çözünürlüğünü Artıran Vektörler Mevcuttur

E. coli’de yüksek miktarda üretilen proteinlerle ilgili sorunlardan birisi oluşan ürünün
inklüzyon body ler ya da çözünemeyen agregatlar halinde birikmesidir (Şekil 5.17). Bu olay ilk kez
İnsülin A ve İnsülin B üreten suşlarda rapor edilmiştir (Williams ve ark. 1982). İlk başta, bu
oluşumların E. coli’deki heterolog proteinlerin aşırı üretimini kısıtladığı düşünüldü, fakat normal E.
coli’ proteinlerinin (örneğin: RNA Polimerazın Altünitesi) yüksek miktarlarda bulunmasını
destekledikleri ortaya çıktı (Gribskov ve Burgess 1983). İnklüzyon body oluşumunu azaltan iki
parametre sıcaklık ve büyüme oranıdır. Yapılan birçok çalışma göstermektedir ki, büyüme sıcaklığının
düşürülmesi çözünebilir proteinlerin doğru katlanmasını olumlu yönde etkiler (Schein ve Noteborn
1988, Takagi ve ark. 1988, Schein 1991). Büyüme oranını azaltan ortam bileşenleri ve pH değerleri
aynı zamanda inklüzyon body oluşumunuda azaltırlar. Bazen de yanlış katlanmış proteinlerin
renatürasyonu için bu proteinler guanidyum hidroklorit’de çözünürler (Lillie ve ark. 1998).

101
[Metni yazın]

İnklüzyon body (cisim) oluşumunu engelleyen üç genetik metod tanımlanmıştır. Bunlardan

ilkinde, konak hücre, üreteceğimiz ilgili proteine ek olarak, bir şaperon (Örneğin: DnaK, GroES,
GroEL proteinleri) üretebilecek şekilde genetik olarak düzenlenir (Van Dyk ve ark. 1997). Castanle e
ark. (1997) pBR322 tip plazmitlerle uyumlu, şaperonların yüksek miktarda üretimini sağlayan bir dizi
vektör geliştirdiler (bu proteinlerin görevi diğer proteinlerin katlanmasını ve yanlış katlanan
proteinlerin doğru katlanmasına yardımcı olmaktır). Bu vektörler, şaperonların heterolog gen
ürünlerinin çözünmesi üzerindeki etkilerini test etmek için kullanılabilir. Ancak şu da unutulmamalıdır
ki, aşırı miktarda şaperon olsa bilse proteinlerin doğru bir şekilde katlanması garanti değildir. İkinci
metot da hedef proteinin amino asit sekansında küçük değişiklik yapmaktır. Örneğin, fibroblast
büyüme faktöründe sisteinin serine dönüştürülmesi, bu faktörden inklüzyon body oluşumunu en aza
indirmiştir (Rinas ve ark. 1992). Üçüncü metot, doğal hallerinde çözünmeyen agregatlar şeklinde
üretilen proteinlere dayanan gözlemlerden oluşmaktadır, bu proteinler çözünebilir formda tiyoredoksin
füzyon proteinleri olarak sentezlenirler (La vallie ve ark. 1993). Daha sonralarında ise Davis ve ark.
(1999) aynı zamanda bakterioferritin olan NusA ve GrpE proteinlerini tanımlamışlardır, bu proteinler
yüksek miktarda üretilen proteinlerin çözünmesinde tiyoredoksinlere göre daha başarılıdırlar. Kapust
ve Waugh (1999) un rapor ettiğine göre maltoz bağlama proteini de tiyoredoksine göre daha iyidir.
La vallie ve ark. (1993) ın yaptığı çalışmaların ilerletilmesiyle, çoklu klonlama bölgesi
içerisine genin klonlanabildiği bir dizi vektör geliştirilmiştir ve gen ürünü, birleşme noktasında
enterokinaz kesim bölgesine sahip olan bir tiyoredoksin füzyon proteinini olarak sentezlenir.
Sentezden sonra, füzyon proteini hücreden osmotik şokla serbest bırakılır ve saflaştırılır. Tiyoredoksin
füzyon proteinlerinin saflaştırılmasını basitleştirmek için, Lu ve ark. (1996) ı yüzey amino asitlerinin
bir grubunda mutasyon oluşturdular. Yaptıkları çalışmada 30. ve 62. amino asitleri histidine
dönüştürdüler ve kolonda iki değerlikli nikel immobilize edilen bir affinite kromotografisi kullanarak
modifiye edilmiş (histidin eklemesi olarak) tiyoredoksini saflaştırdılar. Alternatif bir saflaştırma
prosedürüde Smith ve ark. (1998) tarafından geliştirildi. Bu yöntemde kısa biotinilasyon peptidini
tiyoredoksin geninin N terminaline yerleştirdiler ve BIOTRX denilen yeni bir protein üretmesini
sağladılar. C terminalinde MCS (çoklu klonlama bölgesi) içeren BIOTRX genini ve birA genini
taşıyan bir vektör yaptılar. Böylece MCS’ye bir gen klonlandıkları zaman, oluşan füzyon proteinini
streptavidin kolonları kullanarak affinite kromotografisinde saflaştırabildiler.
Çözünebilen rekombinant proteinleri elde etmenin diğer bir yolu da onları periplazmik boşluğa
göndermektir (gelecek bölümde anlatılacaktır). Fakat böyle yapılsa bile yine de hala çözünmemiş
olabilirler. Barth ve ark. (2000) bu problemi çözmek için üretim yapan bakterileri uyumlu çözünebilen
maddeler varlığında osmotik stres (4 % NaCl+0.5 mol/l Sorbitol) altında büyüttüler. Kullandıkları
uyumlu maddeler glisin, betain gibi düşük moleküler ağırlığa sahip osmolitler dir. Bu maddeler
halofilik bakterilerde doğal olarak ortaya çıkarlar ve yüksek tuz konstrasyonunda proteinleri
korudukları bilinmektedir. Osmotik stres altında E.coli kültürüne glisin ve betain eklemek, hem bu

102
[Metni yazın]

inhibitör şartlar altında hücrelerin büyümesine izin vermenin yanında, aynı zamanda doğru katlanmış
rekombinant proteinlerin üretimi için de periplazmik bir ortam oluşturur.

Sinyal Dizisi İle Sentezlenen Proteinler, Hücreden Dışarıya Salınırlar

E. coli’ gibi gram negatif bakteriler kompleks bir duvar-membran yapısına sahiptirler. Bu
yapı, hücre duvarı ve periplazmik boşlukla dış membrandan ayrılan bir iç sitoplazmik membran
içerirler. Salgılanan proteinler periplazma içinde serbest bırakılırlar ya da periplazmanın yapısına
katılırlar ya da dış membrandan dışarı taşınırlar. E. coli’de iç membrandan dış membrana ya da
periplazmaya protein taşınımı Genel Taşıma Yolu (GEP) diye bilinen evrensel bir mekanizmayla
sağlanır. Bu mekanizma sec gen ürünlerini içerir (Lory’nin 1998 Review ine bakabilirsiniz). GEP’e
giriş yapan proteinler, N terminallerinde bir sinyal dizisi bulunacak şekilde sitoplâzmada
sentezlenirler. Bu sekans taşıma esnasında bir sinyal veya lider peptidaz ile kesilir. Bir sinyal dizisi 3
bölümden oluşur:
1) Pozitif yüklü amino terminal bölgesi
2) Hidrofobik çekirdek, 15 hidrofobik amino asitin 5’ini içerir.
3) Lider peptidaz kesim bölgesi

Sitoplazmik proteine takılan bir sinyal dizisi, onu taşınım yoluna yönlendirir.
Doğal olarak ortaya çıkan salgı proteinlerinden elde edilen çoğu sinyal dizisi (örneğin: OmpA, OmpT,
PelB, β-lactamase, alkaline phosphatase, and phage M13 gIII) amino uçlarıyla birleştikleri zaman
heterolog peptitlerin iç membrana doğru etkili bir şekilde hareket etmesini sağlarlar. Fakat bazı
durumlarda preproteinler kolayca taşınmazlar, ya öncü inklüzyon body’ler içinde biriktirilip iç
membranda sıkıştırılarak toplanırlar ya da çabucak sitoplâzmada parçalanırlar. Uygulamada, birkaç
sinyal dizisini denemek gerekebilir (Berges ve ark. 1996) ya da belirli bir heterolog proteinin yer
değiştirmesini optimize etmek için farklı şaperonların aşırı üretimi gerekli olabilir. Yapılacak
çalışmalarda, ilk adım olarak çoğu moleküler biyoloji firması tarafından önerilen salgılama
vektörlerini denemek olmalıdır ve genelde bu vektörler yukarıda bahsedilen vektörlerin değişik
çeşitleridir.
Dış membrana taşınabilen ve büyüme ortamına salgılanabilen proteinler yapmak mümkündür.
Bu işlem, tip 1 Sec-Bağımlı Salgılama Sistemi kulanılarak başarılır. Tip 1 sisitemin ilk örneği
hemolizin taşıma sisteimidir. Bu sistem kısa bir Karboksi-Terminal Salgılama Sistemi, iki translokatör
(HlyB ve D) ve TolC adında bir dış membran proteini gerektirir. Eğer ilgili protein tip-1-salgılama
proteinin karboksi terminal salgılama sinyaline birleştirilirse, bu protein HlyB, HlyD, ve TolC
proteinlerinin sentezlenmesiyle oluşan büyüme ortamına salgılanacaktır (Spreng e ark. 2000).
Rekombinant proteinlerin oluştuğunun alternatif bir gösterimi de çok sayıda bulunan taşıyıcı
proteinlerden herhangi birini kullanarak bakteri hücre yüzeyinde onları ekspres etmektir.

103
[Metni yazın]

Gateway Sistemi Dna Fragmentlerini Birçok Farklı Vektöre Taşımak İçin

Kullanılan Yüksek Derecede Verimli Bir Metottur
Bir gen parçasını bir vektörden başka bir vektöre taşımak için uygulanan geleneksel metotda
restriksiyon enzimleri kullanılırak kesimler yapılır ve bu metotlar yaygın olarak aşağıdaki adımların
bir kaçını veya tamamını kapsar.
1- Genin alınacağı plazmitin restriksiyon endonukleazlarla kesimi
2- Hedef genin saflaştırılması
3- Hedef vektörün restriksiyon endonüklezlarla kesimi
4- Kesilen hedef vektör ile klonlayacağımız genin birleştirilmesi (ligasyon)
5- Plazmitin E. coli’ye aktarılması (transformasyon) ve yeni rekombinant plazmitlerin seçimi
6- Yeni plazmitin izolasyonu, endonukleaz kesimi yapılarak klonlamanın doğrulanması ve son
olarak da jel elektroforez ile bu parçaların görüntelenmesi

Gateway sistemi lambda fajı bölgeye-özgü (site-specific) rekombinazlar (Kutu 3.3 Syf:51)
kullanarak bütün bu adımları basit iki prosedürlük bir adım haline getirmek için tasarlanır
(Şekil 5.18).

Gateway sistemini kullanmak için, klonlama yapacağımız gen klasik yöntemler kullanılarak
Gateway Entry Vektörüne klonlanır. Bu bölge lambda site-spesific rekombinaz tarafından tanınan
iki tane att bölgesi taşır ve klonladığımız gen bu iki bölge arasına klonlanmış olmalıdır.
Klonladığımız bu geni başka bir vektöre (hedef vektör (destination vector) taşımak çok basittir.

104
[Metni yazın]

Klonlanmış geni içeren entry vektör’ü lambda rekombinaz ve destination vektör’ü ile in vitro da
karıştırılır. Kısa bir inkübasyondan sonra istenilen plazmitler transformasyonla seçilir (Şekil 5.18).
Gateway sisteminin güzel tarafı, birinci entry klonu yapıldıktan sonra ilgilendiğimiz genin başka
birçok vektöre transfer edilebilmesidir (Şekil 5.19). Aynı zamanda bu sistemde genin
oryantasyonun korunması ve translasyonun doğru okuma çerçevesinden başlamasında yüksek
derecede verim vardır (> %99).

Bütün Özelliklerin Tek Bir Vektörde Birleştirilmesi

Günümüzde kullanılan çoğu vektör, özellikle ticari olarak mevcut olanlar, önceki bölümde
tanımlanan vektör özelliklerinin değişik kombinasyonlarına sahiptir. Burada farklı özelliklerin
bağlantısını gösteren iki örnek tanımlanmıştır. İlk örnek, RNA problarının üretimi için kullanılan,
önceki bölümde (Syf:83) tanımlanan LITMUS vektörleridir. Bu vektörler aşağıdaki özellikleri
sergilerler:
• Polilinker’lar lacZ geni içerisine yerleştirilirler ve polilinker içerisine klonlanan insertler
alpha-komplementasyonunu engellerler. Böylece mavi beyaz seçimi (Kutu 3.2, syf:45)
kullanılarak sadece insörtü içerisine almış olan vektörler ayırt edilebilir.
• LITMUS vektörleri tek kesim noktasına sahip olan 32 tane restriksiyon bölgesi içerirler.
Bu enzimlerden 29’u 4 bazlık yapışkan uçlar bırakırken 3 tanesi küt uçlar oluştururlar. Bu
küt uç oluşturan 3 enzim ya polilinker ın sonuna ya da ortasına yerleştirilir.

105
[Metni yazın]

• Vektörler hem pUC hem de M13 ori bölgeleri içerirler. Normal şartlar altında vektör
kendini çift zincirli olarak replike eder fakat yardımcı faj (M13K07) ile enfekte
edildiğinde tek zincirli DNA oluşur ve faj proteini içerisine paketlenir.
• Yardımcı faj üzerinde üretilen tek zincirli moleküller DNA dizisi için gerekli olan bütün
özelliklere sahiptir ( Bak syf:81).
• Vektörler küçüktürler (< 3 kb) ve yüksek kopya sayısına sahip olan pUC ori bölgeleri
vardır.

İkinci örnek ekspresyon vektörlerinden olan PinPoint vektörleridir (Şekil 5.20).

Bu vektörler aşağıdaki özelliklere sahiptir.

• Ekspresyon ya T7 Promotorü yada tac Promotorunun kontrolü altındadır, bu promotorlar
kullanıcıya klonlanan gen ürününün sentezini kontrol altına almada büyük esneklik
sağlarlar.
• Bunlardan bazıları sinyal peptidine özel DNA sıraları taşırlar.
• Bu vektörler faktör-Xa kesim bölgesinin hemen yanında bir MCS (çoklu klonlama
bölgesi) bulundururlar.
• Saflaştırmayı kolaylaştırmak için biotinlenmiş bir N-terminal dizisi sentezlerler.
• Üç farklı vektörün her biri klonlanmış genin üç farklı okuma çerçevesinde translasyonuna
izin verir.

106
[Metni yazın]

• Klonlanmış gene komplementer RNA problarının sentezine olanak sağlaması için

MCS’nin ortasında faj SP6 promotoru bulunur. Şuna dikkat etmemiz gerekir ki, klonlanan
genin oryantasyonu bilinir, bu yüzden RNA probu tek zincirden sentezlenmek zorundadır.

Bu vektörlerde eksik olan şey M13 replikasyon orijinin olmamasıdır. M13 replikasyon orijini DNA
sekanslama yapılırken kullanılan tek zincirli DNA’ların sentezininde büyük kolaylık sağlar.

107
[Metni yazın]

6. BÖLÜM

GEN KLONLAMA YÖNTEMLERİ

108
[Metni yazın]

Giriş
Gen klonlamanın moleküler biyolojide hala önemli olmasının birçok sebebi vardır. Genel bir
sebep hala daha gen haritası ve gen sekansı bilinmeyen canlıların olmasıdır. Örneğin bir araştırmacı
kutup ayısının özel bir geniyle çalışmak istiyorsa onu klonlamadan başka çaresi yoktur. Ek olarak
yüksek organizmalarda cDNA sekansı splice isoformları, onların farklı dokularda bolluğu ve gelişim
düzeyleri hakkında faydalı bilgiler sağlar. Daha ileri bir sebep klonlama stratejileri ekspresyon profili
ve biyokimyasal fonksiyonlar gibi gen hakkında ekstra bilgiler verir. Fonksiyonel olarak genomların
sınıflandırması hakkında bir boşluk vardır. Ve bu bakımdan genlerin fonksiyonlarını ortaya çıkarmak
için klonlama stratejilerini kullanmak gerekir.
Sekanslama projeleri ve genom haritalama sonuçlarının belirtildiği yayınlar şimdi ortalama 15
günde bir bilimsel literatürde ortaya konuluyor. Ve bu kitap yayınlanıncaya kadar 200 üzerinde
genomun tamamının sekanslanmassı ve eklenmesi meydana geliyor.şimdiden klonlama genleri ‘ off-
the-shelf ‘ ve bizim en önemli organizmalarımızın çoğu için cDNAs eldesi mümkün oldu.örnek
olarak,tablo 6.1 memeli BAC kütüphanelerini listeler insanların yanı sıra ,bu laboratuar hayvanlarını ,
çoğu evcil memeliyi ve filogenetik analizleri kolaylaştıracak çalışmalarda kullanılan diğer memeli
türleri içerir.
Artık single genleri klonlamak için çaba harcamak gereklimidir yoksa buna değermi sorusunu
akla getirir. Tek gen klonlamanın birkaç nedeni hala moleküler biyolojinin bir parçası olarak
önemlidir. En sıradan neden orada pek çok genom durmaktadırki kutup ayısından spesifik geni
klonlamayı isteyen araştırmacı sekanslamayı ve haritalamasını henüz yapmıştır. Örneğin , tek gen
seviyesinde çalışmaktan başka seçeneği yoksa , daha önemlisi , genom sekansları verilen gen için var
olan bilginin sadece bir parçasını açığa çıkarırken.aksine mRNA ‘dan reverse transkrib edilen cDNA
sekansları farklı tip hücrelerde ve eksternal uyarıcıları stimule eden deneysel veya naturel cevaplarda
eksperesyon profillerini açığa çıkar. İlaveten, yüksek organizmalar için, cDNA sekansları gelişen
safhalarda ve farklı dokularda splikizoformlar ve onların varlığı hakkında yararlı bilgiler sağlar.
bundan başka bir neden varki , çoğu klonlama stratejileri genler hakkında ekstra fonksiyonel bilgileri
ortaya koyar. Örneğin; eksperesyon profilleri yada biyokimyasal fonksiyonlar fonksiyonel genomların
görevleri daima yapısal annotation fazlardan ve gen klonlama stratejilerinden geri kalır. Buyüzden gen
fonksiyonun açıklanması için değerlendirme yapılmalıdır.
Bölüm 2–5 de biz DNA kesimini ve bağlayıcı teknikleri ve DNA molekül klonlanması için
gerekli olan farklı tip vektörleri tartıştık. İlk bölümlerde klonlama için DNA ‘nın bu segmentlerinin
nasıl elde edildiği gözden kaçan bir sorunduki; Subklonlama prosedürlerinde, kiorada DNA
fragmentleri bir vektörden çıkarıldı ve bir diğerine sokuldu, hedef DNA kaynak vektörün bir
parçasında bulunabilir.
Bizim göz önünde tutmamız gereken donor DNA kaynağının çok kompleks zamanına ne sebep
olduğudur.

109
[Metni yazın]

Tablo 6.1 Memeli BAC kütüphanesi.

Mısır genomundan yada insan genomundan tek geni izole etmek isteyebiliriz. Böyle durumda;
Hedef sekanslar istenmeyen genomik DNA ve diğer genler aracılıyla milyon-fold dilue edilebilir.
Bizim partiküler hedeflerin saptayacağı istenmeyen sekansların büyük miktarlaına rağmen bizim
hızlıca incelemelerimizi yapmamız gerekmektedir.
cDNA yada genomik DNA gibi kompleks kaynaklardan sekansların izolasyonu için iki büyük
yaklaşım vardır. Ancak her klonlama stratejisi Fig 6.1 gösterildiği gibi dört safhaya bölünmüştür. İlki,
hücre temelli klonlama stratejisi ,her klon ve fragment başarılı şekilde DNA içine sokulabilinecektir.
Böyle klonlama türleri, tüm başlama populasyon örnek kütüphaneleri olarak bilinir. Böyle
prosedürlerin bir çoğu sonraki bölümlerde tartışılacaktır. İkinci strateji PCR ‘da kullanılan DNA ‘dan
direkt olarak hedef sekanslar seçilecektir ve sonra her fragment klonlanacaktır. Kütüphane

110
[Metni yazın]

yaklaşımında ; tüm kaynak DNA populasyonu rastgele klonlanmıştı. Tersine, PCR yaklaşımında,
sadece bu seçilen fragmentleri klonlamak için, tarama basamağı prosedürün ilk safhasında yapılmıştır.
Bu bölümde cDNA kütühaneleri ve genomik görüntülemeler ve PCR temelli tekniklerle izole edilecek
genler için karşılaştırıcı kütüphaneleri düşünmeliyiz.

Genomik DNA Kütüphanesi genomu parçalara ayırarak yapılır ve bu parçalar vektöre

birbiriyle çakışacak şekilde klonlanır

İlk genomik kütüphane basit plazmit ve faj vektörlerine klonlandı

İnsan genomunun tamamen haritalanması, klonlanması ve sekansı bilinmesine rağmen
genomik kütüphanelerin nasıl oluşturulacağını ve bir genin nasıl izole edileceğini incelemek hala
önemlidir. Çünkü bu prensipler bütün genomlara uygulanabilir. Basitçe toplam genomik DNA EcoRI
gibi bir endonükleaz ile kesilebilir, parçaları uygun bir λ faj vektörüne sokulabilir. Böylece istenen
klonu izole etmeye girişilebilir. Doğru klonu izole etmek için kaç rekombinant incelemeliyiz? EcoRI
ortalama 4kb’lık fragmentler verdiği varsayılır ve insanın toplam genomu 3,2x106 kb dır. Buna göre
istenen sırayı elde etmek için 7x105 tane bağımsız rekombinantın inceleneceği açıktır. Başka bir
deyişle tam bir genomik kütüphane elde etmek için çok sayıda rekombinanta ihtiyacımız vardır.
Yukarıdaki yolda iki problem vardır. Birincisi gen içinden EcoRI ile bir veya birden çok defa
kesilmiş olabilir. Dolayısıyla tek bir fragment elde edilemez. Bu durum gen büyük olduğu zaman
görülür. Genin yanındaki bölge veya bütün gen elde edilmek istenebilir. Bu iş için 4 kb’lık
faragmentler yeterli değildir. Alternatif olarak gen vektörünün alabileceğinden daha büyük bir EcoRI
fragmenti içerebilir. Bu durumda istenilen gen klonlanmayabilir.

111
[Metni yazın]

Resim 6.1 Klonlama stratejilerine genel bir bakış. Yukarıda oklarla gösterilen şemaya göre klonlama
stratejilerini genel olarak ele alın. Hücreye dayalı klonlama stratejilerine dikkat edin. DNA
fragmentleri önce üretilir ve spesifik olmayan bişekilde klonlanır, böylece istenilen klon bu süreç
sonunda görülebilir. DNA fragmentleri PCR ile yada direkt kimyasal sentezle elde edildiği zaman
ilave bir görüntülemeye(screening) ihtiyaç yoktur.

Bu problemin üstesinden rastgele DNA fragmentlerinin klonlanmasıyla gelinebilir. DNA

rastgele fragmentlere ayrıldığı için herhangi bir dizinin dışarıda kalma ihtimali yoktur. Dahası klonlar
birbirleriyle çakışacak ve uzun genomların oluşması mümkün olacaktır. Her klonlanmış DNA uzun
olduğundan genomik kütüphane oluşturmak için daha az klona ihtiyaç vardır. Her bir genin temsil
edilmesi için kaç klona ihtiyacımız vardır?
n: tek bir klonlama fragmentinin bağıl uzunluğu olsun
İnsan genomu 3,2x106 kb ve ortalama klonlanan fragment 20kb olarak hesaplanırsa n=1.4x105 olur.
Kütüphanedeki bağımsız rekombinantların sayısı n’den daha büyük olmayı gerektirir. Çünkü bazı
diziler birkaç kez klonlanırken bazıları hiç klonlanmayacaktır. Clarke & Carbon (1976) bu amaca
hizmet etmek için bir (bağımsız N rekombinantların,rastgele bir kütüphanede herhangi bir DNA dizisi
içerme olasılığını gösteren) formül türetilmiştir.
N=ln(1-P)/ln(1-1/n)
Bu yüzden 20 kb fragment uzunluğunda,rastgele bir insan genomu kütüphanesinde herhangi
bir özel diziye %95 olasılıkla ulaşmak için;

ln (1 – P) ln (1 – 0,95)
N= N=

112
[Metni yazın]

1 1
ln ( 1– ) ln ( 1 – )
n 1,4x105

%99 ihtimale ulaşmak için rekombinantların çok daha yüksek sayılarına ihtiyaç duyulur. Burası için
N=6,5x105 dir.
DNA parçalarını nasıl elde edebiliriz? Bunun için birçok metot vardır. Mekanik olarak
tesadüfi kırma uygundur. Çünkü ortalama fragment boyutu kontrol edilebilir fakat elde edilen
fragmentleri vektöre sokma ek modifikasyon basamaklarını gerektirir. Daha genel kullanımı olan
prosedürde restriksiyon endonükleazları kullanmak gerekir. Maniatis et al. (1978) (Şekil 6.2)
tarafından geliştirilen bu yöntemde hedef DNA iki restriksiyon enzim karışımıyla sindirilir. Bu
enzimler tetranükleotit tanıma bölgelerine sahiptir ve tam bir double sindirimde ortalama 1 kb’dan
daha kısa fragmentler oluşturur. Bununla birlikte kısmi restriksiyon uygulanırsa daha büyük
fragmentler (10–30 kb ) elde edilir. Mevcut olan her iki restriksiyon bölgesini kesilme şansı hemen
hemen eşittir. Yaklaşık 20 kb’lık fragmentlerin rastgele populasyonunu tayin etmek için jel
elektroforezden yararlanılabilir. İn vitro paketleme (sh. 70) bağımsız rekombinantların büyük oranda
saklanmasını garanti altına alır.

Şekil 6.2. Maniatis yöntemi ile örnek bir gen kütüphanesinin üretimi

113
[Metni yazın]

Maniatis stratejisinde,HaeIII ve AluI gibi tanıma bölgeleriyle ilgisi olmayan 2 farklı

restriksiyon endonükleazın kullanımı,fragmentasyonun neredeyse rastgele elde edilmesini sağlar.Bu
yüzden vektör gelişmelerinin ilk yıllarında alternatif restriksiyon bölgelerine ve genetik markerlerine
sahip çok sayıda farklı vektör kullanılabilir hale gelmiştir,bunlar çeşitli klonlama stratejileri için
uygundur.Bu değişimin iyi bir örneği hem ilave,hemde yedek tip vektörleri içeren Charon serileridir.

Genomik kütüphane oluşturmayı kolaylaştırmak k için daha karmaşık vektörler

geliştirildi
Kolaylaştırılmış bir yol Sau3AI gibi tek bir endonükleaz kullanılarak başarılabilir. Bu yol
enzim çiftleriyle oluşturulan rastgele fragmentlerden daha az fragment oluşturur. Bununla birlikte bu
yol büyük bir avantaja sahiptir. Bu avantaj Sau3AI fragmentlerinin kolayca lambda EMBL3 gibi
BamHI ile parçalanmış (şekil 3) λ’ya sokulabilmesidir. Bunun sebebi Sau3AI ve BamHI’in benzer
yapışkan uçlar üretmesidir (sh. 41).

Resim 6.3. Lamda faj vektörü EMBL 3A’yı kullanarak genomik DNA kütüphanesi oluşturma.
114
[Metni yazın]

Yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA Sau 3AI ile kesilir.Fragmentler 5’fosfat grupları
uzaklaştırılarak fosfataz ile muamele edilir.Vectör BamH1 ve EcoR1 ile polylinker bölgeleri içinden
kesilir.Küçük BamH1 ve EcoR1 polylinker fragmentleri izopropanol presipitasyonu ile çıkarılır veya
alternatif olarak vektör kolları agaroz jel elektroforezi ile polylinkerdan arındırılır.Ardından vektör
kolları kısmi olarak kesilmiş genomik DNA ile birleştirilir.Fosfataz muamelesi genomik DNA
fragmentlerinin birbirleriyle ligasyonunu önler.Rekombinant olmayan vectörler düzeltilemez çünkü
küçük polylinker fragmentler çıkarılmıştır.Sadece paketlenebilir moleküller rekombinant fajlardır.
Bunlar P2 plakları üzerindeki lizojen sup- E.coli ler den elde edilirler. Spi- seleksiyonu red ve gam
genlerinden yoksun fajların geri alınmasını sağlar.Bir sup+ konak gereklidir çünkü bu örnekte vektör
A ve B genlerinde amber mutasyonları taşır.Bu mutasyonlar biyolojik hassasiyeti artırır ve sup+geni
ilave edilmiş DNA veya rekombinasyonel seleksiyon gibi seleksiyon prosedürlerine
başvurulabilir.Sonuçta yabancı DNA polylinkerdaki Sa1 bölgeleri yüzünden vektörden
çıkarılır.Gösterildiği üzere EMBL 3 polylinker orjinal olarak tanımlanamamıştır. Önceden açıklanmış
bir PstI bölgesi ile ekstra bir dizi içerir.Bu bir vektör olarak kullanılmasını etkilemez.
Bu yöntemin uygunluğu ve verimliliğinden dolayı lambda EMBL vektör serisi genomik
kütüphane oluşturmada yaygın olarak kullanılmaktadır. λEMBL vektörleri dolgu fragmentlerinde red
ve gam genlerini ve vektör kollarının birinde bir chi bölgesi taşırlar. Bunlar Spi fenotipinin pozitif
seçimine olanak sağlar (sh.67). λ2001 (Karn et al. 1984), λDASH ve λFIX (Sorge 19 88) vektörleri
dahil çoğu λ vektörleri bu esas üzerine genomik kütüphane oluşturmak için kullanılır. λDASH ve
λFIX türevleri oldukça kullanışlıdır. Çünkü dolgu fragmentinin uçlarından birinde T3 ve diğerinde T7
RNA polimeraz promotoru vardır. Rekombinant vektör restriksiyon endonükleaz ile parçalanırsa
insert DNA’nın sadece kısa fragmentleri bu promotorlara bağlanacaktır. Bu herhangi bir genomik
parçaya karşılık gelen RNA probu üretir. Bu üst üste çakışan klonları belirlemek için kütüphaneyi
araştırmada idealdir. Ayrıca bu işi doğrudan vektörlerden yapması da büyük bir avantajdır. λDASH ve
λFIX’in vektör haritaları şekil 6.4’de gösterilmiştir. λFIX , λDASH’a benzerdir. Fakat λFIX dolgu
fragmentinin yan tarafında XhoI bölgesi içerir. Vektörün XhoI ile kesimi vektörün yeniden ligasyonu
engellenerek yapışkan uçların kısmen doldurulması ile takip edilir. Fakat Sau3AI yapışkan uçlarının
kısmi doldurulması (yapışkan uçtaki 4 nükleotitin 2’sinin polimerazla doldurulması gibi) XhoI
uçlarının kısmi doldurulması ile uyumludur. Bu strateji genomik DNA olmadan vektör kollarının
ligasyonunu ve çoklu fragmentlerin insersiyonunu engeller.

115
[Metni yazın]

Şekil 6.4: λDASH ve λFIX vektörlerinin yer değiştirilmesi. Lamda DASH ve Lamda FIX yeniden inşa edilen
vektörlerdir.Bakteriyofaj T3 ve T7 RNA polymerazları için promotorlar klonlanacak bölgeye yakın bir yere
yerleştirilir ve insertün sonuna uygun problar üretilebilir.

Yüksek yapılı ökaryotlar için genomik kütüphane, genelde yüksek kapasiteli vektörler
kullanılarak oluşturulur
λ fajının türevleri yerine şimdi kosmitler, BAClar, PAClar ve YAClar gibi yüksek kapasiteli
vektörler genomik kütüphane oluşturmak için kullanılmaktadır. Bu gibi vektörlerin avantajı λ fajından
daha büyük gen bölgeleri ilave etmeleridir. Bu yüzden bu tip vektörler büyük genoma sahip canlıların
genomik kütüphanesini oluşturmak için kullanılır.
Genellikle kütüphane oluşturmak için kullanılan stratejiler Maniatis metoduna benzemektedir.
Tek farklılık kısmi restriksiyon sindirim şartları, daha büyük fragmentler için optimize edilmiştir ve
büyüklük ayrımı 30 kb üzerinde ayrım sağlayabilen özel elektroforezle önceden belirlenmelidir.
Modern vektörlerin geliştirilmesi ile kütüphane oluşturmak kolaylaştı. Bununla birlikte ticari
kütüphaneler de mevcuttur. Bu kütüphaneler genelde yüksek kalitededir ve gittikçe popüler
olmaktadırlar. Yüksek kapasiteli vektörler kütüphane oluşturmak için idealdir. Çünkü çok geniş
bölgeler sokabilirler. Fakat böyle kütühaneler oluşturmak zordur. BAC, PAC ve YAC
kütüphanelerinin temel uygulamaları, genom haritalaması ve baz dizisi belirlenmesidir.

PCR, genomik DNA klonlamak için alternatif olarak kullanılabilir

PCR kompleks kaynaklardan spesifik DNA sıralarını çoğaltmak için güçlü bir tekniktir. Sonra
prensipte spesifik primerli PCR genomik DNA dan direk gen izole etmek için kullanılır. Böylece
genomik kütüphane üretme ihtiyacının önüne geçilebilir. Fakat standart PCR ın en önemli dezavantajı
sadece kısa fragmentleri çoğaltabilmesidir. Tipik büyüklük 1-2 kb olmasına rağmen 5 kb ye kadar

116
[Metni yazın]

çıkabilir. Bu durum Taq polimeraz gibi PCR enzimlerinin düşük baz eklemesini ve proofreading
aktivitelerini olmadığını göstermektedir. Bu her iki eksiklik özellikle kalıp uzunsa enzimin kalıptan
ayrılma ihtimalini artırmaktadır. Uzun kalıpların oluşabilmesi için PCR ekstrem reaksiyon şartlarına
ihtiyaç duymaktadır.

Long PCR uzun DNA kalıplarını çoğaltmak için enzim karışımları kullanır
Reaksiyon sıcaklığının düşürülmesi ve pH’nın artırılması ile reaksiyon şartlarının
modifikasyonu polimerazın baz ekleme özelliğini artırır. Böylece kalıp parçalanmadan korunmuş olur
(Foord & Rose 1994). Bu şartlar iki DNA polimerazın kullanılmasıyla sağlanır. Bunlardan biri
proofreading aktivitesine sahiptir (Barnes 1994, Cheng et al. 1994a). Asıl gelişme Taq polimeraz gibi
enzimlerin DNA zincirini uzatırken yanlış baz eklemelerini düzelten proofreading enzimlerinin
kullanılmasından doğmuştur. Normal şartlar altında Taq polimerazın aktivitesi zorlama olunca
yavaşlar. Ayrıca proofreading aktivitesi yoktur. Bu sebeplerden dolayı uzama reaksiyonu sonlanır.
Bunun gibi enzim karışımlarını kullanarak insan genomik DNA’sından 22kb’ın üzerinde
fragmentleri, insanın bütün mitokondri genomunu ve çoğu virüsün bütün genomunu veya tamamına
yakınını elde etmek mümkündür (Cheng et al. 1994a, b). Şimdi birçok ticari şirket long PCR için
uygun enzim karışımları satmaktadır. Örneğin Taq plus long PCR sistemi Stratagene tarafından
pazarlanmaktadır. Long PCR tekniği insan genlerinin yapısal analizinde (e.g. Ruzzo et al. 1998,
Bochmann et al. 1999) ve HIV dahil viral genomlara uygulanmıştır (Dittmar et al. 1997). Long PCR
özellikle Friedreich ataxia (kas koordinasyon bozukluğu) gibi triplet tekrar bozuklukların teşhisinde
kullanılır (Lamont et al. 1997). Bununla birlikte long PCR, halihazırda sekansı belli genlerin
izolasyonu için kullanılırken genomik kütüphanelerin yerine kullanılması pek mümkün değildir.
Aslında long PCR ile gen izolasyonu için genomik kütüphaneler total genomik DNA yerine başlangıç
noktası olarak kullanılabilir.

Fragment kütüphaneleri, geleneksel kütüphane klonları için uygun olmayan

materyallerden hazırlanabilir
Geleneksel genomik kütüphaneler düşük miktarlarda başlangıç materyallerinden
hazırlanamaz. Bu durumlarda PCR, gen izolasyonu için tek yoldur. PCR spesifik fragmentlerin
izolasyonunda kullanılmasının yanında, kütüphanelerin oluşturulmasında da kullanılr. Örneğin
rastgele genomik fragmentlerin temsili örneklerini üretir. Bu ya PCR için uygun rastgele primerler
kullanılarak ya da özel bir strateji ile gerçekleştirilir. Bu stratejide DNA restriksiyon enzimleriyle
kesilir ve sonra primerlerin bağlanabileceği uygun bölgeler oluşturmak için DNA fragmentlerinin
sonuna linkerlerin takılır (e.g. Cheung & Nelson 1996, Zhang et al. 1992). Bu teknikler geleneksel
kütüphane oluşturmak için uygun olmayan DNA ürünlerinden fragment kütüphaneleri

117
[Metni yazın]

oluşturabildiklerinden önemlidirler. Fakat son zamanlarda bu yöntemlerin temsili kütüphaneleri doğru

bir şekilde üretebildiği düşünülmektedir.
Bu problem “whole-genome amplification” adlı bir metotda ele alınmıştır. Bu metotda bütün
genom, herhangi bir dizi, PCR ile çoğaltılır (Lasken & Egholm 2003). Birçok PCR temelli teknik
geliştirilmesine (sh. 34) rağmen kullanılışlılıklarını sınırlayan kısa fragmentler üretirler. MDA olarak
adlandırılan yeni bir gelişme kaydedilmiştir. MDA’da dallanan bir reaksiyon serisi vardır ve yüksek
doğruluğu ve çalışma kapasitesi olan bakteriyofaj ɸ29 DNA polimerazını kullanır. Ürün uzunluğu
genellikle 20-200 kb’dır. Bu uzunluk genomik kütüphane oluşturmak için uygundur. MDA’nın
prensibi sh. 34’te anlatılmıştır.

mRNA'nın revers transkripsiyonuyla komplementer DNA (cDNA) kütüphaneleri

oluşturulur

cDNA, mRNA populasyonunun temsilcisidir ve bu yüzden özel dokulardaki splice

izoformlarının çeşitliliğini ve mRNA seviyelerini yansıtır
Komplementer DNA (cDNA) hücresel mRNA revers transkripsiyonu ile hazırlanır.
Klonlanmış ökaryotik cDNA'lar kendi özel kullanımlarına sahiptir. Bunlar da genomik DNA da
bulunan diğer kodlanmayan sekanslar ve intronlar yoktur. İntronlar bakteride nadirdir, fakat daha
yüksek ökaryotların çoğu genlerinde bulunur. Ep genlerin içinde değil 5’-3’ kodlamayan URL’ler
içinde bulunabilirler. Her halükarda, gen transkribe olduğunda, RNA polimeraz tarafından kopyalanır.
Primer transkript, olgun mRNA olarak sitoplazmada görünmeden önce, nükluestaki işlenir.İşleme
splicing ile intron dizilerinin çıkarılmasıdır. Bazı memeli genlerinin büyük bir kısmını intronlar
oluşturur.Örneğin, insan dystrophin geninin %99'dan fazlasını oluşturan 79 intron içerir. Bu gen
yaklaşık 2.5 Mb uzunluğundadır fakat ilgili cDNA hemen hemen 11 kb üzerindedir. Böylece, cDNA
klonlamasının bir avantajı cDNA klonunun boyutunun birçok olguda ilgili genomik klondan önemli
derecede daha düşük olmasıdır. Bakteride ökaryotik intronlar çıkarılamadığından ökaryotik genler
cDNA klonu olan e.coli’ye klonlanıp, ekspres edilmelidir. 1. amaç polipeptid ürünü meydana
getirmekse veya klon belirlemekse genomik DNA’nın dizisi belliyse cDNA dizisi ile karşılaştırılarak
intron/ekzon sınırları bulunabilir.
Bazı durumlarda saf bir mRNA türünden cDNA 'yı direkt olarak hazırlamak mümkün olabilir.
Genellikle bir cDNA kütüphanesi mRNA'ların bir populasyonu revers transkrip tarafından
hazırlanabilir ve daha sonra özel klonlar için bu kütüphane taranabilir. Önemli bir fikir ise, cDNA
kütüphanesinin türetilen RNA populasyonunun örneği olmasıdır. Böylece genomik kütüphaneler
DNA'nın izole edildiği gelişimsel basamağa veya hücre tipine bakılmaksızın genellikle benzer iken
cDNA kütüphanelerinin içeriği bu paremetrelere göre geniş bir şekilde değiştirecektir. Belirli cDNA
kütüphanesi mRNA'larınn çokluğu için zenginleştirilebilir, fakat nadir mRNA'ları oluşturan sadece az

118
[Metni yazın]

klonları içerir. Ayrıca bir gen farklı şekillerde birbirine bağlandığında bir cDNA kütüphanesi alternatif
bağlantı değişkenlerini oluşturan farklı klonları içerecektir.
Tablo 6.2 iki örnek dokulardaki mRNA'ların farklı sınıflarının miktarlarını gösterir. Genel
olarak mRNA'lar biraz, çok veya az olarak tanımlanabilir. Tavuk ovidüktünde bildirildiği gibi bir
mRNA tipi aşırı miktardadır.Bu major yumurta akı proteini olan ovalbuminini kodlar. Bu yüzden
başlangıç populasyonu bir kütüphanenin kullanımı olmaksızın elde edilebilen ovalbumin cDNA'sından
izole edilen ovalbuminin mRNA'sında doğal bir biçimde zenginleştirilmiştir. Böyle çok cDNA'ları
elde etmek için uygun bir strateji, M13mp8 gibi bir M13 vektöründe onları direkt olarak klonlamaktır.
Klonların bir kısmı sonradan hızlı bir şekilde dizilebilir ve her bir kodlanan polipeptidin temelinde
tanıtılır. Bu stratejinin başarılı bir demostrasyonu kas cDNA klonlarında rastgele seçilen 178 DNA
dizilerini belirleyen Putney ve arkadaşları (1983) tarafından rapor edilmiştir. Miktarı yüksek 19 kas
özel proteini için uygun olan amino asit dizilerine temel alır. Onlar birçok farklı protein değişkenleri
içeren bu 19 proteinin 13'ü tanımlanabildi.
Orta ve düşük miktar sınıflardaki cDNA klonlarının izolasyonu için bir cDNA kütüphanesi
oluşturmak genellikle gereklidir. Çok sayıda cDNA klonları elde etmek için λ faj vektörleri yapılır. in
vitro paketleme, yüksek verimle elde edilmiştir. En yaygın kullanılan vektörlerin bazıları ve cDNA
klonlaması için λ insersiyon vektörleri özellikle uygundur. Kutu 6.1'de tartışılmıştır.
Çoğu hücre tipinden düşük miktardaki mRNA'ların izolasyonu için 105 klon yeterlidir, yani
her hücrede 15 molekül veya yukarısı mevcuttur. Bununla beraber, bazı mRNA'lar bundan daha az
sayıdadır ve onlar özel bir dokudaki sadece birkaç özel hücrede ekspres edilirse, daha fazla
seyreltilmiş durumdadır. Bu şartlar altında, kütüphane yapımından önce mRNA preparasyonu değer
kazandırılabilir, yani istenilen molekülün varlığı için fraksiyonları test etme ve boyut fraksiyonlama.
Bunu başarabilmenin yolu, ilgili protenin üretimi için onları test etme ve Xenopus oocytes içine
mRNA fraksiyonlarını enjekte etmektir. Sayfa 122'de substraksiyon klonlamasının tartışmasını gör.
Tablo 6.2 Tipik mRNA Populasyonlarının Bolluk Sınıflandırılması

Kaynak Farklı mRNA’ların Sayısı Bolluk

(molekül/Hücre)

9 12000
Fare Karaciğer sitoplazmik Poli (A)+ 700 300
11500 15

1 100000
Tavuk Rahmi Polizomal Poli (A)+ 7 4000
12500 5

Referans: Fare ( Young ve ark. 1976); tavuk Rahmi (Axel ve ark. 1976).

119
[Metni yazın]

KUTU 6.1 cDNA klonlaması ve ekspresyonu için λ faj vektörleri λgt10 ve λgt11
Önceden cDNA kütüphaneleri plazmit vektörleri kullanılarak yapılırdı ve bunları uzun süre
muhafaza etmek ve saklamak zordu. λ faj kütüphaneleri tarafından büyük ölçüde değiştirildi. λ faj
kütüphaneleri süresiz saklanabilir ve çok yüksek titreler için hazırlanabilir. λgt10 ve λgt11 yaklaşık
1990'a kadar, cDNA klonlamak için standart vektörlerdi. Hem λgt10 hem de λgt11 insersiyon
vektörlerdir ve sırasıyla yabancı DNA'nın yaklaşık 7.2kb ve 7.6 kb'nı kabul eder. Her durumda,
yabancı DNA bir tek EcoRI klonlama bölgesine klonlanır. λgt10 hibridizasyon ile gösterilen
kütüphaneleri yapmak için kullanılır. EcoRI bölgesi plak morfolojisinin temelinde seçmeyi sağlayan
faj cl genini keser. λgt11 lac promotörü tarafından çalıştırılan E.coli lac Z genini içerir. Eğer doğru
şekilde ve okuma çerçevesinde insört olmuşsa, cDNA dizileri β-galaktozidaz füzyon proteinleri gibi
ekspres olabilen bu vektörlerde klonlanmıştır ve immünolojik tarama veya diğer ligandlar ile
taramayla saptanabilir( bakınız sayfa 117)., yüksek titreleri mümkün olduğu için λgt10 bu tarama
stratejisi için daha uygun olmasına rağmen, λgt11 kütüphaneleri hibridizasyon ile de gösterilebilir.

λ ZAP serileri
λ faj vektörleri daha iyi kütüphaneleri üretmek ile birlikte, onlar plazmit vektörleri gibi rahat
kullanımları yoktur. Bu nedenle, faj klonları daha fazla analiz için plazmitler içine subclonin
yapılmalıdır. Geleneksel λ faj vektörlerinin bu sınırlaması hibridlerin gelişmesiyle aşılmıştır.bu
hibritler fajmitler olarak adlandırılırlar. Fajmidler hem λ bakteriyofajların hem de plazmitlerin en iyi
özelliklerine sahiptir (bakınız bölüm 5). cDNA klonlaması için şimdiki en popüler vektörler hiç
kuşkusuz λZAP serisinin çoğu Stratagene tarafından pazarlanmıştır( Short ve arkadaşları 1988).
Orjinal λZAP vektörünün bir haritası şekil.b6.1’de gösterilmiştir. Bu vektörün özelliklerinin
avantajları : (i) yabancı DNA'nın 10 kb'ı kadar klonlam mümkündür. Çoğu cDNA'yı içine almak için
yeterince büyüktür. (ii) çok yönlü klonlamayı arttıran ve altı kendine özgü restriksiyon bölgesi ile bir
polilinkerın bulunması direkt olarak klonlamaya da izin verir. (iii) polilinkerın iki tarafında T3 ve T7
RNA polimeraz promotorlarının bulunması insörtten sens ve antisens RNA transkripsiyonuna imkan
sağlar. Hepsinden önemlisi bütün bu özellikleri taşıyan ve genomuna entegre olabilen pBluescript
denilen bir plazmit vektör içinde vardır. Bu klon yüksek kopya sayılı plazmitler gibi herhangi bir alt
kopyaya ihtiyaç duymadan bakteri içinde çoğaltılabilir.bakteri iççinde çoğaltılabilmesi için bu klonun
pBluescriptin entegre olarak bulunduğu hücreyi yardımcı F1 fajı ile koinfekte etmek
gerekir.koenfeksiyon plazmit λZAP vektörünü plazmitin uçlarından keserek genomdan ayrılmasını
kolaylaştırır. nedenle cDNA klonu fajdan kurtarılabilir ve kesmeyi kolaylaştıran ve plazmitlerin
yanlarındaki λ ZAP vektörünü çentikleyen yardımcı f1 fajı ile bakteriyi bulaştırması ile basit bir
şekilde herhangi bir alt klonlama yapmaksızın bir yüksek kopya sayısı plazmit olarak çoğaltabilir. Bu
serinin diğer üyesi olan λ ZAP Express insan sitomegalovirus promotörü ve SV40 terminatörü içerir.
Bu yüzden, füzyon proteinleri bakteri gibi memelilerde ekspres edilebilirler. Bu nedenle, cDNA

120
[Metni yazın]

kütüphaneleri E.coli'deki faj vektörlerinde klonlanabilir ve plazmitler gibi kurtarılabilir ve sonra

ekspresyon klonlaması için memeli hücrelerine transfer edilebilir.

Şekil B6.1 Prototip λ ZAP vektörünün lineer faj haritası ile kesilmiş pBluescript'in halkasal haritası
gösterilmiştir.

cDNA kütüphane yapımının ilk aşaması mRNA'nın kalıp olarak kullanılarak çift zincir
DNA'nın sentezidir.
Bir klonlama vektörü içine insersiyon için uygun çift zincir cDNA'nın sentezi 3 ana adım
içerir: (1) kalıp mRNA üzerinde birinci DNA zinciri oluşturmak revers transkriptaz enzimi ile yapılır.
(2) kalıp RNA'nın uzaklaştırılması ve (3) birinci DNA zincirini kalıp olarak kullanılarak ikinci DNA
zincirin sentezi E.coli DNA polimeraz I gibi DNA'ya bağımlı DNA polimeraz ile yapılır. Bütün DNA
polimerazlar ya DNA ya da RNA'yı kalıp olarak kullanırlar DNA sentezini başlatabilmesi için bir
primere ihtiyaç var.
ilk cDNA klonlamaların raporları 1970'in ortalarında yayınlanmıştır ve homopolimer kuyruğu
tekniği ile yapılmıştır. Bu teknik 3. bölümde kısaca anlatılmıştır. Bu alternatif metodlardan en populer
olanı Maniatis ve arkadaşlarının yayınladığıdır(1976). Bu metod mRNA'nın poliadenilat kuyruğu bir
oligo-dT primerleri ile yapıştırılarak cDNA sentezinin ilk zincirini içerir ve ilk cDNA zincirinin geçici
olarak hairpin loop şeklinde geriye doğru katlanmaya meğilli olmasından faydalanılır.ikinci zincirin
kendiliğinden hazırlanması ile sonuçlanır.örneğin S1 nükleaz , klonlama vektöründe araya girmesine
izin verir(Şekil 6.5).

121
[Metni yazın]

Şekil 6.5 İlk zamanlarda kullanılan bir cDNA klonlama stratejisi: hairpin oluşumuyla ikinci zincir sentezi ve
vektöre cDNA’yı klonlayabilmek için homopoliper kuyruklama

Tablo 6. 2 Tipik mRNA populasyonlarının yoğunluk sınıfları

Kaynak Farklı mRNA’ların sayısı Yoğunluk (molekül/hücre)

Fare karaciğeri sitoplazmik 9 12000
poly (A)+
700 300

11500 15

Tavuk ovaryumu 1 100000

polizomal poly (A)+
7 4000

12500 5

122
[Metni yazın]

Firkete metodunun önemli bir dezavantajı klonun 5’ucundaki dizinin belirli bir miktarının
kaybolmasındaki S1 nükleaz sonuçları ile kesilmesidir. Bu yüzden, bu strateji ikinci zincir sentezinin
başka bir primerle yapılmasıyla ortadan kaldırılmıştır. En basit stratejilerden biri Şekil 6.6'da
gösterilmiştir.(Land ve arkadaşları 1981) Genel olarak oligo-dT primeri ile yapılan ilk zincir
sentezlendikten sonra, cDNA terminal transferaz enzimini kullanarak sistin kuyruğu yapılır. ikinci
zincirin sentezine izin verirken, bu suni oligo-dC kuyruğu sentetik oligo-dG primeri için yapışma
bölgesi olarak kullanılır. bu metod kullanılırken Land ve arkadaşları(1981) tavuk lizozim geni için
karşılık gelen bir tam boy cDNA izole edilebildi. bununla birlikte, verimlilik diğer cDNA'lar için daha
düşük olabilir.(ör. Cooke ve arkadaşları 1980)

Şekil 6.6 cDNA klonlaması için geliştirilen metot, ilk zincire oligo(dC) kuruğu takılır, bir oligo(dG) primeri
kullanılarak ikinci zincirin başlatılmasına izin verilir.

cDNA ekspresyon kütüphaneleri için, eğer cDNA'ların doğru şekilde vektöre

eklenebiliyorsa,bu avantajdır. Kendiliğinden primer metodu ile hairpin döngü kesilmeden önce çift
sarmallı cDNA molekülüne bir sentetik linker eklenerek başarılabilir (örn. Kurtz & Nicodemus 1981;
Şekil 6.7a). Burada ikinci iplik primerdir, direkt klonlama bir linker dizisi içeren bir oligo-dT primer
kullanılarak başarılabilir.(örn. Coleclough & Erlitz; Şekil 6.7b). Alternatif bir plazmit ile her zaman
bağlı olan cDNA sentezi için primerler kullanılır. Bu strateji Okayama & Berg (1982) tarafından
tasarlanmıştır ve iki önemli daha özelliği vardır. Birincisi, tam uzunlukta cDNA'lar tercihen elde edilir,

123
[Metni yazın]

çünkü bir RNA-DNA hibrit molekül ilk iplikçik sentez sonucu, bir terminal transferaz reaksiyonu için
substrattır. İkincisi, ikinci zincir sentez basamağı RNaz H ile çoklu klonlama bölgesinde RNA
kesilmesi ile primer yapılır. ikinci zincir sentezinden dolayı yüksek verimli çentik-translasyon
reaksiyon tipi ile meydana gelir. İkinci zincirin tekrardan sentezini içeren daha basit cDNA klonlama
stratejileri yaygın olarak kullanılmaktadır. Yaygın adıyla bilinen Gubbler-Hoffman reaksiyonu Şekil
6.8'de gösterilmiştir.

Şekil 6.7 Doğru oryantasyonlu cDNA klonlama metodu. (a) ilk stratefi; firkete oluşturmuş cDNA’nın açık ucuna
spesifik bir linker (örneğin SalI için kesim bölgesi bulunan) takılır. Bu ligasyonu takiben S1 nükleaz ile firkete
yapı kesilir ve her iki uca EcoRI kesim bölgeli linkerlar takılır. EcoRI ve SalI ile kesim sonucu fragmentler
124
[Metni yazın]

üretilir. Aynı enzimlerle doğru bölgeleri kesilen vektöre insert doğru oryantasyonda klonlanmış olur. (b) benzer
bir strateji; fakat ikinci zincir sentezi rastgele primerler kullanılarak sentezlenir. Oligo-dT primeri SalI için kesim
bölgesi taşır. İkinci zincirin senteziyle çift zincir SalI kesim bölgeli linker oluşmuş olur. cDNA’nın doğru
oryantasyonda klonlanabilmesi için yukarıdaki gibi EcoRI linkerleri her iki uca eklenir. (c) Okayama & Berg
(1982) stratejisi; mRNA, cDNA sentezinden önce plazmid klonlama vektörüyle tek yönlü birleştirilir.

Şekil 6.8 Gubbler-Hoffman metodu, metodu klonlama yönünün dikkate alınmadığı basit ve genel bir metod. İlk
zincir sentezi oligo-dT primerleri kullanarak yapılır. İlk zincir sentezi tamamlandığı zaman, RNA, RNaz H ile
uzaklaştırılır ve ikinci zincire rastgele primerler takılır ve DNA polimeraz I ile ikinci zincir sentezlenir. Vektöre
klonlamadan önce oluşan cDNA’nın uçlarının küt olduğundan emin olmak için T4 DNA polimeraz kullanılır.

Tam uzunlukta cDNA elde etmek zor iş olabilir

cDNA kütüphanelerinin üretilmesi için uygun yaklaşımların iki önemli dezavantajı vardır.
Birincisi ilk zincir sentezinin başlaması için oligo-dT primerlerinin kullanıldığı zaman genellikle 3’
uca bir eğilim vardır (cDNA sekansının 3’ ucunu sunan klonların seçiminde bir tercih oluşu). Bu,
cDNA’nın ilk ve ikinci zincirinin sentezi için çoğunlukla hekzamerler olmak üzere rastgele
oligonükleotid primerlerin kullanılmasıyla açıklanabilir. Buna rağmen, kütüphane oluşturmada bu 3’
uçların tercihini elimine ederken, oluşan klonlar olması gerektiğinden çok daha küçüktürler öyleki,
birkaç kısa fragmentin birleşmesiyle tam uzunluktaki cDNA’lar oluşmuş olmalıdır. İkincisi,
cDNA’nın büyüklüğü arttıkça, tam uzunlukta cDNA içeren klonları izole etmekte zorlaşır. Bu, kısmi
olarak ilk zincir cDNA sentezi için kullanılan reverse transkriptazdaki kusurlar yüzündendir. Bu
enzimler çoğunlukla avian miyelobastosis virus (AMV) ‘den saflaştırılır veya E.coli’ye klonlanmış
Moloney murine leukemia virus (MuLV) geninden üretilir. Doğal enzimler, RNA kalıplarını
parçalayan RNaz aktivitesine sahiptir ve işlerliği çok azdır (Champoux 1995). Bir çok şirket RNaz H
aktivitesinden yoksun bioteknik murine reverse transkriptaz üretir ve bunlar tam uzunluktaki cDNA
ürütmek için çok daha etkindirler (Gerard & D’Allesio 1993). Life Technologies tarafından satılan
Superscript II enzimi bu enzimlere bir örnektir (Kotewicz et al. 1988). Bu enzim 50ºC’ye kadar
reverse transkriptaz aktivitesini gerçekleştirebilir. Doğal enzimlerin optimal fonksiyonu 37ºC’dedir ve
bundan dolayı, sekonder yapıda zengin olan sekanslarda durma eğilimindedir, sık sık 5’ ve 3’ transle
125
[Metni yazın]

olmayan bölgelerde olduğu gibi. Bu sebepten, reaksiyon RNA’da oluşan katlanmaları engellemek için
genellikle 50ºC’de yapılır
Reverse transkriptazların geliştirilmesine rağmen büyük mRNA’lardan geliştirilen tam
uzunluktaki cDNA klonlarının üretilmesi bir problem olarak kalmıştır. Bu 5’ uçları tam olan
mRNA’ların seçimini içeren cDNA klonlama stratejilerinin geliştirilmesiyle açıklanmıştır. Hemen
hemen bütün ökaryotik mRNA’lar özelleşmiş bir 5’ şapka metilenmiş guanin bazlarına sahiptir ve bu
5’ şapka protein sentezini başlatabilmesi için ribozomun tanıma bölgesidir. Nükleaz uygulaması ve
şapka seçiminin birlikte kullanılmasıyla, tam-uzunluk ilk zincir cDNA’ların seçilmesi mümkündür ve
bu yüzden üretilen kütüphaneler fazla miktarda tam uzun klonlarla zenginleştirilir.
Edery ve arkadaşları (1995) tarafından açıklanan yukarıdaki bu örneğe bir örnek: (Şekil 6.9)
bu stratejide, ilk zincir cDNA sentezi oligo dT primerleri kullanarak başlatılır. Sentez reaksiyonundan
sonra hibrid molekül (RNA:cDNA) sadece tek zincir RNA’yı parçalayan RNaz A ile muamele edilir.
DNA:RNA hibridleri bundan dolayı tam olarak kalırlar. Eğer ilk zincir cDNA tam uzunluktaysa,
mRNA’nın 5’ şapka kısmına kadar sentezlenmiştir ve bu yüzden mRNA RNaz A tarafından
parçalanmaktan korunmuştur. Buna rağmen, kısmi uzunluktaki cDNA’lar enzimle kesilip
uzaklaştırılmış şapka ve çift zincir bölgenin ucu arasında kalan korunmayan tek zincir RNA’lardan
ayrılacaktır. Bu posedürün sonraki basamağında ökaryotik translasyonun başlangıç faktörlerinden eIF-
4E tam uzun molekülleri affinite ile izole etmek için kullanılır. Kırık kalıplar üzerinden sentezlenen
tamamlanmamış cDNA’lar ve cDNA’larında şapka olmayanlar tutunamayacaktırlar. mRNA’nın
biyotinlenmesine dayanan benzer bir metot
rapor edilmiştir (Caminci ve arkadaşları
1996). Buna rağmen, her iki yöntemle de
oluşturulan bir kütüphanede, klonların %10’u
kadar olabilen, ilk zincir sentezinde yanlış
primerleşme sonucu oluşan cDNA’lar da
saflaştırılır.

Şekil 6.9 tam uzunlukta cDNA üreten CAPture

metodu; koplementer DNA zinciri ile RNaz
parçalamasından şapkayı korunmasıyla, ökaryotik
başlama faktörlerinden eIF-4E ile şapkalı mRNAların
seçimi

126
[Metni yazın]

Oligo-capping denilen alternatif bir metot RNA safhasında seçimle bu problemi çözer
(Maruyama &Sugano 1994, Suzuki ve arkadaşları 1997, Suzuki ve arkadaşları 2000: şekil 6.10).
metodun temeli RNA’nın alkalin fosfataz ve asid pirofosfatazla muamele edilmesine dayanır. İlk
enzim şapkalı olmayan mRNA moleküllerinin 5’ ucundan fosfat grubunu uzaklaştırır; fakat 5’ şapkası
olan tam uzunluktaki moleküller de etkili değildir. İkinci enzim 5’ uç kısımlarda bir fosfat grubu
bırakarak tam uzun RNA’lardan şapkayı uzaklaştırır. Tam uzun moleküller spesifik bir
oligonükleotidle yapıştırılabilir; fakat kırılmış veya parçalanmış moleküller yapışamaz. Sonuç birden
çok şapkaya sahip olan tam uzun mRNA’ların bir
populasyonudur. Bu seçilen populasyonun oligo dT
primerleri kullanılarak reverse transkripsiyonu
yapılır. Daha sonra ikinci zincir sentezi ve klonlama,
oligo dT primeri ve bir primerin oligonükleotid
şapkayla hibritleşmesi kullanılarak PCR’la
gerçekleştirilir. Sadece primerlerin her ikisiyle
hibritleşen tam uzunluktaki cDNA’lar çoğaltılacaktır,
bundan dolayı kırık veya parçalanmış RNAlar
tamamlanmamış ilk cDNA zincirleri (5’ primer
bağlanma bölgesi olmayan) ve yanlış primerleşmiş
cDNA’lar (3’ primer bağlanma bölgesi olmayanlar)
elimine olacaktır.

Şekil 6.10 oligo şapkalama, ardarda alkalin fosfataz ve asit

pirofosfataz ile muamelesi tarafından tam uzunlukta
RNA'lar için özel oligonükleotit primerin eklenmesi. Bir
kez oligo şapka mRNA'nın 5' ucuna yapıştırmaya sahiptir,
bu PCR çoğaltması için bir primer bağlama bölgesi olarak
görev yapabilir.

PCR, cDNA klonlamada alternatif olarak kullanılabilir

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile takip edilen reverse transkripsiyon (RT-PCR), RNA
sekansının cDNA’ya dönüşmesini sağlar. Temel PCR stratejisinden farklı değildir, sadece farklı olarak
PCR’da kullanılacak kalıp, reverse transkripsiyon ile aynı reaksiyon tüpünde üretilir. RT-PCR, gen
spesifik primerler kullanıldığında, spesifik cDNA moleküllerini klonlamada ve belirlemede oldukça
duyarlı olur. Reverse transkripsiyon, tek zincir cDNA oluşturan 3’ primer ile gerçekleştirilir, daha
sonra reaksiyon karışımına 5’ primeri ilave ederek PCR amplifikasyonu başlatılır. Başlangıç materyali

127
[Metni yazın]

olarak cDNA klonlamada kullanılan poli(A) kuyruklu RNA’dan ziyade total RNA kullanmak daha
anlamlıdır. Total RNA mRNA’dan başka tRNA ve rRNA’yı da içerir.
RT-PCR çabuk sonuç verdiğinden klonlamada gerekli olan cDNA sekansını oluşturmada etkili
bir yaklaşımdır. cDNA kütüphanesi oluşturmak oldukça zahmetli bir iştir. Zahmetli olmasının dışında
cDNA kütüphanesi çok uzun kodlama bölgesi içeren bir cDNA klonu içermez, çünkü böyle bir cDNA
klonu oluşturmak teknik olarak zordur. Böyle zor oluşturulan cDNA özel cDNA kütüphanesinde çok
nadir bulunur. Bu, cDNA kütüphanelerinin kaybolmaya yüz tuttuğu anlamına mı geliyor? RT-PCR’ın
avantajlarına rağmen cDNA kütüphanesi oluşturmanın çeşitli sebepleri vardır. Birincisi, başlangıç
materyalinin mevcudiyeti ve kütüphanenin kalıcılığıdır. Zor bulunan bir mRNA çok az miktarda insan
dokusundan elde edilebilir. Kaliteli bir cDNA kütüphanesi bu mRNA’dan oluşturulabilir. Gerçekten
de PCR ile oluşturulan cDNA kütüphane için kaynak olarak kullanılabilir. İkincisi, hibridleşme
stratejileri ile ilgilidir. PCR’a dayalı yaklaşımlar spesifik primerlere bağlıdır.
Genomik kütüphanelerle ilgili yukarıda anlatıldığı gibi PCR, geleneksel yaklaşımlar için uygun
kaynak olmadığında, kütüphane yapımında DNA sağlamak amacıyla kullanılabilir. Gen spesifik
primerlerin yerine bütün mRNA’ların amplifikasyonunu sağlayan universal primerler kullanılabilir.
cDNA kütüphanesi yaparken PCR’ı kullanmanın dezavantajı, PCR’da kullanılan DNA polimerazların
çift zincir sentezinde kullanılan DNA polimerazlardan daha fazla hata oranına sahip olmasıdır. Bu
yüzden kütüphane çok sayıda hata içerebilir.
RT-PCR’daki temel problem, kontamine olan genomik sekansların amplifikasyonundan
kaynaklanır. Az miktarda genomik DNA bile çoğaltılabilir. Ökaryotik mRNA’ları çalışırken farklı
ekzonlara bağlanabilen primerler seçilir. Bu mümkün değilse RNA DNazlarla muamele edilerek
herhangi bir DNA kontaminantı yok edilir.

128
[Metni yazın]

Şekil 6.11 cDNA uçlarının hızlı amplifikasyonu (RACE) (Frohman et. al 1988).
3’ protokol: mRNA oligo(dT) primer kullanılarak reverse transkriplenir. Bu primer 5’ ucunda 17
nükleotidlik bir sıraya sahiptir. Bu sıra restriksiyon bölgeleri içerecek şekilde dizayn edilir.
Amplifikasyon 17 nükleotidlik primer kullanılarak yapılır. 5’ Protocol: mRNA spesifik primerden
reverse transkriplenir. Oluşan cDNA’nın 3’ ucuna terminal transferaz enzimi ile poli (dA) kuyruğu
takılır. Amplifikasyonn 3’ protokolde yapıldığı gibi yapılır. Açık renk kutular yeni sentezlenen
DNA’yı gösterir. Renkli kutular bir önceki basamakta sentezlenen DNA’yı gösterir.

129
[Metni yazın]

Şekil 6.11 cDNA uçlarının hızlı amplifikasyonu (RACE) (Frohman et. al 1988).
3’ protokol: mRNA oligo(dT) primer kullanılarak reverse transkriplenir. Bu primer 5’ ucunda 17 nükleotitlik bir
sıraya sahiptir. Bu sıra restriksiyon bölgeleri içerecek şekilde dizayn edilir. Amplifikasyon 17 nükleotitlik primer
kullanılarak yapılır. 5’ Protocol: mRNA spesifik primerden reverse transkriplenir. Oluşan cDNA’nın 3’ ucuna
terminal transferaz enzimi ile poli (dA) kuyruğu takılır. Amplifikasyonn 3’ protokolde yapıldığı gibi yapılır.
Açık renk kutular yeni sentezlenen DNA’yı gösterir. Renkli kutular bir önceki basamakta sentezlenen DNA’yı
gösterir.

cDNA’ların Uçlarının Hızlı Amplifikasyonu (RACE) ile Uzun cDNA’lar Oluşturulabilir.

Kütüphanelerdeki tamamlanmamış cDNA sekansı sorununu çözmenin bir diğer yolu cDNA
uçlarının hızlı amplifikasyonudur. Hem 5’ RACE hem de 3’ RACE protokolleri bulunmaktadır. 3’
RACE, random primerler kullanılarak cDNA oluşturulduğu durumlarda kullanılır. Her bir durumda
mRNA sekansının sadece sınırlı bilgisi gereklidir. mRNA’da tek sıranın uzaması yeterlidir, bu yüzden
cDNA kütüphanesindeki tamamlanmamış klon iyi bir başlangıç noktasıdır. Dışa doğru olan spesifik
primerler seçilir ve bu primerler çakışan cDNA fragmentleri oluşturur. Her iki RACE protokolünde de
cDNA’nın transkriptin uçlarından spesifik primerlere doğru uzaması, ya mRNA’nın doğal 3’ poli ( A)
130
[Metni yazın]

kuyruğuna hibridize olan primerler kullanılarak ya da tek zincir cDNA’nın 5’ ucuna eklenen sentetik
poli (dA) ile hibridize olan primerler kullanılarak gerçekleştirilir (Şekil 6.11). Sonuçta,
amplifikasyondan sonra çakışan RACE ürünleri uzun cDNA oluşturmak için birleştirilebilir.
RACE prensip olarak basittir. Ancak normal cDNA klonlama prosedürünü etkileyen
sınırlamalar RACE’de de vardır. Örneğin 5’ RACE’de reverse transkriptaz mRNA’nın 5’ ucuna
varamayabilir; fakat bütün tek zincir cDNA’lara daha sonraki reaksiyonlarda kuyruk eklenir. RACE
protokollerinde spesifik primerler kullanıldığı için amplifikasyonun spesifikliği çok yüksek
olmayabilir. Bu sorunun üstesinden gelebilmek için nested primerler kullanılabilir.

Kütüphane taraması için pek çok farklı strateji mevcuttur

DNA kütüphanesinden spesifik klonun tanımlanması ya klonun sekansı ya da expreslenen
ürünün yapısı/ fonksiyonu kullanılarak yapılabilir. Klon sekansı biliniyorsa; genomik veya cDNA
kütüphaneleri primer kullanılarak PCR ile ya da nükleik asit hibridizasyonu ile taranabilir. Her
durumda prob veya primerlerin dizaynı tek bir spesifik klonda veya yapı olarak ilişkili klonların
grubunda kullanılır. PCR taramanın aynı zamanda klonlanmamış genomik DNA ve cDNA’dan DNA
sekanslarını izole etmek için kullanıldığına dikkat edilmeli. Klon ürünü ancak ekspresyon
kütüphanelerinde mümkündür.Kütüphaneler DNA fragmentlerinin bir protein ürününe ekspreslendiği
yerlerdir. Bu durumda klon ürünü bir antikor veya bir ligand tarafından tanınır veya ürünün biyolojik
aktivitesi mevcuttur ve bir assay ile tespit edilebilir. Genin büyük olduğu durumlarda gene ait tek
RNA bölgesi dizisi varsa özellikle hibridizasyon yapılır. İki bölge varsa reverse PCR yapılır.

Genomik DNA ve cDNA kütüphaneleri hibridizasyonla taranabilir

Nükleik asit hibridizasyonu, kütüphanelerin taranmasında en çok kullanılan yöntemlerden
biridir. Bu yöntemle çok sayıda klon oluşturulabilir. cDNA kütüphanelerinde tam uzunlukta olmayan
klonların tanımlanmasında da kullanılabilir.
Grunstein ve Hogness (1975) radyoaktif RNA probları kullanarak in situ hibridizsayonla
yabancı geni içeren kolonilerdeki DNA sekanslarını belirlemek için bir tarama prosedürü geliştirdiler.
Bu prosedür, binlerce koloni arasından hedef sıra içerenleri çabucak belirleyebilir. Ayrıca, bu yöntem
de yapılan bir değişiklikle, yüksek yoğunluktaki koloni plakları taranmıştır (Hanahan ve Meselson
1980). Bu yöntemde, inokülasyondan önce, tarama yapılacak koloniler, ilk olarak bir nitroselüloz
filtreye replica plate yapılır. Yani nitroselüloz membran kolonilerin üzerine yerleştirilerek bakterilerin
membrana geçmesi sağlanır. Bu işlemden önce, nitroselüloz membran üzerindeki kolonilerin petrideki
hangi koloniye denk geldiğini bulmak için, membran ve petri aynı yerden işaretlenir. Bakteri ve
kolonilerin parçalanması içerdikleri DNA’nın denatürasyonu için alkali ile muamele edilir ve
membranda denatüre edilmiş DNA bandları kalır. Bu işlem, hibridizasyonda DNA ve probun birbirine
olan afinitesini artırır. DNA 80oC’de fiske edilir. Daha sonra işaretlenmiş DNA probları ile hibridize

131
[Metni yazın]

edilir. Bu hibridizasyon sonucu otoradyografi ile görüntülenir. Otoradyografi sonucunda DNA izi
pozitif çıkan koloni, ilk başta işaretlenen kolonilerle karşılaştırılarak ilgili koloni çıkarılır (şekil 6.12).
Bu yöntem faj plaklarına da uygulanabilir. ( Jones ve Murray 1975). Benton ve Davis (1977)
de “plak lift” denen bir metod geliştirdiler. Bu yöntemde, nitroselüloz membran agar yüzeyinde oluşan
plaklar üzerine konulur. Bu plaklar yüksek miktarda paketlenmemiş rekombinant DNA içerdiği gibi
faj partiküllerini de içerir. Faj ve paketlenmemiş DNA filtreye bağlanır, denatüre ve fiske edilir. Sonra
hibridizasyon yapılır. Bu yöntemin avantajı, bir petriyle birkaç kere yapılabilmesidir. Bu durum
güvenilirliği artırır. Plak lift yöntemi iki veya daha fazla probla tek bir yerdeki rekombinantların
taranmasına izin verir. Benton ve Devis prosedürü en çok başvurulan kütüphane tarama metodudur.
Nükleik asit hibridizasyonu, rekombinant fajların izolasyonu için binlerce laboratuarda başarılı bir
şekilde uygulanmıştır. Buna rağmen kütüphane hazırlama ve taramaları gittikçe artan bir şekilde
otomatik olarak yapılmaktadır. Okuma parçası 6.2’ de gredded kütüphanelerinin avantajları
anlatılmıştır.
RNA problarının yerine, DNA veya sentetik oligonükleotid problar kullanılabilir. Radyoaktif
probların kullanımından kaçınmak için alternatif işaretleme metodları da mevcuttur. Ayrıca bu
metodlar, digoksigenin ve biotin gibi kimyasallarla işaretli problarla da yapılabilir.

Şekil 6.12. koloni hibridizasyonuyla rekombinant kolonileri belirlemek için Grunstein- Hogness
metodu

132
[Metni yazın]

İstenen Klonu Seçme Şansını Artırmak için Problar Tasarlanmıştır

Kütüphane taramaları için hibridizasyonun önemli bir avantajı, bir çok işe uygun olmasıdır.
Hibridizasyonda kullanılan koşullar, dizayn edilen probun sadece ilgili sekansa bağlanabilmesi için
çok sıkı tutulur. Spesifik bir cDNA’ya karşılık gelen genomik klonu belirlemek için veya uç kısımları
benzer sekansları içeren klonları tanımlayabilmek için bu sıkı şartlar gereklidir. (bölüm 17). Alternatif
olarak, esnek reaksiyon koşulları uçlarda bulunan benzer sekansları tanımlamak için kullanılabilir. Bu
gevşek koşullar kullanılarak, bir türden bir prob geliştirerek diğer türlerde bu geni aramak için
kullanılan prob, diğer türlerle hibridize edilebilir. Bir genin korunmuş fonksiyonel bir bölgesini temsil
eden bir prob, benzer türler içinde bir çok farklı klonla çapraz hibridizasyon yapabilir. Bu durum, bir
gen ailesini tanımlamayı sağlar. Omurgalı hox genlerinin tanımlanması çapraz hibridizasyona bir
örnektir. Drosophila’daki fushi tarazu ve Antennapedia genleri arasında korunmuş bir DNA sekansı
tanımlanmıştır. Bu korunmuş DNA sekansı (homeobox) kurbağa, insan ve diğer türlerin DNA’larıyla
southern blot analiziyle arandığında, birkaç hibridize olmuş bandın açığa çıktığı görülmüştür. Bu,
hayvan gelişiminde önemli bir rol oynayan, büyük bir familya olan hox genlerini temsil eden omurgalı
cDNA kütüphanelerinden birçok sayıda klonun izolasyonunu sağlamıştır. Bu yüzden hibridizasyon,
eğer bir prob elde edilebilirse herhangi bir kütüphaneden herhangi bir DNA sekansını izole etme
potansiyeline sahiptir. Varolan klonlanmış DNA’dan uygun DNA ya da RNA probu üretilemiyorsa,
alternatif bir strateji, kimyasal olarak sentezlenmiş oligonükleotid prob yapmaktır. Bu yöntemde,
hedef klonun kodladığı proteinin aminoasit sekansının bilinmesi gerekir. Buna rağmen hedef klonla
spesifik bir şekilde eşleşebilecek en az bir prob içeren mixture problar oluşturulabilmesi için prob
dizayn ederken, dejeneratlık kullanılmak zorundadır. Aminoasit sırası bilinen DNA’nın triptofan ve
methionin içermesi avantajlıdır. Çünkü triptofan ve methionin tek bir kodon tarafından kodlanır ve bu
da dejeneratlığı azaltır. Yani mixture’daki prob sayısı azalır. Örneğin, his-phe-pro—met oligopeptidi
tanımlanabilir ve bunu temsil eden bir prob sekansı 32 farklı olasılık arasında bulunabilir.

T
T T T
5’ CA TT CCCTT ATG 3’
C C A C
G

Bu 32 farklı sıra karakteristik bir şekilde sentezlenemez. Çünkü bu 32 farklı sekansda sadece
bir tanesi bizim hedef sekansımıza uygundur. Bu karışımda bulunan primerlerin uçları tek bir izotopla
işaretlenir veya alternatif olarak işaretli nükleotidler kullanılır. Bu mix prob metodu, orijinal olarak
Wallace ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. Başarılı bir şekilde tüm kodon olasılıklarını
sağlayabilmek için 64 veya 256’nın katları şeklindeki dejeneratlıkla çalışılır. Güvenilir bir
hibridizasyon için ne kadar uzunlukta oligonükleotid gereklidir? Southern blot analizinde 11

133
[Metni yazın]

nükleotidlik bir prob yeterliyken, daha iyi bir koloni veya plak hibridizasyonu için daha uzun problara
ihtiyaç vardır. Tipik olarak 16 nükleotidlik problar uygun olmasına rağmen 14 nükleotidlik mix-
problar da başarılıdır.
Alternatif bir strateji ise, 40-60 nükleotidden oluşan daha uzun bir prob kullanılmasıdır.
Burada her kodondaki belirsizlik göz ardı edilir ve onun yerine prob uzunluğu artırılarak güvenilirlik
sağlanır. Bu tüp problar, çoğunlukla hedef türdeki en yaygın türleri temsil etmek için tasarlanırlar ve
kesin olmayan birçok bölgelerde birçok bazla eşleşebilen, inozin bazını içerirler. Çünkü inozin;
mevcut 4 bazla da eşleşebilir. Bazen bu tarz problar, guessmers olarak adlandırılırlar. Bu yanlış
eşleşmeyi sağlayacak strateji teorik olarak Lathe tarafından denenmiştir ve bu strateji insan faktör VIII
ve insan insülinini kodlayan sekansa uygulanmıştır.

Kutu 6.2 gredded (arrayed) hibridizasyon referans kütüphaneleri

Geleneksel olarak, hibridizasyonla kütüphane taranması, agar petri üzerine dağılmış
kolonilerin bir kopyasını üreten koloni blotlama veya plak lift ile yapılır. Bununla birlikte alternatif bir
yöntemde, karakteristik klonlar seçilir ve grid şeklinde bir membrana aktarılır. Gridleme yorucu bir
işlem olduğundan makinelerin kullanılmasıyla kolaylaşmıştır. Makineler, yüksek yoğunlukta klon
almak ve membrana aktarmak için programlanmıştır. Geleneksel kütüphaneleri kullanarak pozitif
klonlar otradyografiyle tespit edilir ve X-ray filmi ve orijinal petri aynı plakların yerlerini tespit etmek
için uygun koordinatlarda işaretlenir. Benzer membranlar kolay bir şekilde hazırlanabildiği için
kopyalar, diğer laboratuarlara tarama için dağıtılabilir. Bu laboratuarlar benzer koordinatları
kullanarak onların pozitif sinyallerini belirleyebilir, böylece o kaynak laboratuar da ilgili klonu
isteyebilir. Bu sayede, bir kütüphane faklı sayıda kullanıcıya hizmet edebilir ve veriler bir yerde
toplanabilir. Bundan dolayı gredded kütüphaneleri, geniş uygulamalarda kullanılmak için önemlidir ve
sık sık hazırlanır. Örneğin, genomik kütüphaneler yüksek kapasiteli P1,BAC veya YAC vektörlerine
klonlanır (Bentley ve ark.,1992) ve ayrıca cDNA kütüphaneleri için önemlidir (Lennan ve Lehrach
1991). Bir kuyucuğa bir klon olacak şekilde kütüphaneleri petrilemek de mümkündür. PAC ve BAC’lar
çok yaygın bir şekilde klon havuzunu oluşturmak için kullanılmasına rağmen, karakteristik klonları
başarılı bir şekilde tanımlamak için daha az yoğunlukta klon havuzu oluşturulmalıdır (Shepherd ve ark.
1994, Shepherd ve Smaller 1994).

134
[Metni yazın]

PCR İle Genomun Taranması ve cDNA Kütüphaneleri İçin Hibridizasyona Alternatif

Olarak Kullanılması
PCR klonlanmamış genomik DNA ya da cDNA’dan spesifik DNA sıralarını izole etmek için
genişce kullanılır. Fakat o, ayrıca kütüphane taraması için de yararlı bir tekniktir. Bir tarama metodu
olarak PCR hibridizasyon ile aynı çok yönlülüğe ve sınırlamaya sahiptir. PCR ile herhangi bir klonu
tanımlamak mümkündür. Fakat bu sadece uygun primerler1 yapmak için sırası hakkında yeterli bilgiye
sahip olduğumuzda mümkündür.
1: Bazı durumlarda yapılan deneysel dizaynlarda PCR, spesifik fakat bilinmeyen DNA
sıralarını izole etmek için kullanılır. Bunun bir örneği 111. sayfada tartışılan 5’ RACE’dir. Diğeri, bir
integrating vektörün ekleme alanı bilinmeyen DNA çevresini izole etmek için kullanılabilen ters
PCR’dır (sayfa 397). Her defasında ilgilenilen DNA fragmentine bağlanacak primerler dizayn edildi
(Sentetik primer kuyrukları, linkerler ve klonlama vektörleri parçaları).
Spesifik bir klon izole etmek için PCR hedefte eşsiz bir sıraya bağlanabilen gen spesifik
primerlerle başarıldı.
PCR ile kütüphane taraması için tipik bir strateji Takumi & Lodish (1994) tarafından gösterildi.
Hibridizasyonla tarama yapmak için gerekli olan kütüphaneyi bir petrideki agara yaymak yerine her
bir klon ayrı ayrıçoklu gözlü kaplarda saklanır. Her bir kuyu PCR ile taranır ve pozitif kuyular
belirlenir. Her bir pozitif kuyudaki klonlar ikinci bir petride seyreltilir ve tekrar taranır. İlgili genlere
karşılık gelen homojen klonları taşıyan kuyucuklar belirlenene kadar bu işlemler tekrar eder.
Dejenerat primerlerin kullanılmasının uygun olduğu birkaç uygulama vardır. Bir dejeneratlar
primer benzer sıraların tümünde ama bu sıraların bir ya da daha çok pozisyonunda değişiklikler
bulunan primerlerin bir karışımıdır. Bu hibridizasyon probu olarak dejenerat oligonükleotidlerin
kullanılmasına analogtur ve primerler aynı yolla sentezlenir. Dejenerat primerlerin kullanımını
gerektiren yaygın bir durum primer sıralarının aminoasit sıralarına bakılıp karşılığına uyan primerlerin
yapılmak zorunda olmasıdır. Ayrıca dejenerat primerler bilinen bir gen ailesinin yeni üyelerini
araştırmak için ya da türler arasındaki homolog genleri araştırmak için kullanılabilir. (Her aminoasitin
kodonuna karşı dejenerat prob oluşturulabiliyor. Hibridizasyonda 256 değişik tip dejenerat primer
olabiliyor. Ama PCR’da ise en fazla 128 değişik tip dejenerat primer olabiliyor.) Oligonükleotid
problar ile düşük kodon dejenerasyonlu aminoasitler seçilmesi arzulanır. Ama her bir primerdeki 128
kat dejenerasyon insan genomundan tek kopyalı bir hedefin amplifiye edilmesinde başarılı olabilir. Bu
şartlar altında herhangi bir bireysel primer sırasının konsantrasyonu çok düşüktür. Bu yüzden primer
ve kalıp arasındaki yanlış eşleşme, seçilmiş annealing şartları altında meydana gelmelidir. Primerin 3‘
terminal nükleotidinin yanlış eşleşmesi etkili uzamayı engellenebildiği için bu pozisyonda
oluşabilecek dejenerasyondan kaçınılmalıdır.

135
[Metni yazın]

Ekspresyon Kütüphanelerinin Taranması İçin Daha Farklı Stratejiler Mevcuttur

Eğer bir DNA kütüphanesi ekspresyon vektörlerini kullanarak kurulduysa her bireysel klon bir
polipeptid ürünü oluşturmak için ekspreslenebilir. Bütün kütüphaneler yukarıda tartışıldığı gibi
hibridizasyon ya da PCR ile taranabilmesine karşın ekspresyon kütüphaneleri bir dizi alternatif
tekniğin kullanılmasına izin verdiği için yararlıdır. Bu tekniklerin her biri gen ürünün bazı yapısal ya
da fonksiyonel özelliklerini kullanır. Bu hedef klonun DNA sırasının tamamen bilinmediği ve uygun
bir prob ya da primer dizilerini dizayn etmek için uygun bir stratejinin olmadığı durumlarda önemli
olabilir.
Daha yüksek yapılı ökaryotlar için bütün ekspresyon kütüphaneleri cDNA kütüphaneleridir.
Çünkü intronların yokluğu ve varlığı ve klonların sayısı çeşitli durumlara göre çeşitli büyüklüklerde
olabilir. Genellikle cDNA sentezi için rastgele primer metodu kullanılır. Bu yüzden 5’ sırasının daha
çok temsil edildiği görülür. Yukarıda bahsedildiği gibi bu tür kütüphaneler elde edildikleri kaynakların
temsilcileridir, alındıkları organın dokunun cDNA kütüphanelerini oluştururlar. Bu yüzden belli
cDNA’lar bol bazıları nadir bulunur. Ama bakteriyal ve birçok maya ekspresyon kütüphanelerinin
genellikle genomik olduğuna dikkat edilmelidir. Bu yüzden bakterilerde ve bazı mayalarda çok az
intron ve çok az intergenik DNA vardır. Hızlı ve verimli çalışan ekspresyon kütüphaneleri rastgele
kesilmiş genomik DNA’nın ya da kısmen kesilmiş genomik DNA’nın klonlanmasıyla üretilebilir ve
bu nedenle bütün genler potansiyel olarak aynı frekansta gösterildi. Bu kütüphanelerdeki bir problem
spesifik bir gene karşılık gelen klonlar upstreamda yatan genden sonlanma sırasını taşıyabilir ve bu
ekspresyonun verimini engelleyebilir. Bu sebeple klonlama için fragmentlerin boyları hedef genden
daha küçük olsun diye şartlat düzenlendi ve bütün 6 olası okuma alanına (3’ü aynı oryentasyonda)
klonlanacak her bir gen fragmentinin makul bir şansı olsun diye yeterince rekombinant üretilir.

İmmünolojik Tarama Ekspres Edilmiş Gen Ürünlerini Belirlemek İçin Spesifik

Antikorları Kullanır
İmmünolojik tarama bir hedef klon tarafından sentezlenilen polipeptid üzerindeki antijenik
belirleyicileri spesifik olarak antijenik belirleyicileri tanıyan antikorların kullanımını içerir. Bu çok
yönlü stratejilerinden biridir. Çünkü mevcut antikor varlığında herhangi bir protein için kullanılır.
Aşağıda tartışılan tarama stratejijerinin aksine ayrıca fonksiyonel olmak için bu proteine ihtiyaç
yoktur. Tanıma için moleküler hedef genellikle bir epitoptur. Epitop, proteinin yüzeyinde özel 3
boyutlu konformasyonda katlanan kısa bir aminoasit sırasıdır. Epitoplar proteinin geri kalan kısmını
bağımsız şekilde katlayabilir ve bu yüzden epitop, polipeptid zinciri eksik olduğunda ya da diğer bir
füzyon proteini ile ekspres edildiğinde bile genelde oluşur. Önemle, birçok epitop, proteinin bütün
konformasyonun anormal olduğu denatürasyon şartları altında bile biçimlenebilir.
İlk immünolojik tarama teknikleri, 1970’lerin sonlarında yani ekspresyon kütüphanelerinin,
genellikle plazmid vektörleri kullanılarak inşa edildiği zamanda geliştirildi. Broome & Gilbertin
metodu o dönemde genişçe kullanıldı. Bu metod polivinil gibi belli plastik tiplerini çok güçlü şekilde
136
[Metni yazın]

125
absorblayan antikorları kullanır ve IgG antikorları in vitro’da I ile kolayca işaretlenebilir. Her
zamanki gibi transform edilen hücreler petrilere alınır ve kolonilerin oluşması beklenir. Pozitif
klonlardan antijeni serbest bırakmak için koloniler mesela kloroform buharı kullanılarak ya da virülent
fajın sprey tüpüyle püskürtülmesiyle parçalanır (nüsha bir tabaka gereklidir. Çünkü bu işlem
bakterileri öldürür) Uygun antikorla kaplanan bir polivinil yaprağı antijen-antikor komplekslerinin
şekillenmesine izin veren tabakanın yüzeyine kaplanır. Sonra polivinil yaprak uzaklaştırılır ve
antijenin yüzeyinde farklı bir belirleyiciye spesifik 125I ile işaretlenmiş IgG’ye maruz bırakılır (antikor
kaplanılan yaprağa antijenin başlangıçta bağlanmasına karışmayan bir belirleyici Şekil 6.14’de
gösterildi). Sonra yaprak yıkanır ve X-ray filmine maruz bırakılır. Bu prosedürde belirlenen klonlar
sonradan kopyası yapılan petriden izole edilir.

Şekil 6.14 Broome ve Gilbert’in immunokimyasal belirleme

metodunda antijen-antikor kompleks oluşumu.

Bu “sandwich” tekniğinin sadece aynı proteinin farklı belirleyicilerini tanıyan iki antikor mevcut
olduğunda uygulanabilir olduğuna dikkat et. Ama protein bir füzyon protein olarak ekspres edilirse
füzyonun her bir bileşenine bağlanabilen antikorlar kullanılabilir. Böylece bu rekombinant
moleküllerinin hızlı ve verimli bir şekilde seçilmesini sağlar.
Plazmid kütüphaneleri ekspresyon taraması için yararlı olmasına karşın plazmid kütüphaneleri
λ bakterifaj insertion vektörlerini kullanmak için çok daha uygundur. Çünkü bunlar daha yüksek bir
kapasiteye sahiptir ve in vitro‘da verimli paketleme çok sayıdaki rekombinantın hazırlanıp
taranmasına izin verir. λ faj cDNA kütüphaneleriyle immünolojik tarama, lac promotorunun kontrolü
altındaki beta galaktosidaz ile füzyon proteinlerini üreten λgt11 ekspresyon vektörünü kullanan Young
& Davies (1983) tarafından takdim edildi (λgt11 ve λZAP gibi benzer füzyon vektörlerinin tartışıldığı
kutu 6.1’e bak).
Orijinal teknikte, tarama, teşvik edilmiş lizogenik bakteri kolonilerini kullanarak yürütüldü, ki
bu üstte olduğu gibi kopya petrilerin üretilmesini gerektirdi. Rekombinant faj plaklarının direkt olarak
taranmasıyla metodun basitleştirilmesi olasıdır. Bu prosedürde (şekil 6.15) kütüphane konak olarak
E.coli Y1090 suşu ile ılımlı olarak hayli yoğun (her 9cm2 tabaka başına 5x104 plağa kadar) kaplandı.

137
[Metni yazın]

Bu E.coli türü lac repressörünü aşırı üretti ve teşvik edici IPTG infekte hücrelere takdim edilene kadar
klonlanmış sıraların (bu sıralar konağa zararlı olabilir) ekspresyonlarının olmadığını garanti eder.
Ayrıca Y1090 lon proteaz içinde yetersizdir. Bu yüzden rekombinant füzyon proteinlerinin kararlılığı
artar. Plaklarda ekspres edilen füzyon proteinleri nitroselüloz membran katmanına absorblanır ve bu
membran antikor taraması için bir takım işlemlere tabi tutulur. Membranda pozitif bir sinyal
belirlendiğinde pozitif plak orijinal agar tabakasından devşirilir (bir nüsha gerekli değildir) ve
rekombinant faj izole edilebilir.
İodinlenmiş antikorları kullanan orijinal belirleme metodunun yerini izotopik olmayan
işaretleri kullanan daha uygun metodlar almıştır. Ayrıca bu metodlar daha hassastır ve spesifik
olmayan sinyallerin daha düşük bir kirli arka zemin yarattığı görülür. Genellikle bunlar polipeptid
ilgisine karşı yönetilen işaretlenmemiş birincil antikorların kullanımını kapsar, ki bu enzimatik bir
işaret taşıyan ikincil antikorlar tarafından tanınan değişimdir. İzotoplar için gerekli eliminasyon için
ayrıca bu tür metodlar bir amplifikasyon basamağı içerir. Çünkü iki ya da daha çok antikor birincil
antikora bağlanır. Tipik olarak ikincil antikor birincil antikorun türe spesifik sabit bölgesini tanır veya
yaban turpu peroksidaz ya da alkalin fosfataz ile birleştirilir. Bu enzimlerin her bir nitroselüloz filtrede
direkt olarak yürütülen basit bir kolorometrik analiz kullanarak belirlenebilir. Onlar ayrıca ekspresyon
konağındaki proteinlere karşı tepki gösterebilmelerine rağmen birçok farklı epitopu tanıyan poliklonal
antikorlar, immünolojik tarama için çok hassas bir prob tedarik eder. Sadece tek bir epitop tanındığı
için bu tür reagentların duyarlılığı azaltılmasına rağmen ayrıca monoklonal antikorlar ve klonlanmış
antikor fragmentleri kullanılır.

138
[Metni yazın]

λgt11’in EcoRI ya da λZAP’ın polilinker

bölgesine sokulan cDNA

E.coli Y1090 üzerine kütüphaneyi yay, küçük

plaklar elde etmek için 37ºC’de 4-6 saat inkübe
et.

Plakları öncelikle IPTG ile muamele edilen

nitroselüloz kağıtla kapla; bu lac promotorundan
ekspresyonu teşvik eder.

Rekombinant faj plaklarının (mesela plağı

tutan) ekspreslediği füzyon proteinlerini
absorblayan nitroselüloz kağıdı dikkatlice
Elde edilen plaktan Pick pozitif
petrisini sakla.

Spesifik antikor ile plağı tutan nitroselülozu

füzyon proteinlerini belirlemek için tara.

Pozitif plağı belirle.

Şekil 6.15 λgt11 ya da λZAP rekombinant plaklarının immunokimyasal taranması

Southwestern ve northwestern ile tarama çalışmaları, nükleik asit bağlama proteinlerini

kodlayan klonları tespit etmek için kullanılır
Biz immunokimyasal görüntüleme yöntemiyle tespit edilen rekombinant λgt11 yada λZAP
vektörleri tarafından plaklarda üretilen bağlama proteinlerinin nasıl ekspres edildiğini görmüştük.
Spesifik DNA bağlama proteinlerinin dizilerini ekspres eden klonların izalasyonu ve görüntülenmesi
için de buna yakın bir metod kullanılır. Bir plak liftini nitroseliloz membranın üzerine yerleştirirerek
kütüphanedeki izlerin transfer edilmesi sağlanır. Fakat hedef DNA bağlama proteinleri için tanıyıcı
diziler içeren, radyoaktif olarak işaretlenmiş çift zincirli DNA oligonükleotit problar membran üzerine
inkübe edildiğinde bir antikor kullanmadan da görüntüleme gerçekleşebilir. Bu teknik southwestern
görüntüleme olarak adlandırılır. Çünkü bu işlem southern ve western blot prensiplerinin bir
kombinasyonudur ve memeli transkripsyon faktörlerine karşılık gelen cDNA dizilerini ekspres eden
klonların izalasyonunda oldukça başarılıdır. Bu tekniğin bazı kısıtlamalarıda vardır. Örneğin, kişisel
plakların yalnızca bir cDNA klonu içermesi, transkripsyon faktörlerinin yalnızca heterodimerlerin
139
[Metni yazın]

yada DNA problarını tanımayan multimerik komplekslerin bir parçası olarak şekillenmesini sağlaması
ve karşılık gelen cDNA’ların izole edilmemesi gibi. Açıkcası, bu teknik bir bağlama proteini ekspres
edildiğinde, transkripsyon faktörünün yalnızca fonksyonel olduğu durumlarda başarıyla sonuçlanır.
Aynı zamanda spesifik DNA dizisi için polipeptit afinitesi yüksek olmalıdır. Bu transkripsyon faktör
tiplerinin öncelikli olarak izalasyonunu sağlar. Yakınlarda, spesifik RNA bağlama dizilerini de izole
etmek için benzer bir teknik kullanıldı ve northwestern olarak adlandırıldı.
Southwestern ve northwestern’nin her ikiside multimerik formda bağlanma dizileri içeren
oligonükleotitler kullanıldığında başarıyla sonuçlanır. Bu birkaç bağlanma polipeptitinin filtre
üzerindeki herhangi bir proba bağlanabileceği anlamına gelir ve ortalama olarak ayrılma sürecini
oldukça arttırır. Spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için işaretlenmemiş çift zincirli büyük
bir DNA, spesifik bir probla muamele edilir. Fakat bu spesifik olmayan DNA genellikle, spesifik
oligonükleotit probların kullanıdığı ikinci raundda bağlanma spesifikliğini kanıtlamak için gereklidir.
DNA ve RNA’nın yanısıra bağlanma polipeptitlerinin tespiti için alternatif olarak “ligand”
larda kullanılabilirler. Bu teknik çok yaygın olarak kullanılmaz. Çünkü ligandlar genellikle düşük
hassasiyete sahiptir ve onların başarısı bir nitroseliloz filtre üzerinde bulunan protein domainlerinin
uygun olarak etkileşimlerinin muhafaza edilmesine bağlıdır. Daha fazlası bölüm 23’de tartışıldı. Maya
ikili hibrid sistemi ve türevleri, protein-protein etkileşiminin bazı spesifik tipleri için çok yönlü sayım
formatlarını sağlar. Bu etkileşimler canlı hücrelerde test edilerek protein içerenlerin daha fazla
fonksyonel etkileşim domainlerine sahip olduğu bulundu.

140
[Metni yazın]

Şekil.6.15 λgt11 ve λZAP rekombinant plakların immunokimyasal görüntülenmesi

Fonksiyonel klonlama ile gen ürününün fizyolojik veya biyokimyasal aktivitesi

belirlenebilir
Sonuç olarak, çalıştığımız proteinin tüm biyolojik aktivitelerini tarayabileceğimiz bir metodun
olmasını düşünürüz. Bu yüzden yapılan işlem fonksiyonel klonlama veya fonksiyonel tamamlama’dır.
Bu işlem, klonlanan gen ile mutant konağın eksik fonksiyonunu yerine getirilerek yaban fenotipin
yeniden oluşturulmasıyla sağlanır. Bu işlem, eğer mutant konak, özel büyüme şartı haricinde
yaşayamıyorsa, klonlanan genin pozitif seçilmesine ve izole edilmesine izin vererek, ekspresyon
klonlamada kullanılan çok güçlü bir metod olabilir.
Ratzkin & Carbon (1977), E.coli’de oksotropik mutasyonu tamamlama esasına dayanarak bazı
ökaryotik genlerin nasıl klonlanabileceğini gösterdi. Bu araştırmacılar, homopolimer kuyruk takma
prosedürünü kullanarak, plazmid ColE1’in içerisine, mekanik kırma ile meydana getirilen maya
DNA’sının parçalarını yerleştirdiler. Bu rekombinant plazmidi, histidin sentezleyemeyen E. coli hisB
mutantına transforme ettiler ve bakterileri minimal medyuma yerleştirdiler. Bu yolla, klonlar,
mutasyonun tamamlanması ile seçildi ve maya his genini taşıyan klonlar izole edildi. Eğer genin
141
[Metni yazın]

fonksiyonu korunmuş ise, memeli proteinlerinin bakteri ve mayaya klonlanması mümkündür. Böylece,
mayada tamamlama, birçok memeli metabolik enziminin (Botstein & Fink 1988), bazı korunmuş
transkripsiyon faktörlerinin (Becker vd. 1991), bitkilerdeki mayoz düzenleyici genlerin (Hirayama vd.
1992) cDNA’larını izole etmek için kullanıldı. Bu yaklaşım, Fanconi anemisinin grup C
tamamlanmasından sorumlu FACC genini izole eden Strathdee vd. (1992)’ın yaptığı gibi memeli
hücrelerinde de kullanılabilir. Genel olarak hücrelerin, 100.000 kadar klonu içeren kompleks bir
karışım ile transfekte edilmesini sağlayacak bir havuz sistemi oluşturulmalıdır. Mutant fenotipi
tamamlamada başarılı olan havuzlar, daha sonra bu havuzların asıl klonu taşıyıp taşımadığının
doğrulanması için tekrar transfekte edilerek alt gruplara ayrılır ve bu prosedür bireysel cDNA’yı izole
edinceye kadar tekrarlanır.
Fonksiyonel tamamlama transgenik hayvanlarda ve bitkilerde de yapılmaktadır. Bu şekilde,
Probst vd. (1998), farede sağırlıktan sorumlu Shaker-2 genini ve onun insan homoloğu olan DFNB3
genlerini klonlamayı başardı (Şekil 6.16). Öncelikle, Shaker-2 mutasyonu, insan sağırlık
bozukluğundan sorumlu bölgeye sentetik (benzer sıra) olan fare genomundaki bölge esas alınarak
haritalandı. Daha sonra, yaban tip farelerden bu bölgeye ait BAC klonları hazırlandı ve
mikroenjeksiyonla Shaker-2 mutantı yumurtalara aktarıldılar. Bu transgenik fareler, fonksiyonel
Shaker-2 genini alarak normal duyma fenotipini kazanmasına göre tarandı. Klonlanan bu genin
sitoiskeletal miyozin geni proteini kodladığı görüldü. Bu yol, daha sonra, benzer insan genlerinin
karakterizasyonunda, insan genomik kütüphanesi yapmakta kullanıldı. Bu tarama prosedürü için
hiçbir sekans bilgisine gerek yoktur ve bitişik işaretten başlayarak kromozom üzerinde yürüme dışında
ne insan ne de fare genini karekterize etmek için fonksiyon testi haricinde bir yöntem yoktur. Bitkiler
için geliştirilen yüksek kapasiteli transformasyon vektörleri benzer şekilde bitki genlerinin
karakterizasyonu için kullanılmaktadır (Sawa vd. 1999, Kubo & Kakimoto 2001).
Tamamlama analizleri, sadece uygun ekspresyon mutant konağı varsa yapılabilir. Birçok
durumda, hedef genin fonksiyonunu çalışmak için kullanılan tekniklerde genin klonlanacağı bakteri ya
da maya konağı ve hatta yüksek ökaryotik sistemler bu gen için çok spesifik olmalıdır, yani konağın
bu kayıp fonksiyonunun konağın sahip olduğu bir başka gen veya genlerle kısmen veya tamamen
telafi edilmemelidir. Alternatif olarak, klonun karakterizasyonu, konak hücrenin sahip olmadığı bir
fonksiyonu konağa kazandırarak yapılabilir. Bazı durumlarda, kazandırılan bu fonksiyonun ortaya
koyduğu fenotip sayesinde klon pozitif olarak seçilebilir. Örneğin, E. coli’de memeli geninin
ekspresletildiği bir çalışmada, Chang vd. (1978) fare mRNA’larını parçalamadan oluşturdukları cDNA
içeren rekombinant plazmidlerin oluşturduğu bir popülasyon inşa ettiler. Bu mRNA’lardan birinin
dihidrofolat redüktaz (DHFR) olması bekleniyordu. Fare DHFR’si trimethoprim ilacına karşı E.
coli’den daha hassasdır ve dolayısıyla ilacı içeren büyüme ortamı sadece fare dhfr cDNA’sına sahip
hücrelerin seçilmesini sağlayacaktır.

142
[Metni yazın]

Şekil 6.16 Transgenik farede Shaker–2 izole etmek için fonksiyonel klonlama. Shaker–2 geni
homozigot olan döllemiş fare yumurtalarına, Shaker–2 geninin yaban tipinden sorumlu bölge BAC
vektörü ile aktarıldı. Doğan bireyin yaban tipe sahip olup olmadığı tarandı. Bunun için Shaker–2
geninden sorumlu BAC karakterize edilmeye çalışıldı. Bu klon sonra sekans edildi ve insan sağırlık
geni DFN3’e göre haritalandı.

Diğer bir durumda da, klona kazandırılan fenotip seçici olmaz fakat gözle görülebilen bir
değişiklik sayesinde belirlenebilir. Örneğin, memeli hücrelerinde klonlar, hücresel onkogenlerin, hem
kültür ortamında hem de tüysüz fareye transplante edildiği zaman, quiescent fare 3T3 fibroblast
hücrelerinin çoğalmalarını teşvik etme özelliği sayesinde belirlendi (Brady vd.1985). Gen ürününün
fonksiyonunu belirleyebilmek için cDNA’ların fonksiyonel klonlamasını sağlayan çeşitli metodlar
geliştirilmiştir. Örneğin, Xenopus melanophores G-protein çifti reseptörlerinin fonksiyonel
klonlanması için kullanıldı. Melanoforlar, çeşitli pigmentleri içeren melanozom denilen organellere
sahip koyu hücrelerdir. Bu organelin en büyük karakteristik özelliği, adenil siklaz veya fosfolipaz C
enzimleri aktifken etrafa dağılmaları, bu enzimlerin inhibe olduğu zaman ise çökmeleridir. Bu yüzden,
tirozin kinaz ve G-protein çifti reseptörlerini kodlayan cDNA’ların ekspresyonları, pigmentlerin hücre
143
[Metni yazın]

içinde tekrar dağılmalarını sağlar. Böylece, bu özellik reseptör cDNA’ların belirlenmesinde

kullanılabilir (Lerner 1994).

Hakkında biyolojik bilgi olmayan bir gen için, bölgesel (pozisyonel) klonlama kullanılır;
bu gen ilişkili diğer genlerle veya markıerlarla haritalanabilir.
Bir gen ürünü hakkında biyolojik bir bilgi yaksa (çoğunlukla insanlardaki hastalık genleri
böyledir) bölgesel klonlama denilen bir yaklaşım kullanılabilir. Bu yaklaşımda bilgi olarak sadece
genin haritalanan bölgelerine (restriksiyon enzimleriyle kesilen fragmentlerine) ihtiyaç vardır
(Parimoo ve ark., 1995). Bu bilgilerle, araştırıcılar en yakın fiziksel markerları bulabilir ve ondan
sonra “kromozom walk” denilen yönteme başlayabilir. Bu teknikte, tespit edilecek genin peşpeşe
gelen parçalarını içeren klonlar tespit edilir. Bunun için her başarılı klon prob olarak geliştirilir ve bir
sonraki gen parçasını bulabilmek için kullanılır. Bu yüzden, bir gen parçası, yanındaki markerla tespit
edilip diğer yanındaki parçayı bulabilmek için kullanılır. Kromozom walking teoride basittir; fakat
teknik olarak zordur. BAC ve YAC gibi büyük kapasiteli vektörlerle oluşturulmuş kütüphaneleri
kullanmak işlem sayısını azlatması bakımından kullanışlıdır. Böyle kütüphaneler oluşturulmadan
önce, bazı kullanışlı stratejiler işlem sayısını azaltmak için kullanılırdı. Bu teknolojinin ilk
uygulamalarından birinde, Hogness ve ark. (Bender ve ark. 1983) Ace ve rosy lokuslarını ve
Drosophila’daki homeotik Bithorax gen kompleksini klonladılar. Spesifik kromozom bölgelerinin çok
iyi tanımlanmış translokasyon ve inversiyonlarını taşıyan bir çok suşun belirlenmesiyle basamak sayısı
en aza indirgendi. İnsan genlerine uygulanan kromozom walking metoduna bir örnek okuma parçası
6.3’te bahsedilmiştir. Bazı genomik uygulamaların tartışıldığı 25. bölümde bu konuya tekrar
değinilmiştir.

Farklı (Diferansiyal) klonlama, çok sayıda bulunan DNA fragmentlerinin ekspresyon

farklılıklarını kullanır
Farklı klonlama, sadece bir kaynaktaki DNA’yı temsil eden sekansların izole edilmesi için kullanılan
tekniklerin çeşitliliğini ifade eder. Doğal olarak bu, bir dokuda aktif ekspreslenen fakat başka bir
dokuda aktif olmayan genleri temsil eden farklı miktarda ekspreslenen cDNA’lar anlamına gelir. Fakat
bu teknik, mutantları tespit etmek için ilişkili genin tanımlanmasında genomik DNA için de
uygulanabilir. Bir seri hücre bağımlı farklı klonlama metotları (ekspresyon miktarındaki
farklılıklardan dolayı oluşan klonların farklı olması = farklı klonlama) ve çok çeşitli PCR teknikleri
vardır. Her metot şu iki prensipten birini takip eder: görsel olarak tanımlanabilen ekspreslenmiş
klonların ayrımına izin vererek, iki kaynak arasındaki ekspresyon farklılıkları gösterilir veya farklı
miktarda ekspreslenen sekanslar açısından zenginleştirilmiş klonların bir koleksiyonunu üretmek için,
ekspresyon farklılıkları kullanılır. Farklı gen ekspresyon analizi son zamanlarda gelişen tekniklerle
yeni bir önem kazanmıştır.

144
[Metni yazın]

Kutu 6.3 önemli bir yayın: kromozom walking ve jumping metoduyla sistik fibrosis geninin
tanımlanması
Sistik fibrosis (SF), çok yaygın otomozomal resesif bir hastalıktır. SF geni klonlanana kadar,
primer genetik eksiklikler hakkında çok az kesin bilgi vardı. SF geninin klonlanması, hastalıkların
biyokimyasının çalışılması için (anormal klor kanal fonksiyonu), doğum öncesi teşhis ve bunun gibi
şeyler için bir gelişme olmuştur. Burada bahsedilen bu yayın (Rommence ve ark., 1989) özellikle genel
klonlama stratejisi açısından önemlidir. SF geni hakkında herhangi bir fonksiyonel bilgi yokluğunda
genin kromozomal bölgesi klonlama stratejisinin dayanak noktası oldu. Bağlantı analiziyle
tanımlanan, 7. kromozom üzerinde bulunan SF bölgesine yakın olan markerlardan başlayarak
toplamda yaklaşık 500 kb kromozom walking ve jumpingle tanımlanmıştır. Bu çalışmada, çok sayıda
klon, birçok farlı faj ve kozmid genomik kütüphalerinde tespit edildi. Bu kütüphanelerden biri
λCharon 4A vektörü kullanılarak Manniatis stratejisiyle hazırlandı, ve birkaç tanesi de insan genomik
DNA’sı Sau3 AI ile kısmi parçalandıktan sonra λDASH ve λFIX vektörleri kullanılarak hazırlandı.
Klonlanan bölgeler SF bölgelerindeki genom haritasıyla belirlendi, Pulse-field jel elektroforezi ve NotI
gibi nadir kesim yapan enzim kompleksleri kullanılarak tespit edildi. Gerçek SF geni açık okuma
bölgelerinin tanımlanması, genomik klonlarla hibritleşen cDNAların tespiti, diğer türlerle kros
hibridizasyon sekanslarının tespiti, ve memelilerde bulunan bir çok genin 5’ ucunda olduğu bilinen
CpG bölgelerinin varlığı gibi bir çok kriterle klonlanan bölgelerde tespit edildi.

Kütüphane esaslı yaklaşımlar, farklı tarama tekniklerini veya farklı klonları temsil eden
zenginleştirilmiş kütüphaneler oluşturmayı içerebilir
Farklı klonlamalara ilk yaklaşım, orta miktarda bulunan ekspreslenmiş farklı cDNA’ların
tanımlanmasında kullanışlı, normal hibridizasyona dayalı kütüphaneleri tarama protokolünün basit bir
şekli olan farklı taramadır (Dworkin & Dawid, 1980). Örnek olarak Xenopus kurbağasının gastrula
safhasındaki embriyoda çok miktarda bulunan; fakat yumurtada hiç olmayan yada çok az olan
mRNA’lardan sentezlenen cDNA’ların izolasyonu verilebilir. Gastrula mRNA’sından bir cDNA
kütüphanesi oluşturulur. Daha sonra rekombinant klonları taşıyan replika filtreler hazırlanır. Bu
filtrelerden biri, gastrula embriyosundan geliştirilen 32P işaretli mRNA (veya cDNA) problarıyla ve
yumurtadan geliştirilen 32P işaretli mRNA(veya cDNA) problarıyla muamele edilir. Bazı koloniler
her iki problada pozitif sinyal verecektir. Bunlar gelişmenin her safhasında bol miktarda bulunan
mRNA’lardan oluşmuş cDNA’ları gösterir. Bazı koloniler bu problardan hiçbiriyle pozitif sinyal
vermeyecektir. Bu durumdan da her iki dokuda da tespit edilemeyecek kadar düşük yoğunlukta olan
mRNA’lar sorumludur. Bu, tek bir molekül yerine mRNA populasyonundan oluşan kompleks
probların kullanılmasının bir özelliğidir: problarda sadece çok miktarda ya da orta düzeydeki
sekanların işaretlenme oranının yüksek olduğunu ve hibridizasyonda etkili olduğunu gösterir. Önemli
145
[Metni yazın]

olarak bazı klonlar gastrula problarıyla pozitif sinyal verirken yumurta problarıyla vermez. Bu görsel
olarak tanımlanabilir ve farklı ekspreslenen sekanslardan kaynaklanmalıdır.
Farklı taramanın popularitesine son bir katkı DNA mikroarraylarinin gelişmesidir (Schena ve
ark., 1955). Bu teknikte, cDNA klonları yoğun bir grid şeklinde küçük katı bir faza transfer edilir ve
farklı floresan renk vermesi için işaretlenen iki kaynaktan geliştirilen kompleks problarla taranır. Her
iki dokuda da ekspreslenen klonlar her iki rengi de gösterirken, farklı ekspreslenen klonlar problardan
birinin sinyaline daha yakın bir renk verecektir. Benzer bir teknikte, oligonükleotidleri içeren DNA
çipleri kullanılır. cDNA mikroarray teknolojisinin uygulama ve gelişmeleri 20. bölümde anlatılmıştır.
Farklı taramaya alternatif bir yolda, iki kaynakta da yaygın olan sekansların uzaklaştırılmasıyla, farklı
genleri ekspresleyen klonlarla zenginleştirilen bir kütüphane üretilir. Bu (substracted) çıkarılan cDNA
kütüphanesi olarak adlandırılır ve nadir bulunan cDNA’ların izolasyonuna çok büyük katkıda bulunur.
Yukarıdaki gibi benzer bir örnek kullanırsak, deneyin amacı gastrula spesifik mRNA’lardan
oluşturulan cDNA’larla zenginleştirilmiş bir kütüphane üretmek olacaktır. Bu, Xenopus oositlerinde
aşırı derecede bulunan mRNAlarla, gastrula mRNAlarından hazırlanmış ilk zincir cDNAların
hibridizasyonuyla başarılacaktır. Eğer oluşturulan populasyon, bu karışık populasyondan çıkarılmayı
sağlayacak herhangi bir yolla işaretlenirse, sadece gastrulaya spesifik cDNA’lar kalacaktır. Uygun bir
işaretleme metodu, tüm oosit mRNAlarına biotin ilave etmek olacaktır, böylece bu oosit/gastrula
RNA/cDNA hibridizasyonları gerçekleşecek ve aşırı miktarda bulunan oosit mRNA’ları streptavidine
bağlanma özellikleriyle ayırt edilecektir, streptavidinin biotine çok yüksek bir affinitesi vardır (Duguid
ve ark., 1988, Rubinstein ve ark., 1990). Farklı sekansları tanımlamak için genomik kütüphanelerle
kullanılan substractive klonlamalara birkaç örnek vardır. Belkide bu yaklaşımın en dikkat çekici
örneği , insan kas distrofin geninin klonlanmasıdır. Bu klonlama normal DNA ve DMD genine kadar
uzanan bir delesyonlu DNA kullanarak substractive klonlama ile yapılmıştır. Bu durum, okuma
parçası 6.4’te bahsedildi.

Farklı olarak (Diferansiyal) expres edilen genler, aynı zamanda PCR-tabanlı metodlar
kullanılarak tanımlanabilir
Beklendiği gibi, farklı klonlama içn PCR’a dayalı metotlar daha hassastır ve kütüphaneye
dayalı metotlardan dah kısa sürelidir ve başlama materyalinin küçük miktarıyla uygulanabilmektedir.
Kısmi cDNA sekanslarının havuzlarını çoğaltmak için kısa rastgele primer çiftleri kullanılarak 2
benzer metot tanımlanmıştır. Eğer iki farklı dokudan cDNA’ları çoğaltmak için aynı primer
kombinasyonları kullanılırs, ürünler bir sekanslama jelinde yan yana yürütülebilir ve oluşmuş
bantlardaki farklılıklar, mRNA parmak izi ve farklı şekillerde ekspres edilmiş genler gözlenebilir. İki
teknik arasındaki fark özellikle, ilk zincir cDNA sentezi için kullanılan primerle ilgilidir.
Aslında iki teknik arasındaki fark tek zincir cDNA sentezi için kullanılan primer ile ilgilidir.
Bu nedenle mRNA’nın 3’ ucuna bağlanabilmektedir. Aksine rastgele seçilmiş primerler içeren PCR

146
[Metni yazın]

metodunda antisense primer rastgeledir ve mRNA’nın herhengi bir yerine bağlanabilir. Her durumda,
yüzlerce mRNA molekülü havuzundan kısmi cDNA’ları çoğaltmaya izin veren, rastgele anlamlı bir
(sense) primer kullanılır. Elektroforezi takiben farklı şekilde ekspres edilmiş cDNA’lar jelden
kesilebilir ve ileri aşamada genellikle onların farklı biçimli ekspresyonunu doğrulamak için karakterize
edilebilir.

Kutu 6.4 İnsan Duchenne Möuscular Dystrophy (DMD) Geninin Eksiltme-Klonlama Tekniği
İle İlgili Kısa Bir Yayın
Çoğu eksltme-klonlama deneyleri cDNA’ları gerektirir. Bu yayın raporu eksiltilmiş bir genomik
kütüphane kullanılarak bir geni izole etmek için birkaç başarılı girişimden biridir. çalışmaX
kromozomuna bağlı 4 kusurdan sıkıntı çeken erkek bir çocuğun BB olarak tanımlanmasıyla başladı.
Sitogenetik analizler erkeğin Xp21 nolu kromozomu üzerinde DMD lokusu olarak bilinen bir
kromozom delesyonuna sahip olduğunu gösterdi. Bir eksiltme- klonlama prosedürü BB genindeki
delesyona uğramış DNA sekanslarını izole etmek için tasrlandı (Kunkel, 1986). Genomik DNA BB’den
izole edildi ve ardışık olarak paylaştırıldı. Küt ve spesifik olmayan yapışkan uçlu fragmentler
oluşturuldu. Üstelik DNA 4 normal X kromozomundan anöploid bir hücre soyundan izole edildi. Bu
DNA Mbo1 restriksiyon enzimiyle kesildi. Klonlama için uygun yapışkan uçlar oluşturuldu. Mbo1
fragmentleri ardışık BB den büyük miktarda kırık DNA fragmentleriyle karıştırıldı ve karışım
dentürasyona tabi tutuldu. Sonra fenol saflaştırması için kullanılarak tekrar yoğunlaştırılarak
yapıştırıldı. Stratejinin arkasında yatan temel, ardışık olarak kesilmiş DNA içersinden fazlalıkları
ayırmaktır.Buna rağmen bu sekanslar Mbo1 fragmentleri arasında yer alır. Fakat sadece hücre
soyundan komplementer zincirlerle birleşebilenler delesyon nedeniyle BB’nin DNA’sından
yoksundur.Böyle zincirler Mbo1 yapışkan uçlarına alındı ve bu nedenle uygun bir klonlama vektörüne
ligasyonla yapıştırıldı. Bu strateji kullanılarak Kunkel ve ark. B’deki delesyona karşılık gelen
fragmentler için ileri derecede zenginleştirilmiş bir genomik kütüphane oluşturuldu. Kütüphanedeki
alt klonlar, delesyon haritasının çıkarılması için normal DNA ve BB DNA’sına karşı hibridizasyon
yoluyla test edildi. Geninue DMD geninin izole edildiğini teyit etmek için, pozitif subklonlar DMD’li
diğer çoğu hastadan alınan DNA’ya karşı test edildi ve benzer delesyon oranı %6.5 olarak bulundu.

Bu gösterim tekniğinin problematik ve oldukça fazla sayıda pozitif gibi görünen yanlış
sonuçlar verdiği bilinmesine rağmen, kaydadeğer önemli başarlar da elde edilmiştir. Liang &
Pardee’nin orijinal kaydına göre teknik, normal hücreler ve tümör hücreleri arasındaki farlılıkları
çalışmak için kullanıldı ve kanserin başlamasıyla ilgili bir dizi genin tanımlanmasıyla sonuçlandı
(Liang et al, 1992). Ileri aşamada farklı gösterim tekniğidiğer gruplar tarafından kullanılarak kanserle
ilgili gen ürünleri keşfedildi (Sager et al 1993, Okamoto & Beach 1994). Teknik ayrıca gelişimsel
147
[Metni yazın]

açıdan düzenleyici genlerin (Adati et al, 1995) ve hormon tedavisiyle teşvik edilmiş genlerin (Nitsche
et al, 1996) tanımlanmasında da başarılı şekilde kullanıldı. Gösterim tekniğinin aşırı azaltılmış
kütüphanelerdeki bir avantajı, aynı gen ailesinde yer alan ilişkili mRNA’lardaki değişikliklerin
belirlenebilmesini sağlamasıdır. Azaltma (eksiltme)- klonlama prosedürlerine, bu gibi farklılıklar
çoğunlukla gözardı edilir çünkü sürücü (driver) DNA’nın fazlası bu gibi sekansları elimine edebilir.

Şekil 6-17: Farklı mRNA gösterim tekniğinin özeti. a) 12 oligo(dT) farklı primerlerinin her biri ile iki baz
ilavesi olan bir grub sentez edilir: bu primer grubu için genetik işaretleme NVTTTTTTTTT ‘dir. N her
nükleotitte ve V ise T hariç her nükleotittedir. b) iki kaynaktan elde edilen farklı mRNA’lar bu primerler
kulanılarak cDNA’ya dönüştürülür. Her bir kaynaktan gelen cDNA’lardan oluşan birbiri ile çakışmayan 12 tane
ilk zincir cDNA havuzu oluşturulur. Daha sonra uygun oligo (dt ) primerleri kullanılarak PCR yapılır. Bu 9
merslik primerler cDNA’da herhangi bir yere bağlanabilir.bu, cDNA’ların amplifikasyonunu kolaylaştırır.
Ekspres edilmiş sekans kuyrukları ile aynı şekilde olur. Farklı ekspres edilmiş kaynaklardan elde edilen
Cdna’lardan elde edilen PCR ürünleri yanyana yürütülür. Bir hatta varken; diğerinde olmayan PCR primeri farklı
olan gendir. Farklı olan bantlar jelden kesilir. c) cDNA’ların havuzlarının çoğalmasını kolaylaştırır, alternatif
mRNA kaynaklarından elde edilir, fakat primerlerin aynı çiftiyle çoğaltılanlar daha sonra sekanslama jeli
üzerinde yan yana karşılaştırılır. Bir şeritte bantlar mevcuttur, fakat diğerinden mevcut olmayan farklı olarak
expres edilen genlerin temsili muhtemeldir. Uygun bantlar sekanslama jelinden kesilerek alınır ve PCR ürünleri
subklonlanır. Sekans annotationuna izin verilir ve diferansiyel expresyonu doğrulamak için in situ
hibridizasyonla veya northern blotla expresyon analiz edilir.

148
[Metni yazın]

Temsili farklılık analizi bir PCR esaslı subtractive-klonlama prosedürüdür

Temsili farklılık analizi bir PCR esaslı subtractive-klonlama prosedürüdür.
Temsili fark Analizi birtür PCR eksiltme tekniğidir, örnak olarak iki kaynak arasındaki benzer
sekanslar çoğaltma öncesind elimine edilebilir. Bu metot genomların karşılaştırmalı analizi için
geliştirilmiştir (Lisitsyn et al, 1993). Fakat farkı biçimlerde ekspres edilen genleri klonlamak için
modifiye edilmiştir (Hubank & Schatz 1994) Teknik özellikle sürücü(driver) bir kaynaktan alınmış
bir DNA’nın aşırı miktarlarını hibridizsayonla eksiltmede aynı prensibi kullanmayı gerektirir ve diğer
kaynakta bulunan benzer sekansları klonlanamaz şekilde ayırmada kullanılır. Genel plan şekil 6,18’de
gösterilmektedir. cDNA iki kaynaktan hazırlanır, restriksiyon enzimleri ile kesilir ve çoğaltılır. Bir
kaynaktan çoğaltılmış ürünlere PCR primerlerinin her bir çifti için yapışma bölgesi sağlayan spesifik
linkerler yapıştırılır. Bu linkerler driver cDNA’YA dahil edilmezleraşıerı miktarda driver cDNA
oluşturulur ve bunlar daha sonra tester cDNA’ya eklenerek populasyonlar karıştırılır. Driver/driver
fragmentleri linkerler taşımazlar ve çoğaltılamazlar, driver /tester fragmantleri ise tek bir primer
bağlanma bölgesine sahiptirler ve doğrusal bir durumda çoğaltılabilirler. Buna rağmen, sadece her iki
ucunda da linker olarak tester taşıyan cDNA’lar eksponensiyal olarak çoğaltılabilir ve bu nedenle de
izolasyonu ve klonlanması rahatlıkla gerçekleştirilebilir.

Şekil 6-18 : cDNA esaslı temsili farklılık analizi için temel strateji

149
[Metni yazın]

7. BÖLÜM

PYROSEQUENCİNG

150
[Metni yazın]

134. sayfa

Pyrosekansing anlık olarak analiz yapılmasını sağlar.

Sekans yapılırken DNA kalıbına hangi nükleotitlerin ilave edildiğini belirleyen tekniktir.
DNA polimeraz, tek zincir kalıpta ilerlerken, her bir nükleozite trifosfatın her biri sıra ile ilave
edilir, daha sonra ayrılır.hangisi uygun ise; o arada olur. 4 bazdan biri bağlantılı olur ise;
pirofosfat salınımı olur. Ve bu da ışık yayan bir enzim sistemi tarafından tespit edilir.
Pirosekansın tekniğinin 2 varyantı mevcuttur. Katı faz pirosekansı tekniğinde sekans edilecek
DNA immobilize edilir. Her bir nükleotit ilave edildikten sonra fazla substratın
uzaklaştırılması için yıkanır. Sıvı faz sekansında ise; nükleotit degrede edici ( apiraz ) enzim,
4 enzimli bir sistem yapmada kullanılır. Bu enzimin ilavesi ile katı destek ihtiyacını ortadan
kaldırır. Böylece vasat bir yıkama pirosekansının tek tüpte olmasını sağlar. Yıkama işlemi
yok ise; inhibitör edici maddeler birikir. Bu tipik programın çıktısı şekil : 7 . 12’de
gösterilmektedir. Şunu belirtmek gerekir ki; enzim selülitleri tarafından oluşturulur ışık
salınan pirofasfatın miktarı ile alakalıdır. Aynı nükleotitten ardışık olarak ilave edilmiş ise;
bunu anlamak için yazılım algoritması kullanmak gerekir. Pirosekans için kalıp hazırlamak
kolaydır. Kalıp PCR ile hazırlandıktan sonra PCR ürünlerinden bağlanmış olmayanlar yıkanır.
Saflaştırma için 2 yöntem mevcuttur. Birincide iyonize edilen boncuklara biyotinli DNA
streptovidin ile tutunur. İkincide ise; alkalin faofat, pürinaz ve endonükleaz PCR ürününe
ilave edilerek primerlerin ve nükleotitlerin tahribi sağlanır. Sonra sekans primeri eklenerek
karışım ısıtılıp soğutulur. Bu adım enzimleri inaktive, DNA’yı denatüre eder. Primerlerin
kalıplarına bağlanmasını sağlar.
Pirosekans ile okunacak dizi 200 bazdır. Sangere göre; daha küçüktür. Bunun ile birlikte
birçok modifikasyon ile okuma uzunluğu uzatılmıştır. Örneğin; tek zincire bağlanan SSC
proteinlerinin DNA’ya eklenmesi zinciri uzatır ve zor kalıpların okunmasını kolaylaştırır ve
primer dizaynına esneklik sağlar. Otomatik pirosekans sistemlerinin mevcut olması daha çok
sekanslama için bu tekniğin kullanılmasını kolaylaştırmaktadır. Test dizisini etiketleme gereği
olmaması bu tekniğin anahtar faydasıdır.

151
[Metni yazın]

8. BÖLÜM

GENLERİN DEĞİŞTİRİLMESİ:
BÖLGE-HEDEFLİ MUTAGENEZ VE
PROTEİN MÜHENDİSLİĞİ

152
[Metni yazın]

Giriş
Mutantların oluşumu ve karakterizasyonu, yapı ve işlev ilişkileri herhangi bir çalışmanın
parçası değildir. Proteinin üç boyutlu yapısı, RNA türleri ya da DNA düzenleyici elementler (ör:
promotor), mutantların fonksiyonları ile ilgili ipucu sağlayabilir fakat doğru mekanizma nükleotit ya
da aminoasit değişikliklerinin mutasyon analizleriyle açıklığa kavuşturulabilir.
Klasik olarak, mutantların değiştirilmiş DNA’sı kimyasal ve fiziksel ajanlı deney organizmalarla
(mutajen) muamele edilerek meydana getirilir. Mutagenezin bu metodu oldukça başarılıdır, moleküler
biyolojinin gelişimi ve fonksiyonel genomların gelişimine neden olmuştur fakat birkaç dezavantajdan
dolayı sorun meydana gelmiştir.
1) Organizmadaki herhangi bir gen mutasyona uğrayabilir ya da ilgili gendeki mutasyonun
sıklığı çok düşük olabilir. Bunun anlamı, seçilim stratejileri geliştirilmelidir.
2) Hatta istenen fenotipteki mutantlar izole edildiğinde, mutasyonun istenen gende olmuş
olmasının garantisi yoktur.
3) Önceki gen klonlama ve dizilenmesi tekniklerinde, gendeki tek baz değişiminin meydana
gelmesinin, DNA’ ya eklenme ve silinme gibi gendeki mutasyonun nerede olduğunu bilmenin
bir yolu yoktur.
Moleküler biyoloji tekniklerinin gelişmesi ile, tek bir genin izolasyonu ve çalışılması sadece mümkün
olmadı ayrıca mutagenez de geliştirildi. Bugün birçok hücre ve organizmanın mutasyonu, binlerce
milyonlarca dölden istenilen mutantın izolasyonunun yapılmasındansa, klonlanan DNA dizisinde her
hangi bir baz kaybı olmadan bir değişiklik yapmak mümkün olabilmektedir. Bu teknik Bölge-hedefli
mutagenez olarak bilinmektedir.
Geçmişte oldukça beceri isteyen ve zor bir iş olan gen manipilasyonunun temel aracı haline gelmiş,
DNA manipilasyonunu basitleştirmiştir.
Bölge-hedefli mutagenezin önemi, gen yapısı ve işlevinin ötesinde, teknik değerli özellikteki mutant
proteinlerin oluşturulmasına imkan sağlamasıdır (protein mühendisliği). Yalnız bu tür mutant
proteinler, sadece küçük değişikliklere sahip olmuş olabilir fakat tüm alanın silinmesi ya da yeni alan
eklenmesi alışılagelmiş bir durum değildir.

Bölge spesifik mutasyon için primeri uzatma (tek primer metodu) kolay bir metoddur.
Bölge spesifik mutasyon için geliştirilen ilk metod tek primer metodudur. Bu metod in vitroda
DNA’nın komplementer sekansına uyumlu olmayan ama bağlanabilen bazlar içeren kimyasal
oligonükleotitlerle sentezlenmesidir. Metod kısaca mutasyona uğratılacak tek zincir DNA ve bu genin
M13 vektörüne klonlanmasını kapsar. Bunun yanında DNA plasmide klonlanır ve kısmen uygun tek
zincire dönüşen çift zincir DNA elde edilir.

153
[Metni yazın]

Şekil 8.1 Oligonükleotit hedefli mutagenez. Yıldız işareti yanlış eşleşen bazları göstermektedir.
Aslında DNA polimeraz’ın Klenow fragmenti kullanılmıştır, ama şuanda çoğunlukla T7 polimeraz ile
yer değiştirmiştir.

Sentezlenen oligonükleotitler DNA sentezi ve kendi içinde birleşerek heterodubleks molekül

haline gelir. E. coli’ye transformasyondan sonra bu heterodupleksten ya orijinal yaban tip DNA veya
mutant baz içeren DNA’lar oluşur. Mutasyonlu koloniler yaban tiplerden daha az olacaktır. Mutantları
belirlemek için klonlar 32P ile işaretli problarla tarama yapılabilir. Uygun hibridizasyon koşullarında,
(sıcaklık ve tuz konsantrasyonunda ) pozitif sinyal sadece mutantlardan alınacaktır. Bu da ilgilenilen
mutantı bulmayı kolaylaştırmaktadır. Mutant sekansları DNA problarıyla taramak oldukça hesaplıydı
fakat rastgele baz değişikliklerini ortaya koyamamaktaydı. Bu E. coli DNA polimerazın kullanıldığı
ilk versiyonlara has bir durumdu. Daha sonraları doğru baz ekleme kapasitesi yüksek DNA polimeraz
kullanılarak yanlış mutasyon problemi, çift zincir oluşturma zamanı kısaltılarak azaltılmıştır. Ayrıca
bu polimeraz, orijinal mutant oligonükleotidleri seçmeyi sağlayan zincir çıkartma işlemini yapamaz.
Bu prosedürün bir versiyonu da baz eklenmesi veya çıkartılmasıdır. Tek zincir yaban tip DNA
hibritler kararlı olduğu sürece, in vitro DNA senteziyle eninde sonunda baz eklenmiş veya çıkartılmış
klonların sayısı artacaktır.

154
[Metni yazın]

Şekil 8.2 Oligonükleotide dayalı mutagenez, çok noktalı mutasyon, insertion mutasyon ve
delesyon mutasyon için kullanılır.

Tek-Primer Metodunun Birçok Eksiklikleri Bulunmaktadır.

Tek primer metodunun verimi birçok faktöre bağlıdır. Çift zincir heteroduplex moleküllerin yanı
sıra yaban tip tek zincir DNA’lar ve kısmen çift zincirli moleküller de bulunabilir. Bu durumda
primerler bağlanamaz; çünkü DNA’nın kendi bölgeleri birbirine yapışabilir. Böylece de mutasyon
gerçekleşmeyebilir. Sükroz gradienti veya agaroz jel ile uzaklaştırılabilir ama bu da zaman alıcı ve
zahmetli olur.
Transformasyonu takiben ve in vivo da DNA sentez edildikten sonra heteroduplex moleküller
ikiye ayrılır: mutant populasyon ve yaban tip populasyon. Mutant tipler parental (atasal)
moleküllerden gelişmiştir ve bu süreç, hücrelerin uygun olmayan onarım sisteminden dolayı çok
karmaşıktır. Bu teoride, uygun olmayan onarım sistemi eşit sayıda mutant ve yaban tipler
oluşturmalıdır; ama uygulamada mutant tipler az sayıdadır. Az sayıda mutant tip oluşmasının en
büyük sebebi ise E.coli metile dayalı onarım sisteminin, metilsiz DNA’yı onarmayı tercih etmesidir.
Hücrede, henüz metillenmemiş yeni sentez edilen DNA zincirleri, uygun olmayan bir mutasyonu
önlemek için tercihen onarılır. Benzer bir yolla metillenmemiş in vitro gelişen zincir, hücre tarafından
onarılır ve sonunda tipin gelişimi yaban tip olur ( Kramer et al.). Uygun olmayan tamir sistemine
dayalı problemler, mutL, mutS ve mutH mutasyonlarını taşıyan konak suşlarının kullanılmasıyla son
bulur.
Bir mutant ve bir mutant olmayan zincir bulunan heteroduplex molekül, replikasyon sürecinde
kesinlikle mutant ve yaban tip sayısını arttıracaktır. Burada arzu edilen, mutant olmayanların
büyümesinin baskılanması ve bu düşünce üzerine birçok farklı strateji geliştirilmesidir (Kramer, B.
1984, Carter et al. 1985, Kunkel 1985, Sayers&Eckstein 1991).
Bu metodun bir dezavantajı da her zaman tek zincir kalıba ihtiyaç duyulmasıdır. Buna karşılık
olarak, PCR- tabanlı mutagenesizde, kalıp, çift zincir, tek zincir, linear ya da dairesel olabilir. Tek
zincir DNA ile karşılaştırıldığında, çift zincir DNA’nın hazırlanması daha kolaydır. Ayrıca, genelde
gen insertleri, çift zincir DNA’da daha istikrarlıdır.
Yukarıda anlatılan konu çift zincir hedeflerin ve çoklu primerlerin ticari olarak kullanan mutajen
kitleri açıklamaktadır. Örneğin; GeneEditorTM sisteminde (Sekil 8.3) 2 primer kullanılır. Bunlardan
bir tanesi hedef gen içerisine klonlanan mutasyonu kodlar. İkincisi ise antibiyotik direnç özelliğini
değiştirerek seftazime dirençli hale getirir. Sağlam circular DNA molekülünün 2 primerinin

155
[Metni yazın]

uzamasından sonra, mutant plazmit E.coli ye transform edilir. Ve mutant plazmit antibiyotikli ortamda
çoğalır. Antibiyotikli ortamda çoğalan plazmitler daima hedef mutant geni taşıyabilir. Bu prosedürün
çeşitleri, vektör 2 antibiyotik direnç belirleyicileri(ampisilin ve tetrasiklin) var.Ama bunlardan bir
tanesi (ampisilin) mutasyon taşır.Tekrardan 2 primer kullanılır.Ve bir tanesi hedef gende bulunan
mutasyonu taşır.Diğeri ampisilin dirençliliğini düzenler.In vitro mutasyon basamağından sonra
plazmit E.coli ye transform edilir.Ve ampisilin dirençliliği seçilir. Eğer hücre ampisilinli ortamda da
büyüyebiliyorsa sizin istediğiniz hücre vardır.

Şekil 8.3. GeneEditorTM sisteminde yüksek sıklıkta mutasyon oluşturmak için bölge hedefli
mutagenezin kullanılması

Bu süreci basitleştirmek ve seçilmiş bölgede tüm olası aminoasit değişikliği için metodlar
geliştirilmiştir.
Bölge-hedefli mutagenez kullanılarak, iki ya da üç birleşik nükleotiti değiştirmek mümkündür
böylece istenilen alanda uygun aminoasit dizisi elde edilebilir. Bu ürünler; 19 farklı mutagenik
oligonükleotitin sadece tek bir kodonun herbir yer değiştirmesi için gereklidir. Tek aminoasidi diğer
bütün alternatiflere değiştirmenin diğer bir yolu, kaset mutagenezdir.
Bu yöntem gen fragmentlerinin istenen kodon değişikliklerinin içeren diğer fragmentlerle yer
değiştirmesini içerir. Mutagenezin etkili ve %100’e yakın olması için basit bir yöntemdir. Fakat eğer
iki alanda istenen aminoasit değişikliği varsa, 400 farklı oligos ya da fragment gereklidir. Yöntem
sorgulanabilir hale gelir..Bu problemi çözmenin bir çözümü inosinli oligonükleotidlerin kullanımıdır.
(Şekil 8.4)

156
[Metni yazın]

Şekil 8.4 Katkılı oligonükleotidler yoluyla mutagenez. Oligonükleotidin üst iplikçiği sentezlenirken, N
pozisyonunda dört nükleotidin bir karışımı kullanılır. Zayıf zincir sentezlenirken, gösterilen
pozisyonda inosin (I) eklenir. İnosin sadece G ile eşleşmez. Çift zincirli oligonükleotid vektörün ilgili
pozisyonunun içine sokulur.

PCR, Bölge Spesifik Mutajen Yapma İçin Kullanılabilir

PCR ile DNA çoğaltılmı metodu üzerine yapılan ilk çalışmalar PCR ‘ın potansiyel bir mutajen
olduğunu gösterdi(Scharf ve arkadaşları 1986). Primer ile kalıp DNA arasındaki tek bir bazın yanlış
eşleşmesiyle, çoğaltılma sonucu bu yanlış eşleşim kalıp dizi içine dâhil olur(Fig. 8.5). Higuchi ve
arkadaşları temel metodun bir varyasyonunu olarak, PCR ürünü olan DNA fragmentlerinin içinde
herhangi bir yerde mutasyonu mümkün kılan bir yöntem geliştirdiler. İki PCR reaksiyonu üst üste
çakışan iki DNA fragmenti verir, üst üste çakışmış bölgede her iki DNA fragmenti aynı mutasyona
sahiptir. Dizilerdeki komplementer bölgeler primerlerin hibridizasyonuna izin verir. Oluşan iki
hibritten biri, çift zincirli bir dizi oluşturmak için DNA polimerazca uzatılır. İkinci hibrit ise,
polimerazın substratı olmadığı için reaksiyon karışımında kaybolur.

157
[Metni yazın]

Şekil 8.5. PCR aracılığıyla yapılan bölge spesifik mutasyon. Diyagram, basit bir PCR mutasyon metodunu
gösteriyor. Şeklin üst yarısında DNA molekülünün ortasına mutasyonun nasıl ilerlediğini göstermektedir.
Primerler koyu gösterilmiştir. A ve A' primerleri birbirinin komplementeridir.

Higuchi ve arkadaşlarının geliştirdikleri metot, 4 primer ve 3 PCR gerektirdiğinden

daha komplekstir. Ticari firmalar daha basit metodlar geliştirmiştir ve bunlardan iki tanesi
şöyle tanımlanabilir. PCR mutasyonlarının iki özeliği şudur; birincisi, prosedür tek baz
değişimiyle kısıtlı değildir, bunun yanı sıra uygun primerler seçimiyle delesyon ve insersiyon
yapmak mümkündür. İkicisi ise, Taq polimeraz düşük verimle DNA yı kopyalayabilir bu da
dış mutasyonların çoğaltma reaksiyonu boyunca oluşma riskini arttırır. Bu sorun yüksek
verimli termostabil polimeraz kullanılmasıyla, kalıp DNA konsantrasyonunun arttırılmasıyla
ve çoğaltmanın 10 döngüden daha az yapılması ile en aza indirilir.(Taq polimerazın
proofreading aktivitesi olmadığı için mutasyona elverişlidir bunu engellemenin başka bir yolu
da proofreading aktivitesi olan başka bir enzimin kullanılmasıdır)
Ticari firmaların geliştirdikleri iki metot, ExsiteTM ve GeneTailorTM metotlarıdır. Bu
metotlardan ExsiteTM metodunda hedef geni taşıyan vektörün her iki zinciri de PCR ile
çoğaltılır fakat primerlerden sadece biri istenilen mutasyonu taşır. Bu mutant geni taşıyan
DNA fragmentleri halka DNA ya aktarılırsa hem mutant hem de mutant olmayan ürünler
oluşturacaktır. Eğer kalıp DNA, restriksiyon- modifikasyon sistemi olan bir E.coli

158
[Metni yazın]

hücresinden edilmişse, bu DNA metillenmiştir ve DpnI endonükleazına duyarlıdır(bu enzimle

kesilebilir). Halkasal DNA ya yapıştırılıp E.coli ye transfer edilmiş amplifikasyon ürünü olan
linear DNA lar, DpnI e karşı dayanıklıdır. Metillenmiş kalıp DNA ve metillenmemiş üründen
oluşan herhangi bir hibrit molekül de endonükleaz tarafından parçalanabilir.

Şekil 8.6. PCR ile mutant oluşturmak için ExsiteTM metodu kullanılır. Hedef geni taşıyan ebeveyn
plazmit, E.coli’nin restriksiyon sistemi olan bir suşundan geliştirilmiştir ve böylece metillenmiştir. Bu onu DpnI
endonükleaz enzimine duyarlı yapar. Bu nedenle son PCR karışımından elde edilmiş olabilir.

GeneTailorTM metodu (Fig. 8.7) hedef DNA mutasyona uğramadan önce in vitro ortamda
metillenir ve üst üste binmiş primerler kullanılır. İstenilen mutasyonu taşıyan linear amplikonlar bunda
da üretilir fakat bu methodda linear amplikonlar direkt E.coli’ye transform edilir. McrBC endonükleaz,
metillenmemiş mutasyona uğramamış parçayı bırakıp metilenmiş kalıp DNA’yı keserken konak tamir
enzimleri linear mutasyonlu DNA’ya dönüştürür.

159
[Metni yazın]

Şekil 8.7. PCR kullanılarak mutantları oluşturmak için GeneTailorTM metodu kullanılır.

Bir Genin Üzerinde Rastgele Mutasyon Yapılmasına Olanak Sağlayan Metotlar Vardır
Genin içerisine belirli mutasyonlara olanak veren metodlar önceki konuda bildirmiştir. Bu
metotlar yapı-aktivite ilişkilerinin de belirlenmesinde rol oynar. Bununla birlikte çalışmanın amacı
değiştirilmiş ve/ve ya geliştirilmiş özellikteki mutantları seçmekse, geni rastgele değiştirmek daha iyi
bir yaklaşımdır. Klonlanan genlerin rastgele mutasyon yapı ile ilgili metotlar bu bölümde anlatılmıştır.
Polimeraz zincir reaksiyonu(PCR) ın hataya meyilli olması ve amplikonlaradaki baz
değişikliklerinin yüksek oranda olmaları ihtimalleri vardır. Bununla birlikte Taq polimerazın düşük
orandaki affinitesiyle de mutasyon yapılabilir. Yine de yanlış olan bileşimlerin oranlarını arttırmak bu
yollardan biridir. En geçerli yollardan birisi, tampondan Mg+2 yerine Mn+2 kullanımı ve diğer iki
nükeleotide oranla daha çok dGTP ve dTTP ilave etmektir. Bu yolla her kilobazdaki bir nükleotitin
yanlış yerleştirilmesi mümkündür(Caldwell & Joyce 1994, Cirino et al.) Hatta nükleosit trifosfat
analogları kullanımı ile yüksek oranda mutasyon gerçekleştirilir(Zaccolo ve arkadaşları 1996).
160
[Metni yazın]

Hataya yatkın PCR metotlarında polimeraz, büyümekte olan zincire ya yanlış baz ilave eder ya
da enzimin proofreading aktivitesi yoktur. Mutant kütüphanelerinin rastgele mutasyonlar sonucu
oluşması beklenir, ancak çeşitli faktörler de bunda etkilidir. Bunlardan:
birincisi; DNA polimerazdan kaynaklanır. Bazı hata tipleri diğerlerine göre daha çok olur
(Cirino ve arkadaşları 2003).
İkincisi, genetik koddan kaynaklanır. Örneğin Valin kodonundaki tek bazın değişimi;
fenilalanin, lösin, izolösin, alanin, aspartat ve glisin gibi aminoasitlerin kodlanmasına yol açarken
ardışık iki ya da üç baz değişimi diğer bütün amino asitlerin kodlanmasına neden olur.
Üçüncü olarak da, amplifikasyon sürecinden kaynaklanır. PCR da ilk adımda olan mutasyon
diğer döngülerde de görülecektir fakat onuncu döngüdeki mutasyon birinci adımda olan mutasyona
göre daha az görülecektir. Bunun için hatayı azaltmak için döngü sayısını az tutmak gerekir.
Hataya yatkın PCR yöntemi, bir amino asiti, son proteindeki içindeki başka bir amino asite
dönüştürmede verimli bir araçtır. Bununla birlikte bazen bazı amino asitlerin delesyon ve
insersiyonları da mümkündür. Bu, Murakami ve arkadaşları tarafından (2002,2003) tasarlananan bir
yöntemdir (RID). Metodun esası insörtü rastgele bir bölgeye yapıştırmak ya da çıkarmaktır.

Değiştirilmiş Proteinler, Protein Sentezi Sırasında Olağandışı (doğal olmayan) Amino

Asitlerin Sokulmasıyla Üretilebilir
Anlatılan tüm mutasyon metodları ile proteinde bulunan bir ya da daha fazla amino asitin
yerine başka doğal amino asitlerin yer almaları sağlanmıştır (Fenilalanin yerine tirosinin, triptofan
yerine ise histidin değişimi olduğu gibi). Doğal olmayan amino asitlerin in vivo da protein içine
sokulmasıyla yeni özelliklere sahip proteinler oluşturulabilir. Örneğin metionin yerine
selenometiyonin konulması, proteinlerin üç boyutlu yapılarının tespitini kolaylaşır (Hendrickson ve
arkadaşları 1990). Proteinlerin içine doğal olmayan aminoasitleri sokmaya bakterileri zorlamak
mümkünse de bunun için en iyi metot translasyon basamaklarını düzenlemektir (Link ve arkadaşları
2003). Bu, aminoaçil- tRNA sentetaz ve sentetaza bağımlı olmadan çalışan tRNA ile E.coli den
endojen tRNA üretilmekle başarılmıştır (Wang ve arkadaşları 2001a, Santoro ve arkadaşları 2003).
Bunlar ortagonal olarak adlandırılmıştır ve birkaç kritere sahiptir;

• tRNA hiçbir endojen E.coli sentetazın substratı değildir ama protein translasyonunda
etkili bir şekilde iş görürler.
• Ortogonal sentetaz, amber (UAG) ya da opal (UGA) stop kodonunu tanımlayacak
şekilde modifiye edilen ortogonal tRNA yı aminoaçiller (yükler).
• Sentetaz, E.coli‘nin hiçbir endojen tRNA sını aminoaçillemez.

Arkeabakteriler E.coli de kullanılabilen ortogonlar için iyi bir kaynaktır.

161
[Metni yazın]

Amber ve opal kodonlarının tanınması için tRNA daki antikodonların modifiye edilmeleri diğerlerine
göre daha kolaydır. Bununla birlikte doğal olmayan aminoasitlerin normal amino asitlere göre daha
etkili bir şekilde tRNA ya yükleyebilecek şekilde bir sentetaz da modifiye edilmelidir. Bu yaklaşımla
Methanococcus jannaschii’nin tirozin-tRNA sentetazı, tirozin ve fenilaleninin O-alliltrozin, p-asetil-
fenilalenin, p-benzol-fenilalenin gibi türevlerinin proteine sokulmasını sağlamak için modifiye
edilmiştir. Bu modifiye amino asitler in vitro da proteinin kimyasal modifikasyonu için (örneğin
floresan etiket olarak kullanılabilme gibi) kullanılabilir (Chin ve arkadaşları 2003, Link ve arkadaşları
2003).
Yukarıdaki teknikte iki önemli gelişme vardır. Birincisinde Zhang ve arkadaşları (2003)
proteinlerin invitro’da olduğu gibi invivo’da da modifiye edilebileceğini göstermişlerdir. Örneğin m-
asetilfenilalanin, protein Z’nin sitoplazmik biriminin 7. Lys ve dış zar proteini LamB’nin 200.
Arg’inin yerine konulmuştur. Hücrelere zardan geçen bir boyanın ilave edilmesi ile modifiye
proteinler işaretlenmiş olacaktır. Hücrenin modifiye LamB türevlerini sentezlediği durumlarda, zardan
geçemeyen ve floresan ışık yayan türevlerin belirlenmesi mümkün olmuştur.
İkinci gelişme, ortogonal tRNA’ları glikozillenmiş amino asitlerle yüklemektir. Örneğin,
Zhang ve arkadaşları (2004), E.coli içerisinde, β-N-glikozilamin (GlcNAc) içeren bir miyoglobin
türevi sentezlemeyi başarmışlardır. Bu GlcNAc bir sakkaroz bağlama proteini tarafından tanınır ve
galaktoziltransferaz tarafından modifiye edilebilir.

Mutant Peptitlerin Seçimini Kolaylaştırmak İçin Fajlar Kullanılabilir

Faj ile görüntülemede yabancı DNA ya bir fajmidin veya infeksiyon özelliğine sahip ipliksi faj
genomunun içerisine sokulur ve faj kılıf proteini içerisinde bir füzyon ürünü olarak sentezlenir. Bu,
yeni fonksiyonlara sahip proteinlerin seçimi ve incelenmesi için oldukça güçlü bir tekniktir. Teknik ilk
olarak E.coli fajı M13 için geliştirilmiştir (Parmely ve Smith, 1988), daha sonra T4 ve λ gibi diğer
fajlar için de kullanılmıştır (Ren ve Black, 1998; Santini ve ark., 1998).
M13 fajı tek zincir bir DNA molekülü ve onun etrafını saran, öncü kılıf proteini P8’in çok
sayıda kopyasının bir araya gelmesiyle oluşan bir kılıftan oluşur. Faj partikülünün bir ucunda iki
minör kılıf proteini P9 ve P7’den 5’er kopya, diğer ucunda ise P3 ve P6’dan 5’er kopya bulunur. Faj
ile görüntülemenin ilk örneklerinde rastgele bir DNA dizisi P3 veya P8 geni içerisine, sinyal dizisi ile
doğal protein dizisi arasına yerleştirilmiştir. Rekombinant DNA moleküllerinin E.coli’ye
transfeksiyonu sonucu, yüzeyinde yabancı DNA dizisinin kodladığı amino asitleri taşıyan faj
partiküllerinin sentezlendiği görülmüştür. Bu tip faj partikülleri örneğin antibiyotik bağlanma
özelliklerine göre afinite kromatografisi ile izole edilmişlerdir (Fig 8.8). Birçok afinite kromatografisi
ve faj çoğaltma tekniği, fajın istenen bağlanma özelliklerini taşıması için kullanılabilir. Bu yolla
milyonlarca rastgele peptit bir antibiyotiğe veya streptavidine bağlanabilme özellikleri bakımından
incelenmiştir (Cwirla ve ark.,1990; Devlin ve ark., 1990; Scott ve Smith, 1990). İnsan büyüme
hormonu yüksek afinite ve reseptör özgüllüğü ile izole edilmiştir (Lowman ve ark., 1991).
162
[Metni yazın]

Orjinal Faj metodunun, dezavantajlarından birisi de polipeptid insertlerinin protein kılıf fonksiyonun
kodlayan kısmın 10 katı kadar olması durumunda verimliliğini kaybetmesidir. Bu problem fajmid
aracılığıyla çözümlenmiştir (Bass ve ark, 1990). Bu sistemde, plazmid M13 ori bölgesi ile M13’ten P3
ve P8 genlerinin tek kopyasını taşımaktadır (bak. S. 75). Önce ki bölümlerde de belirtildiği gibi
istenilen DNA parçası P3 veya P8 geninin aşağasında sinyal peptidinin öncesindeki bölgeye
yerleştirilir ve oluşturulan fajmid E.coli’ye aktarılır. Faj yardımıyla transforme edilen hücreler
yerleştirilen DNA sırasına uygun amino asit sırası gösterirler. Oluşan fajlar karışık fenotipte ve
yüzeyleri normal kılıf proteini ile füzyon proteini yapısındadır.
Özel amaçlar için dizayn edilen fajmidler vektör özelliğindedir. Örneğin dizayn edilen
fajmidler, yerleştirilen DNA sırasından önce ve P3 veya P8 den önce zincir terminasyon kodonu
(amber) bulundururlar. Rekombinant plazmid baskılayıcı faktör içermeyen E. coli kültürüne transfer
edildiğinde insert edilen yabancı DNA tarafından kodlanan bölge amber kodonu vasıtasıyla ortama
salınır. Eğer fajmid, amber kodonunu baskılayacak bir hücrenin içine atılırsa, füzyon proteinin tamamı
sentezlenir ve oluşan faj partikülü yüzeylerinde görülür (Winter ve ark.,1994).

Hücre Yüzeyi Faja Göre Daha Kullanışlı Alternatifler Sunmaktadır

Bir önceki bölümde bahsedildiği gibi faj ile üretilebilecek yabancı proteinin boyutu oldukça
sınrlıdır. Mikrobiyal hücre yüzeyi gösteri sistemleri, bu tip problemlerin üstesinden gelmek için
geliştirildi (Lee ve ark., 2003). Bu sistemlerin oldukça yaygın kullanım alanları mevcuttur. Bu gösteri
sistemleri heterolog peptid veya ilgili proteinleri (yolcu veya hedef protein) çeşitli yüzey proteinleri ile

163
[Metni yazın]

beraber, füzyon proteini (taşıyıcı) olarak kullanmaktadır. Yolcu veya taşıyıcı proteinlerin özelliklerine
bağlı olarak , yolcu protein N terminal, c terminal vaya sandwich olarak üretilir.
Hücre yüzey proteinleri başarılı bir taşıyıcı olduğu için, dört ihtiyaç için memnuniyet vericidir.
Birincisi iç zardan füzyon proteinin geçebilmesi için etkili bir sinyal peptide sahip olması, ikincisi
füzyon proteinin hücre yüzeyine bağlı kalması için kuvvetli bir demirleme yapısına sahip olması,
üçüncüsü füzyon stabil bir yapıya sahip olmadığından yolcu proteinine uygun olmalı, son olarak
büyüme ortamı ya da periplazmik ortamdaki proteazlara karşı dirençli olmalı. E. coli gibi gram negatif
bakterilerde pek çok taşıyıcı protein çeşitleri mevcuttur. Bunlar temelde iki gruba ayrılırlar; dış
memran proteinleri (örneğin adhezin, OmpC ve TraT proteini), pili ve flagella gibi ek yapı proteinleri.
Dış memran proteinleri taşıyıcı olarak kullanıldığında, hangi kısmının yüzeyde kaldığı bilinmelidir.
Çünkü yolcu proteinin insersiyon bölgesinin bilinmesini gerektirir. Yolcu proteinin gösterilmesi,
seçilme uygulamalarını gerektirir fakat bu proteinlerin özellikleri translokasyon işlemlerini gösterme
prosedürlerinin verimliliğini etkilemektedir. Örneğin dış membran bölgede disülfid köprülerinin
oluşumu translokasyon verimliliğini etkiler. Çok fazla yükün veya hidrofilik yapının olması eksik bir
salınmaya sebebiyet verebilir. Böylece bu teknoloji sayesinde, pozitif veya negatif seçimle rastgele
mutasyonlarla oluşturulmuş varyantların taranmasıyla, translokasyon verimliliğini etkileyen faktörler
bulunabilir.

Protein Mühendisliği
Rekombinant DNA teknolojisinin en heyecan verici yönlerinden birisi, proteinlerin dizaynına,
geliştirilmesine, izolasyonuna ve hatta tam kompleks bir proteinin oluşturulmasına izin vermesidir.
Bunun çalışma prensibi, genin farklı ya da rastgele bölgelerinde mutasyon yapılması ve daha sonra
istenilen özellikteki proteinlerin seçilmesi esasına dayanır. Geliştirilen bu protein daha çok mutasyonla
daha da geliştirilerek seçilebilir ki bu işlem directed evolution(yönlendirilmiş mutasyon) olarak bilinir.
Bu yaklaşıma bir örnek olarak subtilisin enzimi gösterilebilir. Bu serin proteazın kataliz oranı, substrat
spesifikliği, pH oranı, oksidatif stabilitesi, sıcaklık ve alkalin inaktivasyonu gibi her özelliği
değiştirilmiştir (Bryan 2000).
Yönlendirilmiş mutasyonun diğer bir alternatif yaklaşımı da gen shuffling metodudur. Gen
shuffling metodu için 3 kaynak vardır. Bunlardan birincisi, ilgilenilen genin farklı polimorfizmleri bir
organizmada doğal olarak bulunabilir ya da in vitro da rastgele mutasyonlarla oluşturulmuş olabilir.
İkinci olarak, aynı protein aynı enzim aktivitesiyle farklı organizmalarda bulunabilir fakat gen ve
protein sırası farklıdır. Gen shuffling metodunda üçüncü kaynak ise ilgi duyulan protein farklı bir
protein ailesine ait ama benzer aktiviteye sahip olabilir.
Gen shuffling çalışmalarına güzel bir örnek olarak, Ness ve arkadaşlarının subtilisin
üzerindeki yaptığı çalışmalar verilebilir (1999). Bunlar, subtilisin ailesine ait 26 üye ile çalışmalara
başlamışlardır ve bir kimerik proteaz kütüphanesi oluşturmuşlardır. Enzim dört farklı özellik açısından

164
[Metni yazın]

tarandığında orijinal enzimden daha iyi özelliğe sahip oldukları anlaşılmıştır. Benzer bir şekilde
Lehmann ve arkadaşları(2000) amino asit sırası belirlenmiş olan mezofilik fitaz ailesi ile çalışmalara
başlamışlardır. Oluşturulan enzim, orijinal enzime göre ısıya dayanıklı olduğu anlaşılmıştır.

Örnek Metot Referans

Dibenzothiophane mono oxygenase modifikasyonuyla RACHITT Coco ve arkadaşları
dizelin biodesulfurization oranın arttırılması 2001

5 farklı subtilisin fragmentinin birleştirilmesiyle StEP Zhao ve arkadaşları

oluşturulan subtilisin 65 0C de yaban tip subtilisinden 50 1998
kat daha verimli olmuştur
Galaktosidaz enziminin fukositaz a dönüştürülmesi Shuffling Zhang ve arkadaşları
1997
Amilosukroz aktivitesinin arttırılması Random Van der Veen ve
mutagenesis plus arkadaşları 2004
shuffling
Sıçan DNA polimeraz beta ile African domuz ateş SCOPE O’Maille ve
virüsü DNA polimerazının X inin birleşmesi sonucu arkadaşları 2002
yeni bir DNA polimeraz eldesi
%40 amino asit ve %49 nükleotit sırası benzerliği içeren SISDC Hiraga & Arnold
iki farklı genin birleştirilmesiyle B- laktamaz eldesi 2003
Tablo 8.1 Protein mühendisliğinin bazı örnekleri

Kutu 8.2 Enzimlerin Geliştirilmesi

A1-antitrypsin (AAT) in Oksidasyona Dirençli Çeşitleri
Akciğer dokusunun kümeler halinde hasar görmesinin nedeni emphisema nın gelişimi olarak
bilinir bu geri dönüşümsüz olarak akciğer dokusunun elastikliğinin kaybolması ile sonuçlanır.
Elastasdaki zarara karşı ilk savunma AAT ile gerçekleştirilir ki, bu 394 amino asitten oluşmuş ve
glikozillenmiş bir serum proteinidir. AAT nin fonksiyonu bilinir çünkü bunda olan bir kusur bağ
dokusunun erken dönemlerde bozulmasına neden olur. Sağlıklı kişilerde AAT’de 358. metiyonin ve
359. serin arasındaki bağın kırılmasından sonra AAT ile nötrofil elastaz arasında bir ilişki doğar.
Sigara içen kişiler emphisemaya çok yatkındırlar çünkü sigara akciğerde lökosit
konsantrasyonunda artışa neden olur ve sonuçta dokular nötrofil elastaza daha çok maruz kalır. Ek
olarak, lökositler serbest oksijen radikalleri açığa çıkarırlar ki bu radikaller 358. metiyonini
oksitleyerek metiyonin sülfokside dönüşmesine neden olur. Metiyonin sülfoksit metiyoninden daha
büyük olduğu için, elastazın aktif bölgesi ile birleşemez. Bu nedenle oksitlenen AAT zayıf bir
165
[Metni yazın]

inhibitördür. AAT’nin 358. metiyonini mutasyonla valine dönüştürüldüğünde AAT oksidasyona

dirençli hale gelmiştir (Courtney ve arkadaşları 1985). Labaratuvar çalışmalarında modifiye AAT nin
elastazın etkili bir inhibitörü olduğu ve oksidasyonla inaktif olmadığı anlaşılmıştır. Klinik olarak da AAT
inhibitör olarak kullanılabilir çünkü AAT üretiminde sorun olan hastalara damar içindeki seruma AAT
verilerek de tedavi yapılabilir.

Subtilisin Performansını Arttırma

Subtilisin üzerinde in vitro da enzim özelliklerini geliştirmek gibi mutasyon çalışmaları 15 yıldır
yapılmaktadır. Bu serin proteazın her özelliği değiştirilmiştir ki bu değiştirilen özellikler; kataliz hızı,
substrat özelliği, pH hız profili, oksidasyona, sıcaklık, alkalin inaktivasyonuna olan kararlılığı
sıralanılabilir. Bu süreçte subtilisin 275 amino asitinin %50 sinden fazlası değiştirilmiştir.
Yukarıda anlatılan değişikliklerin çoğu subtilisinin, hidrolize etme kabiliyetini geliştirmek için
yapılmıştır. Bunun yanı sıra serin proteazlar peptid sentezinde de kullanılabilirler ki bu yaklaşım klasik
metotlara göre daha avantajlıdır (Abrahmsen ve arkadaşları 1991).
Subtilisinin peptid sentezi için kullanılmasındaki tek sorun, reaksiyon organik çözücüler içinde
gerçekleşmedikçe amino asit birleştirmekten daha çok hidrolize meyilli olmasıdır. Çözücüler,
subtilisin yarılanma ömrünü azaltırlar. Bölge spesifik mutasyonlar kullanılarak subtilisinin çözücede
kararlı halde kalabilen birçok varyantı izole edilmiştir (Wong ve arkadaşları 1990, Zhong ve arkadaşları
1991).

Çözünme enerjisini azaltılmak için yüzey değişimlerinin en aza indirilmesi, hidrofobik ve polar
etkileşimlerin arttırılması, protein denatürasyonu için konformasyonel sınırlandırmaların azaltılması
gibi değişimler yapılabilir. Bu değişiklikleri yapmak için enzimin yapı ve fonksiyonları ile ilgili geniş
kapsamlı bir bilgi gerektirir. Chen ve Arnold (1991,1993) farklı bir yaklaşım geliştirdiler. Ortamda

166
[Metni yazın]

substrat olarak kazein ve çözücü olarak dimetil formamid varsa rastgele mutasyonlar sonucu daha
fazla proteolizis yapabilen proteinler oluşmuştur.
Subtilisin çalışmaları bir adım daha götürülerek, sulu çözücelerde dahi sentez özelliklerinin
hidoriz geneline oranla daha fazla olması şeklinde değiştirilebilmiştir. Bu durum enzimin aktif
bölgesindeki serin amino asitinin sisteine dönüştürülmesiyle başarılmıştır (Abrahmsen ve arkadaşları
1991). Bu artışın nedeni, affinitenin artışından ve acyl intermediate reaksiyonundan (8.3)
kaynaklanır.

Şekil B 8.3 Bir asetilaz proteaz aracılığıyla oluşturulan aminolisiz (sentez) ve hidroliz reaksiyonları.

Gen Shufflingi Geliştirmede Bir Çok Farklı Metot Vardır

Orijinal gen shuffling metodunda aynı işi yapan genler alınır ve DNaz ile birlikte küçük fragmentlere
parçalanır. Farklı kaynaklardan alınıp fragmentlere ayrıldıktan sonra bunlar karıştırılarak; erime,
bağlanma ve uzama basamaklarına maruz bırakılırlar (Fig. 8.10). Fragmentler birleşip tam bir gen
olduklarında ise PCR ile çoğaltılıp klonlanırlar. Fragmentler ne kadar küçükse tam bir gen uzunluğu
elde etmek için o kadar çok döngüye ihtiyaç vardır. Bununla birlikte fragmentler ne kadar küçükse o
kadar çok çeşitte ürün elde edilir.

167
[Metni yazın]

Fig. 8.10. Orijinal gen shuffing metodu. İki homolog geni fragmentlere ayırdıktan sonra (fragmentasyon)
döngüde denatürasyon, birleşme ve uzama işlemleri tam bir gen oluşuncaya kadar devam eder ve bu jel
elektroforezi ile belirlenebilir.

Diğer bir alternatif metod zigzaglı uzatma işlemidir (StEP, Zhao ve arkadaşları 1998). Bu metod
gende varyasyonlar yapmak için erime, bağlanma ve uzama döngüsüne dayanır. Bu yöntemde metot
tam uzunluktaki gensürece tam bir gen karışımları ile başlar, bu karışım denatüre edilir ve
komplementer zincirin sentezine başlanır (Fig. 8. 11). Kısa bir primer uzama sürecinden sonra, DNA
erime, bağlanma ve uzama işlemlerine maruz bırakılır. Uzayan primerlerden bazıları farklı baz
dizisindeki bölgelere bağlanır ve ileri ki uzamalar kimeraları üretir. Erime, bağlanma ve uzama
döngüsü arttıkça ürün çeşitliliği de artar.

168
[Metni yazın]

Fig. 8.11 Hibrit proteinleri oluşturmak için StEP metodu. Örnek gösterimde, bir hibrit gen iki homolog
genden oluşturulabilir. Hibrit genin klonlaması bir hibrit proteinin üretiminde sonuçlanabilir. Sadece
her genin bir zinciri, başlangıç denaturasyon basamağından sonra gösterilir..

RACHITT, orijinal DNA shuffling metoduna benzer ancak daha fazla sayıda kimeralar
oluşturmak için tasarlanmıştır (Coco ve arkadaşları 2001, Coco 2003). Bu metotta fragmentler
ebeveyn DNA ların bir zinciri dışındaki diğer zincirden oluşturulur (Fig. 8. 12). Bu fragmentler daha
sonra karşı zincire (kesilmemiş olana) dayanılarak tekrar oluşturulur. Bu fragmentlerdeki uyumsuz
bölgeleri kaldırmak için kesilir, uzatılır ve ardından tüm uzunluktaki geni oluşturmak için yapıştırılır.
Son olarak çift zincir DNA daki kalıp zincir yapıştırılarak oluşturulan DNA dan ayrılması için
parçalanır.

169
[Metni yazın]

Fig. 8.12. RACHITT metodu ile hibrit proteinleri oluşturulması

Tanımlanan metotların hepsinin avantajları ve dezavantajları vardır ve bu metotlar hatalı

eşleşme temeline dayanmaktadır. Bu yüzden her zaman ebeveyn DNA nın üretilmesi ya da
beklenildiği kadar çok varyasyonun olmaması da mümkündür. Bununla birlikte rekombinantların
oluşmasını sağlayan metotlar geliştirilmiştir ( Neylon 2004).

170
[Metni yazın]

Gen Homolojisi Olmadan da Kimerik Proteinler Üretilebilir

Gen shuffling metodunda ebeveyn diziler arasında homolojinin bulunması zorunludur.
Fonksiyonel benzerlikleri olan ama DNA sıra benzerliği %50 nin altında olan proteinler arasında da
hibrit proteinler oluşturmak istenebilir. Homolojisi olmayan DNA dizilerini birleştirmek için metotlar
geliştirilmeye çalışılmış ve ilk olarak Ostermerier ve arkadaşları(1999) ITCHY (incremental
truncation for the creation of hybrid enzymes=hibirt enzimlerin oluşturulması için kademeli kısaltma)
yi geliştirmişlerdir. Bu metot, iki kalıp dizinin kısaltılmasıyla oluşan fragmentlerin yapıştırılmasına
bağlıdır ve her bir kalıp zıt uçlardan kesilir (Fig. 8.13.).

Şekil 8.13. İki benzer proteinden ITCHY metoduyla hibrit oluşturulması. Bu benzer proteinler gen1 ve gen2
tarafından kodlanırlar. Sonuçta gen1 in 5’ ucu gen 2’in 3’ucu ile hibrid geni oluşturulur.

Orijinal ITCHY sürecinde ekzonükleaz kesimleri ile kademeli kısaltma yapılır. Pratikte bu
kesimleri kontrol etmek zordur. Bunun için daha kolay bir yol geliştirilmiştir. Buna göre gen boyunca
rastgele yerlere phosphorothioate bağları içeren kalıplar konmuştur (Lutz ve arkadaşları 2001).
171
[Metni yazın]

Ekzonükleaz kesimleri tamamlandıktan sonra, boyları ekzonükleaza dirençli phosphorothioate

bağlarının uzunluklarına bağlı olarak fragmentler oluşur. Bu metot thio-ITCHY olarak bilinir ve daha
kolayca gerçekleştirilebilir. ITCHY kütüphaneleri her gende sadece bir crosover içermeleri
bakımından eksiklik gösterseler de, ITCHY kütüphanelerinin DNA shuffling metoduyla birleşmesiyle
(bu SCRATCHY olarak bilinir) daha çok varyasyon üretmek mümkündür (Lutz ve arkadaşları 2001b).
ITCHY gibi metotlardaki ana problem mutasyonlar, insersiyonlar ve delesyonlar sonucunda
fonksiyonel olmayan dizilerin üretilmesidir. Proteinlerin üç boyutlu yapılarında domainler ve motifler
vardır. Kimerik bir protein oluşturmak için bu domain ve motiflerin yeniden birleştirilmesi de
gerçekleştirilebilir. Bu işlem için 2 metot geliştirilmiştir. Bunlar SCOPE ve SISDC metotlarıdır.

172
[Metni yazın]

8. QUESTIONS and ANSWERS

1) What is disadvantages of classic mutagenesis metod?
1)Any gene in the organism can be mutated and the frequency with which mutants occur in
the gene of interest can be very low. This means that selection strategies have to be
developed.
2)Even when mutants with the desired phenotype are isolated, there is no guarantee that the
mutation has occurred in the gene of interest.
3)Prior to the development of gene-cloning and sequencing techniques, there was no way of
knowing where in the gene the mutation had occurred and whether it arose by a single base
change, an insertion of DNA, or a deletion.
2) What is site-directed mutagenesis?
As techniques in molecular biology have developed, so that the isolation and study of a single
gene is not just possible but routine, so mutagenesis has also been refined. Instead of crudely
mutagenizing many cells or organisms and then analyzing many thousands or millions of
offspring to isolate a desired mutant, it is now possible to change specifically any given base
in a cloned DNA sequence. This technique is known as site-directed mutagenesis.
3) What are ways to make site-directed mutagenesis with PCR?
It is well known that the polymerase chain reaction is error prone and that there is a high
probability of base changes in amplicons. However, even the relatively low fidelity Taq
polymerase is too accurate to be of value in generating mutant libraries. Nevertheless,
increases in error rates can be obtained in a number of ways. One of the commonest ways of
achieving this is to introduce a small amount of Mn+2, in place of the normal Mg+2, and to
include an excess of dGTP and dTTP relative to the other two nucleotide triphosphates. With
this protocol it is possible to achieve error rates of one nucleotide per kilobase.Even higher
rates of mutagenesis can be achieved by using nucleoside triphosphate analogs.
4) What is the criteria of ortagonal?
• The tRNA is not a substrate for any of the endogenous E. coli synthetases but
functions efficiently in protein translation.
• The orthogonal synthetase efficiently aminoacylates the orthogonal tRNA whose
anticodon has been modified to recognize an amber (UAG) or opal (UGA) stop codon.
• The synthetase does not aminoacylate any of the endogenous E. coli tRNAs.

5) What kind of feature is provided subtilisin enzyme by protein engineering?

Every property of subsitilin enzyme has been altered including its rate of catalysis, substrate
specificity, pH-rate profile, and stability to oxidative, thermal, and alkaline inactivation.
Variants also have been produced that favor aminolysis (synthesis) over hydrolysis in aqueous
solvents.
6) What is method of staggered extension?
An alternative method is the staggered extension process (StEP, Zhao et al. 1998). This also
relies on repeated cycles of melting, annealing, and extension to build the variant genes.
However, in the StEP process one starts with a mixture of full-length genes, denatures them,
and then primes the synthesis of complementary strands (Fig. 8.11). After a short period of
primer extension, the DNA is subjected to a round of melting, annealing, and extension. Some

173
[Metni yazın]

of the extended primers will anneal to templates with a different base sequence and on further
extension will generate chimeras. The more cycles of extension, melting, and annealing the
greater the variability that can be produced.
7) Describe the method of gene shufflig.
In the original method of gene shuffling, one starts by purifying the different genes that will
provide the source of variation. These genes are digested with DNase to generate the
fragments that will be recombined. The fragments from the different sources are mixed
together and subjected to repeated rounds of melting, annealing, and extension (Fig. 8.10).
Eventually a full-length gene should be synthesized and this can be amplified by the PCR and
cloned. The smaller the fragments that are produced in the initial step the greater the number
of single site variations that can be incorporated in the final product. However, the smaller the
fragments the greater the number of cycles needed to reassemble a complete gene.
8) What is the resource of the gene shuffling method?

First, different polymorphisms of the gene of interest might exist naturally in a single
organism or might have been created by random in vitro mutagenesis.
Second, the same protein with the same activity may be found in other organisms but
the gene and protein sequences will be different.
Third, the protein of interest might belong to a protein family where the different
members have different but related activities.

9) Describe the method of RACHITT.

RACHITT (random chimeragenesis on transient templates) is conceptually similar to the
original DNA-shuffling method but is designed to produce chimeras with a much larger
number of crossovers. In this method the gene fragments are generated from one strand of all
but one of the parental DNAs (Fig. 8.12). These fragments then are reassembled on the full-
length opposite strand of the remaining parent (the transient template). The fragments are cut
back to remove mismatched sections, extended, and then ligated to generate full-length genes.
Finally, the template strand is destroyed to leave only the ligated gene fragments to be
converted to double-stranded DNA.
10) Which conditions are you use the ITCHY method?
The gene-shuffling methods describe have an absolute requirement for significant homology
between the parental sequences. However, there may be a wish to create hybrids between
proteins with functional similarities but whose sequence homology is less than 50%.
Achieving this requires methods for combining non-homologous sequences and the first one
to be developed was ITCHY (incremental truncation for the creation of hybrid enzymes).

174
[Metni yazın]

10. BÖLÜM
Escherichia coli HARİCİNDEKİ
BAKTERİLERE KLONLAMA

175
[Metni yazın]

Giriş
Çoğu deneylerde ökaryot ve prokaryotlardan klonlanan genler için alıcı olarak E.coli’yi
kullanmak uygundur. Transformasyon kolay ve bunun için yüksek gen ekspresyonu gibi özelliklere
sahip geniş kapsamlı kolay kullanımlı vektörler var. E.coli’yi kullanmak her zaman pratik değildir
çünkü aromatik bileşiklerin degredasyonu, antibiyotik sentezi, patojenite ve sporulasyon gibi bazı
biyokimyasal yollardan yoksundur. Bazı özel durumlarda genin alındığı organizmaya benzer
organizmalara klonlamak gerekir. Örneğin Clostridium’dan alınan gen Bacillus’a klonlanabilir.
Genleri yeni bir konağa klonlamak için üç ön şart vardır.
• DNA’yı aktarmak için bir metoda ihtiyaç vardır (transformasyon, konjugasyon,
elektroporasyon).
• Aktarılan DNA orada kalıcı olmalı (kendi başına bir replikon olmalı ya da bir hücrenin
kromozomuna entegre olmalı)
• Klonlanmış genlerin içeri alınması ve muhafaza edilmesi eğer bu genler ekspres edilirse
belirlenebilir
Klonlanmış bir genin belirlenememesi; hücreye aktarılmaması, muhafaza edilmemesi ya da ekspres
edilmemesi gibi nedenlerden biri veya birkaçı olabilir.

Bazı Bakteriler Transformasyon İçin Doğal Kompotenttir

DNA konjugasyon, transdüksiyon ve transformasyon gibi üç klasik yolla E.coli’nin farklı
suşlarına transfer edilebilir. Gen manipulasyonlarında transformasyon kullanılır. Bunun üç sebebi
vardır.
• Transformasyon oldukça kolay ve ticari olarak kompotent hazır alınabiliyor.
• Oldukça verimli
• Kendi kendine aktarılabilen klonlama vektörleri (konjugasyonla) aktarılmayanlara göre daha
büyük çünkü konjugal transfer için gerekli olan genleri taşırlar.
E.coli suşları doğal olarak transforme olamıyor. Hücreler kimyasalla muamele edilerek DNA alması
sağlanıyor. Kırkın üzerinde bakteri türünün doğal olarak transforme olabildiği biliniyor. Bu
organizmaların transformasyonu E.coli’ye göre bazı farklılıklar gösterir.
• Neisseria gonorrhoeae hariç transformasyon kompotentliği geçici bir fenomen (N.
gonorrhoeae her zaman alıcı durumda yani kalıcı kompotent, diğerleri ise geçici kompotent)
• Transformasyon DNA dizisinden bağımsız olabilir. Örneğin Bacillus subtilis ve Acinetobacter
calcoaceticus gibi. Ama diğer türlerde (H.influenzae, N.gonorrhoeae) transformasyon bazı
alıcı spesifik DNA dizisine bağımlıdır.
• Doğal transformasyon mekanizması çift zincir DNA’nın nükleazla muamelesini gerektirir.
Tek zincir degrede edilir ve diğeri içeri alınır. Fakat Bacillus subtilis için bu şekilde verimli
transformasyon yapılamıyor. Bunun için özel metotlar geliştirilmiştir.
176
[Metni yazın]

Diğer türlerle çalışmak için elektroporasyon, verimliliği düşük olmakla birlikte oldukça basit
alternatif bir yoldur.
Bazı model organizmaların genetik analizleri gram pozitif ve gram negatif bakterilerde DNA’nın
içeri alınış mekanizmasının korunmuş olduğunu göstermiştir. Fakat kompotentliğin regülasyonu
farklıdır ve birbirinden farklı mekanizmalar belirlenmiştir. Model organizma kullanarak DNA’nın içeri
alınması için bazı homolog proteinleri kodlayan genleri bulmak mümkündür. Çeşitli bioinformatik
araçları kullanarak genomu tamamen belirlenmiş bu organizmada bu genler araştırılabilir.
Bazı enterik olmayan bakterilerde plazmit transformasyonunun zor olduğu şartlarda konjugasyon
bir alternatif yoldur. Kendi kendine birçok gram negatif bakteriye transforme olabilen ve bu
hücrelerde kararlı olarak kalabilen plazmitlere promiscuous plazmit denir. Bunlara en iyi örnekler 60
kb büyüklüğünde olan RP4, RP1, RK2,… gibi IncP alfa plazmitleridir.
Kendi kendine transforme olabilen plazmitler konjugasyon aparatını kodlayan tra (transfer)
genlerini taşımaktadırlar. IncP plazmitleri kendilerini transfer ederken yanındaki diğer plazmitleride
hareketlendirerek onlarında transferini başlatabilir. Örneğin RSF1010 gibi IncQ plazmitlerini mobilize
edebilirler. Daha da önemlisi transfer E.coli ve gram pozitif bakteriler arasında da olabilir.
Farklı gram pozitif cinsler arasında kendi kendine transfer olabilen birçok plazmit bulunmuştur.
Bu plazmitlerin transfer bölgesi gram negatiflerdeki plazmitlerden çok daha küçüktür. Bu farklılığın
sebebi gram pozitif bakterilerin hücre duvarı yapısının çok daha basit olmasıdır. Kendi kendine
transfer olabilen bu gram pozitif plazmitlerin çoğu promiscuous plazmittir. Örneğin pAMβ1 plazmiti
orijinal olarak Enterecoccus faecalis’ten izole edilmiştir. Ama Stafilococcus, Streptococcus, Bacilli ve
hatta bir gram negatif bakteri olan E.coli’ye transfer edilebilir.
Gram pozitif bakterilerin kendi kendine başka bakteriye aktarılan plazmit tipleri gram negatiflerde
olduğu gibi kendi kopyasını aktarırken bir başka plazmitin kopyasını da aktarabilir. Kendi kendini
aktaramayan plazmitler konjugatif transpozonlarla aktarılabilir.
Dikkat edilmelidir ki konjugasyon transformasyonun yerine geçebilen bir şey değildir. Eğer DNA in
vitro’da manipule ediliyorsa bir aşamada mutlaka bir konağa transfer edilmelidir. Çoğu durumda bu
konak E.coli’dir ve transfer için transformasyon prosedürü kullanılır.

KUTU 10.1 Bacillus subtilis’in plazmit DNA’sıyla transforme edilmesi

Bacillus subtilis’i kromozomal DNA parçaları ile transforme etmek kolay olmamasına rağmen
plazmit moleküllerinin transformasyonunda sorunlar yaşanmaktadır. İlk olarak Ehrlich (1977) Bacillus
subtilis’in kompotent kültürlerinin Staphylococcus aureus’tan elde edilen süper sarmal DNA ile
transforme edilebildiğini rapor etmiştir. Bu plazmit replike olabilmekte ve yeni konağına ekspres
edilmektedir. Plazmit DNA’sı veya kromozom DNA’sının transformasyonu için kompotentin gelişimi
belli bir zaman eğrisi izler ve iki durumda da transformasyon DNA konsantrasyonuna bağlıdır. Fakat

177
[Metni yazın]

B.subtilis’in plazmitle transformasyonu kromozomal transformasyonla karşılaştırıldığında verimlilik

çok düşüktür.
Canosi (1978) tarafından plazmitlerin neden bu kadar zayıf transforme olduklarına dair bir açıklama
yapıldı. B.subtilis transformasyonundaki plazmitin spesifik aktivitesinin plazmit genomundaki
oligomerizasyon derecesine bağlı olduğunu bulmuşlar. Mottes (1979) hem E.coli’de hem de
B.subtilis’te replike olabilen bir rekombinant plazmit kullanarak oligomerizasyon olsun olmasın
E.coli’de transformasyonun olabileceğini B.subtilis’te ise olamayacağını gösterdi. De Vos (1981)
neden oligomerlere ihtiyaç duyulduğunu açıklamıştır. Basitçe anlatmak gerekirse plazmitler
kompotentlere temas eder etmez lineer formlara kesilirler. Lineer plazmit hücreye girerse halkasal
hale gelmeden çoğaltılamaz bu nedenle rekombine olmaları için gerekli olan homoloji bölgelerini
sağlayan multimerlere ihtiyaç duyarlar. Michel ve arkadaşları (1982) plazmit genomu duplike
olduğunda bu multimerlere gerek olmadığını göstermişlerdir. 260-2000 bp uzunluğunda doğru
tekrarları taşıyan plazmitler inşa etmişlerdir ve bu plazmitlerin halkasal ya da lineer monomerlerinin
transformasyonda aktif olduklarını bulmuşlardır.

Plazmit kurtarma metoduyla transformasyon

B.subtilis’in transformasyonuna Gryczan (1980) tarafından alternatif bir yöntem sunulmuştur.
Eğer DNA bir restriksiyon endonükleazla kesilirse transformasyon olmamaktadır. Fakat eğer alıcı
homolog bir plazmit taşıyorsa ve kesim homolog markırın içinde olmuşsa bu markır etkili bir şekilde
transforme edilebilir. Bu donor plazmit markırının hücrenin içinde bulunan homolog plazmitle
kurtarılması B.subtilis’in recE gen ürününe ihtiyaç duyar bunun nedeni de lineer donor DNA ile
hücrenin içinde bulanan plazmit arasındaki rekombinasyondur. Restriksiyon endonükleazla lineer
hale getirilen DNA’nın kesim bölgesi monomerik olduğu için bu kurtarma sistemi (plazmit kurtarma)
multimerik vektör ihtiyacını devre dışı bırakmıştır.
Plazmit kurtarma metodunun bir dezavantajı, transformantlar hem rekombinant molekülü
hem de hücrenin içinde bulunan plazmiti taşımaktadırlar. Uyuşmazlık iki plazmitin ayrılmasıyla
sonuçlanır. Rekombinant plazmit, plazmit-free hücrelere aktarılabilir.

Protoplast transformasyonu
B.subtilis’e plazmit DNA transformasyonunda üçüncü bir yöntem protoplast transformasyonudur.
Bu yöntemde pelietilen glikol (PEG) içerir ve DNA’nın protoplasttan içeri alınmasını indükler. Bu
prosedür oldukça etkilidir ve %80 oranında transformant oluşturur. Yüksek verimlilikte plazmit
taşıyan transformantlar oluşturmasına rağmen bu metot geleneksel yöntemden iki açıdan farklılık
içerir.

178
[Metni yazın]

• Lineer DNA ve süpersarmal olmayan halkasal DNA molekülleri in vitro’da ligasyonla

birleştirilerek B.subtilis içine rahatça sokulabilir.
• Protoplast tekniğinde kompotent hücreler kolayca B.subtilis’e entegre olabiliyor fakat
kromozomal DNA olamıyor.

Tablo 10.1 B.subtilis transformasyon metotlarının karşılaştırılması

Sistem Verimlilik Avantajaları Dezavantajları
Kompotent hücre Parçalara ayrılmamış plazmit Transformantlar herhangi Oligomerlere ihtiyaç
4
2*10 bir besiyerinde seçilebilir. duyar bu da deneyleri
Linner 0 Kompotent hücreler kolayca zorlaştırır.
3
CCC dimer 8*10 hazırlanır.
5
CCC multimer 2.6*10
4
CCC monomer 4 *10

Plazmit kurtarma Parçalara ayrılmamış plazmit Oligomerlere ihtiyaç Transformantlar hem

6
2*10 duymaz. hücre içinde bulanan
Transformantlar herhangi plazmiti hem de yeni
bir besiyerinde seçilebilir. gelen plazmiti taşır.

Protoplast Parçalara ayrılmamış plazmit Kompotent hücreye ihtiyaç Verimlilik DNA

6
3.8*10 duymaz. büyüklüğüne bağlıdır.
4
Lineer 2*10 %80 verimlilikte
6
CCC monomer 3*10 transformantlar verir.
6
CCC dimer 2*10
6
CCC multimer 2*10

Rikombinant DNA replike olmalı veya yeni konağın kromozomuna entegre olmalıdır
:::::::::::::::::::::::::::::

183. sayfada kalınmış. Devamı tercüme edilmeli

179
[Metni yazın]

11. BÖLÜM

Saccharomyces cerevisiae VE DİĞER

FUNGUSLARA KLONLAMA

180
 [Metni yazın]

11. BÖLÜM

OUESTIONSAND ANSWERS

1. Give an example method to transform an exogenous DNA into to yeast? And explain.
2. What kinds of plasmits are there in yeast? Explain one of them.
3. Drew a eukoryotic ekspressıon vector and show the control regions on it?
4. What are the ars sequences? What are the functions of them?
5. What are the common features of plasmits in yeast?
6. What is the difference of yeast promotor than bacteria? Explain structure of promoter.
7. What are the proporties of strong (ideal) promotor?Give an example.
8. Explain the structure and functıon of Aga1 and Aga2 protein in yeast?
9. Which plasmit can be used to clone very large fragments of DNA in yeast? Explain
why?
10. The calcium phosphate co-precibitate method is used to chemical transform into the
animals cells. Explain the mechanism.
ANSWERS

1. Like E. coli, fungi are not naturally transformable and artificial means have to be used
for introducing foreign DNA. One method involves the use of spheroplasts (i.e. wall
less cells) and was first developed for S. cerevisiae (Hinnen et al. 1978). In this
method, the cell wall is removed enzymically and the resulting spheroplasts are fused
with ethylene glycol in the presence of DNA and CaCl2. The spheroplasts are then
allowed to generate new cell walls in a stabilizing medium containing 3% agar. This
latter step makes subsequent retrieval of cells inconvenient. Electroporation provides
a simpler and more convenient alternative to the use of spheroplasts. Cells
transformed by electroporation can be selected on the surface of solid media, thus
facilitating subsequent manipulation. Both the spheroplast technique and
electroporation have been applied to a wide range of yeasts and filamentous fungi.
DNA can also be introduced into yeasts and filamentous fungi by conjugation.
Heinemann & Sprague (1989) and Sikorski et al. (1990) found that enterobacterial
plasmids, such as R751 (IncPβ) and F (IncF), could facilitate plasmid transfer from E.
Coli to S. cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. The bacterial plant pathogen
Agrobacterium tumefaciens contains a large plasmid, the Ti plasmid, and part of this
plasmid (the transferred DNA (T-DNA)) can be conjugally transferred to protoplasts of

181
 [Metni yazın]

S. Cerevisiae (Bundock et al. 1995) and a range of filamentous fungi (De Groot et al.
1998). T-DNA can also be transferred to hyphae and conidia.
2. Four types of plasmid vector have been developed: yeast episomal plasmids (YEps),
yeast replicating plasmids (YRps), yeast centromere plasmids (YCps), and yeast
artificial chromosomes (YACs).

3.

4. YRps were initially constructed by Struhl et al (1979). They isolated chromosoma

fragments o DNA which carry sequences that enable E. Col vectors to replicate in
yeast cells. Such sequences ar known as ars (autonomously replicating sequences)
An ars is quite different from a centromere: th former acts as an origin of replication
Whereas the latter is involved in chromosome segregation. The structure of ars
182
[Metni yazın]

elements ha been elucidate and shown to be a short (~100 bp) AT-rich sequence
with the 17-bp core consensus WWWWTTTAYRTTTWGT where W = A or T, Y = C,
and R = A o G (Theis & Newlon 1997) Although plasmids containing an ars transfor
yeast very efficiently, the resulting transformant are exceedingly unstable. For
unknown reasons YRps tend to remain associated with the mother cell and are not
efficiently distributed to the daughter cell (Note: S. cerevisiae does not undergo
binary fissio but off daughter cells instead.) Occasional stable transformants are
found and these appear t be cases in which the entire YRp has integrated int a
homologous region on a chromosome in a manne identical to that of YIps

5.

► First, they all contain unique target sites for a number of restriction
endonucleases.
► Secondly, they can all replicate in E. coli, often at high copy number. This is
important, because for many experiments it is necessary to amplify the vector
DNA in E. coli before transformation of the ultimate yeast recipient.
► Finally, they all employ markers that can be selected readily in yeast and
which will often complement the corresponding mutations in E. coli as well.
► The four most widely used markers are His3, Leu2, Trp1, and Ura3. Mutations
in the cognate chromosomal markers are recessive, and non-revertin mutants
are available.

6. Four structural elements can be recognized in the average yeast promoterFirst

several consensus sequences ar found at the transcription-initiation site. Two of thes
sequences, TC(G/A)A and PuPuPyPuPu, accoun for more than half of the known
yeast initiation site Thes sequences are not found at transcription-initiatio sites i
higher eukaryotes, which implies a mechanisti difference in their transcription
machiner compared with yeast The second motif in the yeast promoter is the TATA
box (Dobson et al. 1982). This is an AT-ric region with the canonical sequence
TATAT/AAT/A located 60–120 nucleotides before the initiatio site. Functionally, it can
be considered equivalent t the Pribnow box of E. coli promoters (see p. 82). The third
and fourth structural elements are upstrea activating sequences (UASs) and upstrea
repressing sequences (URSs). These are found i genes wh transcriptio is regulated.
Binding o positive-control proteins to UASs increases the rate of transcription and
deletion of the UASs abolishe transcription. An important structural feature o UASs is
the presence of one or more regions o dyad symmetry (Rudolph & Hinnen 1987).
Binding of negative-control proteins to URSs reduces the transcription rate of those
genes that need to b negatively regulated The level o transcription can be affected b
183
[Metni yazın]

sequences located within the gene itself and which are referred to as downstream
activating sequences DASs). Noted that, when usin the phosphoglycerate kinase
(PGK) promoter, severa heterologous proteins accumulate to 1–2% o total cell
protein, whereas phosphoglycerate kinas itself accumulates to over 50%. These
disappointin amounts of heterologous protein reflect the level of mRNA which were
due to a lower level of initiatio rather than a reduced mRNA half-life Addition of
downstream PGK sequence restored the rate o mRNA transcription, indicatin the
presence of a DAS. Evidence for these DASs has been found in a number of other
genes.

7. The ideal promoter is one that is tightly regulate so that the growth phase can be
separated from th induction phase. This minimizes the selection of non-expressing
cells and can permit the expression of proteins normally toxic to the cell. The ideal
promoter will also have a high induction ratio. One promoter which has these
characteristics and which is now the most widely used is that from the GAL1 gene.
Galactose regulation in yeast is now extremely well studied and has become a model
system for eukaryotic transcriptional regulation

The first overexpression systems developed wer for S. cerevisiae and used
promoters from gene encoding abundant glycolytic enzymes, e.g. alcoho
dehydrogenase (ADH1), PGK or glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase (GAP).
These are stron promoters and mRNA transcribed from them ca accumulate up to
5% of total. They were at firs thought to be constitutive but later were shown to be
induced by glucose .

8. S. cerevisiae can be used to elucidate and dissec the function of a protein in

manner similar t phage-display systems. Either can be used to detect protein–ligand
interactions and to select mutant proteins with altered binding capacity (Shusta et al.

1999). However, phage-display systems often cannot display secreted eukaryotic

proteins in their native functional conformation, whereas yeast surface display can.
Yeast surface display makes use of the cell surface receptor α-agglutinin (Aga),
which is a two-subunit glycoprotein. The 725-residue Aga1p subunit anchors the
assembly to the cell wall via a covalent linkage.

The 69-residue binding subunit (Aga2p) is linked to Aga1p by two disulfide bonds. To
achieve surface display, the appropriate gene is inserted at the C terminus of a
vector-borne Aga2p gene under the control of the GAL1 promoter. The construct is
then transformed into a yeast strain carrying a chromosomal copy of the Aga1p gene,
also under the control of the GAL1 promoter. If the cloned gene has been inserted in

184
[Metni yazın]

the correct translational reading frame, its gene product will be synthesized as a
fusion with the Aga2p subunit. The fusion product will associate with the Aga1p
subunit within the secretory pathway and be exported to the cell In practice, the gene
fusion is somewhat more complicated. Usually the cloned gene product is
sandwiched between two simple epitopes to permit quantitation of the number of
fusion proteins per cell and to determine the accessibility of different domains of the
fusion protein.

9. Yeast artificial chromosomes can be used toclone very large fragments of DNA
When the first YACs were developed it was found that their segregative stability was
determined by their size. If the size of the YAC was less than 20 kb then centromere
function was impaired whereas much larger YACs segregated normally. Burke et al.
(1987) made use of this fact in developing a vector (Fig. 11.3) for cloning large DNA
molecules. One problem with large DNA molecules is that they are difficult to
manipulate in the liquid phase prior to transformation and keeping them intact is
verydifficult. Thus, many of the early YAC libraries had average insert sizes of only
50–100 kb. By removing small DNA fragments by PFGE fractionation prior to

cloning, Anand et al. (1990) were able to increase the average insert size to 350 kb.
By including polyamines to prevent DNA degradation, Larin et al. (1991) were able to
construct YAC libraries from mouse and human DNA with average insert sizes of 700
and 620 kb, respectively. Later, constructed a human library with an average insert
size of 810 kb and with some inserts as large as 1800 kb. The ability of YACs to
accept such large inserts means that, in principle, it should be possible for them to
carry the very large genes (>1 Mb) found in higher eukaryotes.

10. The precipitate must be formed freshly at the time of transfection. It is thought
that small granules of calcium phosphate associated with DNA are taken up by
endocytosis. The DNA then escapes and some reaches the nucleus and can be

185
[Metni yazın]

Expressed. The technique became generally accepted after used calcium phosphate
to increase the infectivity of adenovirus DNA. It is now established as a general
method for the introduction of DNA into a wide range of cell types in culture.
However, since the precipitate must coat the cells, this method is suitable for cells
growing in monolayers or in suspension, but not those growing as clumps. A variant
of the technique, using a different buffer system, allows the precipitate to form slowly
over a number of hours, and this can increase stable transformation efficiency by up

to 100-fold when using high-quality plasmid DNA.

186
[Metni yazın]

13. BÖLÜM

HAYVANLARDA GENETİK
MODİFİKASYONLAR

187
[Metni yazın]

251-258 tercüme edilmemiş. 258’den başlanmış.

Farelerde Genetik Değişimi Uygulanması

Transgenik Fare Uygulamaları

Transgenik fare, gen fonksiyonu ve regülasyonu için pek çok açıdan ele alınmıştır. Bu konuda çok
geniş bir literatür vardır ve ilgili genler her olası biyolojik süreçte incelenmiştir. (Houdebine 1997)
Temel bilimsel araştırmalarda kullanılmasıyla birlikte, transgenik fare insan hastalıkları ve değerli
ilaçların üretimi gibi daha uygulanabilir amaçlar için kullanılabilir. İnsan hastalıkları için gen
knockout’larıyla birçok farede modeller oluşturuldu, fakat fonksiyon kazanımı modelleri
transgenlerin eklenmesiyle de elde edilmiştir. Örneğin, prion hastalıklarının patolojisi ile ilgili daha
fazla bilgi, transgenik farelerde ekspreslenen mutant prion transgenlerin çalışılmasıyla ortaya çıkmıştır
(Gabizon & Taraboulos tarafından incelenmiştir 1997). Transgenik farelerde ekspreslenen
onkogenler (kontrolünü kaybetmiş protein kodlayan genlerdir) kanser çalışmalarında yaygın bir
şekilde kullanılmıştır (Macleod & Jacks tarafından incelenmiştir 1999).
Gen fonksiyon ve regülasyonunun analizi için transgenik farelerin nasıl kullanılabildiğini
göstermek için bazı deneyler vardır fakat transgenik girişimlere bazı sınırlarda getirilmiştir. Brinster ve
arkadaşları (1981) tarafından fare metallothionein-1 (MMT) geninin promotorunun olduğu yerde
oluşturulan plazmit, HSV Tk geninin kodlayan bölgesine kaynaştırılmıştır. Timidin kinaz (TK) enzimi
kolaylıkla incelenebilir ve MMT promotoruna uygunluk sağlar. Endojen MMT promotoru
glukokortikoid hormonlar ve kadmiyum ve çinko gibi ağır metaller tarafından uyarılabilir. Bu yüzden
hibrid genler tasarlanmıştır. Örneğin, MK (metallothionein-thymidine kinase) benzer şekilde
düzenlenmiştir. Gen döllenmiş yumurtaların erkek pronükleuslarına enjekte edildi, bundan sonra
kadmiyum iyonlarının varlığı yada yokluğunda in vitro’da inkübe edildi (Brinster ve arkadaşları
1982). Beklenildiği gibi, TK aktivitesi metal tarafından indüklenebilir olduğu bulunmuştur. MMT
promotor dizilerinin yukarı birimleri farenin delesyon aralığını yaparak, indüklenebilmek için gerekli
minimum bölge transkripsiyon başlama bölgesinin 40-180 nükleotit yukarısında lokalize edildi. Hem
temel hemde uyarılma aktivitesi olan ek diziler transkripsiyon başlama bölgesinin en az 600 bp
yukarısına eklendi. Fare yumurtasında fonksiyonel promotor aktivitesinin kesilmesi için transfer
edilmiş hücre hatlarında aynı yol kullanılabilir (Gorman ve arkadaşları 1982b; 12.1 kutuda
görebilirsiniz).
Transgenik yetişkinler için oluşturulan aynı MK füzyon geni embriyolara enjekte edildi(Brinster
ve arkadaşları.1981). Bu farelerin çoğunda MK geni ekspreslendi ve genin 1 ila 150 kopyasına sahip
olarak ekspreslendiler. Kadmiyum iyonu tarafından uyarılabilir ya da metallothioneinin buna benzer
bir doku tahribine neden olduğu kayıtlarda gösterilmiştir(Palmiter ve arkadaşları 1982b). Buna bağlı
olarak deneyler ağır metal indüksiyonu için DNA dizilerinin gerekli olduğunu ve hem yumurta hem de

188
[Metni yazın]

transgenik farede doku özel ekspresyonunun kesilebileceğini göstermiştir. Bilinmeyen nedenlerle,

glokokortikoidler yumurta ya da transgenik farede cevap oluşturmadı.
Deneylerde, Palmiter ve arkadaşları (1982a) fare büyüme hormonu genini MMT promotoruna
ekledi. Bu hibrid gen MK füzyonu gibi aynı prensip kullanılarak oluşturuldu. Enjekte edilmiş
yumurtulardan gelişen 21 farenin yedisine MGH füzyon geni taşındı ve bunların altısında
diğerlerinden daha fazla büyüme görüldü. Fare MGH genini indüklemek için çinko ile beslendi, fakat
bu genin kesinlikle gerekli olup olmadığını kanıtlamadı. Onlar çinko diyetine alınmadan önce hızlı bir
büyüme gösterdiler. MGH geninin çok yüksek kopya sayılarını (hücre başına 20-40 kopya) içeren
farelerin serumları çok yüksek konsantrasyonlarda büyüme hormonuna sahiptiler. Bu tür fareler diğer
arkadaşlarının ağırlıklarının yaklaşık iki katına 74 günde ulaştılar (şekil 13.6).
Trangenik fare, genlerin çeşitli gelişimsel regülasyonu ya da özel dokular için cevap oluşturabilen
fonksiyonel DNA birimlerinin kesilmesi için genel bir analiz sağladığından, MMT ifadesinin doku
ayrımı ve hibrid genler arasında benzerlik beklenir. Ancak bazı beklenmedik bulgularda vardır.
Örneğin, MK geni taşıyan transgenik fareden bağımsız yetiştirilen farede transgen modelinde ve
seviyesinde önemli çeşitlilikler vardır. Ayrıca transgenik farelerden yavrulara umulduğu gibi
transgenler aktarılırken, raporlarda bu yavrularda ebeveyndekinden çok farklı miktarlarda olduğu
incelendi. Artan, azalan ve hatta yok olan transgen örnekleri bulunmuştur. Hepsinde olmamakla
birlikte bazılarında, gen dizilerinin metilasyonundaki değişiklikler ile alakalı olarak değişir (Palmiter
ve arkadaşları 1982b). Bu sonuçlar, de novo başlatmayı durdurmak(15.2) ve konum etkileri (kutu
13.2) olan iki kompleks fenomenin ilk örneklerini sağlar.

Şekil 13.6 Transgenik fare, fare büyüme hormonu genine eklenen fare metalotionein promotoru içerir.
Bu fotoğraf yaklaşık 10 haftalık 2 erkek fareyi gösteriyor. Soldaki fare MGH geni ve 44g ağırlık

189
[Metni yazın]

içeriyor; geni olmayan diğer fare 29g ağırlığındadır. Genellikle, gen ekspreslenen fare kontrollere göre
2 ya da 3 kat hızlı büyür ve benzerlerinin 2 katı büyüklüğe ulaşır.

KUTU 13.2 POZİSYON ETKİLERİ

Genellikle aynı ekspresyonu taşıyan bağımsız oluşturulmuş transgenik hayvanlar ve bitkiler,
transgen ekspresyonunun modellerinin değişken seviyelerini gösterir. Bazı durumlarda, varyasyon
transgen integrasyon bölgesine bağlıdır ve bu fenomen pozisyon etkisi olarak bilinmektedir(Wilson ve
ark.1990). Pozisyon etkisi kromotini çevreleyen yapı gibi transgende bölge düzenleyici elementlerin
etkisinden kaynaklanır. Örneğin, entegre bir transgen endojen gendekinin yerini tutmak için
ekspresyon profillerinin değişmesiyle sonuçlanan lokal enhansırların etkisi altında meydana gelir.
Pozisyona bağlılık fenomeni yaban tip yumurtaların pronükleisine mikroenjeksiyonla ve normal
olmayanlar da tüm transgenik lokustan izolasyon ile farelerde kanıtlanmıştır ve normal transgen
ekspresyon şekilleri ile ikincil transgeniklerin oluşmasıyla sonuçlanmıştır (Al-Shawi ve ark.1990).
Pozisyon etkileri de bir işaret genine bağlı küçük bir promotor içeren enhansır yapılarıyla ortaya çıkar
(O’Kane &Gehring 1987; 15. Konuda görebilirsiniz).
Yakındaki regülatör elementlerin özel etkilerinin aksine, kromatin aracılı pozisyon etkileri
genellikle baskılayıcı ve özel değildir. Onlar baskılanmış kromatini (heterokromatin) içeren
kromozomal bölgeye transgenin entegrasyonunu yansıtır. Heterokromatinin karakteristik nükleozom
yapıları asetillenmemiş histonlar ve bazı durumlarda inaktif olmaya neden olan transgene yerleşen
yüksek metilenmiş DNA’nın moleküler özelliklerini içerir (Huber ve ark. 1996,Pikaart ve ark.1998).
Bazı durumlarda, değişik transgen ekspresyonu sürecinin uzaması hücre otonom varyasyonlarına
rağmen kaydedildi (Heinkoff tarafından yayınlandı 1990). Negatif kromozomal posizyon etkileri,
arzulanan transgen ekspresyon seviyeleri ve modellerinin elde edilmesi açısından bazı sorunlar
olabilir, böylece farklı stratejilerin bazısı onlarla mücadele etmek için kullanılmıştır.

Dominant olarak rol alan transkripsiyonel kontrol elementlerinin birlikteliği

Belli regülatör elementlerin açık kromatin domainini kurmak için yardım eden, gen kümeleri
ya da genlerin ekspresyonuyla sonuçlanan (master-switches) ana anahtar gibi rol aldığı düşünülür.
İnsan -globin gen kümesinin lokus kontrol bölgesi (LCR) bir örnektir (Forrester ve ark.1987). Kendi

promotoru tarafından ekspreslenen, insan -globin geni taşıyan transgenik fare düşük sıklıkla

ekspresyon gösterir ve transgen ekspres yapan bu farelerde yalnızca mRNA da düşük seviyede
üretilir. (Magram ve ark.1985, Townes ve ark.1985). Ancak, ekspresyon yapısında LCR olması
pozisyon bağımsız ekspresyonu ve yüksek seviyesini doğrular (Grosweld ve ark 1987). Uzak
mesafelerde tekrar düzenlenen kromatini uyaran LCRs buna kanıttır. Örneğin, mürin immünoglobulin

190
[Metni yazın]

ağır zincir LCR, c-myc genine bağlı histon asetilasyonuna neden olduğu gösterilmiştir (Madisen ve ark.
1998). Transgen entegrasyon bölgesinde açık ökromatini heterokromatine çevirerek pozisyon
etkilerine karşı LCRs’in koruyucu olabildiği araştırılır (Festenstein ve ark.1996, Milot ve ark.1996).
ilgilenen okuyucular LCR araştırmalarında birkaç kapsamlı değerlendirmeye danışabilir (Bonifer 1999,
Grosveld 1999, Li ve ark.1999).

Matriks tutunma bölgeleri/sınır elementlerin kullanılması

Sınır elementler(insulator) enhansır ve küçük promotor tarafından çalışan test transgeni arasına
yerleştiğinde enhansırların aktivitesini bloke eden dizilerdir. Örneğin, insulator aktivitesi ile bir A
elementi tavuk lizozim geninde bulundu. Enhansır ve promotor arasına yerleştiği zaman işaretli genin
aktivitesini inhibe eder fakat yapıda başka bir yerde olduğu zaman inhibe olmaz (Stief ve ark. 1989).
Ancak, A elementinin bir çifti yapıya bağlıyken kromozomal pozisyon etkisinden transgen korunur
(Stief ve ark. 1989). Bu koruyucu etki çalışmaları yalnızca hücrelerde , transgenik hayvan (McKnight ve
ark.1992) ve bitkilerde (Mlynarova ve ark.1994) de değildir. Birçok sınır elementleri bölgesel olarak
bağımsız döngüler içinde kromozomlar bölünerek nüklear matrikse tutunan genom boyunca dağılan
matriks tutunma bölgeleri (MARs) ile ilişkilidir (Spiker& Thompson 1996). Heterokromatinden izole
edilmiş kromatin domeinine eklenen elementler gibi transgene bağlı olması da bu nedenle
mümkündür. Ancak, tüm sınır elementleri olmasada geneli MARsla ilişkilidir (Mirkovitch ve ark.1984).
Benzer şekilde, bazı MARs, sınır elementleri gibi fonksiyon yapmaz fakat gen ekspresyonunun
kolaylaştırıcıları gibidirler (Van de Geest& Hall 1997).

Büyük Genomik Transgenlerin Kullanılması

İntronsuz minigenler ya da komplementer DNA (cDNAs) genellikle ihtiva eden transgenler,
hücreye özel regülatör elementler ya da viral promotorların kontrolü altında ekspreslenir. Böyle
transgenler pozisyon etkisine oldukça duyarlıdır. Son birkaç yıldır, eskiden düşünüldüğünden çok
daha fazla işlem öncesi ve sonrası DNA içeren ve çok daha karmaşık ökaryotik gen ekspresyonun
düzenlenmesi artarak değerlendirilmektedir (Bonifer 1999,2000). Yüksek seviyede transgen
ekspresyonunda gen kaynaklarından bağlanan dizilerin büyük miktarları ve intronlar içeren genomik
yapıların kullanılması tercih edilir (Bonifer ve ark.1990, Lien ve ark. 1997, Nielsen ve ark. 1998). Bu
yapılar pozisyon etkisinden transgeni korumak için birlikte rol alarak sınır elementleri ve LCRs gibi
baskın düzenleyici elementler ve çoklu enhansırlar içermeye benzerdir.

Baskın olarak hareketli transgenler (transgen kurtarma)

191
[Metni yazın]

-globin ve -fetoprotein içeren bazı transgenler pozisyon etkisine ve de novo durdurmak

için çok duyarlıdırlar. Diğer genler immünoglobulin ve elastaz gibi maddelere az duyarlı olduğu
görülür (Storb ve ark. 1984, Swift ve ark. 1984, Davis & MacDonald 1988). Bunun açık bir sebebi
olmamasına rağmen, az duyarlı transgenler bir şekilde kromatini tanımlamak ya da uyarmak için
kabul edilir. Bazı durumlarda, bu diziler iki transgeni aynı anda getirerek negatif pozisyon etkisine
duyarlı transgenleri korumak için kullanılmıştır (Clark ve ark.1992).
Bölge özel entegrasyon
Eğer rekombinaz için bir hedef bölge lokusa eklenebilirse, bölge özel rekombinasyon sistemleri
negatif pozisyon etkisini azaltmak için bilinen bölgeye transgeni ekleyerek kullanılabilir. Cre-loxP
sistemi memeli hücrelerinde bu etkiler için kullanılabilir (Fukushige & Sauer 1992).

Transgenik Farede Bira Mayası Yapay Kromozomu (YAC)

MMT promotoru ve diğer promorlarla ile ilgili çalışmalar endojen genlere benzeyen aynı
şekilde ekspreslenebilme eğiliminde olmayan en küçük yan birimler ile transgenler prensibini açıkladı.
Birçok durumda, bozulmamış genler kullanıldığı zaman özgün modeller ve protein seviyeleri ifade
edilen gibi meydana çıktığı gösterilir ve bu DNA’nın yüzlerce veya binlerce baz çiftine
uzayabilir(kutu 13.2). Fare genomuna büyük DNA segmentlerinin transferi bira mayası yapay
kromozom vektörü (YAC) transformasyonundan elde edilmiştir. Jakobovits ve arkadaşları (1993) ilk
olarak bira mayası sferoplastı ile birleştirme yoluyla, YAC vektör ile ES hücrelerinin
transformasyonunu kaydettiler. Vektör yaklaşık 700 kb uzunluğunda tüm insan HPRT lokusunu içerir.
Bu methodun dez avantajı, endojen bira mayası kromozomunun vektörü ile eklenmiş olmasıdır.
Alternatif stratejiler, pronüklear mikroenjeksiyon ya da ES hücrelerine transfeksiyonla fare
yumurtalarına saflaştırılmış YAC DNA’nın girişini takiben değişken alanlı jel elektroforezi tarafından
DNA vektörünün izolasyonunu içerir. İkinci teknik daha uygundur, çünkü mikroenjeksiyon DNA
fragmentlerini kırma gücüne sahiptir. 12. ünitede anlatıldığı gibi, ES hücrelerine YAC transferi
lipofeksiyonla elde edilir. YAC gen aktarımları lokus kontrol bölgeleri gibi özellikle uzun aralıklı
düzenleyici elementler olan gen regülasyonunu çalışmak için kullanılırlar( Lamb & Gerhart tarafından
incelendi 1995). Insan antikoru üretilmesi için YAC, farelere insan immünoglobulin lokusunu
tanıtmak için kullanılmışlardır(Mendez ve arkadaşları 1997). Mikrocell aracılığıyla füzyon olarak
adlandırılan bir teknik kullanılarak kromozomların yada kromozom fragmentlerinin girişi mümkündür.
Bu kolsişin gibi inhibitörler kullanarak kültür edilmiş insan hücrelerini uzun süreli mitotik tutmayı
içerir. Sonuç olarak, çekirdek plazma membranı ve az miktarda sitoplazma tarafından çevrelenen
küçük hücreler olarak kurtarılan kromozom içeren veziküllere ayrılır (Fournier & Ruddle 1977).
Transgenik fare, insan mikrohücreleriyle birleşebilen ES hücreleri kullanılarak oluşturuldu ve germ
hat transmisyonu ve insan kromozomunun ekspresyonu için kanıt olmuştur(Tomizuka ve arkadaşları
1997).
192
[Metni yazın]

Gen Hedefleme Uygulanması

ES hücrelerinde hedef genler ilk olarak, mutant farelerde giderek artan sayıda üretildiği rapor
edildi. Bunlar birkaç kapsamlı değerlendirme ile ele almıştır (Brandon ve arkadaşları 1995a,b,c,
Soriano 1995, Muller 1999) ve internet veri tabanları sonuçları takip etmek için
oluşturulmuştur(Sikorski & Peters 1997). Mutant farede homozigot fenotipler genin normal
fonksiyonları için önemli ipuçları sağlar. Bazı gen knockout’lar (elenen genler) beklenenden çok daha
az, şaşırtıcı derecede küçük fenotipik etki ile sonuçlandı. Örneğin, transfer fibroblastlarda myoD, canlı
hayvanın gelişmesi için gerekli olmayan miyogenesin düzenleyici bir anahtarı gibi rol alan kas
hücreleri içinde farklılık göstermeye neden olur (Rudnicki ve arkadaşları 1992). Benzer bir şekilde,
embriyolarda diğer retinoik asit reseptörlerinden oldukça farklı olan ve retinoidlere sinyal bileşeni
oluşturması için gerekli olduğu halde, retinoik asit reseptör canlı fare gelişimi için gerekli değildir
(Lohnes ve arkadaşları 1993). Bazı gözlemler genetik fazlalığın gelişimde ortak olduğunu ve bir gen
ailesinin bir üyesi inaktif olduğu zaman, bazı üyelerin dengeleyici regülasyon içerdiği
spekülasyonlarına yol açmıştır. Bunun bir örneği myoD ‘den yoksun farede myf-5 ‘in regülasyonudur
(Rudnicki ve arkadaşları 1992). Gen knockout’ları kırılgan X sendromu, -talasemi, kistik fibröz gibi
insan hastalıkları modelleri olarak farelerde kullanılanilir ( Bedell ve arkadaşları 1997; 26 konuda
görebilirsiniz).
Farelerde hedef gen deneyleri daha çok genlerde mutasyon (yıkıcı insersiyon mutasyonları ve ya
küçük değişiklikler) oluşturmak için yapılırken, tekniğin kapsamı daha geniştir. İlk olarak hedef gen
deneyleri, gen terapilerinde uygulanmasıyla mutasyona uğramış genlerde, bu yaklaşımla
kullanılabildiğini gösterdi. Homolog rekombinasyon gen knock in olarak tanımlanan bir strateji ile bir
genin kodlama bölgesinde alışveriş yapmak için kullanılmıştır. Örneğin, birbirlerinin fonksiyonlarını
karşılamak için Engrailed-1 ve Engrailed-2 transkripsiyon faktörleri ile test edilebilmiştir. Hanks ve
arkadaşları (1995) engrailed-2 ninki ile engrailed-1 nin kodlayan bölgesini değiştirdi ve engrailed-1
mutant fenotipi kurtarıldığı gösterildi. Gen eklenmesinin daha uygulanan kullanımı transgenik farede
insan antikorlarının üretilmesiyle sonuçlanan mürin immünoglobulin geninin parçalarının yer
değiştirilmesidir (Moore ve arkadaşları 1995a). Cre –loxP bölge özel rekombinaz sistemi insan
hastalıkları için model olarak kromozom delesyonu ve trans – lokasyon üretmek ve koşula bağlı ya da
uyarılabilir hedef genlerin olduğu fare üretmek için ES hücrelerinde geniş ölçüde kullanılmaktadır.
15. konuda diğer bölge özel rekombinaz sistemi ve Cre-loxP ‘nin birçok uygulamalarını tartışıcaz.

Standart transgenesis yöntemlerini kuş ve diğer memelilere uygulamak daha zordur

Transgenik fare üretiminde kullanılan 3 ana yol diğer memelilerde, kuşlarda ve özellikle çiftlik
hayvanlarında da kullanılabilmiştir. Her bir prosedürün etkinliği farede olandan daha azdır. Koyun ve
inek gibi memelilerde pronükleolar mikroenjeksiyon sonuçları enjekte edilen yumurtaların %1inden

193
[Metni yazın]

daha azında transgenik hayvanlara sebep olur. Donör hayvanlardan yumurtaların canlanması ve
taşıyıcı annelere transfer edilen yumurtaların reimplantasyonu daha az etkili bir prosedürdür ve alıcılar
ve donörleri çok sayıda olması gerekir. Yumurtalar kendilerini yönlendirmeleri oldukça zordur. Onlar
çok hassas olup opak olma eğilimindedirler. Pronüklei görmek için sık sık yumurtaları santrifüj etmek
gereklidir. Tavuklarda erkek ve dişi pronüklei bulunduğu yer germinal diskin stoplazması içine hassas
enjekte edilen DNA ve fertilizasyondan hemen sonra yumurtaların uzaklaştırılması mümkündür.
Bununla birlikte taşıyıcı anneye transgenik yumurtaların tekrar verilmesi mümkün değildir, bu yüzden
in vitro kültür edilmelidir. Bu prosedürü kullanarak, Love ve arkadaşları (1994) seksüel olgunluğa
ulaşan enjekte yumurtaların yaklaşık %5’ine eşit yedi civciv elde edildi. Yavru horoz transgen
integrasyonu için mozaik olarak belirtilen yavrularının bir kısmına transgenleri aktardı.
Transgenik tavuklar üretmek için retrovirüslerin kullanımı Bosselman ve arkadaşları tarafından
(1989) rapor edildi. Bu araştırmacılar yumurtalardaki neo genine taşınan replikasyon kusurlu
rekombinant retiküloendoteliosis virüs enjekte etti ve erkek kuşlara aktarılan vektör dizilerini yaklaşık
%8’inde buldu. Transgen bu kuşların bir kısmında germ hattına doğru taşındı ve 20 transgenik hat
ekspreslendi. 12. konuda tartışıldığı gibi, oncoretroviral vektörleri yalnızca bölünen hücreleri enfekte
edebilir, çünkü onlar yalnızca çekirdek zarı bozulduğunda çekirdeğe giriş kazanabilirler. Mitozis gibi
mayozis süresince nüklear zarf bozulduğunda Chan ve arkadaşları (1998) sığır oositlerinden izole
edilen perivitelin boşluğa replikasyon kusurlu retrovirüs vektörleri enjekte edilmesini takiben
transgenik sığır üretebildiler. Retroviral eklenme transgenik yavruların üretimi ile sonuçlanan, ikinci
mayotik bölünme süresince oldu. Aynı teknik sonra ilk primatı yani ANDİ2 olarak adlandırılan bir
rhesus maymunu üretmek için kullanıldı (Chan ve arkadaşları 2001),fakat teknik çok yetersizdi: 224
oosit, transgenik bir maymun üretmek için enjekte edildi; fazla sayıda transgenik fetüs sayısı başarısız
oldu. Nüklear bölünmeleri bağımlılığının yanı sıra, ontoretroviral vektörler de novo kayıplarına ve
transgen ekspresyon kayıplarına neden oldular. Bu problemler bölünmeyen hücrelere enfekte olabilen
lentivirüs vektörlerinin gelişimini daha çok ortaya çıkardı(sayfa 245). Bazı vektörler transgenik fare,
tavşan, sığır, domuz üretmek için kullanıldı (Louis ve arkadaşları 2002, Pfeifer ve arkadaşları 2002,
Hoffman ve arkadaşları 2003, 2004; Pfeifer 2004).
Araştırmalar yaklaşık 20 yıl sonra, fareler dışında hiçbir yerli memeliden ES hücrelerini elde
etmenin imkansız olduğunu kanıtlamıştır (ES hücreleri tavuklardan elde edilmesiyle birlikte kuşlar
için transgenik stratejiler geliştirmek için kullanıldı; Pain ve arkadaşları1999, Prelle ve arkadaşları
1999). Bir alternatif hedef olarak, bazı araştırmacılar primordial germ hücresi (PGCs), gametleri
oluşturan embriyonik hücreler elde etmek için çalışmışlardır. Bu morfolojik olarak ES hücrelerine çok
benzer olan embriyonik germ (EG) hücreleri olarak kültür edildi yada direk olarak transfer edildi ve
germ hattına doğrudan transformasyonu için bir yol sağladı (Resnick ve arkadaşları 1992). Tavuk
PGCs’i transgenik yavru üreten kimerik kuların gelişimine neden olan embriyodan çıkarılmış ve
rokombinant retrovirüsle enfekte olan germinal hilalden izole edildi (Vick ve arkadaşları 1993). Konak

194
[Metni yazın]

hayvana eklenen germ hattına sebep olan hücrelere uyum sağlamak zor olmasına rağmen, PGCs fare,
tavşan, sığır, domuzdan izole ve transforme edildi (Brinster2002). Son zamanlarda geliştirilen benzer
bir teknik, erkek PGCs’e transfeksiyon öncesi spermatogonia’nın(olgunlaşmamış sperm hücreleri)
olgunlaşmasına izin verdi. Bu hücreler transgenik spermin meydana geldiği testis içine yeniden
uygulanabildi. Bu metod başarılı şekilde transgenik fare ve domuz üretmek için kullanılmaktadır (Kim
ve arkadaşları 1997, Honaramooz ve arkadaşları 2003).

Intrasitoplazmik sperm enjeksiyonunda rekombinant DNA pasif taşıyıcıları olarak

sperm kullanılır.
Yumurtaların sitoplazmasına doğrudan sperm başlarının enjeksiyonuyla (intrasitoplazmik
sperm enjeksiyonu (ICSI)) insanlarda kısırlık aşılabilir. Sperm enjeksiyonları transformasyonu
başarmak için kullanılabildiği önerilirken in vitro’da sperm başları çıplak plazmit DNA’sına
kendiliğinden bağlanabildiği gösterildi. Yeşil floresan protein (GFP), gen taşınan plazmit DNA’sı ile
fare spermlerini karıştıran Perry ve arkadaşları (1999) tarafından gösterildi. Bu sperm döllenmemiş
oosit içine enjekte edildi ve oluşan embriyolar yüksek değerde %94 GFP aktivite gösterdi. Yalancı
hamile dişilere bu embriyoların transferi farelerin yaklaşık %20’sinin transgenik olmasıyla sonuçlandı.
Bu metot diğer hayvanlara da uygulanabildi. Rhesus maymun oositleri GFP aktivitesi ile embriyo
sayılarının artmasına sebep oldu, fakat bu integrasyon durağan olmadığı belirtilerek, blastula
aşamasına kadar sürer. Bununla birlikte normal gelişme ile uyumlu prosedür gösterilerek birçok
maymun geliştirildi (Chan ve arkadaşları 2000).

Nuklear transfer teknolojisi hayvanları klonlamak için kullanılabilir

Fareler dışındaki memelilerde genetik modifikasyonlar için rutin verim işlemlerine geleneksel
transgenesis yöntemlerinin başarısızlığı, araştırmacıları başka yöntem arayışına itti. 50 yıldan fazladır,
Briggs & King (1952) kurbağa Rana pipens olarak tanımlanan yumurtanın blastulasından nüklei nakli
ile amfibilere nüklear transferin prensiplerini açıkladılar. Xenopus laevis de, iribaş yavrusundan
hücrelerin çeşitli türlerinden nüklei, periferal kromozomları tahrip edilerek UV’ye maruz bırakılan
yumurtalara transfer edildi ve benzer sonuçlar elde edildi (Gurdon tarafından yayınlandı 1986,1991).
Hayvan hücrelerinin gelişim süreci geri dönüşümsüz devam ederken, birçok hücrenin nükleisi tüm
gelişim programı için gerekli olan genetik bilgiye sahiptir, bu uygun koşullar altında olabilir ve tekrar
geliştirmek için yumurtaların sitoplazması yeniden düzenlenebilir prensipleri önemlidir. Tüm türlerde,
daha büyük bir potansiyele tekrar programlamak için izole edilen nüklei gelişimin erken evresinde
ortaya çıkar. Nuklear transplantasyon,tanımlanan bir yumurta içine aynı bireyin birçok somatik
nüklei’si aktarılarak aynı genotipte hayvanların klonlarının oluşturulması için kullanılabilir (King &
Briggs 1956). Belirli ve istenen özellikler bu hayvanlarla sağlanabilir. Eğer bu memelilerde mümkün
olursa, tarımda uygulanabilir.

195
[Metni yazın]

Tavşanlar, koyun, domuz, sığır gibi çiftlik hayvanlarında farelere göre sürecin daha uygun
olmasına rağmen, memelilerde nüklear transfer son 10 yılda başarı ile uygulandı. İlk durumda donör
nüklei morula yada blastosist evresindeki embriyo ve transfekte yumurta ya da pipet ile nukleusu
uzaklaştırılmış oositten elde edilmiştir(Smith & Wilmut 1989, Willadsen 1989, Collas & Robl 1990,
McLaughlin ve arkadaşları 1990). Donör nukleus, somatik hücre ve yumurta arasında birleşme ile
sağlanabilir. Bunu başarabilmek için kalsiyum iyonları hareketliliği sağlayarak embriyonik gelişim
aktifleştirilirken, kısa elektrik titreşimleri uygulandı.
Megan ve Morag (şekil 13.7) adlı iki canlı kuzu kültür edilmiş hücrelerden nüklear transferle
üretildiği zaman 1995’te büyük ilerleme yapıldı (Campbell ve arkadaşları 1996). Bu kültür edilmiş
hücre kullanılarak memelilere nüklear tranferin mümkün olduğunu ortaya koymuştur. Yetişkin bir
memelinin epitelyum hücresinden nüklear transferi takiben, aynı grup daha sonra Dolly’nin (şekil13.8)
doğumunu bildirdi (Wilmut ve arkadaşları 1997). Bu farklılaşmış yetişkin hücreden nüklear transferle
üretilebilecek ilk memeliydi ve insan klonlama olasılığı halk ve araştırmacılar arasında çokça
tartışmaya yol açtı(Johnson1998). Verici ve alıcı hücre arasında senkronizasyonu sağlayan kültürdeki
hücrelerin hareketsizliği deneylerin başarısında kritik faktör oldu (Wilmut ve arkadaşları tarafından
yayınlandı 2002). Dolly’nin üretimi için, büyüme faktörlerinin eksikliğinden dolayı hücre
döngüsünden çekilmeye neden olan bu hücreler kültür ortamında serumun seviyesini düşürerek
başarılı oldular. Bununla birlikte, başarı oranı çok düşüktü: transplantasyonu takiben olan nüklear
tekrar programlama olayının anlaşılmasındaki temel eksikliğin sonucu, 250 deneyin yalnızca birinde
yaşayan bir kuzu üretilebildi (Shi ve arkadaşları 2003). Benzer transfer deneyleri Wilmut ve
arkadaşları tarafından gelişen çeşitli transfer metodlarıyla fare, inek, domuz, keçi, kedi, köpek, tavşan,
katır ve sıçan da yapılmıştır (Cibelli ve arkadaşları 1998, Wakayama ve arkadaşları 1998, Baguisi ve
arkadaşları 1999, Polejaeva ve arkadaşları 2000, Shin ve arkadaşları 2002, Chesne ve arkadaşları
2002, Galli ve arkadaşları. 2003, Woods ve arkadaşları 2003, Zhou ve arkadaşları 2003, Lee ve
arkadaşları 2005; Denning & Priddle 2003, Edwards ve arkadaşları 2003). Ilk olarak klonlanmış bir
insan üretildi diye kanıtlanmamış iddialar ortaya koyan çeşitli kişilere, uluslara, dini mezheplere
rağmen, şimdiye kadar klonlanmış bir primat üretimi başarısız oldu. Vahşi soyu tükenmiş olan türleri
temsil eden hayvanları ve kopyalanan nadir hayvanların fizibilitelerine bakılarak birçok proje devam
etmektedir. Örneğin, enfeksiyondan aynı gün ölmesine rağmen, 2001’de klonlanmış guar (Asya’da
nesli tükenmekte olan yerli bir tür öküz) taşıyıcı bir inekte doğdu.
Yerli memelilere nüklear transfer transgenik hayvanların üretilmesi için yeni bir yol sağlar.
Bu nüklear transfer için donör nükleinin kaynağı olarak kullanılan kültür hücresine DNA girişini
içerir. Nüklear transfer aşamasından önce yüksek seviyede transgen ekspresyonu için transforme
hücrelerin taranabilmesini içeren mikroenjeksiyon gibi, hücre temelli strateji geleneksel tekniklerden
çok daha fazla avantajlıdır. Transfer yapılmış hücre hattından nüklear transferle transgenil memelinin
üretimini ilk olarak Schnieke ve arkadaşları (1997) başardı ve onlar fetal koyun fibroblastlarına insan

196
[Metni yazın]

faktör 9 geni ekleyen ve tanımlanan yumurtalara nüklei transfer etmişlerdir. Sonuç olarak üretilen
koyun olan Polly’nin sütünde rekombinant protein üretilir ve biyoreaktör olarak kullanılabilir(ünite
26). McCreath ve arkadaşları (2000) somatik hücreden, hedef gen tarafından değişikliğe uğratılmış
genom nüklear transferle transgenik koyun üretmeyi başardı. Yabancı gen, kuzuya COL1A1 bölgesine
eklendi ve yüksek seviyede ekspreslendi. Nüklear transfer fareden başka gen knockout üretmek için
ilkin memelilerde kullanıldı: Denning ve arkadaşları (2001) klonlanmış kuzular ürettiler. Bunu
maymun, kuzu ve domuz gibi hayvanlardan organların transplantasyonu, xenoplantasyona engel
sorundan biri insan immün sistemi uyandıran proteine karbonhidrat grupları eklenerek bir enzim
kodlayan GGTA1 geni ya da öncül protein kodlayan PRP geninin bozulması hedeflenerek yapıldı.
2002’de iki bağımsız çalışan grup tarafından domuzlarda GGTA1 geninin hedeflenen bozulmasını
bildirildi (Dai ve arkadaşları 2002, Lai ve arkadaşları 2002). Bu raporların her birinde otozomal hedef
genlerin yalnızca bir aleli bozuldu. İlk homozigot GGTA1 knockout domuzlar, ilk klonlanan
domuzlardan elde edilen heterozigot hücreler kullanılarak Phelps ve arkadaşları tarafından (2003)
üretildi. Deneyin amacı hedef gen tarafından ikinci GGTA1 alelini bozmaktı ve sonra seçilen hücreler
bir mantar toksin kullanılarak eksiltildi. Bununla birlikte, diğer analizlerde GGTA1 geninin
kendiliğinden nokta mutasyonuyla ikinci aleli ürettiği açıklandı, bu yüzden domuzların iki aleli
olmamasına rağmen domuzlar heterezigottu.

Şekil13.7 Megan ve Morag, ilk koyun kültür edilmiş hücrelerden nüklear transferle üretilmiştir. Roslin
enstitüsü, Edinburgh izni ile üretilmiştir.

197
[Metni yazın]

Şekil13.8 Dolly ve onun kuzusu Bonnie. Dolly yetişkin hücreden nüklear transferle oluşturulabilen ilk
memelidir. Roslin enstitüsü, Edinburgh izni ile üretilmiştir.

198
[Metni yazın]

Xenopus’un gen transferi germ hattı transformasyonu ya da geçici ekspresyonuyla

sonuçlanabilir

Xenopus oositi heterolog (kardeşten alınan kök hücre)ekspresyon sistemi gibi

kullanılabilir
Gurdon ve arkadaşları (1971) tavşan globin mRNA’sını Xenopus’a mikroenjekte ettikten sonra
globinin oositlerde büyük miktarlarda sentezlendiğini ilk defa gösterdiler. Bundan sonra, Xenopus
oosit ekspresyon sistemi, bitki ve hayvanlardaki proteinlerin ekspresyonu için kullanılmıştır (Colman
1984). X. Laevis pençeli bir Afrika kurbağasıdır. Oosit yetişkin dişinin yumurtalıklarından çok sayıda
elde edilebilir. Büyüyen oosit ilk mayotik profazda büyük bir hücredir (0.8-1.2mm). Bu büyük hücre
oositin hemisferinde uygun büyüklükte nükleusa (germinal vezikül olarak adlandırılıyor) sahiptir.
Oositin büyük olması sayesinde, doğada ya da in vitro’da transkripsiyonla sentezlenen mRNA,
faj-T7 RNA polimeraz olarak kullanılıyor(Melton 1987). Faj-T7 RNA polimeraz, mikroenjeksiyonla
nükleusa ya da sitoplazmaya aktarılabilir. Bu basit bir mikromanipülatör yardımıyla enjeksiyon iğnesi
olarak ince cam kapiller kullanılarak yapılmıştır. DNA’da enjekte edilebilir. Yumurta çekirdeği en
azından 60.000 hücreye kadar gelişen embriyonun ihtiyaçlarını karşılamak için üç ökaryotik RNA
polimeraz deposu içerirler. RNA polimeraz, enjekte edilen ekzojen DNA’nın transkripsiyonu için
kullanılabilir. Bu sistem kullanılarak, memeli virüs promotorları ya da ısı şok promotorlarına bağlı
komplementer DNAs (cDNA)nın açıklanması mümkündür(Ballivet ve arkadaşları 1988, Ymer ve
arkadaşları 1989, Swick ve arkadaşları 1992). Ayrıca, vaccinia virüs vektörleri sitoplazmada gen
ekspresyonu için kullanılabilir (Yang ve arkadaşları 1991).
Oosit ekspresyonunun en önemli kısmı rekombinant proteinlerdir. Bu proteinler genellikle
post translasyonel olan değişimle ve doğrudan hücre bölünmesi ile alakalı olan rekombinant
proteinlerdir. Örneğin, oositler salgı proteini kodlayan mRNA’nın geniş bir çeşidine dönüşür ve onları
doğrudan salgılar (Lane ve arkadaşları 1980, Colman ve arkadaşları 1981). Yabancı plazma membran
proteinleri genellikle oositin plazma membranına hedeflendirilir. Orada onların fonksiyonel olduğu
gösterilebilir. Bu sistemde ekspres edilen ilk plazma membran proteini Torpedo marmorata’nın
elektrik organındaki asetilkolin reseptörüdür (Sumikawa ve arkadaşları 1981). Enjekte oositler elektrik
organından alınan mRNA’lara çevirdi ve plazma membranında fonksiyonel alt ünite reseptör
moleküller birleştirildi (Barnard ve arkadaşları 1982). Bu çalışmayı takiben, oosit iyon kanalları,
reseptörler ve taşıyıcı kanallar içeren plazma membran proteinleri için standart bir heterolog
ekspresyon sistemi oldu. Başarılı bir şekilde ekspreslenen plazma membran proteinlerinin çeşitliliği
çok etkileyicidir. Bununla birlikte, bunlar yanlış post translasyonel modifikasyon ile oositlerde ikincil
haberci sistemlerde bağlantı eksikliği nedeniyle ya da diğer sebeplerle oositlerde fonksiyonel olmayan
reseptörlerin ve yabancı kanalların örnekleridir(Goldin 1991).

199
[Metni yazın]

Xenopus oositleri fonksiyonel ekspresyon klonlama için kullanılabilir

Oositler kullanılarak fonksiyonel ekspresyon klonlama ilk olarak Noma ve arkadaşları (1986)
tarafından geliştirildi ve şekil 13.9da gösterilen strateji kullanıldı. Aşağıdaki örnek, K reseptörünün
klonlanmasını açıklayıcıdır. Oosit sitoplazmasının içine sığır midesinden bir mRNA enjekte edilerek,
K maddesi, memeli taşikinin nöropeptidine cevap niteliğinde olan oositler olduğu bulundu.
Preparasyon oosit membranına eklenen ve fonksiyonel protein olarak ekspreslenen, K madde reseptör
proteini kodlayan mRNA içerir. Masu ve arkadaşları (1987), bu özelliklerden reseptör kodlayan cDNA
klonu izole etmek için faydalandılar. Bu prensip SP6 veya T7 RNA polimeraz için bir promotor
tarafından kontrol edilen cDNA vektörü kullanılarak mide mRNA’sından bir cDNA kütüphanesi
yapmak içindir. Bu klonlanan cDNA’nın karışımından mRNA’nın in vitro sentezine izin verir.
Reseptör klon oosit sitoplazması içine sentetik mRNA’nın enjeksiyonunu takiben reseptör
ekspresyonu için test edilerek tanımlandı. Kütüphanede cDNA karışımının tekrarlanan altbölümü tek
klon cDNA’nın izolasyonunu sağlamıştır. Yukarıda tanımlanan strateji yalnızca klonlanan tek alt ünite
proteinleri için uygulanabildi. farklı alt ünitelerden olan yada yabancı bir polipeptidi, birden fazla
gerektiren oositlerde fonksiyonel olan proteinlerde uygulanamamıştır. Bu engel bir seratonin cDNA
reseptör klonu için hibrid azaltma prosedürü kullanan Lubbert ve arkadaşları (1987) tarafından ortadan
kaldırıldı.
Fonksiyonel ekspresyon klonlamada oosit kullanımının önkoşulu oositin kendi iyon
kanallarının, reseptörlerinin ve taşıyıcılarının bilinmesidir. Endojen aktivitesi fonksiyon sonrası
incelemeyle engellenebilir ya da maskelenebilir (Goldin 1991).

200
[Metni yazın]

Şekil13.9 Heterolog ekspresyon sistemi olarak Xenopus oocytes kullanarak fonksiyonel ekspresyon
klonlama için yöntem

Xenopus embriyolarına geçici gen ekspresyonu DNA ya da mRNA enjeksiyonuyla

başarıldı
In vitro’da sentezlenen mRNA bir ya da iki hücre evresinde Xenopus embriyolarına
mikroenjekte edilebilir. mRNA, enjekte edilen hücrelerin arasına dağıtılır ve gelişimin erken
dönemleri boyunca ekspreslenir. Bu yaklaşımdan gen üretimi bozulan ya da normalin üzerinde
ekspreslenmesinden kaynaklanan gelişim etkilerinin sınanması için çok geniş şekilde yararlanılır (Vize
ve Melton 1991).
DNA Xenopus embriyolarına aynı şekilde tanıtılabilir. Bununla birlikte memelilerde durum
benzer değildir. Memelilerde genoma hızlıca entegre olan enjekte DNA’da ve epizomal olarak devam
eden Xenopus’da egzogen’de durum farklıdır (Endean & Smithies 1989). Bendig & Williams (1983)
bu sürecin belirgin örneklerini gösterdi. Onlar yumurta içine Xenopus globin genlerini taşıyan
rekombinant bir plazmit enjekte ettiler ve gastrula evresinde DNA plazmitinin miktarının 50 ila 100
kat arttığını gösterdiler. Sonraki gelişmelerde, embriyo başına DNA miktarı azaldı ve devam eden
DNA’lar yüksek moleküler ağırlıklı kromozomal DNA’lar ile birlikte taşındılar. Memelilerle amfibiler
arasındaki bu farklılık onların erken gelişim evresinin farklılığını yansıtmaktadır. Memelilerde
bölünme bölümleri yavaştır ve eş zamansızdır. Gen ekspresyonu erken gelişim süresince olur ve sabit
bir oranda ihtiyaç duyduğu proteinler ile embriyo materyalleri bu süreçte meydana gelir. Buna karşılık,
erken Xenopus embriyolarında transkripsiyon yoktur ve bölünme hızlı ve senkronludur. DNA

201
[Metni yazın]

replikasyonu saklanan maternal gen üretimlerine dayanır, bu yüzden kromatin birleştirme proteinleri
ve replikasyon enzimleri stoğudur. Xenopus yumurtalarına enjekte edilen ekzojen DNA sebebiyle
kromatin içine hemen eklenir ve nükleusta olan hızlı DNA sentezi ile uyumlu replikasyon geçirir
(Leno & Laskey 1991). Etkin ve arkadaşları (1987) Xenopus embriyolarına enjekte edilen DNA’ların
çeşitlerinin replikasyonlarını analiz ettiler. Çeşitli plazmitler farklı uzunluklarda arttığı bulunmuştur.
Bu basit bir plazmitin boyutu ile ilgili de değildir, inhibe edilen replikasyon dizilerinin varlığını
yansıtır. Replikasyon enjekte moleküllerin konformasyonuna ve sayısına bağlı olduğu da bulunmuştur
(marini ve arkadaşları 1989).

Transgenik Xenopus embriyoları restriksiyon enzimi aracılı integrasyonla üretilebilir

Erken Xenopus embriyolarına enjekte edilen DNA gen ekspresyonu ve fonksiyonunun analizi
için bu sistemin kullanılmasının sınırlandırılmasında kullanılan promotora bağlı olmaksızın gelişim
süresince mozaik olarak ekspreslenir. Bazı DNA’lar genoma eklenir ve germ hattına doğru taşınabilir
(Rusconi & Schaffner 1981). Bununla birlikte, entegrasyon çok düşük sıklıkla olur ve Xenopus
leavis’in uzun nesil aralığı (yumurtadan yetişkine 12-18 ay) dikkate alındığında, bu transgenik
kurbağa oluşturmak için etkili bir yol değildir.
Xenopus’da büyük ölçekli transgenesis için basit ve etkili süreç yalnızca son on yılda
kullanılabilir hale geldi (Kroll & Amaya 1996). Restriksiyon enzim bağlantılı entegrasyon (REMI)
olarak bilinen bu teknikte, ilgili transgenleri içeren lineerleştirilen plazmitlerle yoğunluğunu kaybeden
sperm çekirdekleri karıştırılır ve DNA’da restriksiyon enzimlerinin sınırlandırılmış miktarı ile işlenir.
İşlenmiş DNA’sı olan döllenmemiş Xenopus yumurtalarına transplantasyon yapıldıktan sonra nüklei,
genoma plazmit DNA’nın entegrasyonu ile sonuçlanır. Bu teknik en azından yüzen iribaş evresine
kadar hayatta kalan birey başına 700 kadar transgenik embriyo üretimine izin verir. Yoğunluğunu
kaybeden nüklei son derece kırılgandır, bu yüzden normal transgenik embriyoların iyi verimi için
yaklaşık 30 dakikada transplantasyonu ve dikkatli kullanımı gereklidir. Bazı durumlarda, canlı
transgenik yetişkinler iribaşlardan elde edilmiştir ve transgenik X. Leavis’ler belirlenmiştir (Bronchain
ve arkadaşları 1999, Marsh-Armstrong ve arkadaşları1999). X. Leavis’in bir dezavantajı tetraploid
türler olmasıdır. Offield ve arkadaşları (2000) bu nedenle yakın akrabaların transgenik hatlarını kurdu
fakat Xenopus tropicalis diploid türler tetraploid akrabalarından daha kısa generasyona sahiptirler.
Xenopus gelişimsel model organizma olarak dünya çapında kullanılması nedeniyle transgenik Xenopus
teknolojisi birçok laboratuara hızlıca uyum sağladı ve gelişimsel genlerin rollerini incelemek (ya da
birçok durumda yeniden incelemek) için kullanılıyor. Şimdiye kadar, transgenik farede kullanılan
gelişmiş araçlar Xenopus’a uygulanamadı fakat bu yalnızca zaman meselesidir. Son zamanlarda, bir
Xenopus ısı şok promotorunun kullanımına dayalı indüklenebilen ekspresyon sistemi GFP geninin
indüklenebilme kontrolüne izin verdiği açıklandı. Bu sistem erken Xenopus gelişmesine Wnt sinyalini
araştırmak için kullanılabildi (Wheeler ve ark.2000). Yukarıda tartışıldığı gibi, transgenik fare
metodolojisinde başarıların bir tanesi onların transgenik olmayan ikizlerinin büyüklerinin iki katına
202
[Metni yazın]

çıkmayı sağlayan fare büyüme hormonunun ekspreslenmesidir. Amfibi başkalaşımında büyüme

hormonunun rolü transgenik kurbağalarda Xenopus büyüme hormonu ekspreslenerek şimdilerde
incelenmiştir. Transgenik iribaşlar kontrol iribaşlarla aynı oranda gelişti, fakat normal büyüklüklerinin
iki katı büyüdü (Huang & Brown 2000). Başkalaşımdan sonra, transgenik kurbağalar da kontrollerden
daha hızlı büyüdü ve iskelet problemleri görüldü.

Balığa gen transferi genellikle mikroenjeksiyonla taşındı, fakat başka metotlar ortaya
çıkıyor
Balık transgenesisi örneğin zebra balığı (Danio rerio), medaka (Oryzias latipes) gibi model
türlerin gen fonksiyonlarını ve regülasyonlarını çalışmak için, somon ve alabalık gibi ticari olarak
önemli türlerin özelliklerini geliştirmek için kullanılabilir. Balıklarda gen transfer teknolojisi, ağırlıklı
olarak transgen ekspresyonu kontrol etmek için uygun regülatör elementin eksikliğinden dolayı,
memelilerin gerisinde kalmıştır. İlk transgenik balık memeli ya da viral düzenleyici elementlerle
hareket eden transgenler taşıdı ve onların performansları önemli ölçüde değişti. Örnek olarak,
alabalıkta büyüme hormon genleri ekspresyonu için girişimler başlangıçta küçük başarılar ile
karşılaşıldı ve bu memeli intronlarını doğru işlemek için, balık hücrelerinin yetersizliği nedeniyle
olmuş olabilir (Betancourt ve ark. 1993). Bununla birlikte, balık döllenme ve gelişme dış ortamda
olmasından, haploid ve tek aileli diploid embriyolar üretebilme kolaylığı ve kendi doğurganlığı dahil
birçok nedenden avantajlı deney sistemleridir (Ihssen ve ark.1990). Kurbağa benzeri, balık
yumurtalarına ve erken embriyolara DNA’nın enjeksiyonu geçici replikasyona ve entegre olmayan
transgenlerden ekspresyona yol açar, böylece balıklar kurbağa benzeridir ve kısa süreli ekspresyon
deneyleri için kullanılabilir (Vielkind 1992). DNA’nın bir kısmı germ hattına taşınımı ve transgenik
balık hatlarının üretiminden dolayı genoma entegre olur ( Iyengar ve ark.1996, Zbikowska 2003).
Balığa DNA entegrasyonunu arttırmak için entegre DNA elementlerinden saflaştırılmış enzimlerin
kullanılmasına dayanan yeni metotların geliştirilmesinde son zamanlarda ilerleme olmuştur (örnek
olarak transpozonlar ve retrovirüsler). Zebra balığı embriyolarına ekzojen genlerin başarılı transferi
için hibrid tekniğin gelişmesini takiben Retroviral vektörler kullanılıyor. Bu hibrid teknikte
entegrasyon verimliliğini önemli ölçüde arttıran ve erken transgen entegrasyonu ile sonuçlanan
saflaştırılmış retroviral integraz ile zebra balığı embriyolarına DNA enjekte edilmiştir . Bu aynı
fonksiyonu gerçekleştirebilen doğal balık enzimleri için araştırmayı harekete geçirdi, fakat maalesef
tüm balık transpozonları enzim aktivitesi tahrip olan diğer mutasyonlar veya delesyon içerenlerden
izole edildi. Bu problem birçok balık transpozon dizileri toplanarak ve Sleeping beauty olarak bilinen
sentetik transpozon sistemiyle sonuçlanan teorik ideal dizilerden kaynaklanarak ele alındı. Zebra
balığına gen transfer vektörü olarak bilinen Sleeping beauty’nin kullanımı 20 kat daha transgen
entegrasyonunun verimliliğini arttırır ve diğer balık türleri içinde kullanımı uygun olabilecektir
(Zbikowska 2003). Son zamanlarda, elektroporasyon ya da parçacık bombardımanı gibi metotlar ve
sperm aracılığıyla gen aktarımı balık transgenesisi için başarı ile kullanılabilir. Yeni teknik amfibiler

203
[Metni yazın]

için açıklanan REMI tekniğine benzer bir prosedür olan sperm aracılığıyla DNA transferini takiben
plazmit DNA ile spermin elektroporasyonu uygulandı.

Meyve sineklerine gen transferi kutup hücrelerine DNA’nın mikroenjeksiyonunu içerir

P elementleri Drosophila germ hattına DNA tanıtmak için kullanıldı

P elementleri D. Melanogaster germ hattın’da oldukça hareketli olabilen, belirli koşullar
altında taşınabilir DNA elementleridir. Drosophila ‘da özelleşmiş vektör proteinleri olarak bu dizilerin
kontrol altına alınması Drosophila genetiğinin dönüm noktasıdır. P element vektörlerinin kullanılması
ile herhangi bir DNA sekansı sineğin genomu içine eklenebilir.
P elementleri P-M hibrid disgenezi olarak adlandırılan genetik olaylarla ilgili bir sendroma
neden olur (Bingham ve ark.1982, Rubin ve ark.1982). P suşunun erkeği ile M suşunun dişisi eşleştiği
zaman disgenez oluşur, fakat ters çapraz yapıldığında olmaz. Ağırlıklı olarak sendrom germ hattı’nı
etkiler ve yüksek mutasyon oranını ve anormal (disgenik) hibrid yavrulara neden olan sık kromozomal
anomalileri indükler. Ekstrem durumlarda, gametleri üretmek için yetersizdir.
P suşlar M suşu dişilerin yumurtalarında hareketli olabilen, P elementleri yani taşınabilir
genetik elementler, içerdiğinden hibrid disgenezi olur (P elementi aktarılması için toleranslı olan
yumurtalar M sitotipi olarak tanımlanır). P elementleri P suşlarının çaprazlanmasında disgeneze neden
olmaz, çünkü onlar P sitotip yumurtalarında hareketli değildirler. Taşınmayı engelleyen transposaz
kendisinin bir represörünü kodlayan P elementidir. P sitotip erkekten bir sperm, M sitotip bir dişinin
yumurtasını döllediği zaman, transposazın geçici baskısızlaştırması sonucunda yumurtalarda
represörün yokluğunda P element transpozisyonu yüksek sıklıkta olur. Disgenez sendromunun yüksek
oranda karakteristik mutasyonunu çoklu genetik locusa P elementinin eklenmesini yansıtır.
P element ailesinin birçok üyesi klonlandı ve karakterize edildi (O’Hare & Rubin 1983).
Ailenin diğer üyeleri iç delesyon olayı ile meydana gelmiş görünürken, prototip 2.9 kb elementtir.
Elementler transposaz tarafından tanımlanan ters çevrilmiş uç tekrarlar 31 bp olarak karakterize edildi.
Prototip element, transposaz kodlayan 4 ekzonu kapsayan, bir tek gen içerir (transposazın kesilmiş bir
çeşidi represör olarak görev yapar). Transposaz primer transkripti germ hücrelerinde ve somatik
hücrelerde değişik şekillerde birleşmektedir, örneğin fonksiyonel transposaz yalnızca germ
hücrelerinde üretilir. Laski ve ark. (1986) farklı şekillerde birleşen üçüncü intronu tamamen
uzaklaştıran bir P elementi yaparak açıkça gösterdiler. Bu element somatik taşınma aktivitesini yüksek
seviyede gösterdi. Doğal olan kısa P elementleri genellikle kusurludur, çünkü onlar fonksiyonel
transposaz kodlamaz. Bununla birlikte, onlar ters çevrilmiş uç tekrarlara sahiptirler ve aynı nükleusa
kusurlu olmayan P elementleriyle transposaz verilerek in trans aktifleştirebilir.
Spradling & Rubin (1982) Drosophila kromozomlarına P element DNA eklemek için bir
yaklaşım planlamıştı. Öncelikli olarak, birçok yan Drosophila DNA sekansları ile birlikte 2.9kb P
elementi kapsayan bir rekombinant plazmit olan klonlanmış pBR322 vektörü M sitotip embriyoların

204
[Metni yazın]

arka kutbuna mikroenjekte edildi. Sitoplazma henüz hücrelere bölünmediğinde, embriyolar sinsityal
blastoderm aşamada enjekte edildi( şekil 13.10). Arka kutup seçildi, çünkü burası germ hattının
kaynağıdır ve bu bölgede P element DNA germ hücrelerinin bir kısmında genoma eklenebilmesi
umulur.
Döl hatlarının bölmeleri P elementinin politen kromozomlara in situ hibridizasyonla açığa
kavuşan 5 büyük kolda çeşitli bölgelere entegre olduğunu gösterdi. P element entegrasyonu
transpozisyonla oldu, entegrasyon rastgele değildir. Bu sınırlı DNA southern blotla incelenerek ispat
edildi ve rekombinant plazmitte varolan pBR322 DNA entegre P elementi ile yandaş olmadığı
gösterildi (Spradling & Rubin 1982). Enjekte plazmit DNA transposaz üretmek için entegrasyondan
önce bazı seviyelerde ekspreslenmiş olmalıdır.
Bu deney germ hücrelerinin kromozomlarında çeşitli bölgelere enjekte plazmitlerden yüksek
etki ile taşınabilen P elementi olduğunu gösterdi. Her dölde entegre P elementlerinin en az biri M
sitotip yumurtalara sonraki çaprazlamada yüksek mutasyon olabilmesinin nedeni olarak fonksiyonel
kaldı.

Gen transferi için doğal P elementleri vektörler içinde geliştirildi

Rubin & Spradling (1982) Drosophila genomuna yapay olarak eklenebilen P elementlerinden
yararlandılar. Vektör olarak P elementlerini kullanmak için olası bir strateji, transpozisyon için gerekli
dizileri bozarak yapılabilen yabancı DNA’nın insersiyonu olduğu yerde 2.9kb P elementi dizilerine
uygun bölgeleri tanıtmakla olurdu. Ancak alternatif bir strateji tercih edilmiştir. Rekombinant plazmit
klonlanan pBR322 Drosophila dizileri ile birlikte P element ailesinin silinen üyeleri 1.2kb olarak izole
edildi. Bu doğal olarak kusurlu P elementi transposaz kodlayamadı (O’Hare & Rubin 1983). Hedef
DNA kusurlu P elementine bağlandı. Amaç bu rekombinant P elementini in trans transposaz
fonksiyonu üreten enjekte embriyoların germ hattı’na entegre etmekti. Bunu yapmak için başlangıçta
iki yaklaşım test edildi. İlk yaklaşım bir plazmit taşınan rekombinant P elementi yüksek olduğu
umulan transposaz aktivitesi olduğu P-M disgenik çaprazlamadan türemiş embriyo içine enjekte
edildi. Bu yaklaşımın dezavantajı sık sık mutasyon ve kromozomal anomalilikler beklenmesidir. Diğer
yaklaşımda, plazmit taşıyan rekombinant P elementi kusurlu olmayan 2.9kb element taşıyan bir
plazmit ile birlikte enjekte edilmesidir.
Bu türün ilk deneylerinde, rosy mutasyonu için homozigot embriyolar doğal suş rosy geni
içeren P element vektörü ile mikroenjekte edildi. Tamamlayıcı transposaz sağlamak için her iki
yöntemde etkilidir. Doğal suş göz rengi ile tanınan Rosy+ dölü, enjekte embriyoların %20-50sinden
elde edildi. Bu sineklerin kromozomları entegre olmuş rosy geninin bir yada iki kopyasını içerdiler.
Rosy geni genetik işaretlemede özellikle kullanılır. O açıkça görülebilen fenotip üretir: rosy+
sineklerinin karakteristik kırmızı göz rengi yerine rosȳ sinekleri kahverengi gözlere sahiptirler. Rosy
geni göz pigmentlerinin üretimini içeren ksantin dehidrogenaz enzimini kodlar. Rosy geni otonom
hücreler değildir: örneğin doğal tip göz rengi enjekte larvadan gelişen genetik olarak mozaik
205
[Metni yazın]

sineklerde her yerde rosy ekspreslenir. Seçilebilir işaretler transforme sinekleri tanımlamak için
görünür işaretlerin yerine kullanıldı. Bunlar alkol dehidrogenaz geni adh ve neo içerirler. Diğer göz
renkleri beyaz ve parlak kırmızı gibi alternatif görülebilir işaretler kullanıldı.
Şekil 13.11 de basit P element vektörü gösterildi(Rubin&Spradling 1983). bakteriyal vektör
pUC8de klonlanan P elementini içerir. P elementinin çoğu rosy geni tarafından değiştirildi, fakat
transposizyon için özellikle uç tekrarlar muhafaza edildi. Vektör, eklenen yabancı diziler için
polylinker’lar içerir. Enjekte edilen larvanın genomuna rekombinant vektörün transpozisyonu in trans
transposaz sağlayan fakat korunmuş uç tekrarların birindeki delesyondan dolayı kendisi aktarılamayan
yardımcı P elementi ile birlikte enjekte edilerek verildi. Böyle bir eleman kesik uçlu kanatlar olarak
adlandılır (Karess & Rubin 1984). Alternatif bir strateji saflaştırılmış transposaz proteinlerini enjekte
etmektir (Kaufman & Rio 1991). Rekombinant elementin içerdiği boyut transpozisyon sıklığını
azalttığı görülmesine rağmen P element vektörünün kapasitesi büyüktür.40 kb ın üzerinde diziler
sineklere başarıyla tanıtıldı ve bu P elementleri kullanılarak (klonlanan vektör gibi kullanılan hibrid
plazmit) cosmid kütüphaneler kuruldu.

206
[Metni yazın]

Şekil 13.10 Drosophila’nın erken embriyogenezi. DNA germline hücreleri içinde birleştirilen havuz
hücre şeklinde posteriora ve öncül embriyoya enjekte edildi.

207
[Metni yazın]

Şekil 13.11 P elementi bir vektör sistemi gibi üretilmiştir

Drosophila’da gen hedefleme bölge özel rekombinasyonu ve homologlarının

kombinasyonu kullanılarak başarıldı
Sineklerin transformasyonu erken embriyoların kutup plazma bölgesine plazmit vektörler
üzerinde taşınmış P elementinin enjeksiyonu ile başarıldı. DNA’nın doğrudan enjeksiyonu endojen
gene homolog karşılığı olsa bile hedef gen olarak sonuçlanamaz ve bunun nedeni entegre element
olarak P elementi fonksiyonlarıdır. Nadiren hedeflenen olaylar Drosophila somatik hücrelerinde
seleksiyonla ortaya çıkmasına rağmen, sinekler transgenik üretimi için ES hücrelerine eşit sisteme
sahip değildirler.
Bu sorunun üstesinden gelmek için, Drosophila’da hedeflenen gen dizi özel rekombinasyonu
ve endonükleaz sindiriminin yeni bir kombinasyonu kullanılarak başarılan in vivo da donör molekül
oluşturularak gerçekleştirildi. Üç P elementini ilk başta üç farklı sinek hattına eklemek gereklidir ve
sonra melezlemenin iki generasyonu biriktirilir. İlk P elementi dairesel bir ürün olarak FRT’nin
doğrudan tekrarları arasında DNA sekanslarını kesen, maya spesifik bölge rekombinaz FLP kodlayan
gen içerir. İkinci P elementi, doğal tip Drosophila genomunda heryerde bulunmayan 22bplik bölgeyi
tanıyan, rare cutting endonükleaz I-Sce1 kodlayan geni içerir. Bu iki gende ısı şok promotorlarının
kontrolü altındadır. Son element yanındaki işaretleyicilerle birlikte, beyaz gözlü sineklerin evvelinde
kırmızı gözlü sinekler üreten white gen, genomda başka bir bölge tasarlamak için homologları olan
donör molekülün sekanslarını içerir. Donör diziler I-Sce1için tanınan bölgeden kesilmiştir ve donör

208
[Metni yazın]

diziler ve işaretleyiciler FRT bölgesini çevreler (şekil 13.12a). Aynı sinekte 3 elementin hepsi olduğu
zaman, sinekler ısı şoku olur. FLP enzimi işaretleyici gen, homolog bölge ve basit FRT bölge içeren
halkasal element olarak donör molekülleri alır. Aynı anda, I-Sce1 enzimi şekil 13.4de gösterilen
insersiyon tip elemente anolog bir yapı gibi üretilerek homolog bölgeli donör moleküllere ayrılır.
Donör diziler hedefleri ile sıralanır ve endogen genin hedeflenen tahribatı ile sonuçlanan homolog
rekombinasyona uğrar.(şekil 13.12b)

Şekil 13.12 Drosophila’da hedef gen. Bu örnekte, hedef lokus X kromozomundadır ve mor kutularla
açıklanmıştır (sol panelde). 3 P elementi ile sinekler bağımsız transforme çizgiler kullanılarak yapıldı.
bu örnekte, element, diğer otozom bulunan donör diziler içerirken (A)(sağ alt panel), elementler aynı
otozomda bulunan I-Sce1 ve flp transgenleri içerir(A)(sağdaki panel). (a) I-Sce1 ve flp transgenlerin
ekspresyonu (b) donör yapıda görev alan cevap oluşturan enzimlerin üretilmesini sağlar (c) donör
molekülleri lineerleştirerek üretir. Sol alt panelde, (d) bu hedef lokusla ve hedef geni çoğaltan
rekombinasyonla sinapsisleri gösterir.(e) Hedef gen, işaretleyiciler ve FRP bölgesiyle kesilir. Halka
FLP enzimidir, ok FRP bölgesidir, üçgen I-Sce1dir, mor çubuk I-Sce1 hedef bölgesidir.

Hedeflenen olayları kurtarmak için, ısı şoklanan sinekler doğal suşlara eşleştirildi. Bu
melezlemede çoğu dölde işaretli genler kayboldu çünkü FLP kesilip alınan donör molekül, genellikle
kayboldu. Ancak, hedefleme nerede başarılı olduysa, işaretler yavrularda olacaktır ve ilgili fenotipi
gösterecektir. Hedeflenen sürecin her evresi farklı şekillerde doğrulanabilir. Donör sekanslarının
kesilip alınması FLP ekspresyonu ile doğrulanabilir, yalnızca bozulmamış donör element iki FRT
bölgesine bağlı işaretleyici gene sahiptir. Bununla birlikte, işaretleyiciler homolog rekombinasyon gibi
rastgele entegrasyon yoluyla kesilip alınma FLP aracılığıyla hayatta kalmaktadır. Bu nedenle,
hedeflenen olaylar Southern blot hibridizasyon ve PCR gibi moleküler analiz ve genetik bağlantılı
analizle bağlantılı olmalıdır. Memelilerde hedeflenen gibi, Drosophila’da hedeflenen etki lokus
bağımlı ve homolog bölgenin uzunluğu ile ilgilidir. Memelilerde durumun aksine, transfeksiyonla

209
[Metni yazın]

memeli hücrelerine eklenen yüz ya da binlerce hücrede (eğer hücre G2de ise) en fazla iki donör
molekül vardır. Bu araştırmalar, In vivo donörler homolog rekombinasyon için egzojen olarak verilen
DNA’dan daha etkili substratları olduğunu gösteriyor.
Farelerde hedef gen için olduğu gibi, Drosophila hedefleme stratejisi homolog bölgenin
kopyalanmasına yol açar. Ancak, Drosophila genleri, tüm gen bulunması gereken durumlarda etkili
rekombinasyonu kolaylaştırmak için yeterli benzerlik, memelilerdekine kıyasla küçük olabilir. Tüm
geni kapsayan homolog bölgede hedef lokusun mutasyonu sağlamak için çeşitli şekiller gösterilmiştir.
Şekil 13.13’te I-Sce1bölgesinin her iki bölgesinde iki nokta mutasyonunun oluşması gösterilir. Bu
farklı mutasyonlar saklayan her bir kopya işaretleyicilerle ayrılan tüm hedef genin ardışık
çoğaltılmasını üretir.

Şekil 13.13 Drosophila’ da hedeflenen mutasyonlar oluşturmak için şekil. Hedeflenen yapı I-
Sce1bölgesinin diğer yanında nokta mutasyonu içerir, bu yüzden homolog rekombinasyonla insersiyon
farklı mutasyonlar içeren hedef genin iki kopyasını içerir. iki mutasyonun varlığı yaban tipe
dönüşmeyi önlemesine rağmen, duplikasyonları çözmek için spontan intrakoromozomal
rekombinasyon Drosophila’ da gözlenmemiştir.

210
[Metni yazın]

13. QUESTİONS - ANSWERS

1)What is the position effect? Explain.

Independently derived transgenic animals and plants carrying the same expression construct often
show variable levels and patterns of transgene expression. In many cases, such variation is dependent
on the site of transgene integration, and this phenomenon has been termed the position effect. Position
effects result from the influence of local regulatory elements on the transgene, as well as the
architecture of the surrounding chromatin.

2)How can use yeast artificial chromosome (YAC) in transgenic mice? Describe one method that only.

The transfer of large DNA segments to the mouse genome has been achieved by transformation with
yeast artificial chromosome (YAC) vectors. Scientists
were the first to report transformation of ES cells with a YAC vector, via fusion with yeast
spheroplasts. The vector contained the entire human HPRT locus, nearly 700 kb in length. The
disadvantage of this method is that the endogenous yeast chromosomes were co-introduced with the
vector.

3) Describe a technique called microcell-mediated fusion?

It is also possible to introduce chromosomes and chromosome fragments into ES cells using a
technique called microcell-mediated fusion. This involves the prolonged mitotic arrest of cultured
human cells, using an inhibitor such as colchicine. Eventually, the nucleus breaks up into vesicles
containing individual chromosomes, which can be rescued as microcells comprising a nuclear vesicle
surrounded by a small amount of cytoplasm and a plasma membrane.

4)Explain the strategy of knock in giving an example.

Homologous recombination has also been used to exchange the coding region of one gene for that of
another, a strategy described as “gene knock-in”. This has been used, for example, to test the ability of
the transcription factors Engrailed-1
and Engrailed-2 to compensate for each other’s functions. Scientists replaced the coding region of the
engrailed-1 gene with that of engrailed-2, and showed that the engrailed-1 mutant phenotype could be
rescued. A more applied use of gene knock-in is the replacement of parts of the murine
immunoglobulin genes with their human counterparts, resulting in the production of humanized
antibodies in transgenic mice.

5)How can use intracytoplasmic sperm injection? Explain giving an example.

The injection of sperm heads directly into the cytoplasm of the egg can overcome infertility in
humans. It has been shown that sperm heads bind spontaneously to naked plasmid DNA in vitro,
suggesting that sperm injections could be used to achieve transformation. This was demonstrated by
scientists, who mixed mouse sperm with plasmid DNA carrying the gene for green fluorescent protein
(GFP). These sperm were injected into unfertilized oocytes, and a remarkable 94% of the resulting
embryos showed GFP activity.

6)Explain that technique known as restriction-enzyme-mediated integration.

211
[Metni yazın]

In this technique, known as restriction-enzyme-mediated integration (REMI), linearized plasmids

containing the transgene of interest are mixed with decondensed sperm nuclei and treated with limiting
amounts of a restriction enzyme to introduce nicks in the DNA. The nuclei are then transplanted into
unfertilized Xenopus eggs, where the DNA is repaired, resultingin the integration of plasmid DNA into
the genome. This technique allows the production of up to 700 transgenic embryos per person per day,
most of which survive at least to the swimming-tadpole stage.

7)How the effects mice and amphibian expressing growth hormone?

One of the early successes in transgenic mouse methodology was the expression
of rat growth hormone, resulting in transgenic mice up to twice the size of their non-transgenic
siblings. The role of growth hormone in amphibian metamorphosis has now been examined by
expressing Xenopus growth hormone in transgenic frogs. The transgenic tadpoles developed at the
same rate as control tadpoles, but typically grew to twice the normal size. After metamorphosis, the
transgenic frogs also grew much more quickly than controls and showed skeletal defects.

8)What is the fundamental difference between animals and plants in tissue cultures?

A fundamental difference between animals and plants is that organized, differentiated plant tissue
shows a high degree of developmental plasticity. Depending on the species, isolated stem segments
leaf disks, or seed-derived callus tissue may be able to regenerate an entire new plant under
appropriate culture conditions.

9)What is the tissue culture? Which tissues use generally for tissue culture?

Tissue culture is the process whereby small pieces of living tissue (explants) are isolated from an
organism and grown aseptically for indefinite periods on a nutrient medium. The usual explants are
buds, root tips, nodal stem segments or germinating seeds, and these are placed on suitable culture
media where they
grow into an undifferentiated mass known as a callus.

10)Why protoplasts are very useful for genetic manipulation?

Protoplasts are very useful for genetic manipulation for two reasons: first, several transformation
protocols have been developed that work specifically with protoplasts; and second, because under
certain conditions, protoplasts from similar or contrasting cell types can be fused to yield somatic
hybrids, a process known as protoplast fusion.

11)What is callus and which parts of plants can be used to form callus?

Callus is an undifferentiated mass derived from plant tissue. The usual explants are buds, root tips,
nodal stem segments or germinating seeds, and these are placed on suitable culture media where they
grow into an undifferentiated mass known as a callus.

12)What is the hormone, carbon source, organic sources in plant tissue cultures?

There are five main classes of plant hormones: auxins, cytokinins, gibberellins, abscisic acid, and
ethylene. Organic nutrients such as casein hydrolysate, coconut water or yeast extract may also be
required. Organic nitrogen source(one or more amino acids), and sucrose as a carbon source.

212
[Metni yazın]

14. BÖLÜM

BİTKİLERE GEN TRANSFERİ

213
[Metni yazın]

Giriş
Bitkiler yararlı ürünlerin birçok çeşidini insana sağlarlar: gıda ve hayvan yemi, elyaf ve
yapısal malzemeler, ilaç, aroma ve reklendirici olarak kullanılabilen küçük moleküller. Tarihin ilk
çağlarından itibaren bu ürünler için bitkiler yetiştirilmektedir ve o zamandan beri insanlar birçok
yararlı çeşidini ve daha iyi performanslı olanları seçerek ve onları üreterek bitkileri geliştirmek için
çalışmışlardır. Bu yaklaşımın bir engeli, türlerin cinsel uyumlu grupla ya da tüm türlerde mevcut gen
havuzunu sınırlandıran yetiştiricilerdir. Bu engeli aşmak için, bitkilere gen transfer çalışmalarının
gelişmesi gereklidir. 1960 ve 1970ler süresince bitki dokularına DNA transfer etmek için birçok
deneme kaydedildi fakat kararlı bir transformasyon sağlanamadı (Stroun ve ark.1966, Coe ve Straker
1966). Transgenik tütün bitkileri toprak bakterisi Agrobacterium tumefaciens kullanılarak
transformasyonla üretildikleri zaman, 1981’de germ hattı’na doğru kararlı iletimle bir bitkiye yabancı
DNA’nın eklenmesi sağlandı (Otten ve ark. 1981). Bu çalışmaları takip eden 25 yılda, yabancı
genleri, hem bitki hücre ve dokularına doğrudan DNA transferini içeren alternatif stratejileri, hem de
A. tumefaciens kullanılarak 100’ün üzerinde bitki türüne ekleyebildiler. Ayrıca, bitki virüsleri yüksek
seviyede gen ekspresyonuna izin vermesi için çok amaçlı epizomal vektörler olarak geliştirildi. Bu
araştırma beslenme özelliklerinin iyileştirilmesi, strese toleransı geliştirmek, hastalıklara ve pestlere
onları dirençli yapmak ve hatta tedavi edici proteinler ve endüstriyel enzimler üreten fabrikalar gibi
davranan bitkilerin düzenlendiği tarımsal biyoteknoloji endüstrisi kuruldu (ünite 16).
Hayvanlar ve bitkiler arasında temel farklılık; farklılaşmış bitki dokularında, gelişimsel
plastisitenin yani şekil alabilirliğin yüksek seviyelerini göstererek organize edilir. Türlerine bağlı
olarak, izole edilen gövde parçaları, yaprak diskleri veya tohum kaynaklı kallus dokusu (organize
olmamış şekilsiz dokular topluluğu) uygun kültür koşulları altında yeni bir bitkide rejenere olabilir.
Birçok bitki türleri için, doku kültür adımının bazı çeşitleri transgenik bitkilerin başarılı bir şekilde
üretilmesi için bu yüzden gereklidir. Doku kültürü için ihtiyaç minimize edilmede ve elemede
bitkilerin transformasyon stratejilerinin kullanılması bu günlerde artarak ilgilenildiği unutulmamalıdır.

Bitki doku kültürü birçok transformasyon işlemi için gereklidir

Kallus kültürleri farklılaşmamış hücre koşulları altında kuruldu

Doku kültürü, besin ortamında belirsiz dönemler için aseptik olarak büyüyen organizmadan,
izole edilen canlı dokunun küçük parçalarıdır. Başarılı bitki doku kültürü için hücrelerde zengin yapay
ortamda üretilmiş doku ile başlamak en iyisidir çünkü hızlı çoğalma yeteneğinde olan hücrelerdir.
Genel üretilen dokular tomurcuklar, nodül gövde segmentleri, kök uçları yada üretilen çekirdeklerdir
ve bu kallus olarak bilinen farklılaşmamış kütle halinde yetiştirildiği uygun kültür ortamına
yerleştirilmiştir (şekil14.1). Bitkiler için kullanılan besleyici ortam mikroorganizmaların büyümesini
de desteklediğinden dolayı yapay olarak üretilen dokular ilkin sodyum hipoklorit, hidrojen peroksit
gibi dezenfektanlarla yıkanır. Kallus altbirimlere süresiz olarak yayılabilir. Genellikle kallus kültürleri
karanlıkta muhafaza edilir çünkü kallus hücrelerinin farklılaşmasını ışık indükler. Bir kallusu
214
[Metni yazın]

oluşturan bitki hücreleri için, farklılaşmamış evrede muhafaza edilen hücreler için bitki hormonlarının
(fitohormon) dengeli miktarını içeren besleyici ortam esastır. Bitki hormonlarının 5 ana sınıfı vardır:
sitokininler, oksinler, giberellinler, absisik asit ve etilen (şekil14.2). Oksin ve sitokininin doğru miktarı
kallus kültürü için çok önemlidir ve tüm türler ve eksplant tipler için uygun miktarların tespit edilmesi
gereklidir. Düşük oksin/sitokinin oranı kökün formasyonunu yüksek oranda desteklerken filiz
oluşumuna yol açar. Diğer hormonlar için şartlar türlere ve eksplantlara göre değişir. Absisik asit
somatik embriyogenes gibi belirli gelişimsel olayları korumak için kullanılmasıyla ilgiliyken, bazı
explantlar devam eden büyüme için GA3 gibi giberellinlerin varlığına gerek duyar. Hücre büyümesi
inhibe edilen kültür hücreleri tarafından doğal olarak bazı zamanlar üretilen etilene rağmen, etilen
doku kültüründe nadir olarak kullanılır. Yaygın olarak kullanılan besiyerlerin çoğu inorganik tuzlar
makroelementler ve mikroelementler gibi eser metaller, tiamin ve miyoinositol gibi esansiyel
vitaminler, organik nitrojen kaynakları (genellikle bir ya da daha fazla amino asit) ve karbon kaynağı
olarak sukroz içerirler. Kazein hidrolizat, hindistan cevizi suyu ve maya özü gibi daha kompleks
organik besinlere de gereksinim duyulabilir. Birçok bitki kültürü besiyeri jel ajanları içerir ve bu
yüzden bitkiler besiyer yüzeyinde tıpkı toprakta olduğu gibi büyür ve kök salarlar.

Şekil14.1 Bir kallus kültürünün yakından görünümü

215
[Metni yazın]

216
[Metni yazın]

Şekil 14.2 Bitki büyüme regülatörleri, fitohormonlarına ait bazı kimyasal yapılar

Kallus kültürleri gruplar halinde muhafaza edilen hücre süspansiyonları formunda

parçalanabilir
Türlere ve kültür koşullarına bağlı olarak, kallus dokusu sert ve yoğun ya da yumuşak ve
kolay kırılabilir olabilir. Bir diğeri kırılabilir kallus olarak bilinir ve sıvı ortama transfer edildiğinde ve
çalkalandığında, hücre kütlesi, izole edilen hücrelerin, küçük hücre kümelerinin ve büyük kümelerin
süspansiyonunu vermek için parçalanır. Bu süspansiyonlar alt kültür tarafından oldukça heterojen
kümelerin varlığı sayesinde sınırsız korunabilir. Genetik kararsızlık bu heterojenliği sağlar bundan
dolayı uzun süreli kültürler, rejenere bitkilerin verimliliğini ve canlılığını olumsuz olarak etkileyen
mutasyonların ( somaklonal varyasyon) birikmesine neden olur.
Eğer uygun kultür ortamı varsa, bölünme yeteneğinde olan süspansiyon kültürlerden tek
hücreler izole edilir. Hayvan hücrelerinde olduğu gibi, uygun koşullar proliferasyon olması için
gerekli olabilir. Uygun kültür birkaç günlük yeni ortamdaki hücrelerin yüksek yoğunluğa sahip
kültürüyle hazırlanır ve filtre sterilasyonuyla hücreler uzaklaştırılır. Bu yolla hazırlanan uygun ortam,
esansiyel amino asitleri ve bitki hormonlarını içerir. Sağlanan uygun ortam kullanılırsa, tek hücreler
bir koloni, bitki hücreleri proliferasyonu ve kallusun ki yerine mikroorganizmalar gibi aynı yolla katı
kültür ortamına ekilebilir.

Protoplast genellikle süspansiyon hücrelerden elde edilmiştir ve hedeflenen

transformasyon ideal olabilir
Protoplast selüloz duvarı uzaklaştırılmış hücrelerdir. Onlar 2 sebepten dolayı genetik
manipülasyon için çok kullanılırlar: birincisi, birçok transformasyon kuralı protoplastlar ile özel olarak
çalışılarak geliştirilebilir, ikincisi belirli koşullar altında benzer ya da karşıt hücre tiplerinden somatik
hibridlere verim oluştucak şekilde eklenebilir, bu işlem proplast füzyonu olarak bilinir. Protoplastlar
süspansiyon kültürlerinden, kallus dokusundan ya da sağlam dokudan üretilebilir. Örneğin, lif mezofil
hücreleri, tercihe göre ya da mekanik bozulma ile, selülolitik yada pektinolitik enzimler ile muamele
ile üretilebilir. Pektinaz hücre duvarını sindiren selülaz ve hücreler içindeki hücre kümelerini kırmak
için gereklidir. Enzim muamelesinden sonra enzim süspansiyonları sanrifügasyonla toplandı, enzimle

217
[Metni yazın]

kültürde yıkandı ve sukroz tamponuyla flotasyonla (ayırma yöntemi) hücre artıkları sağlam
hücrelerden ayrıldı (14.3). Besin ortamına konulduğunda, protoplastlar 5-10 gün içinde yeni hücre
duvarını sentezleyecektir ve sonra hücre bölünmesi başlayabilir.

Kültürler haploit hücrelerden, embriyolardan ya da meristematik dokunun hızla

bölünen hücrelerinden doğrudan da yapılabilir
Kökler ve sürgünler uzayan kök ve gövdelerde bölünen hücrelerin kaynağı olan meristematik
doku içerir. Kök ve sürgün uçları katı kültürde çıkarılabilir, doğrudan kültür edilebilir ve klonal olarak
çoğalan yeni organlar oluşturacaktır. Benzer şekilde, embriyolar kallus kaynağı olarak kullanılan
hızlıca çoğalan hücreler içerir. Rejenere tahıllar ve diğer monokotil bitkilere uygulanan çok yaygın bir
stratejidir.
Kallus dokusunun diğer yaygın kaynağı erkek gametofit ya da polen granülleri bulunan
mikrospordur. Anter kültürü bu hücrelerden embriyo gelişimini uyaran bir çevre sağlamak için
kullanılır. Embriyogenes süresince, haploid doku aynı haploid genomun iki kopyasını içeren dihaploid
bitkiler olarak adlandırılan iki katı kromozomu baskılayabilir ya da spontana maruz kalabilir.

218
[Metni yazın]

14a. QUESTİONS - ANSWERS

1)What is the position effect? Explain.

Independently derived transgenic animals and plants carrying the same expression construct often
show variable levels and patterns of transgene expression. In many cases, such variation is dependent
on the site of transgene integration, and this phenomenon has been termed the position effect. Position
effects result from the influence of local regulatory elements on the transgene, as well as the
architecture of the surrounding chromatin.

2)How can use yeast artificial chromosome (YAC) in transgenic mice? Describe one method that only.

The transfer of large DNA segments to the mouse genome has been achieved by transformation with
yeast artificial chromosome (YAC) vectors. Scientists
were the first to report transformation of ES cells with a YAC vector, via fusion with yeast
spheroplasts. The vector contained the entire human HPRT locus, nearly 700 kb in length. The
disadvantage of this method is that the endogenous yeast chromosomes were co-introduced with the
vector.

3) Describe a technique called microcell-mediated fusion?

It is also possible to introduce chromosomes and chromosome fragments into ES cells using a
technique called microcell-mediated fusion. This involves the prolonged mitotic arrest of cultured
human cells, using an inhibitor such as colchicine. Eventually, the nucleus breaks up into vesicles
containing individual chromosomes, which can be rescued as microcells comprising a nuclear vesicle
surrounded by a small amount of cytoplasm and a plasma membrane.

4)Explain the strategy of knock in giving an example.

Homologous recombination has also been used to exchange the coding region of one gene for that of
another, a strategy described as “gene knock-in”. This has been used, for example, to test the ability of
the transcription factors Engrailed-1
and Engrailed-2 to compensate for each other’s functions. Scientists replaced the coding region of the
engrailed-1 gene with that of engrailed-2, and showed that the engrailed-1 mutant phenotype could be
rescued. A more applied use of gene knock-in is the replacement of parts of the murine
immunoglobulin genes with their human counterparts, resulting in the production of humanized
antibodies in transgenic mice.

5)How can use intracytoplasmic sperm injection? Explain giving an example.

The injection of sperm heads directly into the cytoplasm of the egg can overcome infertility in
humans. It has been shown that sperm heads bind spontaneously to naked plasmid DNA in vitro,
suggesting that sperm injections could be used to achieve transformation. This was demonstrated by
scientists, who mixed mouse sperm with plasmid DNA carrying the gene for green fluorescent protein
(GFP). These sperm were injected into unfertilized oocytes, and a remarkable 94% of the resulting
embryos showed GFP activity.

6)Explain that technique known as restriction-enzyme-mediated integration.

219
[Metni yazın]

In this technique, known as restriction-enzyme-mediated integration (REMI), linearized plasmids

containing the transgene of interest are mixed with decondensed sperm nuclei and treated with limiting
amounts of a restriction enzyme to introduce nicks in the DNA. The nuclei are then transplanted into
unfertilized Xenopus eggs, where the DNA is repaired, resultingin the integration of plasmid DNA into
the genome. This technique allows the production of up to 700 transgenic embryos per person per day,
most of which survive at least to the swimming-tadpole stage.

7)How the effects mice and amphibian expressing growth hormone?

One of the early successes in transgenic mouse methodology was the expression
of rat growth hormone, resulting in transgenic mice up to twice the size of their non-transgenic
siblings. The role of growth hormone in amphibian metamorphosis has now been examined by
expressing Xenopus growth hormone in transgenic frogs. The transgenic tadpoles developed at the
same rate as control tadpoles, but typically grew to twice the normal size. After metamorphosis, the
transgenic frogs also grew much more quickly than controls and showed skeletal defects.

8)What is the fundamental difference between animals and plants in tissue cultures?

A fundamental difference between animals and plants is that organized, differentiated plant tissue
shows a high degree of developmental plasticity. Depending on the species, isolated stem segments
leaf disks, or seed-derived callus tissue may be able to regenerate an entire new plant under
appropriate culture conditions.

9)What is the tissue culture? Which tissues use generally for tissue culture?

Tissue culture is the process whereby small pieces of living tissue (explants) are isolated from an
organism and grown aseptically for indefinite periods on a nutrient medium. The usual explants are
buds, root tips, nodal stem segments or germinating seeds, and these are placed on suitable culture
media where they
grow into an undifferentiated mass known as a callus.

10)Why protoplasts are very useful for genetic manipulation?

Protoplasts are very useful for genetic manipulation for two reasons: first, several transformation
protocols have been developed that work specifically with protoplasts; and second, because under
certain conditions, protoplasts from similar or contrasting cell types can be fused to yield somatic
hybrids, a process known as protoplast fusion.

11)What is callus and which parts of plants can be used to form callus?

Callus is an undifferentiated mass derived from plant tissue. The usual explants are buds, root tips,
nodal stem segments or germinating seeds, and these are placed on suitable culture media where they
grow into an undifferentiated mass known as a callus.

12)What is the hormone, carbon source, organic sources in plant tissue cultures?

There are five main classes of plant hormones: auxins, cytokinins, gibberellins, abscisic acid, and
ethylene. Organic nutrients such as casein hydrolysate, coconut water or yeast extract may also be
required. Organic nitrogen source(one or more amino acids), and sucrose as a carbon source.

220
[Metni yazın]

Verimli Bitkilerin Rejenerasyonu Somatik Embriyogenezis Veya Organogenezis İle

Yapılabilir
Bitki hücrelerinin gelişimsel esnekliği, bir bitkinin tamamının, doku eksplantları, kallus, hücre
kültürü veya protoplastların uygun ortama aktarılması ile elde edilebileceği anlamına gelir. Yukarıda
belirtildiği gibi hücrelerin farklılaşmamış fazda kalmaları, fitohormonlar arasında doğru bir denge
kurulmasını gerektirecektir. Fakat gövde hücre kültürü için yalnızca sitokinin, kök hücre kültürü için
ise, yalnızca oksin hormonu gerekir. Bu sebeple; sitokinin hormonunun artan seviyesi kallusta gövde
oluşumunu, oksin hormonunun artışı ise kök oluşumunu uyarır.
Nihai olarak, küçük bitkicik (plantlet) ya gövde üzerindeki tomurcuklardan şans eseri oluşan
köklerden, ya da direkt kökün tabanındaki hücrelerin çoğalmasıyla meydana gelmiş gövde
tomurcuklarının gelişimi ile oluşur. Kallus üzerinde kök ve gövdenin oluşması “organogenezis”
olarak bilinir. Organogenezis için doku kültürü koşulları türler arası çeşitlilik göstermektedir ve henüz
her tip kallus için standart bir şart belirlenememiştir. Bahsedildiği gibi, köklerin ve gövdenin tesadüfi
gelişimi ile meydana gelen organogenezis, bir kallus oluşturma fazı yaşamaksızın gövde
segmentlerinde olduğu gibi, direkt olarak bitki dokularının herhangi bir kısmından organize olabilir.
Belli koşullar altında bazı bitki türlerinin kallus dokuları veya hücre süspansiyonları “somatik
embriyogenez” olarak isimlendirilen farklı bir süreç ile uyarılabilir. Bu süreçte hücreler,
fertilizasyondan sonra zigotun embriyonik safhaları oluşturmak için sergilediği paterne benzer bir
farklılaşma sürecine girer. Bu yapılar embriyo benzeri yapılardır fakat, iki üreme hücresinin
füzyonundan değil de, somatik hücrelerden oluşmaları bakımından normal embriyolardan ayrılırlar.
Bu embriyoidler, yapay besiyeri içerisinde fertil bitkilerde kök-gövde oluşumunun uyarılmasına gerek
kalmadan gelişebilirler.
Bitkinin hangi kısmının manipüle ve kültüre edileceğinin bilinmesi, yeni gen transfer tekniklerinin
geliştirilmesinde ve transgenik bitkilerin rejenerasyonunda pek çok fırsat sağlayacaktır.

221
[Metni yazın]

DNA, hücre kültürü, kallus, protoplast, doku eksplantları, gametler, tohumlar, zigot, embriyo,
veyahut da organlar bitkinin tamamına aktarılabilir ve DNA transfer sürecinin kendisinden ziyade
bu materyallerden tekrar fertil bitkinin oluşturulması, bitki genetik mühendisliğini sınırlayan bir
adımdır. Aynı zamanda hayvan hücre kültürlerinde olduğu gibi, rekombinant protein veya
metabolitlerin üretildiği transforme edilmiş bitki hücre hatlarının ya da dokularının oluşturulması,
ticari olarak önemli ürünler elde etmek için biyoreaktör olarak kullanılabilir.

Bitki Hücrelerine Gen Transferi İçin Dört Temel Strateji Vardır

Hayvan hücrelerinde olduğu gibi, bitki hücrelerine gen transferi de dört tip mekanizma ile
gerçekleştirilebilir:
a) viral transdüksiyon,
b) bakteriyal gen aktarımı,
c) fiziksel ve kimyasal DNA transferi.

222
[Metni yazın]

Hayvanlardaki durumun aksine, özellikle dikotil bitkilerde kullanılan Agrobacterium aracılı

bakteriyal gen transferi, yeni bir bilimsel gelişme sayılabilir. Daha sonra gelen en popüler metod,
tahıl gurubuna dahil ettiğimiz monokotil bitkilere gen transferinde kullanılan partikül
bombardımanı yöntemidir. Kimyasal transfeksiyon metotları ise; daha nadir kullanılır ve yalnızca
protoplastlara uygundur ve birçok bakımdan hayvan hücreleri ile benzerlik gösterir.
Bu sebeple, hayvan hücrelerine transfeksiyonda kullanılan kalsiyum fosfat transfeksiyonu gibi
birçok teknik, bitki protoplastlarına da uygulanabilir. Yukarıdaki her üç metot da hem geçici
ekspresyon hem de stabil transformasyon deneylerinde kullanılabilir. Bitki ve hayvan hücrelerine
gen transfer stratejileri arasındaki bir diğer önemli fark, doğal enfeksiyon döngülerinin bir
basamağında, bitki genomuna genetik materyallerini entegre edebilecek bilinen bitki virüslerinin
olmayışıdır. Fakat stabil transformasyon başarılamazken, bitki virüsleri sıklıkla bitkinin
tamamında rekombinant proteinlerin yüksek seviyede ve hızlı üretimine sebebiyet veren sistemik
enfeksiyonlara yol açarlar. Bunu ya normal enfeksiyon rotalarında ilerleyerek, ya da virüs
bulundurmayan konaklarda enfekte olmuş hücreleri aşılayarak yaparlar.

Agrobacterium Aracılı Transformasyon

Agrobacterium Tümör Oluşumunu

Uyaran Bir Bitki Patojenidir

Bakterilerden bitkilere gen transferi doğal

olarak gerçekleşir ve bu süreç “taç tümörü”
hastalığına sebep olur. Bu tümör
gimnospermlerde ve dikotiledon
angiospermlerde yaralanmış bölgelerin, gram
negatif bir toprak bakterisi olan
Agrobacterium ile inokülasyonları sonucu
oluşan bir bitki tümörüdür.
Bu hastalığa Agro’nun sebep olduğu
yaklaşık yüz yıl önce ortaya konmuştur. Taç
tümörü dokusunun onkogenik
transformasyona sebep olduğu gösterilmiştir.
Bakteri antibiyotikler ile öldürülse dahi,
kallusta tümör özellikleri saklı kaldığı için, in-
vitroda kültüre edilebilir.

223
[Metni yazın]

Tümör oluşturma özellikleri sağlıklı bir bitkiye aktarıldığında, doku kültüründeki kallusta,
normal hücrelerin in-vitro büyümesi için gerekli olan fitohormonların yokluğunda bile,
sınırlanamayan bir büyüme kapasitesi vardır. Bazı a.a kalıntıları, oktopin, nopalin gibi opinlerin
sentezi, normal bitki dokularında bulunmaz.

224
[Metni yazın]

Opin metabolizması taç tümörü hastalığının merkezi düzenleyicisidir. Bitki hücresinin Agro
ile muamele olması üzerine bitkide, opin sentezi başlar. Üretilen opinin tipi, konak bitki ile değil,
bakteriyal suş ile alakalıdır. Genellikle bakteri, opini karbon ve nitrojen kaynağı olarak kullanır.
Böylelikle, tümör oluşturmak için oktopin kullanan bakteri oktopin, nopalin kullanan bakteri ise
nopalin sentezi yapar.

Ti-plazmidi Tarafından Tümör Oluşumunun Uyarılması Yeteneği Yalnızca Virülent

Agrobacterium Suşlarında Bulunmuştur
Agrobacterium’un varlığı, bitkinin transforme halini sürdürmek için gerekli değildir.
Bakteriden bitkinin yaralanmış bölgesine “tümör oluşumunu indükleyici” bir parça aktarıldığı
açıktır. Zeanen ve ark., ilk kez 1974’te Agrobacterium’un virülent suşlarının 140-235 kbç’lik
geniş plazmidleri barındırabildiğini öne sürmüşlerdir. Oktopin veya nopalin kullanan çeşitli suşlar
arasında bu tip plazmidlerin aktarımı oluşan virülans etki, opin sentezinin uyarılması ve opinin
kullanılmasının, tamamen plazmid kaynaklı özellikler olduğunu göstermişlerdir. Bakterinin
taşıdığı plazmid ile ilgili bu özellikler kaybedilebilir. Aynı zamanda da, konjugasyon ile aktarılan
bir plazmid vasıtasıyla bu özellikler avirülent bir suşa da kazandırılabilir. Bu yüzden bu plazmidler
“tümör indükleyici plazmidler” (Ti plazmidleri) olarak bilinmeye başlanmıştır.
Ti plazmidleri, transforme edildikleri bitki dokusunda sentezlenen ve bakteri tarafından kullanılan
opin tiplerine göre sınıflandırılır. Oktopin grubu plazmidler birbirleriyle yakından ilişkili iken,

225
[Metni yazın]

nopalin grubuna ait olan diğerleri, birbirlerinden oldukça farklıdır. Gruplar arasında, tümör
oluşumunun dışında diğer sorumlu genleri içeren, homoloji gösteren dört bölge vardır.

Şu belirtilmelidir ki, Agrobacterium’da bir plazmidin varlığı, o suşun virülent olduğu

anlamına gelmez. Birçok suş, virülans etki oluşturmayan çok geniş kriptik plazmidler taşır ve bazı
doğal izolatlarda kriptik plazmid bir Ti plazmidi ile birlikte bulunur.

DNA’nın Kısa Bir Parçası (T-DNA) Bitki Genomuna Transfer Olur

Ti plazmid DNA’sının tamamı değil, fakat yaklaşık 23 kbç’lik bir kısmı bitkinin tümör
hücrelerindeki nüklear DNA’nın rastgele herhangi bir kısmına entegre olur. Bu DNA parçası “T-
DNA” (transfer DNA) olarak isimlendirilir ve transformasyonu gerçekleştirilen dokuda hem opin
sentezleme hem de kontrolsüz büyüme yeteneği sunan genler taşır.
Fakat bu genler, gen transferi için zorunlu değildir ve yabancı DNA parçası ile değiştirilebilirler.

Nopalin tipi plazmid T-DNA sekanslarının yapısı ve organizasyonu genellikle basittir. Tek bir

bütünleşik segmentleri vardır. Tam tersi oktopin tipi T-DNA ise, tümör oluşumu için gerekli

genler (TL), ve opin sentezi için gerekli genler (TR) olmak üzere iki segmentten oluşur. Bu iki

segment bitki genomuna bağımsız olarak aktarılır ve aktarım genomda çoklu kopyalar şeklinde var

olabilir. Bu durumun getirdiği ek karmaşıklığın önemi açıklığa kavuşturulamamıştır.

Ti plazmidinde T-DNA bölgesi 25 bç’lik çok mükemmel olmayan tekrar dizileri ile çevrilidir ve

bu tekrarlar sınır sekanslar olarak bilinir. Oktopin ve nopalin plazmidlerinin her iki tipinde de bu

bölgeler korunmuştur. Sınır sekanslar, bitki genomuna bozulmadan aktarılmaz fakat transfer

sürecinde yer alırlar. İzole edilen bitki genomik DNA’sındaki bağlantı bölgelerinin analizi T-DNA

226
[Metni yazın]

entegrasyonunun sınır bölgelerin arasında son bulduğunu göstermiştir. Sağ sınır daha tam ve

kararlı olmasına rağmen sol bağlantı sınırı yaklaşık yüz nükleotid değişebilir.

Sağ sınırdaki tekrar dizilerinin delesyonu T-DNA transferini sekteye uğratır. Fakat sol sınırla
alakalı bu tip bir durum olmadığından, şaşırtıcı şekilde bu kısmın çok da zorunlu olmadığı
anlaşılır. Sağ sınırdaki tekrar dizilerin yalnız başına kullanıldığı deneylerde bu kısımların bir
enhancer olarak davrandığı gösterilmiş ve “overdrive sekans” olarak isimlendirilen tekrar diziye
göre daha dışta yer alan bu sekansın yüksek etkinlikte transfer için de gerektiği saptanmıştır. Sol
sınır tekrar dizisi ise yalnız başına düşük transfer aktivitesi sergiler.
T-DNA transferinden sorumlu genler Ti plazmidinde, virülans bölge olarak adlandırılan bir
bölgede yer alırlar. Bu genlerden virA ve virG, bazal seviyede sürekli ekspreslenir ve bitki
tarafından uyarılabilecek diğer vir genlerinin aktivasyonunu kontrol ederler. VirA bakteriyal
membranın iç kısmında köprü kurmuş bir kinazdır ve bitki yaralandığı durumda, o bölgeden
salınan bazı fenolik bileşikler için reseptör molekül olarak hareket eder. Ti plazmidinde bulunan
bu bileşenlerin birçoğu karakterize edilmiştir, fakat özellikle asetosringon, laboratuvar
çalışmalarında vir gen ekspresyonunu uyarmak için en yaygın kullanılan bileşendir.

Asetosringon gibi fenolik bileşikler, bakteriyi yaralanmış bitki hücrelerine doğru çekmez.
Buna nazaran bakteri, a.a’lar veya şeker gibi basit moleküllere cevap verir ve bakterinin bitki
hücrelerine tutunmalarından sonra vir genleri uyarılır. Birçok şeker molekülü vir gen
ekspresyonunu arttırmak için fenolik sinyallerin hareketi üzerinde sinerjistik bir etki oluşturur.
Aktive olan virA, diğer vir genlerinin transkripsiyonel aktivatörü olan virG proteinini fosforile
eder. virA ve virG proteinleri bakteride yaygın olan iki bileşenli regülatör sistemleri ile benzerlik
gösterir. VirG’ye ek olarak, bakteriyal kromozom üzerindeki bazı genler de vir gen ekspresyonunu
düzenleyen transkripsiyon faktörlerini (TF) kodlar.

227
[Metni yazın]

Vir gen ekspresyonunun uyarılması, T-DNA’nın bitki hücresine aktarımını sağlayan

konjugatif pilusu oluşturan proteinlerin sentezlenmesi ile sonuçlanır. Pilus bileşenleri virB
operonundaki genler tarafından kodlanır.
DNA transferi virD1 ve virD2 gen ürünlerinden oluşan bir endonükleaz ile başlatılır. Bu
enzim, tek iplikçikte kırıklar oluşturur veya 25 bç’lik T-DNA sınır sekanslarında çift iplikte
kırıklar meydana getirir. Bu süreç virC12 ve virC2 proteinleri tarafından hızlandırılır. Bu
proteinler enhancer elementini tanır ve buna bağlanırlar. virD2 proteini ise bu süreçte T-DNA’ya
kovalent olarak bağlı kalır. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda, Ti plazmidinin tipine bağlı
olarak tek ya da çift zincirli T-DNA oluştuğunu öngörmüştür. Çift zincirli T-DNA nopalin
plazmidlerinde bulunurken, T-strand olarak isimlendirilen tek iplikçikli T-DNA ise oktopin ve
suksinopin plazmidlerinde vardır ki bu bölgelerde T-DNA komşu olmayan bölümlere ayrılmıştır.
T iplikçikleri, tek iplikli DNA bağlanma proteini olan virE2 proteinine sarılıdır. Kompleksin
tamamı bazen görünümünden ötürü “fire cracker complex” olarak adlandırılır. Ardından bu
kompleks pilus ile bitki hücresine transfer edilir. VirD2 proteininin T-DNA’yı bitki hücresinin
nükleusuna oradan da bitki genomuna entegre oluncaya kadarki sürede nükleaz ataklarına karşı
koruduğu iddia edilmiştir. Bu protein T-DNA’yı etkilemede temel bir rol oynadığı düşünülen C
terminal sinyali ile birlikte iki farklı nüklear lokalizasyon sinyali taşır.
Yaralanmış bitki hücrelerinin nükleusunun yaralanma bölgesine yakın olan sitozolik membran
ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Bu veri de T-DNA’nın sitozole aktarılmadan direkt nükleusa
transfer edilebileceğini önerir. T-DNA’nın nükleusa vardığında muhtemelen doğal olarak
meydana gelen kromozom kırıklarını kötüye kullanarak uygun olmayan bir rekombinasyon ile
genoma entegre olduğu düşünülür.
Agro gen transfer sistemi, bakteriyal konjugasyonun bir formudur. Birçok geniş konak
spektrumlu plazmid, kendi mobilizasyon fonksiyonlarını ve konjugasyon sitemlerinde yaygın
olarak bulunan birçok bileşeni kodlayan vir genleri ile Agrobacterium’dan bitki genomuna transfer
edilebilir. Bitkilere ek olarak Agrobacterium bakteri, maya ve flamentöz mantarlara da DNA
transfer edebilir. Son zamanlarda Citovsky ve ark., tarafından ortaya konulan gen transfer
mekanizması, Agrobacterium’dan, insan hücre kültürlerine gen transferinin mümkün olduğunu
göstermektedir.

Ti Plazmid Kalıntıları Bitkiye Gen Transfer Eden Vektörler Olarak Kullanılabilir

T-DNA bölgesinin haritası, tümör morfolojisini etkileyen spontane veyahut da transpozonlar
tarafından oluşturulan mutantların çalışılması ile elde edilmiştir. Bu mutantlar, gövdemsi veya
kökümsü yapılar oluşturan, normalden büyük tümörler ile karakterizedir. Normal tümörler, oksin
veya sitokinin içermeyen mediumlarda büyüyebilmesine rağmen aslında oluşan tümör, bu
hormonları yüksek düzeyde ihtiva etmektedir.

228
[Metni yazın]

Bu sebeple Ooms ve ark., T-DNA bölgesinde bulunan onkogenlerin kodladığı ürünlerin

fitohormon sentezinde yer aldığını, ve kallusta bulunan hormon oranlarının dengesinin
bozulmasının, T-DNA mutantlarındaki bu anormal morfolojiden kaynaklandığını öne
sürmüşlerdir. T-DNA genlerinin klonlanması ve fonksiyonel analizi, oksin biyosentezinde görevli
enzimler bakımından mutant olan organizmaların “shooty” fenotip sergilerken, “rooty” fenotip
sergileyenlerin; sitokinin üretimi ile alakalı mutantlar olduklarını doğrulamıştır. Bazı genlerin
fonksiyonları hala bilinmezken, diğer genlerin opin sentezi ile ilgili oldukları belirlenmiştir.

Bir Nopalin Ve Bir Oktopin Plazmidinden Elde Edilen T-DNA’ların Transkripsiyon

Haritaları
İlginç bir şekilde, sekans analizleri T-DNA bölgesindeki genlerin, promotor elementi ve
poliadenilasyon bölgesi bulundurmaları bakımından, ökaryotik bir tabiatta olduklarını ortaya
çıkarmıştır. Bu da, bakteriyal kökenli bir plazmidden gelen genlerin,bitki hücresine transfer
edildiğinde nasıl olup da sorunsuz bir biçimde ekspreslendiğini açıklar.
Bu durum Ti-plazmidinin, evolüsyonel süreç içerisinde bu sekansları bitki genomundan aldığı
ihtimalini doğurur. Agro’nun çok geniş bitki gruplarında tümör oluşumunu uyarması, oktopin ve
nopalin sentaz genlerinin promotorları vasıtasıyla, trans gen ekspresyonunu olanaklı ve kolay
kılar.

229
[Metni yazın]

Ti-plazmidinin, genetik mühendisliği yapılmış bitki hücreleri için doğal bir vektör olduğunu,
çünkü T-DNA’sını bakteriden bitki genomuna aktarabildiğini gördük. Fakat yabani tip Ti-
plazmidleri, genelde vektör adayı olmaya uygun değillerdir, çünkü T-DNA’nın içerdiği
onkogenler, transformasyon için hazırlanan bitki hücrelerinin büyümesinde organizasyon
bozukluklarına yol açar.
Bitkileri etkili bir biçimde yeniden elde edebilmek için, non-onkogenik olarak manipüle
edilmiş vektörler kullanılmalıdır. Bu basitçe T-DNA bölgesindeki tüm onkogenler silinerek
başarılabilir. Örneğin; Zambryski ve ark., pTiC58 plazmidinin T-DNA bölgesinin neredeyse
tamamını (sağ-sol sınırlar ve NOS bölgesi hariç) pBR322 sekansı ile yer değiştirdiler ve oluşan
yapıyı pGV3850 olarak adlandırdılar.

230
[Metni yazın]

Bu şekilde T-DNA’sı modifiye edilmiş plazmidi taşıyan Agro bitkiye transfer edildiğinde
beklenildiği gibi hiç tümör hücresi oluşmadı, fakat gerçek şu ki hücreler nopalin üretimi
bakımından taranıp pozitif bulunduğunda transfer kanıtlanmış oldu. Eğer uygun fitohormonlar
sağlanabilirse kallus dokusu bu nopalin pozitif hücrelerden kültüre edilebilir ve gelişmiş fertil
bitkiler bitkiciklerin hormon muamelesi ile elde edilmiş olur.
T-DNA’nın modifiye edilmesi ciddi bir adımdır. Fakat transfer sonucu tümör oluşumunun
meydana gelmemesi, gen aktarılmış bitkilerin teşhisi için alternatif metotlar kullanmayı gerekli
kılmıştır. Yukarıda bahsedilen deneyde opin sentezi taranabilir bir fenotip olarak kullanılmış ve
bundan sonra oktopin ve nopalin sentaz genleri taranabilen markerlar olarak kullanılmaya
başlanmıştır.
Fakat; sistemle alakalı özellikle potansiyel transformantlar üzerinde enzimatik deneylerin
gerçekleştirilebilmesi bakımından pek çok kısıtlama vardır. Trans gen aktarılmış bitki hücrelerinin
tespitini kolaylaştırmak adına, T-DNA bölgesine dominant selektif markerlar insert edilir. Böylece
bitkiler herbisit veya ilaç direnci bakımından seçilir.

T-DNA’ları Bakımından Farklı Binary Vektörler Ve T-DNA Transferi İçin Gerekli

Genler Transgenlerin Küçük Plazmidlere Klonlanmasını Sağlar
Modifiye edilmiş yabani tip Ti plazmidi türevleri transformasyonda kullanılmış olmasına
rağmen özellikle deneysel ve gen vektörleri için pek uygun değillerdir. Çünkü geniş ebatları
231
[Metni yazın]

onların in-vitro manipülasyonlarını kısıtlamaktadır. Ayrıca, T-DNA üzerinde tek bir restriksiyon
endonükleaz bölgesi yoktur. Başlangıçta bu problem “co-integrate” vektörlerin yapılandırılması
ile çözülmeye çalışıldı. Atasal bir Ti plazmidinden elde edilmiş T-DNA daha kolay bir
manipülasyon için geleneksel bir E. coli plazmidine sub-klonlama yapıldı ve aracı vektör
dediğimiz bir yapı oluşturuldu.
Bu vektörler Agro’da replike olabilme yeteneğinden ve konjugasyon özelliğinden
yoksundular. Transfer, üç farklı bakteriyel suş karıştırılarak “triparental eşleşme” yöntemi ile
başarıldı. Bunlar;
a) Aracı vektörü trans şeklinde yerleştirecek olan, yardımcı bir plazmid taşıyan E.coli suşu.
b) Rekombinant aracı vektörü taşıyan E.coli suşu.
c) Ti plazmidi taşıyan Agrobacterium.
Yardımcı plazmidi taşıyan E.coli, aracı vektörün taşıyıcısı olan E.coli suşuna konjugasyon ile
transfer edildi. Ardından homolog rekombinasyon ile oluşan mobilize vektör de konjugasyon ile
Agrobacterium suşuna transfer edildi. Ti plazmidinin T-DNA’sı ile aracı vektör arasında meydana
gelen homolog rekombinasyon büyük bir “co-integrate” plazmid oluşturdu ve bu plazmid
vasıtasıyla T-DNA bitki genomuna aktarıldı.

Co-entegre vektör sisteminde rekombinant T-DNA’nın kararlılığı rekombinasyonun kalitesine

bağlıdır. Eğer T-DNA bölgesinde pBR322 plazmidinden bir segment taşıyan pGV3850 Ti

232
[Metni yazın]

plazmidinde olduğu gibi iki plazmid arasındaki homoloji yüksek ise rekombinasyonun kalitesi
arttırılabilir.
Aracı moleküller sıklıkla kullanılmasına rağmen; yüksek orandaki co-entegrasyonlar
transformasyonlar için gerekli değildir. Ti plazmidinin vir genleri, trans fonksiyon gösterir ve
aynı hücredeki herhangi bir T-DNA sekansı üzerine etki eder. Bu sebeple vir genleri ve trans geni
taşıyan modifiye edilmiş T-DNA, ayrı plazmidlerde yer alır. Bu durum, binary verktörlerin temel
prensibini oluşturur.
T-DNA kolay manipüle edilebilmesi için küçük bir E.coli plazmidine sub-klonlama
yapılabilir. “mini-Ti” veya “micro-Ti” olarak isimlendirilen bu plazmid, T-DNA bölgesi
uzaklaştırılmış bir Ti plazmid taşıyan Agro suşuna aktarılabilir. Trans organizasyonda yerleşen vir
genleri, rekombinant T-DNA’yı bitki genomuna aktarmada fonksiyon gösterir T-DNA’yı taşıyan
plazmid Agro’ya ya triparental eşleşme ile veya elektroporasyon gibi daha basit bir prosedür ile
aktarılabilir.
Birçok modern Ti plazmid transformasyon sistemi binary vektör prensibine dayanır. Bu
sistemde T-DNA, hem Agro’da hem E.coli’de fonksiyon gösterebilen RK2 vektörü gibi geniş
konak spektrumlu replikasyon orjinine sahip bir vektörde veya, her tür için ayrı replikasyon orjini
olan shuttle vektörlerde yer alır. Bağımsız biçimde replike olabilen bir vektör avantajlıdır, çünkü
T-DNA’nın stabilizasyonu rekombinasyona bağımlı değildir ve transformantların tespitini daha
kolay kılan binary vektörün kopya sayısı Ti plazmidi tarafından belirlenmez.
Bakteriyel klonlama plazmidlerinin tüm kolaylıkları binary vektörlere bahşedilmiştir: Örneğin;
sub-klonlama yapabilmek için T-DNA bölgesindeki çoklu RE kesim bölgeleri, mavi-beyaz koloni
seleksiyonu için lac-Z geni, cosmid kütüphaneleri hazırlamak için ƛ cos bölgesi.

233
[Metni yazın]

Bu plazmid 5 kbç’den daha küçük bir ebattadır ve T-DNA bölgesi içinde 18 farklı RE bölgesi
bulunur. Çünkü T-DNA tamamen sentetiktir. Rekombinantların seçimi için bir lacZ geni taşır ve
hem bakteri hem de gen aktarılmış bitkide kullanılabilecek seçici bir marker taşır. Plazmidin
ebatındaki küçülme, Agro’da replike olabilmek için gerekli genlerin uzaklaştırılmasını ve bu
genlerin bakterinin genomuna veyahut da yardımcı bir plazmide aktarılmasını mümkün kılacaktır.
Örneğin pGreen plazmidi, daha geleneksel olan Ri ve RK2 plazmidlerinin replikasyon orjininden
daha küçük bir replikasyon orjini içerir. Dahası, bakteri içindeki pSoup olarak isimlendirilen
ikinci bir plazmid replikaz geni taşır ve tüm konjugasyon fonksiyonları uzaklaştırıldığı için bu
plazmid Agro’ya yalnızca transformasyon ile aktarılabilir.

Birçok Dikot Organizmada Basit Bir Deneysel Protokol İle Agrobacterium Aracılı
Transformasyon Gerçekleştirilebilir
Modifiye edilmiş ve istenen tipte seçilebilen T-DNA vektörlerinin bulunmasından sonra bitkilere
DNA transfer metotlarında bir patlama olmuştur. Özellikle dikot bitkilere gen transferinde Horsch
ve ark., basit genel bir protokolü, üzerinde minör değişiklikler yaparak kullanmıştır.

234
[Metni yazın]

Orijinal prosedürde, yapraklardan kesilen birkaç mm çapındaki küçük diskler sterilize edilir ve
rekombinant T-DNA’nın bulunduğu Agro ihtiva eden besiyerine aktarılır. Kimerik neomisin
fosfotransferaz genini bulunduran yabancı DNA, kanamisin antibiyotiğine direnç sağlar. Diskler
iki gün boyunca kültür edilir, neomisin genini seçmek ve Agrobacterium’u öldürmek için
sırasıyla kanamisin ve karbenisilin içeren besiyerine aktarılır. 2-4 hafta sonra gelişen sürgünler
kallustan kesilir ve kök oluşumunu tetikleyen besiyerine transfer edilir. İnökülasyondan 4-7 hafta
sonra, köklenen bitkicikler toprağa aktarılır.
Bu metod, basit ve diğer metodlara kıyasla hızlı olması bakımından avantajlıdır ve protoplast
kökenli kallustan rejenerasyonu sağlayan önceki metodlardan daha üstündür. Her türe özgü
optimum eksplantlar belirlenmiş olmasına rağmen, Solanaceae familyasından birçok bitki için
modern Agro-aracılı transformasyon, yaprak-disk protokolünde küçük varyasyonlar yapılarak
gerçekleştirilir.

Monokotlar Başlangıçta Agrobacterium Aracılı Transformasyon İçin İnatçı

Organizmalardı Fakat Şu Anda Tahılların Birçok Çeşidine Bu Yolla Gen Transferi
Mümkündür
1990’ların ortalarına kadar birçok monokot bitkinin Agrobacterium’un konak aralığı dışında
olduğu düşünülüyordu. Bu da araştırıcıları alternatif transfer metodlarının geliştirilmesine
yönlendirdi. 80’lerde bazı monokotların Agro enfeksiyonuna hassas olduklarını gösteren sınırlı
sayıda kanıt vardı. Ama laboratuvarda kuşkonmaz ve tatlı patates / hint yer elması gibi bazı
monokotlarda tümör oluşumunun uyarılabildiği kanıtlandı.
İkinci durumda deneyin başarısı için önemli bir faktör de; Agro süspansiyonunun patates
yumrularının yaralanmış bölgeleri ile ön muamelesi idi. O dönem monokotlarda Agro
enfeksiyonunun yetersiz olduğu tartışıldı. Çünkü yaralanmış monokot dokuları asetosringon gibi
vir gen ekspresyonunu uyarıcı fenolik bileşikleri yeteri derecede salgılamıyordu.
Fakat sonunda araştırıcılar en azından bazı monokotlarda çalışmak üzere modifiye edilmiş kültür
koşulları ve transformasyon prosedürleri geliştirmeye başladılar. Pirince gen transferi 90’ların
başlarında başarılmasına rağmen; rejenerasyon sistemi ile seleksiyon sekteye uğradı ve çok az
sayıda transgenik bitki üretilebildi. Higromisine direnç sağlayan alternatif bir marker kullanımı,
çok sayıda transgenik pirinç bitkisinin rejenerasyonuna izin verdi ve aynı seleksiyon stratejisi
pirincin diğer önemli alt türleri için de kullanıldı. Yakın geçmişte etkili Agro-aracılı gen transferi
mısır, buğday, arpa ve şeker pancarı için de mümkün oldu.
Tahıllara Agro-aracılı gen aktarımındaki buluşlar monokotlara etkili enfeksiyon ve etkili gen
transferi için gerekli birçok anahtar faktörün tanımlanmasını sağladı. Embriyo ve apikal meristem
gibi yüksek oranda aktif ve bölünebilen hücreler içeren eksplantların kullanımı transformasyonun
etkinliğini iyice arttırdı. Çünkü DNA sentezi ve hücre bölünmesi, exogen DNA’nın
entegrasyonunu kolaylaştırıyordu. Monokotlardaki yaralanmış bölgeler ligninleşmeye eğilimli

235
[Metni yazın]

iken dikotlarda hücre bölünmesi sıklıkla yaralanma ile uyarılır. Bu leaf disk metodu gibi
geleneksel metodların monokotlarda neden yetersiz olduğunu açıklar. Hiei ve ark., Agro ve pirinç
embriyolarının 100 Mm asetosringon varlığında co-kültivasyonunun başarılı bir transformasyon
için kritik faktör olduğunu ortaya koymuşlardır. Ayrıca fonksiyonları arttırılmış vektörlerin
kullanımıyla, transformasyonun etkinliği, daha da arttırılabilir.
VirG ve/veya virE1 gibi T-DNA transferini sınırlayan en önemli faktörlerin ekspresyonunun
arttırılması ile Agrobacterium’un arttırılan virülansı sayesinde AGL-1 gibi süpervirülant olarak
isimlendirilen bakteriyal suşlar oluşturulur. Komari ve ark., süper virülant suş A281’in Ti-
plazmidinin virülans bölgesinin bir parçasını T-DNA taşıyan bir plazmide transfer etmiş ve süper
binary vektör olarak adlandırılan yeni bir vektör oluşturmak gibi farklı bir strateji izlemişlerdir.
Bu sonraki tekniğin avantajı süper binary vektörün herhangi bir Agro suşunda kullanılabilir
olmasıdır.

Binary Vektörler Büyük DNA Parçalarını Bitki Genomuna Aktarmak İçin Modifiye
Edilmişlerdir
DNA transferindeki parça büyüklüğünün üst limiti tam olarak tespit edilememiştir. 50 kbç’lik
fragmentler transfer edilebilir. Fakat standart vektörler kullanılarak 30 kbç’den büyük insertlerin
transferi zordur. Çünkü bu fragmentlerin bakteriyal konaktaki stabilizasyonları güçtür. Çok büyük
genlerin analizi veya bir metabolik yolun enzimleri gibi aktif sekansları kodlayan çoklu genlerin
transferi E.coli’de kullanılan yapay kromozom vektörlerine dayalı yüksek aktarım kapasitesine
sahip vektörlerin geliştirilmesi ile başarılabilmektedir.
Bunlardan ilk tanımlanan BIBAC2’idi. Bu vektör F plazmid replikasyon orjini taşır ve BAC
üzerinde modellenmiştir. Vektör, tütüne yüksek etkinlikte transforme edilmiş fakat büyük insert
kullanıldığından transformasyonun etkinliği oldukça düşmüştür. Bu deneyde vektör, T-DNA
sınırları ile çevrili 150kbç’lik insan DNA’sının tütün bitkisine aktarılmasında kullanılmıştır.
P1 yapay kromozomu üzerinde modellenmiş P1 replikasyon orijini taşıyan alternatif bir vektör
(PAC) Liu ve ark., tarafından oluşturulmuştur. Bu transformasyon için kompetent olan bakteriyal
yapay kromozom (TAC) 80 kbç’ye kadar olan genomik DNA’nın Arabidopsis’e aktarılmasında
kullanıldı ve büyük insertler aktarılırken bir etkinlik kaybı olmasına rağmen birçok transgenik
bitki oluşturulabildi. Tüm vektörler bakteride kullanılmak üzere bir kanamisin direnç geni ve
transgenik bitkilerin seçiliminde kullanılmak üzere bir higromisin geni taşıyorlardı.
Yüksek kapasiteli binary vektörlerin pozisyonel gen klonlanmasındaki en cazip
kullanımlarından biri mutasyonla tanımlanmıştır. Büyük DNA segmentlerinin etkili bir şekilde
bitki genomuna aktarılabilmeleri, genetik haritalama ve sekanslama arasındaki boşlukta köprü
görevi görür. Mutant genlerin aralarındaki boşluk tamamlanarak daraltılmış olur. Birçok bitki için

236
[Metni yazın]

BIBAC2 ve TAC vektörleri kullanılarak genomik kütüphaneler oluşturulmuş ve çok sayıda yeni
gen izole edilmiştir.

Agrobacterium rhizogenes Bitki Köklerinden Gen Transferini Olanaklı Kılar

ve Hairy-Root Formunda Kültürler Oluşturur
A. rhizogenes bitkide saçak kök hastalığı oluşturur ve bu A.tumefaciens’teki Ti plazmidlerine
homolog olan Ri plazmidleri tarafından uyarılır. Ri T-DNA genleri A.tumefaciens’teki aaM ve
iaaH genlerine homolog genleri barındırır. Ri T-DNA’daki rol genleri olarak isimlendirilen diğer
dört gen kök lokuslarında yer alır. Bunlardan rol B ve rol C indol ve sitokinin N-glukozidazları
hidrolizleyen P-glukozidazları kodlar. Bu sebeple A. rhizogenez’in, inaktif veya daha az aktif
konjugatif formlardaki serbest hormonları salarak bitkinin fizyolojisini değiştirdiği görülmüştür.
Ri plazmidleri, vektör geliştirilmesi noktasında ilgi alanı olmuştur. Çünkü opin sentezleyen
kök dokusu birçok dikot bitkide, Ri plazmidleri tarafından uyarılır ve böylece besiyerindeki
fitohormonların manipülasyonu ile bitkinin tamamı yeniden oluşturulabilir. Ri T-DNA’sı bu
bitkilere seksüel olarak aktarılır ve morfolojik ve fizyolojik birçok parametreyi etkilemesine
rağmen genel manada zararlı değildir. Ri ve Ti plazmidleri bu açıdan benzerdir.
Transforme olmuş kökler saçak kök kültürlerinde bekletilebilir. Bu kültürler, süspansiyon
kültürlerden daha fazla miktarlarda bazı değerli sekonder metabolitleri üretme potansiyeline
sahiptirler ve genetik açıdan da daha kararlıdırlar. Bu kültürlerde ticari kullanım açısından en
önemli sınırlama; ölçek büyütmedeki zorluklardır. Çünkü her kültür, ara formda ve düzensiz
dağılım gösteren heterojen bir dokudan oluşmuştur.
Modifiye olmuş Ti plazmidlerinin içeriğini açıklayan prensiplerin çoğu, Ri plazmidlerine de
uyarlanabilir. Bu bağlamda, bir co-entegrativ vektör sistemi geliştirilmiş ve transgenik legüme
bitkilerindeki nodülasyon çalışmalarında kullanılmıştır. Saçak kök hastalığını oluşturan Ri
plazmidi Arabidopsis ve havuç hücre kültürlerinde co-transfer edilmiş rekombinant T-DNA için
bir transformasyon markeri olarak iş görür ve sağlam bitkilerin rejenerasyonunu sağlar. Bu
plazmid kombinasyonunda antibiyotik direnç markerına ihtiyaç yoktur.

Bitkilere Direkt DNA Transferi

Gen Aktarılmış Protoplastlardan Transgenik Bitki Elde Edilebilir

Protoplast transformasyonu genellikle hayvan hücre transfeksiyonunda yaygındır.
Protoplastlar başlangıçta dışarıdan DNA almak için yönlendirilir, ardından transfekt olmuş hücre
oranında DNA genoma entegre olur. Protoplast membranı üzerinden yapılan gen transferi bir çok
kimyasal ile sağlanır. PEG basit transformasyon deneylerine uyum sağlaması bakımından en
yaygın kullanılanıdır.

237
[Metni yazın]

Alternatif olarak DNA’nın hücreye alınımı elektroporasyon ile gerçekleştirilebilir. Hayvan

hücrelerinde olduğu gibi seçici marker genin aktarılacak olan gen ile birleştirilmesi stabil
transformantların tanımlanması için gereklidir. Bu hem markerı hem de ilgili trans geni taşıyan
plazmid vektörler kullanılarak başarılabilir. Fakat ayrı vektörlerin kullanılması yüksek sıklıkta co-
transformasyon ile sonuçlanır.
Olası transformantlar seçici besiyerine aktarılır ve sağlam protoplastlar hücre duvarlarını
yenileyerek kallus oluşturmak üzere bölünmeye başlarlar. Manipüle edilmiş kültür koşulları, kök
ve gövde gelişimini uyararak fertil transgenik bitkilerin oluşumuna hizmet eder.
Protoplast transformasyonunun en önemli sınırlaması, gen transfer sürecinin kendisi değil,
konak türlerin protoplastlardan tekrar rejenere olma kabiliyetidir. Dikot bitkilerin bu süreçte
aktarılan genin kabulü noktasında monokotlara göre daha kolay cevap verdikleri ile ilgili genel
bir kanı vardır. Rejenerasyonun mümkün olduğu türlerde bu tekniğin protoplastların dondurularak
rejenere olma potansiyellerini kaybetmeyecek şekilde korunabilmesi gibi avantajları vardır.
İlk transformasyon deneyleri protoplasttan bitkiye rejenerasyonun iyi analiz edildiği tütün ve
petunya gibi türler üzerinde denenmiştir. İlk örnek nptll marker genini ve antosiyanin
biyosentezinde görevli, mısır dihidroquercetin 4-redüktaz genini kodlayan cDNA’yı taşıyan bir
plazmid vektör oluşturan Meyer ve ark., tarafından ortaya konulmuştur. Trans gen güçlü ve
sürekli ekspres olan CaMV35 promotorunun altında yer almıştır.
Beyaz petunya bitkilerinin mutant protoplast suşu, elektroporasyon yöntemi kullanılarak
rekombinant bir plazmid ile transforme edilmiş ve kanamisinli besiyerinde seçilim yapılmıştır.
Birkaç gün sonra hayatta kalan protoplastlar tüm bitkiyi oluşturma potansiyeline sahip
“microcalli”yi meydana getirirler. Bu bitkilerden üretilen çiçekler beyaz yerine kiremit kırmızı
olmuş bu da mısır cDNA’sının genoma entegre olduğunu ve ekspreslendiğini göstermiştir.
Model dikot bitkiler kullanılarak yapılan başarılı deneylerden sonra protoplast
transformasyonu alternatif gen transfer sistemleri olmayan monokotlarda da denendi. Bu tip bir
çalışma ilk kez buğday ve İtalyan çimi Lolium multiforum’da yapıldı ve başarılı bir protoplast
transformasyonu ile transgenik kallus oluşturuldu. Fakat bu kallustan transgenik bitki
oluşturulması mümkün olmadı.
Birçok monokotta protoplastlardan rejenerasyon kabiliyetinin olmaması farklılaşmış
hücrelerin doku kültür koşullarına uyum sağlama yeteneklerini kaybettiklerini yansıtır. Tahıl ve
çimlerde, protoplast kaynağı olarak embriyonik süspansiyon kültürleri kullanılıp, transferde belli
bir noktaya kadar iyileştirme sağlanmıştır. Buna ek olarak birçok monokot türü kanamisine doğal
olduğu için başlangıçta yapılan deneylerde kullanılan nptII marker, higromisin veya
fosfoinotrisine direnç sağlayan alternatif markerlarla değiştirilmiştir.

238
[Metni yazın]

Bu modifikasyonlarla bazı pirinç ve mısır çeşitlerinden makul etkinlikte transgenik bitkilerin

rejenerasyonu mümkün olmuştur. Fakat rejenere olmuş bitkilerde sıklıkla sterilizasyon veya
fenotipik anomalilere yol açan uzun süreli doku kültürü adımı arzulanan bir durum değildir.
Ayrıca protoplast transformasyonu yüksek yapılı bitkilerin kloroplast genomuna gen transferi için
geliştirilen ilk metottur. Bu bölümde ribozom yapısındaki değişikliklerle antibiyotiklere tolerans
oluşturan plastid mutasyonları transformantların seçimi için kullanılan bakteriyal antibiyotik
direnç genlerine alternatif olarak kullanılabilirler.

Partikül Bombardımanı Çok Sayıda Bitki Türünde Transformasyon İçin

Kullanılabilir
1987’de bitki transformasyonu için modifiye edilmiş shot-gun tekniği kullanan alternatif bir
prosedür geliştirildi. Başlangıç olarak kurulan test sisteminde sağlam soğan epidermis hücreleri
tungsten parçacıkları ile kaplı TMV ile bombardıman edildi.
Bombardımandan 3 gün sonra soğan hücrelerinin yaklaşık %40’ı partikülleri aldı ve aynı
zamanda TMV replikasyonunu da gerçekleştirdi. CaMV promotorunun kontrolü altında cat
raportör genini taşıyan bir plazmid aynı yöntemle DNA’nın aktarılıp aktarılamayacağı
bakımından test edildi. Bombardımandan 3 gün sonra analiz edilen epidermal dokuda yüksek
düzeyde geçici cat aktivitesi tespit edildi.
Bu ilk denemeden sonra birçok bitki türünde (soya, mısır, tütün gibi) sabit eksplantlara
transformasyon gerçekleştirilebildi. Her durumda seçici marker olarak nptII geni kullanıldı ve
kanamisin içeren besiyerinde büyüyen kalluslar ile doğrulama yapıldı.
Bu metod ile bitki hücrelerine stabil şekilde gen aktarılabilmesi, gen aktarımının zor olduğu diğer
transformasyon prosedürlerinin de bu yöntemlemodifye edilerek transformasyonun
gerçekleştirilebileceğini önermiş oldu. Bununla ilgili ilk raporda olgunlaşmamış tohumlardan elde
edilen meristem doku kullanılarak transgenik soya bitkileri oluşturuldu.
Bu deneyde, taranabilen marker geni GUSA, partikül bombardımanı ile hücrelere aktarıldı ve
seleksiyon sonucu elde edilen bitkiler GUS aktivitesi bakımından tarandı. Pamuk, papaya, mısır
ve tütünde de benzer başarılar elde edildi. Partikül bombardımanı ayrıca kloroplast
transformasyon teknolojisinin de odak noktasıdır.
Partikül bombardımanı ile gen aktarım yönteminde gerçek bir sınırlama yoktur. Kallus,
süspansiyon hücre kültürleri, olgunlaşmamış embriyo, meristem ve yapraklar gibi pek çok farklı
tipte bitki materyali transformasyon için kullanılabilir. Geçtiğimiz on yıl boyunca bu yöntemle
elde edilmiş transgenik bitkilerin üretiminde ciddi derecede artış olmuştur.
Daha inatçı baklagillerde türe bağımlı gen transfer metotları geliştirmek için, elektrik ile çalışan
bir aparat kullanılıyordu. Partikül hızını basınçlı gaz ile kontrol edebilen birçok cihaz geliştirildi.

239
[Metni yazın]

Bunların arasında “partikül girişli tabanca” olarak isimlendirilen sıkıştırılmış helyum gazını
kullanan ve hava ile çalışan bir cihaz da vardır.

Sağlam Bitki Hücrelerine DNA’nın Direkt Transfer Edilebildiği Farklı Metotlar da

Geliştirildi
Hücrelerin delinmesini de içeren diğer transfer metotları silikon karbür, ultrasonik ya da ince
odaklanmış lazer ışını gibi metodların kullanımını içerir. Bu durumların pek çoğunda transgenik
mısır bitkilerindeki tersi durumu saymaz isek, aktarılan DNA’nın sadece geçici ekspresyonu
başarılabilir. Son olarak mikroenjeksiyon yöntemi de, her ne kadar hayvan hücrelerinde uzun
ölçekli transformasyonlar için uygun olmasa da, transforme hücreler, hatta transgenik bitkiler
oluşturabilen bir yöntemdir.

Direkt DNA Transferi Kloroplast Transformasyonu İçin de Kullanılabilir

Şu ana kadar bitkide nüklear genoma DNA transferi hakkında konuştuk. Fakat kloroplast da
genetik manipülasyonlar için oldukça idealdir. Çünkü, fotosentetik hücrelerde binlerce kloroplast
vardır ve bunlar aktarılan genin ekspresyonunu nüklear genoma kıyasla 50 kat daha fazla kılar.
Dahası kloroplast DNA’ya entegre olan genler nüklear DNA’da aktarılan genin ekspresyon
düzeylerini etkileyebilecek susturulma mekanizmaları veyahut da pozisyon etkisi gibi
durumlardan etkilenmez. Kloroplast transformasyonu aynı zamanda doğal bir sınırlama
metodudur. Çünkü aktarılan gen polen ile taşınamaz.
Prensip şu şekildedir: kloroplast genomuna hedeflenen entegrasyonu gerçekleştirmeyi
sağlayan, kloroplast homoloji bölgeleri içeren vektörler ve aminoglikozid adeniltransferaz geni
gibi, streptomisin ve spektinomisin vb. antibiyotiklere direnç sağlayan seçici marker genler
kullanılmaktadır.
Hem partikül bombardımanı hem de PEG aracılı transformasyon ile etkili kloroplast
transformasyonu başarılmıştır. Seçilebilen ve taranabilen kombine bir marker kullanımı ile
klorofil sentezinden önce bitkinin transplastomik bölümleri incelenebilir ve böylelikle transgenik
bitkiler kolayca belirlenebilir. Şu anda, kloroplasta gen transferi mümkün olup trans gen
entegrasyonun ardından seçici marker genler elimine edilebilir.
Tüketilebilen bitkilerden, kolza tohumu ve diğer Brassica türlerinde olduğu gibi, tütün,
domates ve patates kloroplastlarına da transformasyon yapılmıştır. Son olarak da yakın zaman da
soya plastid transformasyonu başarılmıştır.

Bitkilerde Gen Hedefleme

Gen hedefleme bakteri, maya ve bazı hayvan hücrelerinde homolog rekombinasyon ile
genomda direkt değişiklikler yapmayı sağlayan etkili bir prosedürdür. Fakat bitkilerde homolog

240
[Metni yazın]

rekombinasyon çok etkisiz bir süreçtir. Şu ana kadar yalnızca bir yosun türünde etkili homolog
rekombinasyon gözlenmiştir.
Yüksek bitkilerden bazı dikotlarda frekansı 10-3 ile 10-6 arasında değişen oranlarda gen
hedefleme başarılabilmiştir. Fakat daha umut verici sonuçlar güçlü bir seçici marker ile kombine
edilmiş uzun homoloji bölgesi ihtiva eden T-DNA aracılı gen hedefleme yöntemi ile pirinçte elde
edilmiş ve bu sistemle hedefleme frekansı %1 oranında arttırılabilmiştir.
Bitki transformasyonu, genellikle transgenik bitki jenerasyonlarını oluşturmak için gereken
doku kültürü adımlarını minimize veyahut da elimine eder.
Prosedür, aktarılan genin bitkinin yaşam döngüsüne uygun bir zamanda (genellikle
fertilizasyon, ya da erken embriyonik dönem evresinde) direkt germ hücre hattına katılabilmesi
şeklinde gerçekleştirilir. Bitki transformasyon metodları genellikle çok düşük etkinlikte
gerçekleşir fakat; Arabidopsis’in küçük ebatı ve bitki başına 10.000 tohum üretebilme kabiliyeti,
transformasyon açısından onu avantajlı kılar.
Metod basitçe fertilizasyon evresinde Arabidopsis çiçeklerini bakteriyal bir süspansiyon ile
muamele etme şeklindedir. Oluşan bitkiler kimeriktir fakat; bitki başına 10 döl şeklinde çok az
sayıda transgenik döl verirler.
Direkt DNA transferi kullanılarak diğer bitki türlerine gen transferi için benzer yaklaşımlar
denenmiştir. Fakat germ hücre hattı transformasyonu tekrarlanabilir değildir. Örneğin; çavdar
bitkisinin sürgünlerine enjekte edilmiş çıplak DNA, veya pamuk bitkilerinden transgenik bitkiler
oluşturulabilmiş, yine benzer şekilde, tütün polenlerine partikül bombardımanı sonrasında,
transgenik tütün bitkileri elde edilebilmiştir.

Sayfa 294--- yarım sayfa atlanmış

:::::::::::::::::::::::::::::::

241
[Metni yazın]

14b. QUESTIONS AND ANSWERS

1-What are the basic four types of transfer methods to plants?
As is the case for animal cells, gene transfer to plants can be achieved through four types of
mechanism – viral transduction, bacterial gene delivery, and chemical and physical direct DNA
transfer.

2-Are there any integrative virus for stable DNA transformation into plans?
no known plant viruses integrate their genetic material into the plant genome as part of the natural
infection cycle. Therefore, plant viruses are used as episomal vectors rather than for stable
transformation.

3-What are the properties of A. tumefaciens and which plants can be infected by Agro and how?
Gene transfer from bacteria to plants occurs naturally and is responsible for crown gall disease. This
is a plant tumor that can be induced in a wide variety of gymnosperms and dicotyledonous
angiosperms (dicots) by inoculation of wound sites with the Gram-negative soil bacterium A.
tumefaciens.

4- How opins synthesized by plants after Agro infections and what are the roles of opins in
tumorogenesis?
Opine synthesis is a property conferred upon the plant cell when it is colonized by A. tumefaciens .
The bacterium induces the synthesis of an opine that it can catabolize and use as its sole carbon and
nitrogen source and the metabolism of opines is a central feature of crown gall disease.

5-What are the properties of T-DNA and its effect on the transform plants? Are these genes on
T-DNA essential for transfer?
Complete Ti-plasmid DNA is not found in plant tumor cells but a small, specific segment of the
plasmid, about 23 kbp in size, is found integrated in the plant nuclear DNA at an apparently random
site.This DNA segment is called T-DNA (transferred DNA) and carries genes that confer both
unregulated growth and the ability to synthesize opines upon the transformed plant tissue. However,
these genes are non-essential for transfer and can be replaced with foreign DNA.

6-Where the nucleus stands while cell wall is wounded and does it provide an advantage for T-
DNA in transformation?
It has been observed that the nucleus of wounded plant cells often becomes associated with the
cytosolic membrane close to the wound site, suggesting that the T-DNA could be transferred directly
to the nucleus without extensive exposure to the cytosol.

7- How the genes of prokaryotic origin on T-DNA, can be expressed in eukaryotes?

Nucleotide sequencing has revealed that the T-DNA genes have promoter elements and
polyadenylation sites that are eukaryotic in nature. This explains how genes from a bacterial plasmid
come to be expressed when transferred to the plant nucleus. It is possible that the sequences may have
been captured from plants during the evolution of the Ti-plasmid.

242
[Metni yazın]

8- Please describe binary system of T-DNA transformation and formation of co-integrate

plasmids? Why do you need them?
Binary vectors separate the T-DNA and the genes required for T-DNA transfer, allowing transgenes to
be cloned in small plasmids and although disarmed derivatives of wild-type Ti- plasmids can be used
for transformation, they are not particularly convenient because their large size makes them difficult
to manipulate in vitro, and there are no unique restriction sites in the T-DNA. This problem was
addressed by the construction of cointegrate vectors. T-DNA isolated from a parent Ti-plasmid was
sub cloned in a conventional E. coli plasmid vector for easy manipulation.

9- Please explain why don’t you need drug resistance of marker gene in Ri-plasmid
transformation?
The Ri-plasmid induces hairy-root disease in Arabidopsis cells, serving as a transformation marker for
the co-transferred recombinant T-DNA, and allowing regeneration of intact plants. That is why no
drug resistance marker on the T-DNA is necessary with this plasmid combination.

10- Why protoplast is suitable for genetic manipulation? What is the limitation of protoplast
transformation and the advantage of regenerable ones from protoplast?
They are very useful for genetic manipulation for two reasons: first, When plated onto nutrient
medium, protoplasts will synthesize new cell walls within 5 –10 days and then initiate cell division;
and second, because under certain conditions, protoplasts from similar or contrasting cell types can be
fused to yield somatic hybrids, a process known as protoplast fusion. The major limitation of
protoplast transformation is the ability of the host species to regenerate from protoplasts..In species
where regeneration is possible (especially dicots), an advantage of the technique is that protoplasts can
be cryopreserved and retain their regenerative potential.

243
[Metni yazın]

Küçük ve basit genomları sebebiyle ilk bitki viral vektörleri DNA virüsleri
tabanlıdır
Bitki virüslerinin büyük bir çoğunluğu RNA genomuna sahiptirler. Bununla beraber
caulimovirüs ve geminivirüs bitkileri enfekte eden DNA virüsleridir ve basit ve küçük DNA
genomlarına sahip olmaları sebebiyle ilk geliştirilen vektörlerdir.
Cauliflower mosaic virüs (CaMV) Caulimovirüslerin tipik bir üyesi’dir. Bazı izolatlarının 8 kb
büyüklükteki dsDNA genomu tamamiyle sekans edilmiştir. CaMV genomunun bir haritası şekil 14.15
‘de gösterilmiştir. 8 tane sıkı paketlenmiş gen bulunmaktadır ve bu genler 35S RNA ve 19S RNA
olarak bilinen iki büyük transkript olarak ifade edilirler. Önceki kısımda tartışıldığı gibi her iki
transkript için promotor ve terminatör diziler bitki ekspresyon vektörlerinde kullanılmıştır. CaMV
genomunda yalnızca iki gen (gen II ve VII) elzem değildir ve CaMV ikozahedral bir kapsite sahip
olduğu için genomun boyutunu paketlenmenin tesirinden etkilenmeksizin artırmak mümkün değildir.
CaMV kapsitinin maksimum kapasitesi 8.3 kb olarak belirlenmiştir ve elzem olmayan genler
çıkarıldığında bu 1 kb den daha az bir maksimum insert büyüklüğünü temsil eder (Daubert et al.
1983). Yabancı DNA için bu kapasitedeki bir kısıtlama CaMV vektörleri için büyük bir
sınırlandırmayı gösterir. Şimdiye kadar çok küçük transgenlerin ekspresyonu mümkün olmuştur.
Bunlara örnek olarak 240-bp bacterial dhfr geni (Brisson et al.1984), 200-bp murine metallothionein
cDNA (Lefebvre et al. 1987) ve 500 bp insan interferon cDNA’sı verilebilir. (de Zoeten et al. 1989).
Bölüm 12 de replikasyon vektörleri ve yardımcı virüsler geliştirerek veya transdaki temel
fonksiyonları sağlayan tamamlayıcı hücre kültürleri sayesinde bu gibi benzer kısıtlamaların üstesinden
nasıl gelindiğini açıkladık. Maalesef bu yaklaşım CaMV ile mümkün değildir ve bu durum yabancı
DNA nın hızlı bir şekilde kesilip çıkarılmasına sebep verir. (Gronenborn & Matzeit 1989).

244
 [Metni yazın]

Şekil 14.15 cauliflower mozaik virüsü genom haritası. Sekiz kodlama bölgeleri kalın gri oklarla
gösterilmiştir ve farklı okuma çerçeveleri radyal pozisyonda ile belirtilmiştir. Merkezdeki ince çizgiler
üç kesikli DNA zincirini (artı ve eksi) belirtmektedir. 19S ve 35S dışarıda gösterilmiştir.

Geminivirusler ikiz virionları ile karekterize edilirler ve bunlar kısmi olarak kaynaşmış
ikozahedral kapsitleri içerir. Küçük tek zincir DNA genomu daireseldir ve bazı türlerde iki segmente
bölünür. Bunlar DNA A ve DNA B olarak adlandırılır. Geminivirus vektör gelişimine olan ilgi bu
virüslerin bir DNA replikatif intermediate kullanmalarının keşfiyle kamçılanmıştır ve bu durum
Geminiviruslerin CaMV lerden daha stabil olduğunu gösterirmiştir ve CaMV‘nin RNA-bağımlı
replikasyon çevrimi oldukça hata eğilimli ‘dir (Stenger et al. 1991). Geminivirüslerin üç generasından
ikisi vektör olarak geliştirilmiştir. Begomovirusler iki parçalı genoma sahip olup whitefly Bemisia
tabaci tarafından taşınırlar ve dicotları enfekte ederler. Vektör olarak geliştirilen türleri African
cassava mosaic virus (ACMV) ve tomato golden mosaic virus (TGMV)’leri içerir. Mastrevirusler tek
parçalı genomlara sahiptirler ve leafhopper’lar (yaprak pireleri) tarafından taşınırlar ve hakim bir
şekilde monocotları enfekte ederler. Vektör olarak geliştirilen türleri maize streak virus (MSV) ve
wheat dwarf virus (WDV) içerir. Bu iki genera arasındaki önemli bir farlılık ise mastreviruslerin
mekaniksel olarak transfer edilememeleridir. Örnek olarak; MSV hiçbir zaman doğal veya klonlanmış
DNA olarak bitkilere başarılı bir şekilde sokulamamıştır. Grimsley et al. (1987) Agrobacterium
kullanarak bu problemin üstesinden gelebilmiştir ve agroenfeksiyon prensibini ilk gösteren kişi
olmuştur. Bu araştırmacılar MSV genomunun ardışık dimerini içeren bir plazmit oluşturmuşlardır. Bu
dimer binary vektöre yerleştirilmiş ve darı bitkisi rekombinant T-DNA içeren A. tumefaciens ile
enfekte edilmiştir. Viral semptomlar inokülasyonun ikinci haftasında gözükmüştür. Agroenfeksiyon
farklı virüslerin bazı genomlarının bitkilere sokulmasında kullanılmıştır. Eğer T-DNA kısmi ya da tam
duplike olmuş genomlar içerirse, genomun tekli kopyaları kaçar ve enfeksiyonu başlatır. Buna
homolog rekombinasyon veya replikatif bir mekanizma aracılık edilir (Stenger et al. 1991). Grimsley
245
[Metni yazın]

et al. (1987) tarafından yapılan çalışmada Agrobacterium T-DNA’sının darıya transfer edebileceğine
dair ilk bulgulara rastlanılmıştır. Virüs enfeksiyonundaki kalıtsal amplikasyonlar ve görülebilir
semptomlardan dolayı, Agroinfection bitki hücrelerine, enfeksiyon için çok hassas bir denemedir.
Viral replikasyonun bir fonksiyonu olarak yüksek seviyede rekombinant protein ekspresyonuna
ulaşma olasılığından dolayı çok sayıda geminivirusler ekspresyon vektörleri olarak geliştirilmiştir
(reviewed by Stanley 1993, Timmermans et al. 1994, Palmer & Rybicki 1997). Diğer kullanışlı bir
strateji de kılıf proteinin yer değiştirilmesidir. Çünkü bu gen replikasyon için gerekli değildir ve güçlü
bir promotor olduğundan dolayı transgen ekspresyonu için kullanılabilir. İki parçalı genoma sahip olan
begomovirüslerde ise kılıf protein geni DNA üzerinde yerleşmiştir (DNA replikasyonu için gerekli
bütün fonksiyonlarla beraber). Dolayısıyla DNA A tabanlı replikonlar protoplastlarda bağımsız
replikasyona muktedirdirler (e.g. Townsend et al. 1986). Geminivirüs replikon vektörleri
protoplastlarda yabancı genlerin yüksek seviyede ekspresyonunu kolaylaştırabilirler.
Genel olarak mastrevirus replikonları begomovirüs esaslı replikonlara oranla protoplastlarda
daha fazla kopya sayısına ulaşabilirler. E. coli ve bitkilerin her ikisinde de replike olabilen bir WDV
shuttle vektörünün kültüre edilmiş darı endosper hücrelerinden türetilen protoplastlarda 3x104 ‘den
daha fazla bir kopya sayısına ulaştığı gösterilmiştir (Timmermans et al. 1992). Buna karşılık tütün
protoplastlarındaki TGMV replikonları tarafından ulaşılan kopya sayısı 1000’den daha azdır
(Kanevski et al. 1992). Bu durum vektörlerin kendilerine has verimliliklerinden ziyade konak
hücrelerin farklılıklarını yansıtır.
Ayrıca geminivirüsler tüm bitkilerde bir ekspresyon vektörü olarak değerlidir. Mastrevirüslerde
ise bütün viral genler sistemik bir enfeksiyon için elzemdir, dolayısıyla kılıf protein replacement
vektörleri olarak kullanılamazlar. Aksine ACMV ve TGMV’nin kılıf protein genleri sistemik
enfeksiyon için elzem değildir fakat bunlar böcek transmisyonu için gereklidir (Briddon et al. 1990).
Dolayısıyla bu virüsleri esas alan replikon vektörleri transient ekspresyon sistemi içeren bir in planta
sağlar. Viral hareket fonksiyonlarının DNA B tarafından sağlandığını yani sistemik enfeksiyonun
ancak DNA B’nin bitkide varolması durumunda gerçekleşeceğine dikkat edilmelidir.
Ward et al. (1988) ACMV AV1 genlerinin çoğunu cat raporter geni ile değiştirmişler. Enfekte
olmuş tütün bitkisinde dört haftaya kadar yüksek seviyede CAT aktivitesi tespit edilmiş. Kılıf protein
genlerindeki delesyonun bitkilerde enfektivite kaybına sebep olduğunu bulmuşlar. Fakat bu durum cat
ile yer değiştirilmesi ile tamir edilmiş oldu ki cat silinen gen ile yaklaşık olarak aynı büyüklükteydi.
Bu ve takip eden pek çok çalışma protoplastlarda replikon vektörlerin ebatına herhangi bir gerçek limit
olmadığını, sistemik infeksiyonun wild-type DNA A kompenentinin boyutunun korunmasına bağlı
olduğunu göstermiştir. Bu sistemde daha ileri bir kısıtlama ise, rekombinant genlerin
paketlenmemelerinden dolayı nakillerinin zayıf olmasıdır. Buna yönelik bir çalışma ise her bir
hücresinde rekombinant proteinlerin üretileceği transgenik bitkilerin üretilmesidir. Bu kısmen
çoğaltılmış viral genom içeren bir DNA’ya sahip transform bitkiler oluşturularak başarılabilir (Meyer

246
[Metni yazın]

et al. 1992). Tam replikonlar aktarılan transgenden aynı yolla çıkarılabilir ki burada agroenfeksiyon
esnasında kaçan ve bağımsız bir şekilde replike olan MSV genomları tespit edilebilir. Entegre DNA B
kopyası taşıyan transgenik tütün bitkileri üretilmiştir (Hayes et al. 1988, 1989). DNA A ve DNA B
dizisi tarafından sağlanan replikasyon fonksiyonları transgenden geri alınır ve epizomal olarak
çoğaltılabilir. Böylece DNA B DNA A’ya hareket fonksiyonu sağlayabilir ve vektörün sistemik
yayılımına imkan verir.

DNA virüslerinden daha fazla transgen kabul edebildikleri için çoğu bitki ekspresyon
vektörleri RNA virüs tabanlıdır
Çoğu bitki RNA virüsleri flamentli bir yapıya sahiptir ve bu yüzden CaMV gibi DNA
virüslerinin kullanımını etkileyen paketlemedeki sınırlama bu virüslerden vektör geliştirilmesinde bir
kısıtlama oluşturmaz. Buna mukabil, RNA virüslerinin vektör olarak kullanımındaki araştırmalar
DNA virüsleri üzerindeki araştırmaların gerisinde kalmıştır, (RNA genomlarının manipulasyonları için
güçlü tekniklerin gelmesi beklenmektedir.)
1984 yılında brome mosaic virüs (BMS) genomunun tam genom klonlaması ile ilgili bir çalışma
yapılmıştır. Enfektif RNA in-vitro olarak cDNA’ dan üretildilmiştir (Ahlquist & Janda 1984, Ahlquist
et al.1984). BMV genomu RNA1, RNA2, RNA3 olmak üzere üç segmentten oluşmaktadır. Yalnız
RNA1 ve RNA2 replikasyon için gereklidir. Disistronik olan RNA3 viral kılıf ve hareket proteinlerini
kodlar. BMV enfeksiyonu esnasında RNA3’den sentezlenen ve yalnız kılıf protein genini ihtiva eden
subgenomik bir RNA fragmenti sentezlenir. Dolayısıyla kılıf protein genini yabancı DNA geni ile yer
değiştirmek ve verimli bir enfeksiyon oluşturmak mümkündür (Ahlquist et al. 1987). 1986’da French
ve arkadaşları kılıf protein geni ile cat raporter geninin yer değiştirilmesini içeren bir deney
yapmışlardır. Rekombinant RNA3, elzem RNA1 ve RNA2 segmentleri ile birlikte arpa
protoplastlarının içine sokulmuş ve ardından yüksek seviyeli CAT aktivitesine ulaşılmıştır.
Bu deney brome mosaic virüs (BMS)’ün yabancı gen ekspresyonu için potansiyel kullanışlı bir
vektör olduğunu göstermiştir. Mamafih şu ana dek BMV sadece diğer bitki virüsü genlerinin
fonksiyonel analizi çalışmalarında kullanılagelmiştir. Enfektiv BMV RNA’nın in-vitro transkripsiyon
ile üretilebileceğinin gösterilmesinin ardından, pekçok RNA virüs genomları cDNA kopyaları halinde
hazırlanmıştır. Bu virüslerin bazıları yaygın bir şekilde yabancı gen ekspresyonu için vektör olarak
geliştirilmiştir (Scholthof et al. 1996, Porta & Lomonossoff 2001). Buna iki örnek aşağıda verilmiştir.
Tütün mozaik virüsü (TMV) üzerinde yaygın bir şekilde araştırma yapılan bitki virüslerinden
birisidir ve bu yüzden vektör geliştirilmesi için doğal bir tercihtir. Bu virüs 6.5 kb’lik tek zincir RNA
genomuna sahiptir. Dört polipeptid üretilir ve bunlar subgenomik RNA’lardan translasyona uğrayan
hareket ve kılıf protienleridir (şekil 14.16). TMV’nin vektör olarak ilk kullanımı Takamatsu ve
arkadaşları tarafından (1987) rapor edilmiştir. Bu araştırmacılar kılıf protein geni ile cat geninin yer
değişimini gerçekleştirip, enfeksiyon bölgesinde yüksek seviyeli CAT aktivitesi gösteren enfekte

247
[Metni yazın]

edilmiş bitkiler elde etmişler. Ancak sistemik enfeksiyon için kılıf proteini gerekli olduğundan
rekombinant virüs tüm bitkiye yayılamamıştır.

Şekil 14.16 Tütün mozaik virüsünün genom haritası ve ekspresyonu.

Dawson ve arkadaşları duplike edilmiş kılıf protein subgenomik promotoru ile kontrol edilen
bakteriyak cat genini TMV’nin orijinal hareket ve kılıf protein genleri arasına ilave ettiler. Bu
durumda sistemik enfeksiyon yüksek-seviyeli CAT aktivitesi ile uyumlu bir şekilde meydana geldi,
fakat enfekteli bitkilerde rekombinasyon olayı transgenin delesyonuyla ve yaban tip TMV RNA’sının
üretimi ile sonuçlandı. Homolog rekombinasyon TMV kılıf geni ile onun eşdeğeri Odontoglossum
ringspot virüsünün geni ile yer değiştirilerek engellenebilir (Donson et al. 1991). Bu strateji ribozom-
inaktiviteli protein (Kumagai et al. 1993) ve scFV antikorları (McCormick et al. 1999) gibi değerli
proteinlerin bitkilerde sentezlenmeleri için kullanılan çok stabil ekspresyon vektörlerinin üretimi için
kullanılmaktadır. Bunun yanında bitkileri, hafif ve ağır zincirleri ekspres eden ayrı ayrı TMV
vektörleri ile co-enfekte ederek tam monoklonal antikorlar üretmek mümkün olmuştur (Verch et al.
1998).
Patetes virüsü X (PVX), Potexvirus familyasının bir üyesidir. TMV gibi yaklaşık olarak 6.5 kb
tek zincir RNA genomuna sahiptir ve genom filamentli partikül içerisine paketlenmiştir. PVX’e ait
genom haritası şekil 14.17’de gösterilmiştir ve replikasyon, viral hareket ve kılıf protein genlerini
ihtiva eder. Kılıf protein genleri subgenomik bir promotordan ekspres edilir. gusA ve yeşil floresan
protein gibi raportör genler duplike kılıf protein subgenomik promotor kontrolü altında PVX’e
eklenmiş ve enfekte edilen bitkilerde yüksek seviyede ekspres edilebilmişlerdir (Chapman et al. 1992,
Baulcombe et al. 1995). Önceki TMV vektörleri gibi, transgenin homolog rekombinasyonla kaybolma
eğilimi vardır, fakat PVX durumunda, kılıf protein geninin fonksiyonel olarak endojen viral
promotorun yerini alabileceği alternatif herhangi bir virüs tanımlanmamıştır. Bu sebeple, PVX genelde
uzun vadeli ekspresyon için kullanılmamakta fakat geçici ekspresyon vektörü olarak geniş ölçüde
kullanılmıştır. Antikorlar gibi değerli proteinlerin sentezi (e.g. Hendy et al. 1999, Franconi et al. 1999,

248
[Metni yazın]

Ziegler et al. 2000) ve bitki fizyolojisini etkileyen genlerin ekspresyonu için kullanılmıştır (e.g. the
fungal avirulence gene avr9, Hammond Kosack et al. 1995).

Şekil 14.17 Patates virüs X'in genom haritası ve ekspresyonu.

xPVX genomunun cDNA kopyalarının bitkilere stabil tansformasyonu yüksek seviyeli transgen
ekspresyonu için potansiyel bir strateji sağlar. Çünkü viral replikasyon döngüsü esnasında transkriptler
yüksek kopya sayısına amplifiye edilmek zorundadırlar. Ancak bu strateji yüksek seviyeli ekspresyon
yerine, hem etkili ve tutarlı bir şekilde transgen susturulmasına hem de viral enfeksiyona dirence yol
açar (English et al. 1996, English & Baulcombe 1997). Bu fenomenin temeli ve bitkilerde transgen
ekspresyonu için etkileri bölüm 15’de detaylı olarak tartışılmıştır. Ancak vektör geliştirme açısından
dikkate değer olan PVX esaslı vektörlerin virüs-indüklenmiş gen susturulmasında ve ilgili fenomenleri
araştırmak için ve homolog bitki genlerinin indüklenmesi için geniş ölçüde kullanılmasıdır.

249
[Metni yazın]

14c. QUESTIONS AND ANSWERS

QUESTİONS
1-What is PVX virus? What is the advantage of it in various applications? (page 298)
2-Give examples endogenous chemically inducible promoters have also been used to control
transgene expression in plants. Explain the advantage of these systems. (page 300)
3-What are the limitations in usage of endogenous inducible promoters? (page 300)
4- What are the properties of recombinant inducible system? What are the purposes of the
current system? (page 300)
5-What is the disadvantage of repressor-based systems? How to address these problems and
why is tet system used in mammalian cells? (page 302)
6-What are the advantages of steroid hormone regulated inducible expression system? Give
an example. (page 303)
7-Why are the post-translational level inducible systems used? Give an example. (page 306)
8- What are the differences between site-spesific recombination and homolog recombination?
(page 306-307)
9- Please list areas of site-spesific recombination is used. Give an example. (page 307)
10- Please list the visible marker genes. Where are they? What is the properties of GFP,
where is green fluorescent protein used? (page 310-311)

ANSWERS
1- Potato virus X (PVX) is the type member of the Potexvirus family. Like TMV, it has a
monopartite RNA genome of approximately 6.5 kb which is packaged in a filamentous
particle. The stable transformation of plants with cDNA copies of the PVX genome
potentially provides a strategy for extremely high-level transgene expression, because
transcripts should be amplified to a high copy number during the viral replication cycle. In
terms of vector development, however, it is notable that PVX-based vectors are probably most
widely used to study virus-induced gene silencing and related phenomena and to deliberately
induce silencing of homologous plant genes.
2- Endogenous chemically inducible promoters have also been used to control transgene
expression in plants. Two systems have been widely employed: the PR-1a promoter, which is
induced by pathogen infection and by chemical elicitors such as benzothiadiazole, and the
maize In2–2 (Inducible gene 2–2) promoter, which is induced by benzenesulfonamide

250
[Metni yazın]

safeners (agrochemicals that are used to increase the tolerance of plants to herbicides; De
Veylder et al. 1997). The advantage of these systems is that neither inducer is toxic to plants
so they can be applied safely in the field as well as under laboratory conditions.
3- There are several limitations associated with the use of endogenous inducible promoters
which limit their usefulness. First, they tend to be somewhat leaky, i.e. there is a low to
moderate level of background transcription in the absence of induction. Second, the level of
stimulation achieved by induction (the induction ratio) is often quite low, typically less than
10-fold. Third, there are often unwanted side effects caused by the activation of other
endogenous genes that respond to the same inductive stimulus. The inducers used with many
of these endogenous promoters are also toxic or damaging if contact is prolonged. Finally, the
kinetics of induction are generally not ideal. For example, in transgenic animals and plants,
there may be differential uptake of the inducer into different cell types and it may be
eliminated slowly. For these reasons, there has been great interest in the development of
alternative inducible expression systems.
4- All recombinant inducible expression systems are based on a two-component principle in
which the transgenic organism is transformed with a transgene encoding a transcription factor
whose activity is controlled by the external stimulus or chemical, as well as a transgene
regulated by that transcription factor. Because the components are heterologous, there should
be no coincidental activation of other endogenous genes in the transgenic organism. For the
same reason, the inducer itself should be non-toxic, because it does not interfere with any
endogenous processes.
Current systems aspire to the ideal in which the inducing agent is taken up rapidly and
evenly, but has a short half-life, allowing rapid switching between induced and non-induced
states.
5- A disadvantage of repressor-based systems is that, in order to function effectively, high-
level constitutive expression of repressor molecules is required to suppress background
transgene activity. However, both the LacI and TetR proteins are cytotoxic at high levels.
To address these problems, TetR and LacI have been converted into activators by generating
fusion proteins, in which the repressor is joined to the herpes simplex virus (HSV) VP16
transactivator In these systems, only the DNA-binding specificity of the repressor proteins is
exploited. The binding of the modified bacterial proteins to operator sites within the transgene
leads to transcriptional activation, because the VP16 protein acts positively on the

251
[Metni yazın]

transcriptional apparatus. The operator sites have effectively become enhancers and the
inducers (IPTG and tetracycline) have effectively become repressors.
The tet transactivator (tTA) system has been more widely used than the equivalent lac
system, because very high levels of IPTG are required to inhibit LacI binding in mammalian
cells and this is toxic.
6- Steroid hormones are lipophilic molecules that penetrate cells rapidly and are eliminated
within a few hours. The use of heterologous steroids for inducible transgene expression is
advantageous because, in addition to their favorable kinetics, such molecules should not
activate endogenous signaling pathways in the expression host and should therefore have
limited toxicity.
Ecdysone is a steroid hormone found only in insects and is responsible for the extensive
morphological changes that occur during molting. As with other steroid-like signaling
molecules, the hormone acts through a heterodimeric transcription factor of the nuclear
receptor family. In Drosophila, this receptor comprises the products of the genes ecdysone
receptor (ecr) and ultraspiracle (usp). The hormone and its signaling pathway are not found in
mammalian cells. Therefore, transgenes including an ecdysone response element in the
promoter can be induced by exogenously supplied ecdysone or its analog, muristerone A, in
cells or transgenic animals expressing the components of the Drosophila receptor.
7- The inducible expression systems are all regulated at the level of transcription, such that there is
often a significant delay between induction and response and between removal of induction and return
to the basal state. Where a rapid response to induction is critical, inducible systems that operate
at the post-translational level can be utilized.
For example, the mammalian estrogen receptor exists in an inert state in the absence of
estrogen, because the hormone-binding domain interacts with heat-shock protein 90 (Hsp90)
to form an inactive complex. When estrogen is present, it binds to its receptor, causing a
conformational change that releases the receptor from Hsp90. The receptor is then free to
dimerize and interact with DNA
8- Site-specific recombination differs from homologous recombination in several important
respects. In terms of gene manipulation, the most important differences between these
processes concern the availability of the recombinase and the size and specificity of its target
sequence. Homologous recombination is a ubiquitous process that relies on endogenous
recombinase enzymes present in every cell, whereas site-specific recombination systems are
very specialized and different systems are found in different organisms. Homologous

252
[Metni yazın]

recombination occurs between DNA sequences with long regions of homology but no
particular sequence specificity, whereas site-specific recombination occurs at short, specific
recognition sites. This means that target sites for site-specific recombination can be
introduced easily and unobtrusively into transgenes, but recombination will only occur in a
heterologous cell if a source of recombinase is also supplied. The power of site-specific
recombination as a tool for genome manipulation thus relies on the ability of the experimenter
to supply the recombinase enzyme on a conditional basis.
9- Site-specific recombination can be used to delete unwanted transgenes
Site-specific recombination can be used to activate transgene expression or switch between
alternative transgenes
Site-specific recombination can facilitate precise transgene integration
Site-specific recombination can facilitate chromosome engineering
For example; Site-specific recombination can be used to delete unwanted transgenes
If two loxP sites are arranged as direct repeats, the recombinase will delete any intervening
DNA, leaving a single loxP site remaining in the genome. If the loxP sites are arranged as
inverted repeats, the intervening DNA segment is inverted. Both reactions are reversible.
However, when the loxP sites are arranged in the same orientation, excision is favored over
reintegration, because the excised DNA fragment is rapidly degraded. The ability of flanking
loxP sites to delineate any sequence of interest for site-specific deletion has numerous
applications. The most obvious of these is the deletion of unwanted sequences, such as marker
genes.
10- β-galactosidase and β-glucuronidase; The E. coli lacZ gene encodes β-galactosidase, an
enzyme and the E. coli gusA gene, which encodes the enzyme β-glucuronidase (GUS)
Luciferase; The original marker gene, luc, was isolated from the North American firefly
Photinus pyralis .
Green fluorescent protein; green fluorescent protein(GFP) is isolated from the jellyfish
Aequoria victoria
GFP is a bioluminescent marker that causes cells to emit bright green fluorescence when
exposed to blue or ultraviolet light. However, unlike luciferase, GFP has no substrate
requirements and can therefore be used as a vital marker to assay cellular processes in real
time. Other advantages of the molecule include the fact that it is non-toxic, it does not
interfere with normal cellular activity and it is stable even under harsh conditions

253
[Metni yazın]

15. BÖLÜM
İLERİ TRANSGENİK TEKNOLOJİSİ

254
[Metni yazın]

Giriş
Hayvan ve bitkilerdeki gen transfer deneyleri, hedef genomların içerisine ilave DNA dizileri
yerleştirme gibi basit proseslerin çok ötesinde bir gelişme göstermiştir. Günümüzde DNA transferi pek
çok tür için rutin olmaya başlamıştır ve dikkatler daha çok sofistike yaklaşımlara yönlenmektedir. Bu
yaklaşımlar transgenlerin ve endojen genlerin hem yapıları hem de ekspresyonu cinsinden kusursuz
kontrolünü kapsamaktadır. Hayvan ve bitki biyoteknolojisindeki paralel gelişmeler, transgenlerin dış
regülasyonuna imkan sağlayan indüklenebilir ekspresyon sistemlerinin gelişmesi sayesinde ve hedef
dizilere insersiyon ve modifikasyon yapmak için bölge-spesifik rekombinant sistemlerin kullanılması
sayesinde meydana gelmiştir. Transgenik teknoloji özellikle farede geliştirilmiştir ki burada hedef gen
kombinasyonları, bölge-spesifik rekombinasyonu ve indüklenebilir transgen ekspresyonu hem
transgenleri hem endojen genleri aktif ve inaktif yapmayı mümkün kılar.
Şartlı gen susturulması için başka yollar da araştırılmıştır. Bunlar hedef genin modifikasyonunu
direkt olarak kapsamaz, aksine ürünleri hedef ekspresyon ile çatışan inhibitör genlerin ekspresyonunu
kapsar. Örneğin, antisens RNA, ribozomlar, interfering antikorlar ve dominant negatif mutant gibi pek
çok stratejiler geliştirildiyse de özelilkle bir yaklaşım bu alana hakim olmak için ön plana çıkmıştır.
Oldukça muğlak başlangıçlardan sonra RNA interferens fenomonu (RNAi) moleküler biyolojide en
heyecan verici gelişmelerden biri olarak ortaya çıkmıştır ve yakın gelecek zamanda laboratuvarlardan
kliniklere geçiş yapabilir.

İndüklenebilir ekspresyon sistemleri transgen ekspresyonunun fiziksel stimulasyon veya

küçük kimyasal modülatörlerin uygulanması ile kontrol edilmesine izin verir
Pek çok gen transfer deneylerinde, sunulan transgenin spesifik bir şekilde ifade edilmesi
arzulanan bir şeydir. Hayvan ve bitkilerin her ikisinde, hücre veya doku spesifik promotorlar
organizmanın belirli bölgelerinde transgen ekspresyonunu kısıtlamak için kullanılmaktadır. Örneğin,
ticari bir düzenlemede hayvanlarda transgen ekspresyonunun meme bezleriyle sınırlandırılması
kullanılışlıdır. Böylece rekombinant proteinlerin sütten geri kazanılabilir (Wall et al. 1999). Benzer
şekilde, protein birikimi için stabil bir çevre olduğu için bitkilerde transgen ekspresyonunun tohumla
sınırlandırılması kullanılışlıdır (Stoger et al. 2000). Başka durumlarda da transgen ekspresyonunu
daha tutarlı bir şekilde kontrol etmek gerekli olabilir. Örneğin, eğer rekombinant bir protein toksik ise
yüksek seviyeli ekspresyon öldürücü olabilir ve stabil bir şekilde transform edilmiş hücre kültürlerini
kurtarmayı engelleyebilir. Bu şartlar altında deneyci transgeni kapatmak için en iyi zamanı seçmek
isteyebilir. Bu gibi konular transgen ekspresyonunun bir dış uyarıcı tarafından kontrol edilebildiği
indüklenebilir ekspresyon sistemleri kullanımı sayesinde gerçekleştirilebilir.

255
[Metni yazın]

Doğal olarak oluşan bazı indüklenebilir promotorlar transgen ekspresyonunu kontrol

etmek için kullanılabilir
Hayvan ve bitkiler için, hücresel veya viral genlerin promotorlarını esas teşkil eden bir dizi
indüklenebilir ekspresyon sistemleri geliştirilmiştir. Buna ilk örnek Drosophila ısı-şok promotorudur.
Pek çok hücre yükselen sıcaklığa ısı-şok proteinlerinin sentezlenmesiyle cevap verir. Bu proteinler,
koruyucu fonksiyonları olan moleküler şaperonları ve diğer proteinleri içerir (Parsell & Lindquist
1983). Bu cevap transkripsiyon seviyesinde bir ısı-değişken transkripsiyon faktörü tarafından kontrol
edilir ki bu faktör ilgili genlerde, ısı-cevap promotorlarını birbirine bağlar. Drosophila hsp70 geninin
promotoru transgen ekspresyonunu tetiklemek için hem Drosophila’nın kendisinde (Lis et al. 1983)
hem de heterolog sistemlerde geniş ölçüde kullanılmaktadır (e.g. Wurm et al. 1986). Transgenik
sineklerde, hsp70 promotoruyla bağlantılı herhangi bir gen oda sıcaklığında çok az inaktif durumdadır,
fakat bütün hücrelerdeki yüksek-seviyeli ekspresyon 30 dakikalık bir sürede 370C sıcaklığa ısıtılarak
indüklenebilir. Isı-sok promotorunu aktif hale getiren uyarıcının fiziksel olduğu indüklenebilir
ekspresyon yapıları nadirdir. Transgen ekspresyonunu kontrol etmek için kullanılan indüklenebilir
promotorların çoğu kimyasallara tepki verir. Bu kimyasallar, transforme edilmiş hücrelere veya
transgenik organizmalara transgenin ekspresyonunu aktif hale getirmek için tedarik edilmelidir.
Memelilerde bir takım promotorların glukortikoid hormonlar veya deksamethason gibi sentetik
analoglar tarafından aktif hale getirildiği bilinmektedir. Bunlardan ikisi olan mouse metallothionein
promotoru (Hager & Palmiter 1981) ve fare meme tümör virüsünün (MMTV) long-terminal-repeat
(LTR) promotoru indüklenebilir transgen ekspresyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Metallothionein promotoru interferonlar veya kadmiyum ve çinko gibi ağır metaller tarafından da
indüklenir ki bu transgenin transgenik hayvanlarda içme sularına bir ağır metal kaynağı dahil edilerek
aktive olmasına izin verir. Buna bir örnek, transgenik bir farede rat growth –hormon geninin çinko-
indüklenmiş aktivasyonu sayfa 259’da tartışıldı. Her ne kadar sistemin bileşenleri mayadan
türetilmişse de bir metal-indüklenebilir ekspresyon sistemi bitkiler için de geliştirilmiştir (Mett et al.
1993) ve bir etanol-indüklenebilir sistem de açıklanmıştır (Roslan et al. 2001).
Endojen kimyasal indüklenebilir promotorlar bitkilerde transgen ekspresyonunu kontrol etmek
için de kullanılmıştır. İki sistem yaygın şekilde uygulanmıştır: bunlar patojen enfeksiyonu ve
benzothiadiazole (Gorlach et al. 1996) gibi kimyasal uyarıcılar tarafından indüklenen PR-1α
promotoru ve bir tarım kimyasalı olan ve bitkilerin herbisitlere olan toleransını yükseltmek için
kullanılan (De Veylder et al. 1997) benzenesulfonamide safenerler tarafından indüklenen maize In2–2
(indüklenebilir gen 2–2) promotorudur. Bu sistemlerin avantajı şudur; hiçbir indükleyici bitkiler için
toksik değildir ve hem laboratuvar şartlarında hem de çalışma alanlarında güvenli bir şekilde
uygulanabilir. Bitkiler için fiziksel olarak indüklenebilir sistemler açıklanmıştır: buna bir örnek tatlı
patatesten izole edilen peroksit gen promotorudur ve yaralanma veya UV ile hidrojen peroksit
tarafından indüklenir. (Kim et al. 2003). Domates hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase 2

256
[Metni yazın]

(HMGR2) geninden alınan bir yara indüklenebilir promotoru, MeGA-PharM (Mechanical Gene
Activation Postharvest Manufacturing) olarak adlandırılan bir ticari indüklenebilir promotor sisteme
esas teşkil edecek şekilde kullanılmıştır ve bu sistem bitkilerde eczacılığa ait proteinleri kodlayan
transgenlerin, yapraklar hasat edildikten ve dilimlendikten sonra açılmasına izin verir (Ma et al. 2003,
Fischer et al. 2004).
Maalesef, endojen indüklenebilir promotorların kullanımı ile ilişkili birkaç sınırlama mevcuttur.
İlk olarak bu promotorlar bir miktar sızdırma eğilimindedirler yani indüksiyon yokluğunda
transkripsiyon seviyesini ölçülü tutmak için düşük seviyede bulunurlar. İkinci olarak, indüksiyon ile
ulaşılan stimülasyon seviyesi (indüksiyon oranı) 10 katından daha az olacak şekilde çoğu kez oldukça
düşüktür. Üçüncüsü, aynı indükleyiciye tepki veren diğer hücresel (endojen) genlerin aktivasyonuna
sebep olduğu istenmeyen yan etkiler sıkça mevcuttur. Ayrıca bu endojen promotorların pek çoğu ile
birlikte kullanılan indükleyiciler temas uzatıldığı takdirde toksik ya da zarar vericidir. Son olarak,
indüklemenin kinetiği ideal değildir. Örneğin, trangenik hayvan ve bitkilerde farklı hücre türleri
içerisine indükleyicinin farklı alınımı olabilir ve yavaş yavaş elimine edilebilir. Bu nedenlerden dolayı,
alternatif indüklenebilir ekspresyon sistemlerin geliştirilmesine muazzam bir ilgi vardır.

Konak hayvan veya bitkide bulunmayan kompenentlerden inşaa edilen rekombinant

indüklenebilir sistemler
Endojen indüklenebilir promotorların pek çok dezavantajları rekombinant sistemler kullanılarak
çözümlenebilir. Bütün rekombinant indüklenebilir sistemler iki-bileşen prebsibini esas alır. Burada
transgenik organizma, aktivitesi bir dış uyarıcı veya kimyasal ile kontrol edilen tanskripsiyon
faktörünü kodlayan bir transgen ile transform edilir. Bileşenlerin heterolog olması nedeniyle,
transgenik organizmada diğer endojen genlerin herhangi bir tesadüfü aktivasyonunun olmaması
gerekir. Aynı nedenle indükleyici, herhangi bir endojen süreç ile engellenemeyeceği için bizzat non-
toksik olmalıdır. Bugünkü sistemler ideal olanın peşindedir. Şöyle ki indükleyici ajan çarçabuk ve eşit
şekilde alınmalı, kısa bir yarılanma ömrüne sahip olmalı, böylece indüklenmiş ve indüklenmemiş
durumlar arasında çok hızlı bir değişime imkân vermelidir. Farklı özellikleriyle bir dizi indükleyici
mevcut olabilir. Bu ideal sistemin doğru adımları promotorlar ve transkripsiyon faktörleri kullanılarak
elde edilmiştir.

Bakteriyal operonları esas alan lac ve tet represör sistemleri

İlk heterolog sistemler bakteriyal kontrol sistemlerini esas almıştır (şekil 15.1). Hu & Davidson
(1987), lac represör devresinin başlıca elemanlarını dahil ederek, memeli hücreleri için indüklenebilir
bir ekspresyon sistemi geliştirmiştirler. Escherichia coli’de laktozun yokluğu durumunda lac
operonunun transkripsiyonu gen lacI tarafından kodlanan bir represör protein tarafından kapatılabilir.
Bu protein operatör bölgelerine bağlanır ki bunların en önemlisi promotordan downstream yönüne

257
[Metni yazın]

uzanır ve böylece transkripsiyonel başlangıcı inhibe eder. Laktozun mevcudiyeti veya isopropyl-β-d-
thiogalactoside (IPTG) gibi uygun bir analog durumunda lac represörü konformasyonel bir değişime
uğrar ve bu onun operatör bölgelerinden salıverilmesine sebep olur ve transkripsiyonun başlamasına
izin verilir.

Şekil 15.1 E. coli’de indüklenebilir tabanlı lac ve tet represör sistemlerinin özeti.

Hu & Davison (1987) lac sistemini ökaryotik sistemlerde kullanmak için lacI genine, ökaryotik
bir başlangıç kodonu ilave ederek modifiye etmişler ve sonra Rous Sarcoma virus (RSV) LTR
promotoru tarafından çalıştırılan bir gen ile hibrit yapı oluşturmuşlardır. Bu yapı fare fibroblastlarının
içine sokulmuş ve lac represör proteinini yapısal olarak ifade eden bir hücre soyu şeçilmiştir. Bu hücre
soyu modifiye edilmiş bir Simian Virus 40 (SV40) promotoru tarafından çalıştırılan cat raportör genini
içeren bir dizi plazmitler ile geçici olarak transfekte edilmiş. Bu plazmitlerin her biri ekspresyon
yapısının içerisinde herhangi bir yerde lac operatör bölgesi içerirler. Araştırmacılar, operatör
bölgelerinin promotor bölgesi içine yerleştirildiği takdirde raportör yapısındaki transkripsiyonun bloke
edilebileceğini bulmuşlardır. Ancak IPTG ile desteklenen hücreler tarafından transkripsiyon derepres
edilebilir ki bu kuvvetli chloramphenicol transacetylase (CAT) aktivitesine sebep olur.
E. coli tetracycline operonunu temel alan benzer bir sistem tütün bitkileri için geliştirilmiştir
(Gatz & Quail 1988). tet operonu tetrasiklin antibiyotik dirençliliği veren bakteriyal bir transpozona
taşınır. lac sistemine benzer şekilde tet operonu tetR geni tarafından kodlanan ve promotor etrafındaki
operatör bölgelere bağlanıp transkripsiyonel başlangıcı inhibe eden represör protein ile kapatılır.
Tetrasiklin bu represör proteini kendisi bağlar ve tet operonunu baskıdan kurtaran konformasyonel
değişime sebep verir. Tetrasiklin bakteriyi çok düşük konsantrasyonlarda inhibe ettiği için tet

258
[Metni yazın]

represörü antibiyotikler için sadece birkaç molekülün varlığında derepresyona izin veren çok yüksek
bir bağlayıcılığa sahiptir. tet represörü kendi operatör bölgeleri için de çok yüksek bir afiniteye
sahiptir. Bu nedenle TetR’yi ekspres eden tütün bitkileri ve hücre kültürleri üç tet operatör bölgesiyle
çevrelenmiş cauliflower mosaic virüs (CaMV) 35S promotorundan raportör gen ekspresyonunu inhibe
etmeye muktedir olmuştur. Bu baskılanmış durum tetrasiklin uygulanarak çabucak kaldırılabilir (Gatz
et al. 1991).
Lac ve tet sistemlerinin her ikisi de uygun represör proteinin varlığında minimal transkripsiyon
gösterir ve bundan dolayı yüksek bir indüksiyon oranı mümkündür. lac sisteminde maksimum
indüksiyon oranı yaklaşık 50’dir, buna mukabil tet sisteminde 500 kata kadar indüksiyona ulaşılmıştır
(Figge et al. 1988, Gatz et al. 1992). Prokaryot ve ökaryotlar arasında transkripsiyonel kontrol
mekanizmasında farklılıklar olmasına rağmen dikkate değer bir şekilde bakteriyel represör proteinler,
ökaryotik transkripsiyonel aygıtlarla karşılıklı etkileşime ve bakterilerdeki gibi fonksiyonelliğe gayet
duyarlı gözükmektedirler.

Orijinal tet sisteminin bazı kısıtlamalarının üstesinden gelmek için tet aktivatör ve
reverse aktivatör sistemleri geliştirilmiştir
Represör esaslı sistemlerin bir dezavantajı şudur; etkili bir şekilde işlevlerini yerine getirmek
için yani temel düzeydeki transgen aktivitesini baskılamak için represör moleküllerin yüksek seviyede
ekspresyonu gereklidir. Mamafiğ, LacI ve TetR proteinlerinin her ikisi de yüksek seviyelerde
sitotoksiktir.
Bu sorunları gidermek için, LacI ve TetR, füzyon proteinlerin üretilmesiyle aktivatörlere
dönüştürülürler. Burada füzyon proteinler represörün herpes simplex virüs (HSV) VP16
transaktivatörüyle birleştirilmesiyle oluşturulmuştur (Labow et al. 1990, Gossen & Bujard 1992). Bu
sistemlerde, yalnızca represör proteinlerin DNA-bağlayıcı özgüllüğünden yararlanılır. Modifiye
edilmiş bakteriyal proteinleri transgen içindeki operatör bölgesine bağlamak transkripsiyonel
aktiviteye yol açar, çünkü VP16 proteini transkripsiyonel aparatus üzerine pozitif etki yapar. Operatör
bölgesi, etkin bir şekilde enhansırlar ve indükleyiciler de (IPTG ve tetracycline) etkin bir şekilde
represör olurlar (şekil. 15.2). tet transaktivatör (tTA) sistemi, ona eşdeğer lac sistemine kıyasla daha
geniş ölçüde kullanılmaktadır, çünkü memeli hücrelerinde LacI bağlayıcısını inhibe etmek için çok
yüksek seviyelerde IPTC’ye gereksinim duyulur ve bu hücre için toksiktir (Figge et al.1988). Pek çok
farklı proteinler özellikle sitotoksik proteinler tTA sistemi kullanılarak memeli hücre kültürlerinde
üretilmiştir ki bunların yapısal ekspresyonu, hızlı bir şekilde hücre ölümüne yol açar (Wu & Chiang
1996). Hücrelerde temel düzeyde bir aktivitesi rapor edilmiştir ve yaklaşık 105 indükleme oranına
ulaşılmıştır. Ancak transgenik hayvanlarda uzun süreli tetrasikline maruz kalmanın toksik etkileri
rapor edilmiştir. Bunun yanısıra tetrasiklinin farklı organlara farklı miktarlarda alınımı temel

259
[Metni yazın]

transkripsiyon seviyesinin dalgalanmasına ve hücre-spesifik etkilere yol açar (reviewed by Saez et al.
1997).

Şekil 15.2 The tet transaktivatör (tTA) sistemi.

tet sisteminde bir diğer modifikasyon dikkat çekici ilerlemelere öncülük etmiştir. tTA
proteininin mutasyona uğramış bir şekli üretilmiştir ki bunun DNA-bağlayıcı aktivitesi
tetrasiklin tarafından ortadan kaldırılmaktan ziyade, bilakis tetrasikline bağımlıdır (Gossen et
al. 1995). Bu protein revers tTA (rtTA) olarak adlandırılmıştır ve tetrasiklin mevcudiyetinde
bir aktivatör olmaktadır. Bu sistem de, antibiyotik bir kez daha indükleyicidir, fakat uzun
süreli maruz kalmaya gereksinim yoktur (şekil 15. 3). Bu sistemin ilk kullanımlarına bir örnek
Bohl et al. (1997) tarafından tanımlanmıştır. Burada erythropoietin cDNA, bir tetrasiklin-
indüklenebilir promotorunun kontrolü altında bir retroviral vektör yerleştirilmiş ve
myoblastlar rtTA sistemi ile transforme edilmiştir. Bu hücreler fareye yerleştirilmiş (implant)
ve eritropoetin sekresyonu, daha kısa bir yarılanma ömrüne sahip tetrasiklinin bir türevi olan
doxycyclinin farelere yedirilmesiyle kontrol edilmiştir. Bu hormonun salgılanmasının uzun-
vadede kontrolünün mümkün olması gen terapide indüklenebilir ekspresyon sistemlerinin
kullanılmasına etki etmiştir. Maalesef, doxycyclinin etkilerini tersine çeviren mutasyonlar
onun bağlayıcı aktivitesini azaltmıştır. Şöyle ki inhibe tTA’ya kıyasla rtTA’yı aktive etmek
için 10 kez daha fazla antibiyotiğe gereksinim vardır. Yakın zamanda, rtTA’nın yeni
versiyonları geliştirilmiştir. Bu versiyonlarda doxycyclin bağlayıcıyı etkilemeyen farklı
bölgelerde mutasyonlar mevcuttur (Urlinger et al. 2000, Lamartina et al. 2002). Orijinal rtTA
sisteminin diğer bir kısıtlaması şudur; doksisiklin yokluğunda, regülatör, tet operatörüne

260
[Metni yazın]

önemli bir rezidual bağlanma gösterir. Fakat antibiyotik mevcut olduğunda bağlanmaya
muktedir olmaz. Ancak bunlar, rtTA ile fiziksel etkileşime girmezler (Zhu et al. 2001).
Yaklaşık olarak 104 indüksiyon oranına sahip bir revers-transaktivatör lac sistemi
geliştirilmiştir (Baim et al. 1991). Pristinamycin (Pip) operonuna dayalı streptogramin
ailesinin antibiyotikleri tarafından indüklenen standart ve revers formatında diğer bir sistem
de mevcuttur (Fussenegger et al. 2000). Farklı sistemlerin mevcudiyeti multipl transgenlerin
farklı indükleyiciler tarafından bağımsız bir şekilde kontrol edilmesine imkan verir.

Şekil 15.3 The revers tet transaktivatör (rtTA) sistemi

Steroid hormonlar elverişli heterolog indükleyiciler de yaparlar

Steroid hormonlar, hücrelere çabucak nüfuz eden lipofilik moleküllerdir ve birkaç saat içinde
yok edilirler. İndüklenebilir transgen ekspresyonu için heterolog steroidlerin kullanımı avantajlıdır
çünki, kinetiklerine ilaveten bu gibi moleküller konak ekspresyonunda endogenus sinyal yollarını aktif
etmemelidir ve dolayısıyla sınırlı toksisiteye sahip olmalıdırlar.
Ecdysone, yalnız böceklerde bulunan bir steroid hormondur ve deri değiştirme esnasında oluşan
morfolojik değişimlerden sorumludur. Diğer steroid –benzeri sinyal molekülleri gibi, hormon nükleer
reseptör ailesinin bir heterodimerik transkripsiyon faktörü ile hareket eder. Drosophila’da bu reseptör
ecdysone receptor (ecr) ve ultraspiracle (usp)’nin genlerinin ürünlerini içerir. Hormon ve sinyal
yolları memeli hücrelerinde bulunmaz. Dolayısıyla, promotorda bir ecdysone respons elementi ihtiva
eden transgenler, Drosophila reseptörünün kompenentlerini ekspresyon eden hücrelerde veya
transgenik hayvanlarda ekzogenus olarak temin edilebilen ecdysone veya analoğu olan muristerone A
tarafından indüklenebilir.
Ecdysone sistemi bitkilerde de başarılı bir şekilde uygulanmıştır. Bu, çalışma alanı kullanımı
için güvenli olan ecdysone reseptörünün non-steroid agonistlerinin tanımlanması ve gelişimi

261
[Metni yazın]

sayesindedir. Örneğin; Martinez ve arkadaşları (1999) glukokortikoid reseptör DNA-binding domain

ile füzyon olmuş tütün budworm ecdysone reseptör ligand-binding domaini ve VP16 transaktivasyon
domaini içeren hibrit bir sistem geliştirmişlerdir. Reseptör tebufenozide (ticari ismi CONFİRM olarak
bilinen bir böcek ilacı) tepki verir. Benzer şekilde, Padidam ve arkadaşları (2003) spruce budworm
ecdysone reseptör ligand-binding domain tabanlı bir sistem geliştirmişler ve methoxyfenozide
(INTREPID) olarak bilinen diğer bir böcek ilacına tepki vermiştir. European corn borer ecdysone
reseptör tabanlı diğer bir sistem de bu böcek ilacına tepki vermiştir(Unger et al. 2002).
Ayrıca glukokortikoid reseptör bitkilerde bir heterolog sistem olarak geliştirilmiştir (Schena et
al. 1991, Aoyama & Chua 1997, Moore et al. 1997). Aoyama ve Chua tarafından tanımlanan bu
sistem maya transkripsiyon faktörünün GAL4 DNA bağlanma domainine füzyon olmuş
glukokortikoid-reseptör steroid-binding domaini ile VP16 transaktivasyon domainini ihtiva eder. Bu
sistemde, altı GAL4-tanıma bölgesi ihtiva etmesi için modifiye edilmiş bir CaMV 35S promotoru
transgen ekspresyonunu çalıştırmak için kullanılır. Bu promotorun kontrolü altına yerleştirilen genler,
dexamethasone mevcudiyetinde 100-kat indüklenebilir. Son günlerdeki bir uygulama da, bu sistem
insan γ- interferonunu da ekspres eden bir bitkide viral bir replikazı ekspres etmek için kullanılmıştır.
Esas amplikasyon, gen ekspresyonunu amplifiye edilmemiş sistemlerden 300-kat daha fazla uyarmıştır
(Mori et al. 2001). Diğer bir ilginç sistem dual sistemdir ki, bu sistem dexamethasone ile aktive edilir
ve tetracycline ile baskılanır (Bohner et al. 1999).

Kimyasal olarak indüklenmiş dimerizasyon iki proteini birbirine bağlamak için divalent
ligand yeneğini kullanır
İndüklenebilir transgen regülasyonu için maya two-hibrit sistemiyle hemen hemen aynı
prensiplere dayanan daha ileri bir strateji geliştirilmiştir (s. 459). Kimyasal olarak indüklenmiş
dimerizasyon olarak adlandırılan bu teknik, fonksiyonel bir transkripsiyon faktörü üretmek için ayrık
haldeki DNA-binding ve transaktivasyon domainlerini eş zamanlı bağlamak ve bir araya getirmek
için, sentetik divalent ligand kullanımını kapsar. Başlangıç sistemi, immunosuppressant ilaç olan FK-
506’dan yararlanır. Bu yüksek bir özgüllükle FKBP12 olarak adlandırılan bir immünosüpresan
proteinini bağlar. FKBP12 T hücrelerinin olgunlaşmasını engelleyerek immün sistemi baskılayan bir
kompleks oluşturur. (reviewed by Schreiber 1991). Transgen indüksiyonu için, iki immunophilin
domainini eş zamanlı olarak bağlayabilecek FK-506’nın yapay bir homodimeri oluşturulmuştur.
Dolayısıyla GAL4 DNA-bağlanma domaini ve VP16 transaktivatörünün herbirinin bağlandığı füzyon
proteinleri ekspres eder. Sentetik homodimer fonksiyonel bir hibrit transkripsiyon faktörünü
kuvvetlendirebilir ki bu transkripsiyon faktörü GAL4 tanıma elementlerini taşıyan herhangi bir
transgeni aktive edebilmeye muktedirdir (Belshaw et al. 1996).
Bu homodimer, verimsiz kombinasyonları kuvvetlendirebileceği için (örn. iki GAL4
füzyonları), iki farklı immünosüpresanın spesifik yapay bir heterodimer olarak kullanıldığı ileri bir

262
[Metni yazın]

sistem geliştirilmiştir ( Belshaw et al. 1996). Bu durumda FK506 belirgin bir hedefe bağlanabilen bir
ilaç olan cyclosporin A ya bağlanmıştır. Heterodimerin, FKBP12-GAL4 füzyonu ve cyclophilin-VP16
füzyonunu kapsayan bir transkripsiyon faktörünü etkin bir şekilde birleştirdiği gösterilmiştir ve bu
memeli hücrelerinde bir raportör geninin kuvvetli ve spesifik aktivasyonu ile sonuçlanmıştır (şekil
15.4). Rapamisin olarak bilinen diğer bir immunosupressant ilacın kabiliyetini kullanan çok yönlü bir
sistem geliştirilmiştir ve bu sistem FKBP12’nin heterodimerizasyonuna aracılık eder ve FRAP olarak
bilinir (Rivera et al. 1996). Bu sistemde, FKBP12 ve FRAP’ın her biri fonksiyonel bir transkripsiyon
faktörünün kompenentleri ile birlikte füzyon olarak ekspres edilir. Rapamisin yokluğunda füzyonlar
arasında herhangi bir interaksiyon yoktur, ancak ilaç sağlandığı zaman bunlar transgen ekspresyonunu
aktive edebilen bir hibrit transkripsiyon faktörü içinde birleşirler. CID-regulated promotoruyla kotrol
edilen büyüme hormonu geni içeren transgenik bir fare indükleyici yokluğunda herhangi bir
ekspresyon göstermemiştir. Ancak rapamisin ile indüksiyon sonrası 24 saat içinde insan büyüme
hormonunun yüksek seviyedeki ekspresyonu gerçekleşmiştir (Magari et al. 1997). Bu sistemin
avantajı şudur; rapamisin in-vivo hücreler tarafından hızlı bir şekilde alınır ve yine hızlı bir şekilde
parçalanır. Bir kimyasal dimerizasyon indükleyicisi olarak immunosupresant ilaçların farmakolojik
yan etkilerinin olması önemli bir dezavantajdır. Bu yüzden rapamisinin önemli farmokolojik etkileri
olmayan çeşitli analogları geliştirilmiştir. En iyi sistemler artık endogenus FKBP ve FRAP’a
bağlanmayan, fakat sadece CID sistemleri için geliştirilen modifiye edilmiş türevlerle ilişkiye giren
rapologları kullanmaktadır. Rapologların diğer avantajları oral alınımı takiben uzun süreli
biyoyararlılığını ve kan-beyin bariyerini geçebilme kabiliyetini kapsar. Sistemin en çok popüler olan
versiyonunda (şekil 15.5), FKBP’nin üç kopyası bir çift çinko parmak ve homedomain ihtiva eden
sentetik bir DNA-bağlanma domainine katılır, halbuki FRAP’ın FKBP-rapamisin bağlanma domaini
NF-κB’nin alt ünitesi olan p65 aktivasyon domainine katılır. Genelde hibrit kompenentlerin her ikisi
de, internal bir ribozomun giriş bölgesini kullanan tek bir transkripsiyon ünitesinden ekspres edilir.
Hedef promotor, TATA kutusunu takiben hedef bölgenin 12 kopyasını ihtiva eder (Auicchio et al.
2002 a,b, Chong et al. 2002).

263
 [Metni yazın]

Şekil 15.4 Sentetik FK-506 siklosporin A çifti ile immünosüpresanlar ve siklosporin domainler içeren füzyon proteinler
arasındaki kimyasal yolla oluşan dimerleşme Dimerleşme gal4 cevap elemanları ile bir promotoru etkinleştirebilen
fonksiyonel bir transkripsiyon faktörünü birleştirir.

Şekil 15.5 (a) İçinde insan FKBP’sinin üç ardışık kopyası bir sentetik DNA-binding domaini ile füzyon
edilmiş ve FRAP p65 DNA aktivasyon domaini füzyon edilmiş rapamisin sisteminin sık kullanılan
konfigürasyonu. Rapamisin fonksiyonel transkripsiyon faktörünün oluşumunu sağlayan FKBP ve FRAP
arasındaki etkileşimi kolaylaştırır. (b) FKBP ve sentetik DNA-binding domaini ZFHD1 (zinc finger
homeodomain 1)’nin üç kopyasını kodlayan yapının ayrıntılı yapısı. ECMV-IRES encephalomyocarditis
virüsün internal ribozom giriş bölgesidir. (c) ZFHD1- binding bölgesini 12 ardışık kopyasını gösteren tipik
bir hedef gen yapısı. 264
[Metni yazın]

İndüklenebilir ekspresyon sistemlerinin hepsi transkripsiyonel şarteller değildir

Yukarıda tartışılan indüklenebilir ekspresyon sistemlerinin hepsi transkripsiyon seviyesinde
düzenlenmiştir. Yani indüksiyon ve cevap arasında ve indüksiyonun uzaklaştırılması ve bazal seviyeye
dönme arasında önemli bir gecikme vardır. İndüksiyona hızlı bir cevabın kritik olduğu yerlerde post-
translasyonel seviyede işleyen indüklenebilir sistemlerden yaralanılabilir. Örneğin; memeli östrojen
reseptörü, östrojen yokluğunda atıl bir durumda bulunur, çünkü hormon-bağlanma domaini inaktif bir
kompleks oluşturmak için 90 (Hsp90) ısı-şok proteini ile etkileşime girer. Östrojen mevcut olduğunda
kendi reseptörüne bağlanır ve reseptörünü Hsp90’dan serbest bırakan konformasyonel bir değişikliğe
yol açar. Reseptör DNA ile etkileşime girmek ve dimerize olmak için serbest kalır (şekil 15.6). Prensip
olarak, östrojen-bağlanma domaini ile beraber bir füzyon olarak ekspres edilen herhangi bir protein
benzer şekilde Hsp90 ile etkileşime girecektir ve inaktif bir kompleks oluşturacaktır (Picard 1994).
Böylece inaktif konumdaki rekombinant bir protein yüksek seviyelerde ifade edilebilecektir. Ancak
rekombinant protein, östrojenle ya da endogenus östrojen-responsive genlerini indüklemeyen
Tamoxifen gibi analogları ile beslenen hücreler ve transgenik hayvanlarda aktive edilebilir (Littlewood
et al. 1995). Benzer bir sistem mutant-form progesteron reseptörü kullanılarak tasarlanmıştır. Bu
sistemde reseptör progesterona bağlanamaz ancak, antiprogestin RU486 ile indüklenebilir (Garcia et
al. 1992, Vegeto et al. 1992). Trangenik farelerde 3500’e kadar indüksiyon oranına ulaşıldığı
gösterilmiş ve en önemlisi endüktif cevap, ilacın antiprogestin olarak fonksiyon yapması için gerekli
olan miktarından 100 kat daha az bir dozda verildiğinde gerçekleşmiştir.

Şekil 15.6 Post-translasyonel seviyede çalışan östrojen-indüklenebilir ekspresyon sistemi,

ayrıntılar için metne bakınız.
265
[Metni yazın]

Bölge-spesifik rekombinasyon gen hedeflemenin etkisiz olduğu organizmalarda

genomun kusursuz manipülasyonuna izin verir
Yakın bir zamana kadar, hayvan ve bitki genomlarındaki DNA dizilerinin kusursuz bir şekilde
in-vivo manipülasyonuna uygulanabilecek bir metod yoktu. Farelerde, homolog rekombinasyon
vasıtasıyla gen hedefleme, önceden seçilmiş genlerin içine spesifik değişikliklerin sokulmasına izin
verir. Ancak bu tekniğin diğer bitki ve hayvanlara kadar genişletilmesinin imkansız olduğu ispat
edilmiştir. Ayrıca gen hedefleme, germline’da hedef genin modifiye edilebileceği gerçeği ile
sınırlandırılmıştır. Böylece faredeki bütün hücreler gelişimin başlangıcından itibaren tüm ömrü
boyunca benzer şekilde etkilenmektedir.
Son 10 yıldır herhangi bir bitki ve hayvan türünde in-vivo transgen manipülasyonuna izin veren
genel metodlar kullanılabilir hale gelmiştir. Daha önemlisi, bu sistemleri indüklenebilir veya hücre-
tipi-spesifik ekspresyon sistemleri ile ahenkli bir şekilde kullanarak, transgenlerin koşullu modifiye
edilebildiği transgenik organizmalar üretmek mümkündür. Farelerde, bu metodların gen hedefleme ile
kombinasyon halinde kullanımı koşullu mutantların üretimine izin verir ki burada endojen bir gen
belirli hücrelerde veya gelişimin belirli bir safhasında özellikle inaktif edilir. Bu metodlar
özelleştirilmiş bir genetik prosesi esas alır ve bölge-spesifik rekombinasyon olarak adlandırılır.
Bölge-spesifik rekombinasyon pek çok önemli hususta homolog rekombinasyondan farklılık
gösterir. Gen manipülasyonu açısından bu prosesler arasındaki en önemli farklılık, rekombinazın
mevcudiyetiyle ve hedef sekansın ebatı ve spesifikliğiyle ilgilidir. Homolog rekombinasyon, her
hücrede mevcut olan endogenus rekombinaz enzimlerine bel bağlayan bir ubiquitous prosestir, buna
karşın bölge-spesifik rekombinasyon sistemleri çok özelleştirilmiştir ve farklı organizmalarda farklı
sistemler bulunur. Homolog rekombinasyon uzun homolog bölgeleri ile DNA sekansları arasında vuku
bulur ancak belirli bir sekans spesifitesi yoktur. Öte yandan bölge –spesifik rekombinasyon kısa
spesifik tanıma bölgelerinde vuku bulur. Bir başka deyişle bölge-spesifik rekombinasyon için hedef
bölgeler transgenlere kolayca ve mütevazi bir şekilde sokulabilir ancak, eğer bir rekombinaz kaynağı
sağlanırsa rekombinasyon sadece heterolog hücrelerde vuku bulacaktır. Bu nedenle genom
manipülasyonu için bir araç olarak bölge-spesifik rekombinasyonun gücü koşullu şartlarda
rekombinaz enzimi sağlamak için deneycinin kabiliyetine bel bağlar.
Farklı olarak bir dizi bölge-spesifik rekombinasyon sistemleri tanımlanmıştır ve bir çoğu detaylı
bir şekilde çalışılmıştır (reviewed by Craig 1988, Sadowski 1993). Bacteriophage λ integrase gibi bazı
rekombinazlar etkili rekombinasyon için yardımcı proteinlere ihtiyaç duyar. Ancak en basit sistemler
rekombinaz ve onun hedef sekansına ihtiyaç duyar. Bunlar arasında en geniş ölçüde kullanılanlar
bacteriophage P1’den Cre rekombinazı (Lewanodski & Martin 1997) ve Saccharomyces
cerevisiae’nin 2 µm plazmitinin FLP rekombinaz (flippase)’ıdır (Buchholz et al. 1998). Bunların
memeli ve transgenik hayvan ve bitkileri içeren pek çok ökaryotik sistemlerde fonksiyonel olduğu
gösterilmiştir (reviewed by Sauer 1994, Ow 1996, Metzger & Feil 1999). Her iki rekombinaz da

266
[Metni yazın]

8bp’lik merkezi bir elemanı kuşatan, bir çift 13bp tekrar dizilerini kapsayan 34 bp’lik bölgeyi
(sırasıyla loxP and FRP olarak adlandırılan) tanır. Her ne kadar rekombinasyon için gereksiz olduğu
gösterilmişse de FRP 13bp’lık tekrar sekansının ilave bir kopyasına sahiptir. Cre rekombinaz optimum
37°C’de çalıştığı için büyük ölçüde memelilerde kullanılmıştır. Ancak multiple sistemler eş-zamanlı
olarak kullanıldığında büyük avantajları görülür ki bu marker-free transgenik bitkilerin geliştirilmesi
için bir strateji olarak sunulmuştur.

Bölge-spesifik rekombinasyon istenmeyen transgenleri silmek için kullanılabilir

Şekil 15. 7’de Cre rekombinaz tarafından kataliz edilen reaksiyon gösterilmiştir. Eğer iki loxP
bölgesi direkt tekrarlar olarak düzenlenirse rekombinaz genomda tek loxP bölgesi bırakarak, herhangi
bir müdahil DNA’yı silecektir. Eğer loxP bölgeleri ters tekrarlar olarak düzenlenirse, müdahil DNA
segmenti tersyüz olur. Her iki reaksiyonda geri dönüşümlüdür. Ancak loxP bölgeleri aynı
oryantasyonda düzenlendiğinde eksizyon reintegrasyona tercih edilir, çünkü çıkarılmış DNA
fragmentleri çabucak degrede olur.

Şekil 15.7 Farklı oryantasyonlarda düzenlenmiş Cre rekombinaz tarafından katalizlenen reaksiyonlar ve
loxP bölgelerinin yapısı.

Bölge-spesifik delesyon için herhangi bir ilgilenilen sekansı belirginleştirmek için loxP askı
bölgelerinin becerisi sayısız uygulamalara sahiptir. Bunların en aşikâr olanı marker genler gibi
istenmeyen sekansların delesyonudur. Örneğin; bu yaklaşım basitleştirilmiş bir strateji olarak nokta
mutasyonlar içeren mutant fareler oluşturmak için kullanılmıştır. Farelerde subtle mutantların
çoğaltılması için embriyonik kök hücrelerdeki homolog rekombinasyonun iki bölümden oluştuğunu
bölüm 13’ten hatırlayalım. Homolog rekombinasyon nadir bir olay olduğu için bu gibi stratejiler çok

267
 [Metni yazın]

verimsizdir. Ancak Cre rekombinaz-tabanlı yaklaşım da homolog rekombinasyonun ikinci bir roundu
gereksizdir (Kilby et al. 1993). Şekil 15. 8’de gösterildiği gibi gen hedefleme endogenus bir genin
yabani tip alleliyle nokta mutasyonu içeren bir allelinin yer değiştirilmesi için ve eş zamanlı olarak
marker genlerin sokulması için kullanılır. Pozitif ve negatif seleksiyon için neo ve Tk gibi marker
genler kullanılır. Homolog bölge içindeki pozitif-negatif seleksiyon işaretleyicileri loxP bölgeleri
tarafından kuşatılmıştır. İkinci bir negatif marker (örn. Difteria toksin geni gibi) rastgele bir
integrasyon olayını belirlemek için homolog bölgenin dışına ilave edilir. Difteria-toksin genlerini
kaybetmiş ve neo için hayatını devam ettiren hücreler muhtemelen özgün hedefleme olaylarını temsil
ederler. Bu hücreler daha sonra, Cre rekombinazı ifade eden bir plazmid ile transfekte edilir ki bu arta
kalan işaretleyicilerin eksizyonunu katalizler, sadece bir intronda arta kalan loxP bölgesi haricinde
hiçbir acemilik delili olmayan temiz bir nokta mutasyonu bırakır. Negatif seleksiyon ganciclovir ya da
1-(2-deoxy-2-fluoro-β-d-arabinofuranosyl)-5 iodouracil (FIAU) kullanılarak Tk’ya karşı
işaretleyicilerini kaybetmiş hücreleri tespit eder.

Şekil 15.8 Cre rekombinaz tarafından katalizlenen marker eksizyonu ile gen hedeflemenin takibi. Başlangıçta, loxP
siteler ile çevrili pozitif ve negatif işaretliyiciler (neo ve Tk), homolog rekombinasyon ile sokulmuştur. G418
üzerindeki neonun seçimini takiben, Cre rekombinaz genomun içinde tek bir loxP bölgesi bırakarak, her iki
işaretleyiciyi çıkarmak için kullanılmıştır. Eksizyon olayı gansiklovir veya FIAU kullanılarak, Tk’nın yokluğunun
belirlenmesiyle tespit edilebilir. Asteriks mutasyonu gösterir.

Benzer stratejiler bitkilerden marker genleri uzaklaştırmak için kullanılabilir ve ilk olarak Dale
& Ow (1991) tarafından gösterilmiştir. Bu araştırmacılar, tütün yaprak eksplantlarını bir CaMV 35S-
luciferase reporter yapısı ile trasforme etmek için Agrobacterium kullanmışlar. Transfer DNA (T-
DNA) loxP bölgesi ile çevrili hygromycin direnci için seçilebilir bir marker da ihtiva ediyordu.
Transgenik bitkiler hygromycin seleksiyonunun altında yeniden üretilmiş ve bu bitkilerin yaprak

268
 [Metni yazın]

eksplantları ikinci bir yapı ile transforme edilmiş ki burada Cre rekombinaz CaMV 35S promotoru ile
çalıştırılmıştır. Bu yapı ayrıca nptII genini ihtiva ediyordu ve ikinci-round transgenik bitkiler
kanamisin üzerinden seçilmiştir. Test edilen 11 bitkiden 10’u her ne kadar lusiferaz ekspresyonunu
devam ettirseler de hygromycin duyarlı bulunmuştur ki bu orijinal işaretleyicinin eksize edildiğini
gösterir. cre/nptII yapısı ayrı ayrı sokulduğu için orijinal T-DNA’ya bağlı değildi ve yalnızca lusiferaz
transgenini ihtiva eden ‘’temiz’’ transgenik bitkiler bırakacak şekilde, gelecek generasyonlar için ayrı
tutulmuştur.

Bölge-spesifik rekombinasyon transgen ekspresyonunu aktif etmek veya alternatif

transgenler arasında değişim yapmak için kullanılabilir
Bölge-spesifik rekombinasyon delesyon vasıtasıyla transgenleri inaktif etmek için bir metod
olarak kullanılmasına karşın aynı zamanda transgenleri aktive edebilir veya iki transgen ekspresyonu
arasında değişim yapabilir (şekil 15.9). Recombinase-activated gene expression (RAGE) olarak
adlandırılan bir metotta, polyadenylation bölgesi gibi bloke edici bir sekans transgen ve promotoru
arasına yerleştirilir ve böylece transgen ekspres edilmez. Eğer bu bloke edici sekans loxP bölgesi ile
kuşatılırsa, Cre rekombinaz sekansı eksize etmek için ve transgeni aktif hale getirmek için
kullanılabilir.

Şekil. 15.9 Rekombinaz-aktive gen ekspresyon stratejisine (RAGE) genel bakış. Bir poliadenilasyon sinyali
ekspresyonu bloke etmek için hedef gen ve promotoru arasına yerleştirilir. Bununla birlikte, bu sinyal loxP
siteleri tarafından kuşatıldığı takdirde, Cre rekombinaz bloklamayı kaldırmak için kullanılabilir böylece gen
ve promotoru yan yana kaynaştırılır ve gen ekspresyonu aktive edilir

Bu strateji ilk olarak, SV40 T-antijen ekspresyonunun trasgenik farelerin gelişimindeki

etkilerini çalışmak için kullanılmıştır (Pichel et al. 1993). Bu durumda Cre rekombinaz bir gelişimsel
olarak düzenlenmiş promotorun kontrolü altında ekspres edilmiştir. Aslında aynı strateji tohumlardaki
raportör bir geni aktif hale getirmek için trangenik tütün bitkilerinde de kullanılmıştır (Odell et al.
1994) . Bu durumda Cre rekombinaz tohum-spesifik bir promotorun kontrolü altında ekspres edilmiş.
269
[Metni yazın]

Her iki deneyin en önemli özelliği iki ayrı transgenik soyun kullanılmasıydı. Bunlardan birisi Cre
rekombinazı düzenlenmiş bir şekilde ekspres eder, diğeri ise hedef geni içerir. Bu soylar arasındaki
çaprazlamalar, her iki transgeni hibrid dölde bir araya getirir ki bu Cre ekspresyon profilini esas alan
transgenin koşullu aktivasyonu ile sonuçlanır. Bu oldukça çok yönlü ve geniş ölçüde kullanılan bir
stratejidir, çünkü farklı Cre transgeniği ile responder arasında “mix and match’’( karıştırma ve
birleştirme)’e izin verir. Aşağıda bu konuya dönülecektir.

Bölge spesifik rekombinasyon tam transgen integrasyonunu kolaylaştırabilir

Transgenlerin bölge-spesifik integrasyonu, genomun bir rekombinaz tanıma bölgesi ihtiva
etmesi durumunda oluşabilir. Bu rastgele integrasyon vasıtasıyla ya da (farede) gen hedefleme
vasıtasıyla sokulabilir. Modifiye edilmemiş bir Cre-loxP sistemi kullanılarak yapılan transgen
integrasyonu düşük bir verimlilikte oluşur, çünkü yukarıda tartışıldığı gibi reaksiyonun dengesi
eksizyonun lehine kayar. Bu problemin üstesinden gelmek için yapılan ilk girişimlerde, geçici Cre
aktivitesi sağlanarak sınırlı bir başarıya ulaşılmıştır (Sauer & Henderson 1990, Baubonis & Saur
1993). Ancak mutant ya da inverted loxP bölgesi kullanılarak bitki (Albert et al. 1995) ve memeli
hücrelerinde (Feng et al. 1999) yüksek verimlilikte Cre-aracılı integrasyon sağlanmıştır. FLP
rekombinaz kullanılarak da memeli hücrelerinde bölge-spesifik transgen integrasyonu sağlanmıştır
(O’Gorman et al. 1991).
Biyoteknolojide marker-free transgenik hayvan ve bitkiler geliştirmek için son zamanlarda
yapılan baskı ile beraber bu araştırma alanı büyük bir miktarda fon desteğinden yararlanmıştır. Pirinç
gibi ticari önem taşıyan ürünlerde belirli ilerlemeler sağlanmıştır ki burada hedeflenmiş integrasyon
yüzlerce klonda verimli olmuştur (Srivastava & Ow 2002, Srivastava et al. 2004). Bölge-spesifik
rekombinasyon vasıtasıyla transgen entegrasyonunun, rastgele rekombinasyonun üzerinde pek çok
avantajı vardır. Örneğin; genomun bir bölgesinin negatif pozisyon etkilerine (kutu 13.2) maruz
kalmadığı belirlenebilirse, bu pozisyonda bir loxP bölgeli transgenik soylar herhangi bir transgenin
stabil ve yüksek seviyeli ekspresyonu için kullanılabilir (Fukushige & Sauer 1992). Ayrıca bölge-
spesifik rekombinasyonun kusursuz doğasından dolayı, bu metodla çoğaltılan transgenik
lokuslar,rastgele integrasyon ile çoğaltılan lokuslardan muhtemelen daha az komplekstir.

Bölge-spesifik rekombinasyon kromozom mühendisliğini kolaylaştırabilir

Bölge-spesifik rekombinasyon, birbirinden geniş ölçüde farklı hedef bölgeler ya da farklı
kromozomlardaki hedef bölgeler arasında büyük delesyonlar, translokasyonlar ve diğer kromozom
mutasyon türlerini oluşturmak için kullanılabilir. Bölge-spesifik rekombinasyon vasıtasıyla kromozom
mühendisliği ilk olarak Drosophila’da FLP rekombinazı kullanan Golic (1991) tarafından rapor
edilmiştir. Ancak aynı deneyler şimdilerde bitki ve farelerde uygulanmaktadır. Kusursuz intra-
kromozomal delesyonlar farelerde Cre-aracılı rekombinasyonu takiben uzak bölgelere loxP bölgeleri

270
[Metni yazın]

sokularak iki round gen hedefleme vasıtasıyla çoğaltılabilir (Ramirez-Solis et al. 1995, Li et al. 1996).
Bitkilerde gen hedefleme çok verimsizdir, ancak dahice bir plan geliştirilmiştir ki burada loxP
bölgeleri biri Ds transpozon içinde, diğeri dışında olmak üzere bir transformasyon yapı üzerinde art
arda düzenlenmiştir. Transpozon bir marker gen ile promotoru arasına yerleştirilmiştir. Bu yapı bir
transposas kaynağı sağlamak için otonom transpozon Ac içeren tütün bitkilerine tatbik edildiği zaman,
tıpkı marker-gen ekspresyonu tarafından ifşaa edildiği gibi Ds elemanı transgenden eksiz edilebilir.
Çoğu heterolog bitkilerde Ac-Ds elemanları orijinal konuma bağlanmış bir pozisyonda yeniden
birleşebilirler. Her ne kadar yeniden birleşme bölgesi kotrol edilemese de, bu yine de Cre-rekombinaz
tarafından eksize edilebilen geniş bir kromozomal segmenti tanımlar (Medberry et al. 1995, Osbourne
et al. 1995). İnterkromozomal bölge-spesifik rekombinasyon verimsiz olduğu için translokasyonları
düzenlemek daha zordur ve istenen ürünlerin belirlenmesi için orijinal seleksiyon stratejilerine ihtiyaç
vardır Qin et al. 1994, Smith et al. 1995, Van Deursen et al. 1995).

İndüklenebilir bölge-spesifik rekombinasyon koşullu mutantların üretimine ve haricen

düzenlenmiş transgen eksizyonuna imkan verir
Farelerde gen-hedefleme ve bölge-spesifik rekombinasyon, şartlı knockout mutantları
oluşturmak için güçlü bir kombine yaklaşımla kullanılabilir. Esasen hedef vektörler seçilmiş bir
endogenus genin bir kısmının loxP bölgesi, veya floxed tarafından kuşatılmış olması için dizayn
edilirler. Olağan strateji loxP bölgelerini gerekli bir ekzon ile kuşatılan intronların içine sokmaktır. Bu
genellikle genin normal ifadesini engel değildir. Daha sonra Cre rekombinaz gelişimsel olarak regüle
edilmiş veya indüklenebilir hücre-tipi-spesifik bir promotorun kontrolü altına verilir, bu loxP bölgeleri
ile tanımlanan gen segmentinin hücrelerde veya deneyci tarafından belirlenen bir gelişim safhasında
silinmesine yol açar. Bu geleneksel gen knockout tekniklerinin önemli bir kısıtlamasının üstesinden
gelir, yani mutasyon embriyonik ölümcül fenotipe sahip ise sadece erken etkileri araştırılabilir.
Bu gibi deneyler için genel metodoloji daha önceden tartışıldığı gibi transgenik farenin iki
soyuna çaprazlamaktır ki, birisi floxed hedef geni, diğeri koşullu cre transgeni taşımaktadır. Bu gibi
deneylerin sayısı arttıkça daha fazla farklı koşullu promotorların kontrolü altında Cre ekspres eden
transgenik fare soyları kullanılabilir hale gelecektir. Örneğin; spesifik olarak göz merceklerinde Cre
ekspresyon eden bir fare soyu Lasko ve arkadaşları (1992) tarafından oluşturulmuştur. Cre’nin meme
bezlerinde (Wagner et al. 1997) ve gelişmekte olan sperm (O’Gorman et al. 1997) hücrelerinde
spesifik olarak ekspres edildiği soylar da mevcuttur. Germ hücrelerinde veya erken gelişimde Cre’nin
ekspresyon edildiği soylar “deleter” soylar olarak bilinirler ve marker genleri uzaklaştırmak ve Cre-
aracılı yapısal gen knockoutlarının oluşturulması için kullanılırlar.
Koşullu knockout yaklaşımının ilk örneklerinde Gu (1994) ve arkadaşları, yalnızca T
hücrelerinde ekspres edilen lck promotorunun kontrolü altında rekombinazı ekspres eden bir Cre
transgenik soyu oluşturdular. Kuh. (1995) ve arkadaşları aynı geni mutasyona uğrattılar, ancak onlar

271
[Metni yazın]

Cre rekombinazı ekspres etmek için interferon ile bölge-spesifik rekombinasyon indüksiyonuna izin
veren metallothionein promotorunu kullandılar. Başarılı olmasına rağmen bu deney, indüklenebilir
promotorların pek çok yetersizliklerini vurgulamıştır. Farklı dokularda eksizyon verimliliğinde
muhtemelen indükleyici diferansiyel alımını yansıtan bariz varyasyonlar vardır. Ayrıca dalakta
muhtemelen endogenus interferonlar varlığı nedeniyle indüksiyon yokluğunda gen segmentinin
çıkarılması ile sonuçlanan Cre’nin yüksek seviyeli background aktivitesi gözlemlenmiş. tTA sistemi,
Cre ekspresyonunu tetrasiklin yönetiminin kontrolü altına vermek için kullanılmıştır. Her ne kadar
yüksek-seviyeli bir backround aktivitesi gözlemlenmişse de, hedef genin indüksiyon öncesi
eksizyonuyla sonuçlanmıştır (St Ogne et al. 1996). Post-translasyonel indüksiyon kullanılarak daha
sıkı kontrol mümkündür. Örneğin; Cre, östrojen reseptörünün ligand-binding domaini ile birlikte bir
füzyon olarak ekspres edildi (Fiel et al. 1996). Bu transgen uygun bir responder suşa aktarıldığı zaman
backround eksizyon minimal düzeyde olup Cre, Tamoxifen tarafından kuvvetli bir şekilde
indüklenmiştir. Şu anda Cre farenin pek çok suşunda mevcuttur ve onlarda Tamoxifen- veya RU486-
indüklenmiş bölge-spesifik rekombinasyonun oldukça verimli olduğu gösterilmiştir (Brocard et al.
1997, Wang et al. 1997a, Schwenk et al. 1998). Koşullu mutantlar oluşturmanın yanı sıra,
indüklenebilir bölge-spesifik rekombinasyon transgen eksizyonunu haricen kontrol etmek için de
kullanılabilir. Bölümün başında tartışılan sistemlerden birini kullanarak, bitkilerde indüklenebilir
kontrol altında ekspresyon edilen Cre veya FLP rekombinaz ile ilgili bir dizi rapor yayımlanmıştır. Bu,
rekombinaz genin gelişim safhasına kadar (ki burada işaretleyicinin uzaklaştırılması gerekir) inaktif
bir durumda korunmasına müsaade eder. Üstelik bu strateji vejetatif olarak çoğalan bitkiler için de
uygundur. Tipik strateji, bir floxed gen içeren bitkiler ile koşullu ekspresyon edilmiş Cre genini içeren
bitkileri çaprazlamaktır. Bu eşeyli üremeyen bitkilerde mümkün değildir. Ancak, Cre geni
indüklenebilir bir kontrol altına yerleştirilerek floxed transgenin ve Cre geninin her ikisi de aynı
zamanda taktim edilebilir.

Kutu 15.1 Görülebilir İşaretleyici Marker, Şahit) Genler

Raportör genler, promotor aktivitesinin invitro testleri için yaygınca kullanılır (Kutu 12.1).
Ancak, sitolojik ya da histolojik işaretleyiciler olarak kullanılabilen raportörler çok yönlüdür, çünkü
bunlar gen ekspresyon proteinlerinin sağlam hücrelerde ve bütün organizmalarda belirlenmesine
imkan verir.

β-galactosidase ve β-glucuronidase
E. coli lacZ geni çeşitli sentetik analogların yanı sıra β-Dgalactopyranosides’leri (laktoz gibi)
hidrolize eden β-galactosidase’ı kodlar. Her ne kadar testlerin non-radyoaktif olma dezavantajı olsa da
CAT gibi β-galactosidase aktivitesi de invitro’da test edilebilir. Örneğin; hücre lizatları kromojenik
substrat ONPG kullanarak spektrofotometrik olarak test edilebilir ki bu çözünebilir sarı bir bileşik

272
[Metni yazın]

oluşmasına sebep olur. Alternatif olarak, daha hassas olarak florometrik test MUG substratı
kullanılarak yapılabilir. Histolojik boyama için Xgal substratı hücreleri parlakça işaretleyen bir
çözünemez mavi çökeltiye sebep olur. Hall ve arkadaşları (1983) tarafından ilk olarak lacZ geni
transfeksiyonu doğrulamak için memeli hücrelerinde ekspres edilmiştir. Bu deneyler için gen SV40
erken promotoruna ve fare meme tümör virüsü (MMTV) LTR promotoruna eklendi. Ayrıca hsp70
promotor ve lacZ arasında füzyonlar oluşturuldu ve Drosophila’da ısı-şok-indüklenebilir β-
galactosidase ekspresyonunu çalıştırdığı gösterildi (Lis et al. 1983). İşaretleyici olarak lacZ’nin bir
dezavantajı şudur: Belirli bir memeli hücreleri ve pek çok bitki yüksek seviyede bir endogenus β-
galactosidase aktivitesi gösterir bu da kimerik genlerin analizini örtbas edebilir (Helmer et al. 1984).
β-glucuronidase (GUS) enzimini kodlayan E. coli gusA geni bir alternatiftir ( Jefferson et al. 1986). Bu
marker endogenus enzimin minimum background aktivitesi bitkilerde tercih edilir. Ancak hayvanlarda
da başarılı bir şekilde kullanılmaktadır. β-galactosidase için tanımlanmış olanlara benzer invitro ve
histolojik test formatları GUS için de mevcuttur. Örneğin; bir histokimyasal substrat olan X-gluc
çözünmez mavi bir çökeltiye sebep olur.

Lusiferaz
CAT, GUS ve β-galactosidase stabil proteinlerdir ki bunlar kendilerini ifade eden hücrelerde
kalıcıdırlar. Stabil raportör proteinler ile ilgili bir problem şudur: Gen aktivasyonu faydalı
işaretleyiciler sağlamalarına rağmen bunlar gen aktivitesindeki hızlı değişimleri veya transkripsiyonel
baskılanma testleri için daha az kullanışlıdırlar. Lusiferaz, 1986’da hem hayvan (De Wet et al. 1987)
hem de bitkilerde (Ow et al. 1986) kullanılabilecek yeni bir raportör gen olarak tanıtılmıştır. Orijinal
işaretleme geni olan luc Kuzey Amerika ateşböceği olan Photinus pyralis’den izole edilmiştir ve 550
amino asitlik tek bir polipeptiti kodlar. Enzim lusiferin oksidasyonunu katalizler (oksijen gerektiren
bir reaksiyonunda, ATP ve magnezyum iyonlarının varlığında). İlave substrat sağlandığında mevcut
enzim miktarıyla orantılı bir ışık yayılır. Bu ışınım bir luminometre veya fotografik bir film
kullanılarak tespit edilebilir (Wood & DeLuca 1987). Lusiferaz sistemlerinin önemli avantajları
şunlardır; lacZ’ye göre 100 kat daha fazla olan yüksek hassasiyeti ve ışık emisyonunun hızlıca
zayıflamasıdır. Lusiferaz bu nedenle Drosophila period geni gibi salınan ekspresyon profilli genlerin
aktivitesini analiz etmek için kullanılmaktadır (Brandes et al. 1996). Lusiferaz sisteminin
yükümlülüğü, diğer organizmalardan alternatif lusiferazların izolasyonu vasıtasıyla genişletilmiştir ki
bunlar farklı renklerde biyoluminezlerdir (Thompson et al. 1990). Bir bakteriyal lusiferaz olan LuxA
geni transgenik bitkilerde bir işaretleyici olarak kullanılmıştır.

Yeşil floresan protein

Büyüyen raportör ailesine katılan en yeni üye deniz anası Aequoria victoria’dan yeşil floresan
protein (GFP)’idir. Beş yılı aşkın bir süredir bu olağan üstü molekül, moleküler ve hücresel biyolojide

273
[Metni yazın]

en beceriklilerden biri olarak ortaya çıkmıştır. Giderek artan bir çeşitlilikte bakteri, maya, hayvan ve
bitkilerdeki biyolojik proseslerin araştırılmasında kullanılmaktadır (reviewed by Tsien 1998, Haseloff
et al. 1999, Ikawa et al. 1999, Naylor 1999). GFP biyoluminesant işaretleyicidir ve hücrelerin mavi
veya ultraviyole ışığa maruz kaldıklarında parlak yeşil floresan yaymalarına sebep verir. Ancak,
lusiferazın aksine GFP herhangi bir substrata ihtiyaç duymaz, dolayısıyla gerçek zamanlı olarak test
etmek için canlı bir marker olarak kullanılabilir. Molekülün diğer avantajları ise toksik olmaması,
normal hücresel aktiviteyi engellememesi ve zor koşullar altında bile stabil olmasıdır (Ward
&Bokman 1982).
GFP ilk olarak heterolog bir işaretleyici olarak Caenorhabditis elegans’larda kullanılmştır
(Chalfie et al. 1994). Ancak, Drosophila (Wang & Hazelrigg 1994), memeli hücre soyları (Marshall
et al. 1995) ve bitkileri (Haseloff & Amos 1995, Hu & Chen 1995, Sheen et al. 1995) içeren GFP
ekspresyonu ile yapılan ilk deneyler, gfp geninin heterolog ekspresyonundaki bir dizi zorlukları tespit
etmiştir. Bazı bitkilerde güçlü GFP ekspresyonu için modifikasyonlar gerekli olmuştur. Örneğin;
Arabidopsis’de orijinal gfp geni, anormal splayzing nedeniyle çok zayıf bir şekilde ekspres edilir. Bu
problem, bu bitkide tanınan şifreli bir splayz bölgesinin çıkartılması ile çözülmüştür (Haseloff et al.
1997). Orijinal gfp, proteinin uyarma ve emüsyon dalga boyları gibi çeşitli özelliklerini değiştirmek
için geniş ölçüde modifiye edilmiştir (Heim & Tsein 1996, Zolotukhin et al. 1996, Cormack et al.
1997). Sonuç olarak şu anda proteinin dual etiketleme için kullanılabilen sarı floresan proteini (YFP)
ve mavi floresan proteini (CFP) gibi çeşitli varyasyonları mevcuttur (Tsien& Miyawaki 1998;
reviewed by Ellenberg et al. 1999).Pek çoğu mercan resif organizmalarından elde edilen diğer
renklerin floresan proteinleri de mevcuttur. Örneğin; DsRed, AmCyn ve ZsYellow proteinlerinin hepsi
mercan türevli floresan proteinleridir. Anthoza’dan (Matz et al. 1999) alınan bir kırmızı floresan
proteininin mutant formu zamanla yeşilden kırmızı floresana dönüşür ki bu onun geçici gen
ekspresyon modellerini karakterize etmek için kullanılmasına olanak sağlar (Terskikh et al. 2000).
GFP özellikle hücrede rekombinant proteinleri lokalize etmek için bir etiket sağlar. Bu yüzden
füzyon proteinleri için kullanışlıdır. Bu özellik hücre içi protein trafiğinin ve hatta hücreler arası
protein taşınımının incelenmesini kolaylaştırır. Bu uygulamaya ilk örnek Drosophila’da oogenesis
esnasında ribonükleoproteininin hareketini gözlemlemek için GFP’nin kullanılmasıdır (Wang &
Hazelrigg 1994). Kohler ve arkadaşları (1997) bitki organelleri arasındaki moleküllerin taşınmasını
çalışmak için GFP’yi kullandılar buna karşın Wacker ve arkadaşları (1997) salgı yolu boyunca bir
GFP-kuyruklu bir proteinin taşınmasını araştırdılar. Bitkilerde sistemik bir viral enfeksiyonunun
gerçek zamanlı dinamiğini çalışmak için GFP’nin kullanımı Padgett ve arkadaşları (1996) tarafından
tanımlanmıştır.

274
[Metni yazın]

Gen aktivasyonu için pek çok strateji hedef genin direkt modifikasyonuna ihtiyaç
duymaz
Geleneksel gen transferi stratejileri genoma transgen tarafından sağlanan bir gain-of-function
fenotip ile sonuçlanan yeni genetik bilgiler eklemektedir. Gen hedefleme ve bölge-spesifik
rekombinasyon halen bize, fare genomunun spesifik parçalarını bozmak veya silmek için beceri sağlar;
loss-of-function fenotiplerin araştırılmasına müsaade eder. Fakat bu yaklaşım diğer bitki ve
hayvanlarda rutin olarak kullanılamaz. Bu sebepten ötürü gen inhibisyonu için geniş ölçüde
uygulanabilir bir dizi alternatif transgen stratejileri geliştirilmiştir. Bu stratejiler genoma yeni genetik
bilgilerin takdim edilmesini kapsar. Ancak, bir fonksiyon kazancı yerine, transgen, bir endogenus gen
ekspresyonunu ya RNA ya da protein seviyesinde engeller. Gerçek hedef gen etkilenmez. loss-of-
function etkileri functional knockouts veya phenocopies olarak adlandırılır.

Antisens RNA, katlanılabilir (stoichiometric) tarzdaki mRNA aktivitesini bloke eder

Antisens RNA, mRNA’ya karşıt bir anlama (sense) sahiptir. Aynı hücredeki tamamlayıcı sense
ve antisense RNA moleküllerinin mevcudiyeti istikrarlı bir dubleks yapının formasyonuna yol açabilir
ki bu transkripsiyon seviyesindeki ya da RNA prosesi veya olası translasyon seviyesindeki gen
ekspresyonuna müdahale edebilir (Gree et al. 1986). Antisens RNA, bir dizi prokaryot sistemlerin gen
ekspresyonunu düzenlemek için doğal bir mekanizma olarak kullanılmaktadır (Simons & Kleckner
1988). Bu ökaryotlarda daha az oranda mevcuttur (Kimelman & Kirchner 1989, Lee et al. 1993,
Savage & Fallon 1995).
Belirli genlerin geçici inhibisyonu, antisens RNA veya antisens olgonükleotitlerin hücreye
direkt olarak sokulmasıyla başarılabilir. Ancak, hücrelerin antisens transgenler ile transformasyonu
(transgen promotora göre ters çevrilmiştir) antisens RNA’nın istikrarlı üretimine ve böylece gen
ekspresyonunun uzun-vadede inhibisyonuna müsaade eder. Bu prensip, transgenik hayvan ve
bitkilerde hemen hemen aynı zamanlarda kanıtlanmıştır. Katsuki. (1988) ve arkadaşları bir ekspresyon
kaseti oluşturdular ki burada fare myelin temel protein (MBP) cDNA’sını promotora göre ters çevirip
endogenus gene karşı yönlendirilmiş bir antisens RNA ürettiler. Transgenik farelerin bazılarında
MBP’nin seviyesinde %80’e varan bir azalma vardı.
Smith ve arkadaşları (1988) endogenus polygalacturonase (pg) genini hedef alan bir antisens
yapısı taşıyan transgenik domates bitkileri üretmişlerdir. Bu genin ürünü, yumuşamaya sebep olan ve
olgunlaşmaya yol açan bir enzimdir. Transgenik bitkilerde pg mRNA’nın seviyesi normal seviyenin
%6’sına düşürülmüş ve meyve daha uzun raf-ömrüne sahip olmuş ve morarmaya direnç göstermiştir.
Antisens yapılar, gen inhibisyonu için transgenik hayvan ve bitkilerde geniş ölçüde kullanılmıştır.
Ancak, tekniğin verimliliği geniş ölçüde değişiklik gösterir ve etkileri bazı durumlarda non-spesifik
olabilir. Bazı deneylerde, endogenus gen aktivitesini neredeyse tamamen durdurmak (shut down)
mümkün olmuştur. Erickson ve arkadaşları (1993) fare wnt-1 genine karşı antisens RNA üretmek için

275
[Metni yazın]

ters çevrilmiş bir cDNA kullanmışlar ve endogenus mRNA seviyesini normalin %2’sine
indirgemiştirler. Diğer taraftan her ne kadar antisens RNA’nın varlığı doğrulansa da, Munir ve
arkadaşları (1990) fare Hprt geninin ilk egzon ve intronuna karşılık gelen antisens RNA üretmek için
bir yapı dizayn ettiler ve endogenus mRNA seviyesinde hiçbir azalma olmadığını gözlemlediler.
Anlaşılan o ki, inhibisyonun seviyesi antisens RNA’nın boyutuna ya da tamamlayıcı olduğu
endogenus gen parçasına bağlı değildir. Örneğin; Moxham ve arkadaşları (1993) genin 5’ translate
edilmemiş bölgesinin sadece 39 bp’sine karşılık gelen antisens RNA’nın ekspresyonu sayesinde Gαi2
protein seviyesinde %95 azalmayı başarmışlardır.
Koşullu gen susturma, antisens yapıları indüklenebilir bir promotorun kontrolü altına
yerleştirerek başarılabilir. MMTV LTR promotorunun kontrolü altındaki antisens c-myc ekspresyonu,
indüksiyon yokluğunda transforme edilen hücrelerin normal büyümesi ile sonuçlanmıştır. Ancak
dexamethasone mevcudiyetinde neredeyse tam büyüme inhibisyonuyla sonuçlanmıştır (Sklar et al.
1991). Bitkilerde antisens ekspresyonunu kontrol etmek için tTA sisteminin kullanıldığı deneyler de
rapor edilmiştir (Kumar et al.1995).

Ribozimler Hedeflenen mRNA'ların Yıkımını Sağlayan Katalitik Moleküllerdir

Ribozimler RNA substratlarının özel bölgelerinden kesilmesini ve yapışmasını sağlayan
katalitik moleküllerdir. Antisens RNA içine ribozim katalitik merkezlerinin dahil edilmesi, ribozimin
parçalanma ve bozulmadan sonra mRNA molekülünü hedef alması için izin verir (Rossi 1995, James
& Gibson 1998). Ribozimlerin önemli bir avantajı antisense RNA üzerindeki katalitik aktiviteleridir;
ribozimler kesme reaksiyonlarından sonra yeniden kullanılabilirler ve bundan dolayı inaktive birçok
RNA molekülü olabilir. Bunun aksine, antisense inhibisyonu sense ve antisense RNA molekülleri
arasındaki sitoizometrik bağlanmayla sağlanır.
Ökaryotlarda spesifik gen inhibisyonu için ribozim yapılarının kullanımı Drosophila’da
olmuştur. İlk rapor olarak, Heinrick ve ark (1983) beyaz gene karşı hedeflanmiş ribozim yapısı içeren
P-element vektörünü Drosophila yumurtalarına enjekte ettiler. Ribozim Drosophila’da ısı şok
promotorunun kontrolü altında ekspres edilmektedir. Bu durumda, amaç gelişimsel regülatör fushi
tarazu (ftz) geniydi. Basitçe sıcaklığın 370C’ye yükseltilmesiyle ftz ekspresyonunun durdurulması
sağlanabilir ve böylece birçok mutant durumun meydana gelmesi mümkündür.
Ribozimler ağırlıklı olarak onkogenlerin çalışılması ve virüslere karşı direnç kazanımı
denemeleri için memeli hücre hatlarında da kullanılırlar (yorumlar Welch ve ark 1998). HIV’in
ribozim aracılı inhibisyonu hakkında yoğun araştırmalar olmuştur ve dikkate değer başarılar özellikle
çoklu ribozimler taşıyan retroviral vektörler kullanılarak elde edilmiştir (Welch ve ark 1998, Muotri ve
ark 1999). Şimdiye kadar, transgenik farelerde ribozim ekspresyonu nispeten az sayıda bildirilmiştir.
Larsson ve ark. (1994) β2-makroglobulin mRNA’sına karşı farelerde ekspreslenen 3 farklı ribozim
enzimi üretti ve %90 oranında endojen RNA düzeyini azaltmayı başardı. Ribozimlerin doku spesifik

276
[Metni yazın]

ekspresyonuda rapor edilmiştir. Glukokinaz mRNA’sına karşı hedef ribozim pankreasta endojen gen
spesifik inhibisyonu ile sonuçlanan insülin promotorunun kontrolü altında transgenik farelere eksprese
edildi (Efrat ve ark 1994). Son zamanlarda, tavuk embriyolarının içine antineurogulin riboziminin
retroviral salınımı rapor edilmiştir (Zhao&Lemke 1998). Neurogulin ekspresyonunun inhibisyonu
farelerde ekuilavelent (eş) homozigot null mutasyonuna çok yakın başlangıç yaşı faktörü üreten
embriyonik öldürücülük ile sonuçlanmıştır.

Kosupresyon Homolog Sense Transgenin Varlığı İle Endojen Bir Genin İnhibisyonur
Kosupresyon homolog endojen genin ekspresyonunun baskılanması için sense transgen
özelliğine başvurur. Bu şaşırtıcı fenomen ilk olarak bitkilerde ilgili genin ekstra kopyalarını
içermesiyle endojen proteininin seviyesini arttırmak için tasarlanan bir dizi deneyle gösterilmiştir.
Petunya çiçeklerinde sentezlenen pigment miktarını arttırmak için bir girişim olarak, Napoli ve ark
(1990) chalcone sentaz (chs) geninin birden fazla kopyasını taşıyan transgenik petunya bitkileri
ürettiler. Bu antisiyanin öncüsü chalcone içinde coumaroyl-CoA ve 3-malonyl-CoA’yı dönüştüren bir
enzim kodlar. Çoklu transgen kopyalarının varlığının enzimin seviyesini yükseltmesi ve derin bir
pigmentasyon sonucu beklendi. Ancak, deneyden çıkarılan bitkilerin yaklaşık %50’sinde tam ters etki
gözlenmiştir, örneğin, çiçekler ya saf beyaz ya da beyaz-mor alacalı renklerdeydi. Benzer bulgular
başka pigment biyosentez enzimi dihidroflavonol-4-redüktaz kodlayan transgen kullanan Van der Krol
ve ark (1988) tarafından bildirilmiştir. Her iki durumda da homolog endojen genlerin kosupresyonu ve
bazı ya da tüm transgenlerin baskılanmasına yol açan transgenin çok kopyalarının entegrasyonu
olduğu görüldü.
Yüksek transgen ekspresyonu düzeyleri ile bitki hatları üretimi sıkıntılı olsada, kosupresyonda
spesifik gen inaktivasyonu için bir araç olarak kullanılabilir. Bu nitelikte pek çok rapor bulunmaktadır.
Örneğin, anlamlı oryantasyonda pg geninin kısmi bir kopyasını içeren transgenik domatesler imal
edilmiştir (Smith ve ark 1990). Aynı grup tarafından (yukarıya bakınız) daha önce oluşturulan
antisense pg transgenik bitkiler olduğu gibi, endojen genin güçlü inhibisyonu raf ömrü uzun bir meyve
ile sonuçlanarak başarılmıştır. Kosupresyon hayvanlarda da gösterilmiştir (Pal-Bhadra ve ark 1997,
Bahramian&Zabl 1999, Dernberg ve ark 2000) ve mantarlarda belirlenen quelling olarak adlandırılan
benzer durumla ilişkilidir (Selker 1997,1999 tarafından yorumlandı).
Bitkilerde kosupresyon mekanizması karmaşıktır ve transkripsiyonel ya da post-
transkripsiyonel düzeylerde susturulmayı içerebilir (detay için kutu 15.2 ye bakınız). Post-
transkripsiyonel gen susuturulmasının en dikkat çekici yönlerinden biri (PTGS) yayılabilir sinyal
katkısı olduğunu düşündüren sistemik bir fenomen olduğudur. Bu susturuculu transgenik konaklar
üzerine susturucu olmayan transgenik aşılama ile ortaya konulabilir. Susuturma etkisini aşı içine
yaymak mümkündür ve 2 transgenik dokunun yabani tip kökten 30 cm kadar yukarısında bile sistemik
etkiyle çalıştığı görülmüştür (Palauqui ve ark 1997, Vionnet ve ark 1998).

277
[Metni yazın]

Bitkilerde PTGS virüs genomu ve entegre gen arasında homoloji bölgeleri var olduğu sürece,
sadece entegre gen tarafından değil aynı zamanda RNA virüsleri tarafından da uyarılabilir. Örneğin,
virüs endojen gen ya da konak genomu içine entegre olmuş transgen için homolog bir dizi taşıyabilir.
Angell&Baulcombe (1997) tarafından kanıtlandığı gibi, eğer bitki virüs genomunun bir kısmına
karşılık gelen bir cDNA ile transforme edilirse etkiside çalışır. Bu deney arkasındaki mantık gus A
raportör genini içeren kimerik patates X virüsü (PVX) genomuna karşılık gelen cDNA yapısı ile
transform bitki oluşturmaktı. Transgenin transkripsiyonundan sonra sonuçta elde edilen viral RNA
virüsünün kendi replikasyonunda çoğalacağından dolayı transgen ekspresyonuyla çok yüksek
seviyelerde β-glukuronidaz (GUS) aktivitesi umulmaktaydı. Ancak, hayal kırıklığı oldu, transgenik
bitkilerin tümü viral RNA ve GUS aktivitesini çok düşük düzeyde üretti. Bitkilerde aynı zamanda
PVX semptomlarının yokluğu gösterildi ve PVX enfeksiyonuna direnç bulunmuştur. Virüsten
kaynaklı susuturma etkisi sadece susuturma için tetikleyici viral replikasyonlar içeren çift zincirli
RNA (dsRNA) yı düşündüren kompotent replikasyon vektörü kullanılarak çalışıldı (Kutu 15.2’ye
bakınız).
PVX RNA verimliliği bitkilerde fonksiyonel knock-out oluşturmak için çok başarılı bir
şekilde kullanılır, PVX vektörleri bitki genomunda homolog genlerin susturulması içinde böyledir
(Baulcome 1999). Örneğin, Burton ve ark (2000) olduğu varsayılan bir selüloz sentazını kodlayan bir
cDNA sekansı içeren PVX vektörleri ile tütün bitkilerinin enfeksiyonunu belirtti. Aşılanmış bitkiler
cüce bir fenotip gösterdi ve etkilenen yapraklarda selülozun düzeyi %25 oranında azaldı. Bu kanıtlara
dayanarak, araştırmacılar cDNA’nın gerçekten böyle bir enzimi kodladığı ve endojen selüloz sentaz
geninin kosupresyon yeteneğine sahip olduğu sonucuna vardılar.

Kutu 15.2 Gen Susturulması

Ana metinde açıklandığı gibi, belirli bir gen ya da transgenlerin aktivitesini inhibe etmek için
spesifik sekans şekillerinde rol oynayan gen susturulmasının ökaryotlarda çeşitli biçimleri
bulunmaktadır. Susuturulmanın bu formları hem transkripsiyonel hem de post-transkripsiyonel
düzeyde meydana gelebilir. Bölüm içindeki ilk durumda, mRNA etkilenen genden üretilememişken
daha sonraki durumda transkripsiyon sadece izin için değil aslında susuturulmanın meydana gelmesi
için gereklidir. Transkripsiyonel susuturulma gen ekspresyonuna izin veren açık konfrigürasyon
(ökromatin) ya da gen ekspresyonunu baskılayan kapalı konfigürasyon (heterokromatin) formlarında
olabilecek kromatin yapısını yansıtır. Post-transkripsiyonel susuturulma (şimdi yaygın olarak RNA
susturulması olarak anılmaktadır) yıkım için spesifik sekanslar ile hedef mRNA yani belirli protein
komplekslerinin aktivitesini yansıtır. Susturulmanın iki çeşidinde de istilacı nükleik asitlere (virüsler,
transpozonlar vs.) karşı savunma mekanizmaları ortaya çıkmış ve her ikiside gen regülasyonu için
mekanizmalar olarak kabul edilmiştir. Bu susturma yolları arasında karışma vardır.

278
[Metni yazın]

Pozisyon-Bağımlı ve İçerik-Bağımlı Susturma

Transkripsiyonel susturulmanın bu formları tek-kopya transgenleri etkileyebilir bu nedenle,
homoloji bağımlı değildir. Pozisyon bağımlı susturma genomik bölge içeren heterokromatin içine
transgen entegrasyonu ile meydana gelir. Baskıcı kromatin yapısı ve DNA metilasyonu komşu
genomik DNA’dan transgenik lokus içine yayılabilir (Matzke ve Matzke 1998); bu yüzden, susuturma
negatif pozisyon etkisiyle sonuçlanabilir (pozisyon etkileri kutu 12.1’de daha detaylı ele alınmıştır.).
negatif pozisyon etkilerinden yoksun genomik bölgelerin içine kromatin entegrasyonu bile tek-kopya
transgenlerin susturulmasını sağlayabilir. Örneğin, entegre bir retrovirüs vektörü DNA
metilasyonunun artan düzeyiyle ilişkili olan de novo susturulmaya tabidir (Jahner&Jaenisch 1985).
Hayvanlar ve bitkilerde birçok ilişkisiz transgenler spesifik sekansların sorumlu olmadığı düşünülen
bu tip susturulma işlemine tabi tutulmuştur. Bu ökaryotik genomların yabancı DNA sekanslarının
belirlenmesi ve taranması için kullanılmayan sekans dizilerine dayanan ve sonra metilasyon ile
inaktive olan mekanizmalara sahip olması mümkündür (Kumpatta ve ark 1998). Prokaryotik diziler de
novo metilasyonu için güçlü bir tetikleyici olarak rol oynamasından beri prokaryotik DNA bu şekilde
kabul edilebilir, örneğin; transgenik fareler (Clarck ve ark 1997).

RNA Susturulması
RNA susturulmasının tüm formları (örneğin bitkilerde PTGS ve VIGS, kosupresyon, RNAi,
mantarlarda quelling) çift zincirli RNA’nın varlığına şu veya bu şekilde bağlı olduğu görülmektedir.
dsRNA’nın biogenezisi birçok yoldan meydana gelebilir, örneğin, RNAi’de hücrelerde komplementer
RNA’nın ekspresyonu ya da kasten girişi ile, PTGS’de kompleks transgenlerden anormal dsRNA’ların
üretimi ya da VIGS’de viral replikasyon ara ürünlerinin üretimi. dsRNA bir kez, kısa dubleks 21-25kb
uzunluğunda çıkıntıları indirgeyen Dicer adlı bir nükleazın substratı olacak forma sahip olur. Bu
dubleksler küçük müdahaleci RNA’lar (siRNA) olarak bilinir. Bunlar RNA kaynaklı susturma
kompleksi (RISC) olarak bilinen endonükleotik kompleksler içinde hedef komplementer mRNA ve
onların yarılması için siRNA’nın bir iplikçiğini kullanan Argonaute ailesinin birine dahil olan çeşitli
proteinler topluluğudur. RISC güçlü susturma ile sonuçlandığından etkilidir (Tıjsterman&Plasterk
2004). Birçok organizmada (fakat memeliler hariç) susturulma etkisinin kuvvetini artırmak için RNA
bağımlı RNA polimeraz tarafından siRNA’nın çoğaltılması vardır. siRNA molekülleri RNAi ve diğer
RNA susturma olgularının sistemik nedenlerini açıklayarak aynı zamanda hücreler arasında hareket
edebilir.

RNA Susturulması Genomik Bir Savunma Biçimidir

RNA susturulması invazif (istilacı) nükleik asitlere karşı bir savunma olarak evrimleşmiş
olabilir (Yoder ve ark 1997, Jones ve ark 1998, Jensen ve ark 1999, Li ve ark 1999). Bu PTGS ya da
RNAi de eksiklikleri gösterilen çeşitli organizmalarda mutantların son izolasyonu ile desteklenmiştir.

279
[Metni yazın]

RNA için engelli hayvanlar transpozon mobilizasyonunun artan oranlarını gösterir oysa PTGS için
engelli bitkiler viral enfeksiyon için çok daha duyarlıdır. İlginçtir, benzer gen ürünleri PTGS ve RNAi
arasında bir bağlantı için daha fazla kanıt sağlayacak şekilde farklı organizmalarda tespit edilmiştir.
Araştırmanın bu heyecan verici yeni alanın kapsamlı tartışması bu kitabın kapsamı dışındadır, ancak
ilgilenen okuyucular pek çok mükemmel yorumlara ulaşabilir (Plasterk&Ketting 2000, Hammond ve
ark 2001).

RNA Susturulması ve Gen Regülasyonu

Küçük RNA molekülleri aynı zamanda gen regülasyonunda rol oynar ve bu endojen
düzenleyicilerin yapısı RNA interferens deneyleri sırasında üretilen siRNA’lar ile çok benzerdir.
Mikro RNA olarak adlandırılan (miRNA) uzun dsRNA sadece prekürsürlerinin bölünmesi yoluyla
üretilmez aynı zamanda hairpin RNA prekürsürleri üreten küçük miRNA genlerinin direk transkripti
vardır. İşlenmiş miRNA’lar hedef mRNA’ların 3’ transle olmayan bölgelerine bağlanan ve bunların
translasyonunu düzenleyen miRNP (mikroribonükleoprotein) kompleksi adı verilen kompleks içine
toplanırlar. Tuhaf bir özellik olarak, ökaryotik genomda (Lim 2003) miRNA’nın yüzlercesinin keşfi
artık miRNA’nın gen regülasyonunun başlıca formu olabileceğini düşündürmektedir. Araştırmacılar
regülasyon için yardımcı süreçler ve miRNA’ların hedefleri belirlemesi üzerinde durmaktadırlar.
siRNA ve miRNA’lar mekanizmalarıyla (mRNA ayrılması ya da transkripsiyonel baskı) ayırt
edilirken, iki yol arasındaki kapsamlı örtüşme orjinlerine (hücre içi veya dışı üretilen çift zincirli RNA,
endojen genin transkripsiyonundan üretilen dsRNA) göre sınıflandırılabilir demektir. Seçilmiş yolun,
Dicer ile işlenen siRNA’ların türüne bağlı olduğu görülmüştür ve bölünmeye neden olan RISC’ler
içine toplanan en az bir hayvanda miRNA’lar diğer enzim olan Drosha ile işlenir, düzenleyici role
sahip miRNP’ler içinde toplanır. Bu kompleksler arasında seçim, komplementer zincirler arasında
eşleşmenin ne kadar mükemmel olduğuna bağlıdır. Eşleşmeyen dubleksler veya baloncuklar miRNA
gibi davranır oysa mükemmel dubleksler genelde siRNA gibi davranırlar (Bartel 2004, Kim 2005).

RNA Susturulması ve Transkripsiyonel Susturulma Arasındaki Tartışma

RNA susturulma aparatı aynı zamanda histon-modifiye enzimler ve DNA metiltransferazı
içeren modifiye kromatin proteinleri ile belirgin bir etkileşime sahiptir. Son kanıtlar RNAi
mekanizmalarının Drosophila ve memeli hücrelerinin (Matzke&Birchler 2005) yanı sıra maya ve
bitkilerde (Wassenegger 2005) epigenik işaretlerine rastlanabilir. İlgili mekanizmalar karmaşık
olmasına ve henüz tam olarak aydınlatılamamasına rağmen, ardışık tekrarlayan transpozonlar gibi (ve
belki entegre transgenler) genomun tekrarlayan bölgeleri rasiRNA’lar (tekrar ilişkili siRNA’lar) olarak
bilinen siRNA benzeri yapıların içine işlenen uzun dsRNA molekülleri üretebilir gibi görünüyor. Bu,
histon modifikasyonunun ve DNA metilasyonunun aracılık ettiği RITS (Transkripsiyonel

280
[Metni yazın]

susturulmanın RNA-bağımlı başlaması) olarak bilinen kompleksler ve Dicer ile bölünebilir (Xie ve ark
2004).

Şekil B15.1 Transkripsiyonel

ve post-transkripsiyonel
susturmaya neden olan küçük
RNA’lar yollarının modeli.

İnterferens RNA, Hücreye Çift Zincirli RNA’nın Doğrudan Girişinin Neden Olduğu
Susturulmanın Güçlü Bir Şeklidir
RNA interferens (RNAi) çift-zincirli RNA’nın varlığı nedeniyle özel gen susturulması
olgusudur. Süreç sense veya antisense RNA homolog genin ekspresyonunu baskıladığı zaman
nematod solucanı C. elegans’da gen susturulması üzerine çalışan araştırmacılar tarafından
keşfedilmiştir. Bu Fire ve ark (1998) ilk olarak solucanlar içinde sense ve antisense RNA’ların kasıtlı
girişini ve aynı zamanda tek iplikli RNA’nın yaklaşık 10 kat daha spesifik inhibitör etkisine neden
olduğunu gösterdi. Bunlar kontamine dsRNA’nın varlığı nedeniyle önceki deneylerde görülen
susturucu etkinin varlığıyla doğrulanmıştır. C. elegans’da keşfedilmesine rağmen, bitkilerde
kosupresyon ve virüs-kaynaklı gen susturulması dsRNA’nın (sırasıyla, anormal transgen ekspresyonu
ve viral replikasyon nedeniyle) üretimini içerdiği düşünülmesinin yanında, RNAi’nin ilkesi bundan
çokta eskilere dayanıyor.
İlk araştırmalar, dsRNA’nın sadece birkaç molekülü sitokiyometrikten daha katalitik olan
ribozim benzeri RNAi’yi düşündüren C. elegans’da RNAi indüklemesi için gerekli olduğunu gösterdi.
İnterferens post-transkripsiyonel süreci olduğunu belirten hedef genin ekzonları için dsRNA’nın

281
[Metni yazın]

homologu olduğu takdirde elde edilebilir. RNAi olgusu oldukça genel olarak görülür ve Drosophila
(Kennerdall&Carthew 2000), fareler (Wianny&Zernicka-Goetz 2000) ve bitkiler (Waterhouse ve ark
1998, Chuang&Meyerowit 2000) dahil olmak üzere birçok diğer organizmalar gen susturulma
deneyleri için kullanılmıştır. Gerçektende, RNAi basitliği, spesifikliği ve potansiyeli nedeniyle bu
organizmalarda büyük ölçekli fonksiyonel analizler için hızlı bir seçim yönetimi haline gelir
(Hammond ve ark 2001, Hannon 2002). Biz bölüm 19’da büyük ölçekli RNAi konusuna döneceğiz.
C. elegans’da mikroenjeksiyon RNAi’yi indüklemek için en tutarlı etki yapan yoldur. Tipik
olarak, in vitro sentezlenen dsRNA erişkin solucanların hücre hattı içine enjekte edilir ve soy RNAi
bağımlı fenokopyalar için taranır. Ancak, RNAi sistemik bir fenomen olduğundan, mikroenjeksiyon
bunun elde edilebildiği tek yol değildir. RNAi indüklemesi için teknik olarak kolay yollar;
solucanların sıvı besiyerlerine dsRNA eklenmesi ya da dsRNA’nın ekspresi için tasarlanmış olan
bakteriler üzerinden solucanların beslenmesini içermektedir (Maeda ve ark 2001, Fraser ve ark 2000).
Daha yakın zamanlarda, RNAi elde etmek için transgenik stratejiler popüler olmuştur. Çift karşıt
promotorlar ile tekli transgen (Wang ve ark 2000) ya da firkete (hairpin) RNA üreten bitişik sense
veya antisense transgen içeren (örneğin Chuang&Meyerowitz 2000, Tavernarakis ve ark 2000)
yapıların kullanımı dsRNA’nın stabil kaynağını ve dolayısıyla kalıcı gen inaktivasyonu için potansiyel
sağlar.
2001 yılına kadar, RNAi 30bp uzunluğundan daha uzun dsRNA’nın ve herhangi bir özel etkisi
olmayan maskelerin varlığında protein sentezi kapatılırdı bu ‘’interferon cevap’’ olarak adlandırılır, bu
alakasız olgu nedeniyle memelilerde mümkün değildi. Ancak, RNAi’nin mekanizması hakkında daha
fazlası öğrenildi. Kutu 15.2’de görüldüğü gibi, RNAi kısa interfer RNA’lar (siRNA) olarak bilinen 2nt
çıkıntılar ile 21 ya da 22bp uzunluğunda dsRNA’yı kısa fragmentler halinde kıran Dicer adlı enzim
tarafından ortaya çıkar. 2 grup arasındaki bağımsızlık gösterdi ki memeli hücrelerine transfekte
kimyasal olarak sentezlenen siRNA’lar interferon cevabı indüklemeden spesifik RNAi etkisini
uyarabilir olduğunu gösterdi (Elbashır ve ark 2001, Caplen ve ark 2001), daha fazla deney yapılmış
olmasına rağmen, RNAi tarafından indüklenen interferon cevabın bazı örnekleri rapor edilmiştir
(Bridge ve ark 2003, Sledz ve ark 2003). Memeli hücrelerinde RNAi’nin diğer bir problemi RNAi
yolunun bir kısmının eksik görülmesidir. Diğer organizmalarda, ancak memelilerde değil, etkiyi
uzatan ve daha etkili yapan tetikleyici RNA’nın intrinsik (içsel) çoğalmasının bazı formları vardır. C.
elegans’da, örneğin, yetişkin solucanlar içine dsRNA’nın etkisi enjekte solucanların yavrularında da
devam edebilir!! Memeli hücrelerinde çoğalmanın olmaması nedeniyle, siRNA’nın ekspresyonu için
transgenik sistemlerin geliştirilmesi büyük ilgi alanı olmuştur. Transgen ekspresyonu için geleneksel
stratejiler siRNA genlerinin çok kısa olması nedeniyle kullanılmaz. Bunun yerine, ekspresyon
kasetleri memeli genomunda kısa RNA genlerinin doğal olarak meydana gelmesini sağlayan
transkripsiyon enzimi RNA polimeraz III tarafından transkripsiyonu tasarlanmıştır. Bir yaklaşımda,
siRNA ipliklerinin her birini üreten, ardışık 2 pol III transkripsiyon ünitesi içeren plazmit inşa

282
[Metni yazın]

edilmiştir. Ayrı ipliklerin in vivo siRNA dubleksine kendiliğinden toplandığı düşünülmektedir. Çok
benzer ikinci yaklaşım, pol III transkripsiyon birimleri ayrı vektör üzerinde temin edilmektedir.
Bireysel RNA iplikleri aynı şekilde monte edilir. Üçüncü bir strateji olarak, kendini eşleştirme
tarafından siRNA içine toplanarak hairpin (saç tokası) RNA plazmitte üretilir. Ya RNA pol II ya da
RNA pol III hairpin siRNA’ların üretimi için kullanılabilir çünkü transgen uzundur. Bu gelişmeler
nedeniyle, birçok RNAi deneyi memeli hücrelerinde yapılmıştır (Tuschl&Borkhardt 2002, Mİttal
2004) ve ilk raporlar eş mutant fenotipleri yansıtan bazı durumlar fare ve sıçanlarda siRNA
transgeninin eşey hücre hattı transmisyonu ile ilgili olduğunu gösteriyor (Carmell ve ark 2003,
Hasuwa ve ark 2002, Kunath ve ark 2003). Başka deneyler, minumum fenotip sonuçlarıyla fare
organları içine nasıl in vivo siRNA transfeksiyonu yapıldığını göstermiştir (McCaffrey ve ark 2002).
RNAi’nin tıbbi uygulamaları potansiyel olarak çok heyecan vericidir ve bölüm 26’da tartışılmıştır.
RNAi aynı zamanda bitki biyoteknolojisinde uygulanır ve son raporlarda RNAi transgenleri
kullanılarak geliştirilen kültür bitkileriyle yapılan çeşitli deneyler tartışılmaktadır. Örnekler,
poliploidilerde genetik çoklukları aşmak için RNAi kullanımı (Lawrence&Pikaard 2003), giberellin
metabolizmasına müdahale ile pirinçle bitki boyunun değiştirlmesi (Sakamato ve ark 2003), pirinç
tanelerinin glutein içeriğinin değişimi (Kusaha ve ark 2003) ve pamuk tohumunun yağ içeriğinin
değişimi (Liu ve ark 2002) ve yaprakların gelişiminin kontrolünü (Palatnik ve ark 2003) içerir. En
ilginç gelişme kafein biyosentezini bastırmak için RNAi kullanarak kafeinsiz kahve yapımı için kahve
bitkilerinin üretimidir (Ogita ve ark 2003).

Gen İnhibisyonu Protein Seviyesinde De Mümkündür

Hücre İçi Antikorlar ve Aptamerler Protein Ekspresyonuna Bağlanırlar ve Onların

Toplanmasını ve Aktivitesini İnhibe Ederler
Antikorlar belirli hedef antijenlere karşı büyük bir özgüllük ile bağlanır ve bu nedenle seçici
biyokimyasal ajanları olarak birçok farklı yolda sömürülürler. Bu kitapta tartışılan örnekler cDNA
ekspresyon kütüphanelerinin immünolojik taranmasını (bölüm 6), immünoaffinite kromotografisi ile
rekombinant proteinlerin izolasyonu (bölüm 23) ve antikor-bazlı protein çiplerin geliştirilmesini
(bölüm 20) içerir. Benzer şekilde, proteinlerin bağlanmasıyla oluşan oligonükleotitler -aptamer olarak
bilinen- spesifik yakalama ajanı olarak kullanılabilirler. Hücre içine antikorların mikroenjeksiyonu
proteinlerin aktivitesini engellemek için yaygın olarak kullanılır, fakat bu yaklaşımın sınırlılığı
inhibitör etkisinin geçici olmasıdır (Morgan&Roth 1988 tarafından yorumlandı). Spesifik inhibitör
etkileride hibridoma hücre hattından RNA ile mikroenjeksiyonlu hücreler tarafından elde edilebilir
(Valle ve ark 1982, Burke&Warren 1984). Bu tür deneylerde lenfoid olmayan hücrelerde sentez ve
fonksiyonel antikorların toplanmasıyla ilk kanıtlar sağlanmıştır.
Spesifik proteinlerin uzun süreli inhibisyonunu elde etmek için, hücre içi antikorların (bazen
intrabadi olarak adlandırılır) ifade edilmesine olanak sağlayan cDNA yapıları hücrelere transforme

283
[Metni yazın]

edilebilir. (Richardson&Marasco 1995). Burada önemli hususlardan biri antijen bağlanmasına ek

olarak intrasellüler protein inhibisyonu için gerekli olmayan çeşitli efektör fonksiyonları ile birlikte
antikorların büyük multimerik proteinler olmasıdır. İntrasellüler antikorların ekspresyonu için strateji
tek-zincir Fv (scFv) fragmenti gibi modifiye antikor formları kullanılarak radikal olarak
basitleştirilmiştir (Şekil 15.10). Bu esnek peptit kolun birbirine bağlanmış immunoglobülinin ağır ve
hafif zincirlerinin antijen-bağımlı değişken domainlerini içermektedir. Böyle fragmentler ana
monoklonal antikorun spesifikliğini korur fakat nispeten küçük transgen tarafından kodlanır.
Ekspresyon yapıları için daha fazla modifikasyonlar çekirdek, mitokondri ya da sitoplazma gibi belirli
hücre içi bölmelerde antikorların hedeflenmesine izin verir. Dikkat edilmelidir ki, bu antikorlar normal
katlanmıştır ve endoplazmik retikulum (ER) ve Golgi aparatı içinde toplanmıştır ve salgı yolu
dışındaki hücre bölünmelerinde genel olarak daha az stabildir.

Şekil 15.10 Tek zincirli Fv fragmenti ile

immunoglobülin molekülünün
karşılaştırılması.

ER içinde yarı ömrü uzun olması nedeniyle, intrasellüler antikorlar plazma membranına
giderken bu bölmelerden geçmesine yardım eden hücre yüzey reseptörlerinin inhibisyonu için
özellikle yararlı olmuştur. Örneğin, fonksiyonel interlökin-2 (IL-2) reseptörünün hücre yüzey sunumu
dışsal olarak uygulanan IL-2’ye karşı duyarsız kalan hücrelerin ER’de anti IL-2Ra scFv fragmentinin
Jurkat hücrelerinde stabil ekspresyonu tamamen kaldırılmıştır (Richardson ve ark 1998). Hücre içi
antikorlar onkogenlerin aktivitesini kaldırmak için (Beerli ve ark 1994, Cochet ve ark 1998, Caron de
Fromental ve ark 1989) ve inhibe replikasyon ile virüs direncini tanımak için kullanılmıştır
(Rondon&Marasco 1997). Fonksiyonel antikorlar tam-boyutlu immunoglobülinler ve fragmentler aynı
zamanda bitkilerde ekspres edilebilirler. Hiatt ve ark (1989) bitki rekombinant antikorlarının
ekspresyonu, adlandırılan bitki gövdelerinde ilk defa gösterildi ve daha sonraki deneylerde hedef
spesifik viral proteinler ile viral hastalıklarda mücadele etmek için hayvan hücrelerinde olduğu gibi bu
stratejinin kullanıldığı gösterildi (Conrad&Fiedler 1998). Bitkilerde antikor ekspresyonu aynı zamanda
bitkilerde fizyolojik süreçler ile etkileşim için kullanılmıştır; örneğin, absisik asite karşı antikorlar
tütünde bu hormon tarafından sinyal bozmak için kullanılmıştır (Artsaenko ve ark 1995). Ekspres

284
[Metni yazın]

aptamerin bazı örnekleri (intramer olarakta bilinir) aynı zamanda protein aktivitesini baskılamak
içinde kullanılmıştır (örneğin Good ve ark 1997, Konopka ve ark 2000, Thomas ve ark 1997, Shi ve
ark 1999a). siRNA’da olduğu gibi, intramerin ekspresyonu genellikle pol III ekspresyon kaseti
gerektirir (Famulok&Verma 2002).

Aktif Proteinler Multimerik Toplanmalarda Dominant Negatif Mutantlar Tarafından

İnhibe Edilebilir
Diploid organizmalarda, fonksiyon kayıplı mutantlar en çok resesif veya semi-
dominant (dozajla ilgili) fenotipleri üretir, çünkü genin geriye kalan yaban tip kopyası normal
veya normale yakın aktivite için yeterli gen ürünü sağlar. Ancak, bazı fonksiyon kayıplı
mutantlar yaban tip alel üzerinde tamamen dominanttır, çünkü mutant gen ürünü yaban tip
proteininin aktivitesini engeller. Böyle mutantlar dominant negatifler olarak bilinir ve esas
dimer formları ya da büyük multimerik kompleksleri oluşturan proteinleri etkiler.
Dominant negatif transgenlerin kasıtlı aşırı ekspresyonu inaktif kompleksler içinde
temizlenerek tüm fonksiyonel moleküllerin ortaya çıkmasına neden olan belirli proteinlerin
mutant formları ile hücreye batırılmasında kullanılabilir. DNA yapılarının mikroenjeksiyonu
ya da Xenopus embriyoları içinde in vitro sentezlenen dominant-negatif RNA yaygın olarak
pek çoğu dimerik olan gelişmelerde hücre yüzey reseptörlerinin fonksiyonlarını incelemek
için kullanılmıştır (örneğin, Amaya ve ark 1991, Hemmati-Brivanlou&Melton 1992 bakınız.).
memeli hücrelerinde dominant-negatif proteinlerin stabil ekspresyonu hücre büyümesi ve
proliferasyonunun kontrolünü incelemek için ağırlıklı olarak kullanılmıştır. Arabidopsis’den
dominant-negatif etilen reseptörü transgenik domates ve petunyada etilenin duyarsızlığını
göstermiştir. Transgen ekspresyonunun etkiler çiçek senesensi ve meyve olgunlaşmasının
gecikmesini içerir (Wilkinson ve ark 1997).

285
[Metni yazın]

15. QUESTIONS AND ANSWERS

1. What are ribozymes? How do they act on their target? Explain with one example.
Ribozymes are catalytic RNA molecules that carry out site-specific cleavage and (in some
cases) ligation reactions on RNA substrates. An important potential advantage of ribozymes
over antisense RNA is their catalytic activity: ribozymes are recycled after the cleavage
reaction. For example; In the first such report, Heinrich et al. (1983) injected Drosophila eggs
with a P-element vector containing a ribozyme construct targeted against the white gene. They
recovered transgenic flies with reduced eye pigmentation, indicating that expression of the
endogenous gene had been inhibited. A ribozyme construct has also been expressed under the
control of a heat-shock promoter in Drosophila. In this case, the target was the developmental
regulatory gene fushi tarazu ( ftz).
2. What are transcriptional and post-transcriptional silencing? Explain.
There are several forms of gene silencing in eukaryotes, which act in a sequence-specific
manner to inhibit the activity of particular genes or transgenes. These forms of silencing can
occur at either the transcriptional or post-transcriptional levels. Transcriptional silencing
reflects the structure of chromatin, which can form an open configuration (euchromatin) that
is permissive for gene expression or a closed configuration (heterochromatin) that represses
gene expression. Post-transcriptional silencing (now more commonly referred to as RNA
silencing) reflects the activity of particular protein complexes that target mRNAs with a
specific sequence for destruction. Both forms of silencing have arisen as mechanisms of
defense against invasive nucleic acids (viruses, transposons etc.), and both have been
subjugated as mechanisms for gene regulation.
3. What is the co-suppresion? Explain with one example.
Cosuppression refers to the ability of a sense transgene to suppress the expression of a
homologous endogenous gene. For example, transgenic tomatoes have been produced
containing a partial copy of the pg gene in the sense orientation. As with the antisense pg
transgenic plants generated previously by the same group strong inhibition of the endogenous
gene was achieved, resulting in fruit with a prolonged shelf-life. Cosuppression has also been
demonstrated in animals and is related to a similar phenomenon called quelling, which has
been described in fungi.
4. What are the position and context dependent silencing? Explain their differences.
These forms of transcriptional silencing can affect single-copy transgenes and are not,
therefore, homology-dependent. Position-dependent silencing occurs where a transgene
integrates into a genomic region containing heterochromatin. The repressive chromatin
structure and DNA methylation can spread into the transgenic locus from the flanking
genomic DNA; therefore silencing results from a negative position effect. Single-copy
transgenes may also be silenced, even if they integrate into a genomic region that lacks
negative position effects. For example, integrated retrovirus vectors often undergo de novo
silencing associated with increased levels of DNA methylation. Many unrelated transgenes in
animals and plants have been subject to this type of silencing, suggesting that a specific
sequence is not responsible.
5. What are siRNA and miRNA, RNAi? Draw the shape differences between the
mechanisms.

286
[Metni yazın]

Once the dsRNA has formed, it becomes the substrate of a nuclease called Dicer, which
reduces it to short duplexes, 21–25 bp in length with overhangs. These duplexes are known as
small interfering RNAs (siRNAs). Small RNA molecules are also involved in gene regulation,
and the structure of these endogenous regulators is very similar to that of the siRNAs
produced during RNA interference experiments. These so-called microRNAs (miRNAs) are
produced not through the cleavage of longer dsRNA precursors, but are the direct transcripts
of small miRNA genes that generate hairpin RNA precursors. RNA interference (RNAi) is a
sequence-specific gene silencing phenomenon caused by the presence of double-stranded
RNA. The process was discovered by researchers working on gene silencing in the nematode
worm C. elegans, when they observe that either sense or antisense RNA could suppress the
expression of a homologous gene.

6. What are features of mtDNA? Explain.

Mitochondria are found in almost every eukaryotic organism and their primary function is the
generation of ATP by oxidative phosphorylation. The mitochondrial genome is characterized
by a bewildering diversity of structures and mechanisms of gene expression. Although most
mtDNA consists of a single DNA molecule of uniform length, molecules of varying length
are found in some protists. The size of mtDNA in most eukaryotic phyla ranges from 15–60
kb but there are some notable exceptions. The mtDNA of the malarial parasite (Plasmodium
spp.) is only 6 kb long while that of rice (Oryza sativa) is 490 kb and in cucurbit plants it may
have a size of 2 Mb. The differences in mtDNA genome size mostly reflect the size of the
intergenic regions and their content of tandem repeats. The mitochondrial genome of most
animals is very compact and has very little intergenic space and no introns.
7. What are features of ctDNA? Explain.
The complete sequence of ctDNA has been reported for over a dozen plants including the
single-celled protist Euglena a liverwort and angiosperms such as Arabidopsis, spinach,

287
[Metni yazın]

tobacco, and rice. Overall, there is a remarkable similarity in size and organization. The
differences in size are accounted for by differences in length of introns and intergenic regions
and the number of genes. A general feature of ctDNA is a 10–24 kb sequence that is present
in two identical copies as an inverted repeat. The proportion of the genome that is represented
by introns can be very high, e.g. in Euglena it is 38%.

The chloroplast genome encodes 70–

90 proteins, including those involved
in photosynthesis, four rRNA genes,
and 30 or more tRNA genes.

8. What is the telomers? Explain.

The ends of eukaryotic chromosomes are also the ends of linear duplex DNA and as such
require a special structure to ensure that they are maintained. The reason for this is connected
with the way in which double-stranded DNA is replicated. DNA synthesis occurs in a 5′ → 3′
direction and is initiated by extension of an RNA primer. After removal of this primer there is
no way of completing the 5′ end of the molecule. In the absence of a method for completing
the ends, chromosomes would become shorter after each cell division. Telomeres are
specialized nucleic acid sequences whose role is to protect the ends of chromosomes. In most
eukaryotes the telomere consists of a short repeat of TTAGGG many hundreds of units long
but in S. cerevisiae the repeat unit is TG1−3. These repeats vary considerably in length
between species but each species maintains a fixed average telomere length in its germline.
9. What is the telomerase? And where is it? Explain.
The enzyme telomerase, also called telomere terminal transferase, is a ribonucleoprotein
enzyme whose RNA component binds to the single-stranded end of the telomere. Telomeres
are found at the ends of chromosomes and their role is to protect the ends of chromosomes.
They also stop chromosomes from fusing to each other. Telomerase is found in fetal tissues,
adult germ cells, and cancer cells. In normal somatic cells the activity of telomerase is very
low and each time the cells divide some of the telomere (25–200 bp) is lost. When the
telomere becomes too short the chromosome no longer divides and the host cell dies by a
process known as apoptosis. Normal somatic cells are mortal. Cancer cells can divide
indefinitely in tissue culture and thus are immortal. Telomerase has been found in cancer cells
at activities 10- to 20-fold greater than in normal cells.
10. What are the split genes and splicesome? Explain.
In some genes the coding sequence is interrupted by the presence of non-coding (untranslated)
sequences known as introns. Such genes are known as split genes and the parts of these genes
that are translated are known as exons. Split genes are rare in prokaryotes although they are
commoner in archaebacteria than eubacteria. Split genes are much commoner in eukaryotes
but the number of such genes, and the number and size of introns per gene, increase with
genome complexity. After split genes are transcribed the introns are excised and the exons
spliced together by a complex of snRNA and some 145 different proteins known as the
splicesome. As the number of introns within a gene increases it is possible for the pre-mRNA

288
[Metni yazın]

(unspliced messenger) to be spliced in different ways. This is known as alternative splicing

and provides a mechanism for producing a wide variety of proteins from a small number of
genes.

289
[Metni yazın]

16. BÖLÜM

GENOM ORGANİZASYONU VE YAPISI

290
[Metni yazın]

Giriş
Tüm hücreli organizmaları kıyasladığımızda, genom yapılarında büyük çeşitlilik olduğu
görülmektedir. Örneğin, bakteriyal genom sadece kodlanan genlerden oluşurken, yüksek yapılı
ökaryotlarda DNA’nın kodlanmayan kısımlarını büyük bir denize benzetecek olursak, genlerde bu
deniz içindeki küçük bir ada kadardır. Evrimsel ağaca bakıldığında genlerin bile yapısal olarak daha
kompleks oldukları görülebilmektedir. Bütün genom seviyesinde, bakteri, virüs ve organel genomları
arasında anahtar farklılıklar vardır. Ökaryotlar arasında da, sekans sırasında, DNA miktarında ve
kromozom sayılarında farklılıklar mevcuttur.

Hücreli organizmaların genomları büyüklük bakımından çeşitlilik gösterir

Bir organizmanın farklı hücreleri farklı ploidi’ye sahip olabilir, örneğin, eşey hücreleri
haploidken somatik hücreler diploittir. Genom büyüklüğü daima haploid genomla ilişkilendirilir.
Haploid genom büyüklüğü C değeri olarak da bilinir. C değerleri, en küçük virüs olan kolifaj MS2’de
3,5 X 103 ile bazı amfibi ve bitkilerde olduğu gibi 1011 arasında değer alabilmektedir (Şekil 16,1). En
büyük viral genom 1–2 x 105 bp’dir ve en küçük hücreli olan mikoplazmalardan (5 x 105) sadece biraz
daha küçüktür. Basit tek hücreli organizmaların genom büyüklüğü 1–2 x 107’dir ve bu en büyük
bakteriden daha büyük değildir. Nemotodlar gibi ilkel çok hücreli organizmalar dört kat daha büyük
genoma sahiptir. Birçok organizmanın genom büyüklüğü karşılaştırıldığında, minimum C değerinin,
belirli bir filumda bulunan bireyler arasında farklılık gösterdiği bulundu. Evrimsel olarak daha
kompleks organizmalarda minimum genom büyüklüğü daha büyüktür. (şekil 16.2).
Şekil 16,1’de her filum’um içerisinde genom büyüklükleri aralıkları sunulmuştur. Bazı
filumlarda, örneğin memelilerde en küçük ve en büyük C değeri arasında sadece iki kat fark vardır.
Diğerleri arasında, örneğin böcekler ve bitkilerde 10–100 kat arasında büyüklük farkı görülmektedir.
Gerçekten, çiçekli bitkilerin gen sayısında 100 kat kadar çeşitlilik var mıdır? Bu bilgilere göre, bitki
genomu, insan genomuna göre daha kompleks olduğu anlamına mı gelir? Bu soruların çözümü için, C
değeri paradoksları, grafikte yerleştirilerek, genom komplekliğini analiz etmeyi sağladı (Kutu 16,1).
Bu teknik kullanılarak genomun emsalsiz DNA sekanlarından ve tekrarlanan sekaslardan oluştuğu
gösterildi ve ikisi arasındaki oran organizmalar arasında farklılık gösterir (Şekil 16,3). Basit
organizmalarda DNA’nın hemen hemen hepsi emsalsiz DNA sırasından oluşur. Bu karşın, yüksek
yapılı organizmalarda tekrarlayan DNA’ların sayısı fazladır. Tekrarlayan DNA’ların başlıca iki çeşiti
mevcuttur: ardışık tekrarlar ve dağınık tekrarlar (Şekil 16,4).
Genel olarak, tekrarlanmayan DNA’ların büyüklükleri evrim ağacında yukarıya doğru
çıkıldıkça artar ve memelilerde maksimum değeri olan 2 x 109 bp’ne ulaşır. Gerçekte, birçok bitki ve
hayvanda C değerinin büyük olması, tekrarlayan sıraların fazla olduğunu göstermektedir. mRNA’nın
DNA ile hibridizasyon analizleri, birçoğunun tekrarlanmayan DNA’ya bağlandığını gösterdi yani
birçok gen, tekrarlanmayan DNA içerisindedir. Bu yüzden, genetik çeşitlilik, tekrarlanmayan DNA ile
orantılıdır fakat genom büyüklüğü ile orantılı değildir. Bir sonraki bölümde daha iyi anlaşılacağı gibi,

291
[Metni yazın]

tekrarlayan DNA’lar genom sekansının tamamlanmasını zorlaştırmaktadır. Dolayısıyla, eğer biri,

belirli bir phylum’un sekansını yapmak isterse, en az tekrarlayan DNA’lara sahip olanı seçmelidir. Bu
sebeple, ilk olarak Arabidopsis (125 Mb) ve pirinç (430 Mb) genomları sekans edilmiştir (Şekil 16,1).

Şekil 16.1 Filumların haploit

genomunun DNA içeriği. Bir filum
içinde değer aralığı gölgeli alanda
gösterilmektedir (Oxford üniversitesi
yayınları izniyle Lewin 1994 yılında
çizilmiştir.).

Şekil 16.2 Organizmaların sahip

olduğu minumum genom
büyüklüğü. (Oxford üniversitesi
yayınları izniyle Lewin 1994
yılında çizilmiştir.)

Kutu 16.1 Genom Karmaşıklığı Tekrar Birleşme Kinetiği Kullanılarak Analiz Edilebilir
Bir solüsyonun içerisindeki çift zincirli DNA ısıtıldığı zaman, denatüre olarak (eriyerek)
komplementar tek zincirler oluşur. Eğer solüsyon hızlıca soğutulursa DNA tek zincirli olarak kalır.
Ancak, solüsyon yavaşça soğutulursa zincirler yeniden birleşir. Pratikte, yeniden birleşme için
optimum sıcaklık, dubleksin %50’sinin ayrılması için gerekli olan erime sıcaklığının (Tm) 25°C’nin
aşağısındadır. Ayrıca, inkübasyon zamanı ve DNA konsantrasyonu, DNA’nın yeniden birleşmesini
sağlayacak çakışmaların olması için uygun olmalıdır. DNA fragmentlerinin büyüklüğü yeniden
birleşme oranını etkiler ve bu yüzden DNA kontrollü olarak küçük fragmentlere bölünmelidir.
Komplementar zincirlerin yeniden birleşmesi çakışmaların sonucudur ve bu yüzden oran
konsantrasyonlara bağlıdır. Çünkü iki zincir, ikinci sıradaki kinetiği takip eden işlemlere tabi tutulur.
Böylece t zamanında C değeri tek zincirli DNA konsantrasyonunu ifade ederse k de tekrar birleşme
oranı sabitini ifade eder.
292
[Metni yazın]

C, t zamanındaki tek zincir DNA’yı temsil ederse, k’da yeniden birleşme oranı sabitidir. Eğer Co t =
0’da ki tek zincir DNA’nın başlangıç konsantrasyonu ise, yukarıdaki eşitliğe göre şu eşitlik meydana
gelir;

Yeniden birleşmenin yarısı tamamlanınca, C/C0 = 0.5 ve yukarıda ki eşitlik şu şekilde özetlenebilir;

Buna göre, C0t1/2 değeri ne kadar büyükse, DNA’nın o konsantrasyondaki reaksiyonu o kadar yavaştır.
Daha da önemlisi, DNA’nın o konsantrasyonundaki yeniden birleşme oranı farklı fragmentlerin
sayısına bağlıdır (Britten & Kohne 1968). Bu tablo B16.1 incelendiğinde daha iyi anlaşılacaktır.
Çünkü yeniden birleşme oranı komplementar zincirlerin konsantrasyonuna bağlıdır. B organizmasının
C0t1/2 değerine göre yeniden birleşme A organizmasından 200 kat daha hızlıdır.
Deneysel olarak da tekrar birleşmenin oranının gerçektende genom büyüklüğünün oranına
bağlı olduğu gösterildi ( Şekil B16.1). Bununla birlikte, bu orantı tekrarlı dizilerin yokluğunda sadece
doğrudur.

Tablo B16.1 İki organizmanın farklı

genom büyüklükleriyle sekans
kopyalarının karşılaştırılması

293
[Metni yazın]

Şekil B16.1 Çeşitli kaynaklandan elde edilen çift zincir nükleik asidlerin yeniden birleşmesi (Oxford
University Press izniyle Lewin tarfından 1994 yılında yeniden çizilmiştir.).

Şekil B16.2 Dana timus DNA sının

yeniden birleşmesinin kinetiği. Şekil
B16.1 de gösterilenlerle grafiğin
şeklini karşılaştırın.

294
[Metni yazın]

Şekil B16.3 İki farklı tip tekrarlayan

DNA’nın bulunduğu ökaryotik DNA
örneklerinin yeniden birleşme
kinetiği. Oklar, üç bileşenin C0t1/2
değerini göstermektedir. (Oxford
University Press izniyle Lewin
tarfından 1994 yılında yeniden
çizilmiştir.).

Dana timus DNA’sının yeniden birleşmesinin ilk çalışıldığı zaman, kinematik analizler iki
bileşenin varlığına işaret ettiler (Şekil B16.2). DNA’nın yaklaşık %40’ının C0t1/2 değeri 0.03 iken,
%60’ının C0t1/2 değeri 3000’di. Hızlı birleşen DNA’nın konsantrasyonu, yavaş birleşenden 100.000
kez daha fazlaydı. Yavaş birleşmede bir parçanın birleştiği sürede hızlı birleşmede ortalama 100.000
parça birleşmektedir. Bu sebeple, C0t1/2 değeri DNA’nın sekans kompleksitesini belirlemek için
kullanılabilir. Farklı kaynaklardan hazırlanan DNA’ların karşılaştırmalı analizleri tekrarlanan sıraların
ökaryotlarda sıkça raslandığını gösterdi (Davidson &Britten 1973) ve farklı tipde birçok tekrar
bulunmaktadır. Şekil B16.3’deki örnekte gösterildiği gibi, hızlı birleşme ve aracı birleşme bileşenleri,
eşsiz veya tekrarlanmayan DNA olabilen yavaş bileşenlerinin aksine fark edilebilir ve bu bileşenler
farklı sayıda olabilmektedir (sırasıyla 500.000 ve 350).

Şekil 16.3 Farklı organizmalarda

tekrarlı DNA’nın oranı.

295
[Metni yazın]

Şekil 16.4 Ökaryotlarda DNA’nın iki tipi bulunur; dağınık tekrarlar (şeklin üst kısmında),
tandem tekrarlar (şeklin alt kısmında). Mor kutular tekrarlı DNA’nın temsilcisidir ve ince siyah
çizgiler genomun geri kalanını temsil eder.

Genom kompleksliliği, bazen gen yapısının kompleksliliğinin artmasıyla birlikte artar

İntron olarak bilinen kodlamayan (translasyona uğramayan) sekansların genlerde bulunması,
bazı genlerin kodlayan sekanslarını bozabilir. Bu genler, split genler (intron içeren genler) olarak
bilinir ve ekzonlar (translasyonu olan gen parçaları) da bu genlerin bir parçasıdır. Split genler
arkeobacterilerde, öbakterilerden daha yaygın bulunmasına rağmen, prokaryotlarda çok nadir
bulunurlar (Edgell et al., 2000, Martinez-Arbaka & Toro 2000). Split genler ökaryotlarda çok daha
yaygındır; fakat bu genlerin sayısı ve her gendeki intronların sayı ve büyüklüğü genom
kompleksliliğiyle birlikte artar (Şekil 16.5). Örneğin tomurcuklanarak çoğalan Saccharomyces
cerevisia genomunda 6000’den fazla açık okuma bölgesi ve sadece 330 intron vardır (Lopez &
Serapin, 2000). Split genler, sadece tek bir intron içerme eğilimindedir ve en uzun intron sadece 1 kb
uzunluktadır. İntronlar bölünerek çoğalan Schizosaccharomyces cerevisia’da (intron içeren genler
genomun %43’ü kadardır) daha çok yaygındır; fakat yine de intronlarının uzunluğu kısadır. Tavuk
kollejen geninde 50’den fazla ekzon, insan distrofin geninde 78 intron ve Drosophila’daki Dscam
geninde 100’den fazla intron vardır. Bununla birlikte, bu organizmalardaki intronlar ekzonlardan daha
büyüktür (Şekil 16.6). En çok bilinen ilgi çekici bir örnek: distrofin geni 2,5 Mb büyüklüktedir; fakat
kodlayan sekanslar sadece 14 kb uzunluktadır. İnsanlarda bulunan en uzun intron 480 kb’dır ve bu en
küçük bakteri genomuyla aynı büyüklüktedir!
Akraba genlerde exonlar hemen hemen benzer büyüklüktedir; fakat genlerin kendileri oldukça
değişik uzunluktadırlar. Bu, intronların benzer bölgelerde olmaları gerektiği; fakat büyüklüklerinin
farklı olabileceği anlamına gelir (Şekil 16.6). Bununla birlikte, eğer intron içeren bir gen klonlanmışsa,
ekzon veya intron sekanslarını sub-klon yapmak mümkündür. Eğer bu sub-klonlar genomik Southern
blot hibridizasyonunda prob olarak kullanılırsa, genomun herhangi bir yerinde benzer sekanslar
olduğu takdirde, bu problar bunları tespit edebilir. Bir gende bulunan ekzon sekansları çoğunlukla
diğer bir veya daha fazla gende de vardır. Bu tarz gen familyalarına bazı örnekler tablo 16.1’de
verilmiştir.
Bir ekzonun birçok kopyası ilişkili olmayan genlerde de birkaç kopya halinde bulunabilir.
Birkaç ilişkisiz genin sahip olduğu benzer ekzonlar farklı proteinlerde benzer özellikleri gösteren
benzer polipeptit bölgelerini (domainleri) kodlarlar. ATP ve DNA bağlanma buna örnektir. Bazı

296
[Metni yazın]

genler mozaik olarak görünürler. Bunun sebebi farklı genlerdeki karakteristik ekzon kopyalarının
birlikte yapıştırılmasıdır ve bu fenomen ekzon shuffling (ekzon karışıklığı) olarak bilinir. Şunu
belirtmek gerekir:
protein domainleri ve ekzon yapıları arasında güçlü bir ilişki olmasına rağmen, özellikle
metazoada, bunlar arasında her zaman bir ilişki yoktur.

Tablo 16.1 Multigen ailelerin bazı

örnekleri.

İntron içeren genlerden kaynaklanan kompleksliliğin ikinci bir özelliği vardır. İntron içeren
genler transkripsiyona uğradıktan sonra intronlar çıkarılır ve 145 farklı proteinden oluşan splicesome
ve snRNA tarafından ekzonlar yapıştırılır. Bir gende bulunan intronların sayısına bağlı olarak, pre-
mRNA (splice olmamış mRNA)’nın farklı yollarla splice’a uğraması mümkündür (Thanaraj ve ark.,
2004). Bu alternatif splicing olarak bilinir ve bu mekanizma az sayıdaki genlerden, çok çeşitli
proteinlerin üretilmesini sağlar (bazı basit örnekler için okuma parçası 16.2’ye bakınız). Drosophila
dscam geni 108 ekzon içerir ve teorik olarak alternatif splicing 38016 farlı protein üretebilir!

Şekil 16.5: Üç ökaryot organizmada

bulunan ekzon sayıları. Sadece tek
bir ekzon içeren, intron içermeyen
genler grafiğin sağ tarafındadır.
(Oxford University Press izniyle
Lewin tarafından 1994 yılında
yeniden çizilmiştir.)

297
[Metni yazın]

Şekil 16.6: Globulin süper ailesinin farklı üyelerdeki intron yerleşimi. İntronların baz çifti
büyüklükleri üçgenlerin içinde gösterilmiştir. Her polipeptitin büyüklüğü ve intronların farklılıkları
arasındaki ilişki tutarlıdır.

Virüsler ve bakteriler çok basit bir genoma sahiptir

Virüsler büyük bir çeşitlilik göstermesine rağmen, virüs ve prokaryotların genomu çok basit
bir yapıdadır (Dimmock ve ark., 2001). Bir çok virüs tek zincir lineer veya halkasal bir genoma
sahiptir; fakat reovirüsler, bakteriyofaj Φ6 ve bazı bitki virüsleri gibi, bazı virüsler segmentli RNA
genomuna sahiptir. Uzun bir süre, tüm öbakterial genomların tek zincir halkasal bir kromozomdan
oluştuğuna inanılıyordu. Buna rağmen lineer kromozomlar, Borrelia sp., Streptomyces sp. ve
Rhodococcus fascians’da bulundu ve haritalama Coxiella burnetii’nin de lineer bir genoma sahip
olduğunu göstermiştir. Rhodobacter spheroides, Brucella melitensis, Leptospira interrogens ve
Agrobacterium tumefaciens bakterilerinde iki kromozom bulundu. Halkasal kromozomlar içeren
birçok bakteride olduğu gibi, Agrebacterium’da halkasal bir kromozom ve buna homolog olmayan
başka bir lineer kromozom vardır (Goodner ve ark., 1999). Lineer plazmitler Borrelia sp. ve
Streptomyces sp. de bulunmuştur (Casjens ve ark., 2000). Bakterilerde membrana bağlı ayırıcı bir
sistem olmasına rağmen, ökaryotik kromozomlarda bulunan sentromer bakteri genomlarında yoktur.
Genom duplikasyonu replikasyon orijininde başlar ve tek yönlü veya çift yönlü olarak
gerçekleşir. Replikasyon orijinin yapısı, oriC lokusu, bakterilerde uzun süre çalışılmıştır ve çok benzer
298
[Metni yazın]

bir yolla, genlerin zorunlu benzer bölgeler içerdiği bulunmuştur (Cole & Saint Girons 1994). oriC
lokusu, ribozomal RNA operonuna bağlı gyrB (DNA girazın B altbirimi) genleri veya dnaA için bir
bölge (cDNA başlangıç) olarak tanımlanır.

Bir çok bakteriyal ve viral genom halkasaldır veya replikasyon amaçlı halkasal bir
konformasyona uyum sağlayabilir. Buna rağmen, lineer konformasyonda olan, bu viral ve bakteriyal
genomlar kromozom uçlarını replike etmek için özel bir mekanizmaya ihtiyaç duyarlar (Okuma
parçası 16.3). Virüsler lineer moleküllerin uçlarını replike etmek için bir çok farklı stratejiler
gösterirler (Dimmock ve ark., 2001); fakat bakterilerde bunun için iki ana mekanizma vardır (Volff &
Altenbuchner 2000). Borrelia’ da, kromozomlar uç kısımlarında kovalent bağlarla kapalı hairpin
(firkete) yapısındadır. Böylesi yapılar Borreli plazmitlerinde, Escherichia coli faj N15’de,
poxvirüslerde, ve Williopsis ve Pichia mayalarındaki lineer mitokondriyal DNA moleküllerinde de
bulunmuştur. Bu hairpin yapıların molekül uçlarının replikasyonunu nasıl kolaylaştırdığı bilinmiyor.
Bunun aksine, Streptomyces’lerde, lineer moleküller DNA’nın 5’ uçlarına bağlı proteinlere sahiptir ve
bu proteinler adenovirüslerde, birçok bakteriyofaj, fungus ve bitki mitokondriyal plazmitlerinde de
bulunmuştur. Bu terminal proteinler muhtemelen replikasyonun tamamlanmasında görevlidirler.
Bununla birlikte, Streptomyces lineer replikonları, uç kısımlarda palindromik sekanslara ve zıt yönlü
tekrarlara (inverted repeat) sahiptir.
Tamamı sekans edilmiş bakteriyal genomların büyüklükleri 0,6 – 9,1 Mb arasındadır. En
küçük ve en büyüğünün boyutlarındaki farklılık intronların bir sonucu değildir, çünkü prokaryotlarda
intronlar çok nadir bulunurlar (Edgell ve ark., 2000; Martinez –Abarca & Toro 2000). Bu aynı
zamanda tekrarlayan DNA sekansları yüzünden de değildir. Denatüre olmuş bakteriyal DNA’nın
renatürasyon kinetik analizleri E.coli’de tekrarlayan DNA sekanslarının varlığını göstermez (Britten &
Kohne 1968) ve sekans edilmiş tüm bakteriyal genomlarda sadece küçük bir miktar belirlenmiştir.
Mycoplasma genitalium (0,58 Mb) ve E.coli (4,6 Mb) genomlarının yaklaşık %90’ı protein kodlayan
genlerden oluşmuştur. Bundan dolayı büyüklükler arasındaki farklar taşıdıkları gen sayılarını yansıtır.

Virüs ve bakteriler çok basit genomlara sahiptir

Ori C lokusu ribozomal RNA operonlarını bağlayacak gyr B genleri yada harboring DNA a
bölgesi olarak belirlenir. Çoğu bakterial ve viral genomlar sirküler yada replikasyon amacıyla sirküler
yapıya adapte olabilir.ancak linear konfirgasyonu sürdüren bakterial ve viral genomlar kromozom
ucunda replikasyonu sağlayacak özel bir mekanizmaya ihtiyaç duyarlar.linear moleküllerin sonundaki
replikasyon için farklı strtejiler virüsler tarafından benimsenmiştir.fakat bakteride iki temel
mekanizma vardır.Borrelia ‘da kromozomlar son kısımlarında kapalı firkete yapılarına sahiptir.böyle
yapılar Borrelia plazmidlerinde , E.coli faj N 15 , poxvirüs ve Williopsis , pichia daki linear
mitokondrial DNA moleküllerinde bulunur.tam olarak moleküllün ucundaki replikasyonu firkete
yapılarının nasıl kolaylaştırdığı bilinmiyor . bunun aksine streptomyceslerde, linear moleküller DNA

299
[Metni yazın]

‘nın 5’ ucunda bağlanacak proteinlere sahiptirler ve böyle proteinler adenovirüslerde , ve

bakteriyofajarın çoğunda ve mantar ve bitki mitokondrial plasmidlerde bulunur.
Bu terminal proteinler replikasyonun tamamlanması için gereklidir.bundan başka Streptomyces linear
replikanlar palindramik sekanslara sahiptirler.bakterial genomlar 0.6-9.1 Mb oranında büyüklüğe sahip
sekansları bulundururlar. denatüre bakterial DNA kinetik analizi E.coli de tekrarlayan DNA varlığını
gösteremedi ve sadece küçük miktarlarda sekanslara sahip bakterial genomların hepsinde
belirlenebilmişti.Hem mycoplasma genitalium ( 0.58 Mb ) hem E.coli ( 4.6 ) genomunun % 90 ‘ı
protein –kodlama genlerini içerir.buyüzden genlerin birçoğunda büyüklük farkları bulunur

.Kutu 16.2 Alternatif Splalsing Örnekleri

Hayvanlar mikrobiyal enfeksiyonlara karşı antikorlar (immunoglobülinler) üretirler. Bu
immunoglobulinler iki form halinde üretilirler; çözünür antikorlar olarak ve immün sistemin diğer
hücreleri için üretilen hücrelerin belirlenmesine yardım eden membran bağlanma antikorudur.
Antikorların iki formuda alternatif splisingde aynı pre-mRNA molekülünden üretilirler (Şekil B16.4).
Drosophila’da belirlenen sxl (sex letal), tra (transformer) ve dsx (double sex) genlerini
belirlemeye karar verdik. Bu genlerin her biri pre-mRNA üretiyor ki bunlar sineğin dişi ya da erkek
olmasına bağlı olarak iki splising kalıbına sahiptir (Şekil B16.5). Erkek sineklerde splising inaktif tra
ve sxl gen ürünlerinin üretimi ile sonuçlanır. Dsx gen ürünü ise fonksiyoneldir ve dişi spesifik
genlerini inaktive eder. Dişi sineklerde splising fonksiyonel sxl ve tra gen ürünlerini üretirve bunlar
dsx geninin splisingini değiştirmek için intraksiyona girerler, dişi spesifik genlerin inaktivasyonu
meydana gelmez.

Şekil B16.4 İmmunoglobulin sentezinde alternatif splising. Şeklin üst bölümü bir IgM
immunuglobulininin ağır zincir yapısını göstermektedir. Ekzon kutularla intron çizgilerle
gösterilmiştir. Bu gen pre-mRNA ‘dan transmembran bağlanma bölgeleri şeklinde ya da zara bağlanan
antikor şeklinde üretilir.

300
[Metni yazın]

Şekil B16.5 Alternatif splising aracılığı ile Drosophila’da cinsiyet tayini. Pre-mRNA şeklin
ortasında, dişi splising başta ve erkek splising sonda gösterilmiştir. İki ekzon sxl’nin 3 numarası ve
tra’nın iki numarası kesilmiş ve etkin olmayan proteinlerin üretilmesiyle sonuçlanan stop kodonlarına
sahip messengerları ürettiğini unutmayınız.

Organel DNA’sı Tekrarlayan Bir Dizidir

Mitokondri ve kloroplastların her ikisi de DNA genomuna sahiptir ve RNA türlerinin hepsini
kodlamak için DNA genomuna sahiptirler ve proteinlerin bazıları organellerin fonksiyonlarını içerir.
Bazı düşük ökaryotlarda mitokondriyal DNA (mt) lineerdir fakat genellikle organel genomu DNA’nın
tek dairesel molekül şeklini alırlar. Her organel genomun birkaç kopyasını içerdiğinden ve hücre
başına birden fazla organel olduğundan, organel DNA’sı tekrarlayan bir dizi oluşturur. Kloroplast (ct)
DNA’sı 120-2000kb aralığına denk düşer oysa, mt DNA boyutu çok değişir. Hayvanlarda en az
20kb’a göre küçük, fakat bitkilerde bu 2000kb’a kadar büyük olabilir.

Kloroplast DNA Yapısı Büyük Ölçüde Korunur

ctDNA’sının tek hücreli protist Euglena (Hallick ve ark. 1993), liverwort (kızılyaprak)
(Ohyama ve ark. 1986) ve Arabidopsis, ıspanak, tütün ve pirinç gibi Angiospermlerde (Shinozaki ve
ark 1986, Hiratsuka ve ark 1989, Sato ve ark 1999, Schmitz-Linneweber ve ark 2001) dahil olmak
üzere bir düzine bitki için rapor edilmiştir. Genel olarak, boyut ve organizasyonunda dikkate değer bir
benzerlik vardır (Şekil 16.7 ve Tablo 16.2). Boyutundaki farklılıklar intronların ve intergenik
bölgelerin uzunluğundaki farklılıklardan ve genin sayısındaki farklılıklardan kaynaklanmaktadır.
ctDNA’sının genel özelliği iki benzer kopyanın mevcut olduğu bir 10-24kb sekansıdır. Genomun
oranı çok yüksek olabilen intronlar ile temsil edilmektedir, örneğin; Eulena’da intron %38’dir.
Kloroplast genomu fotosentezle ilgili olanlar dahil 70-90 proteini, 4rRNA genini ve 30 veya
daha fazla tRNA genini kodlar. Kloroplast mRNA’ları standart genetik kod ile (bkz mitokondrial
mRNA) transle olur. Bununla birlikte, birçok düzenleme ikinci kodon pozisyonunda değişim için C ile
U geçişleri güçlü bir eğilimle genomik sekansta sapmalara karşılık geldiği için birçok transkriptin
301
[Metni yazın]

primer yapısına neden olur (Maier ve ark 1985). Bu düzenleme aminoasit sekanslarındaki dönüşümü
zor olan kloroplast nükleotit sekanslarının gen ürünlerine karşılık gelmesini sağlar.
Astasia longa, Euglena gracilis ile yakından ilişkili renksiz hetetrofik flagellattır. Euglena’dan
gelen ctDNA’nın büyüklüğünün yarısı 73kb uzunluğunda plastid DNA’sı içerir. Bu plastid DNA
‘sının sekansı ribuloz 1-5 bifosfat karboksilazın büyük alt birim kodlayan olması dışında fotosentezle
ilişkili bütün proteinler için tüm kloroplast genlerinin eksik olduğunu göstermektedir
(Gockel&Hachtel 2000).

Şekil 16.7 ctDNA’sının genel

yapısı.

Tablo 16.2 Kloroplast DNA’sının

önemli özellikleri

Mitokondrial Genom Mimarisi Özellikle Bitki Ve Protistlerde Çok Değişir

Mitokondri hemen hemen her ökaryotik organizmada bulunur ve birincil görevi, oksidatif
fosforilasyonla ATP üretmektir. mtDNA, mitokondrilerde gerçekleşen biyokimyasal fonksiyonların
çok azını kodlar. Ancak bu durumun aksine, mitokondrial genomun gen ekspresyon mekanizmaları ve
yapıları şaşırtıcı bir şekilde mtDNA’yı karakterize eder (Burger ve ark., 2003). Çoğu mtDNA aynı
uzunlukta tek bir DNA molekülü olmasına rağmen, bazı protistalarda farklı uzunluklarda moleküller
bulunmuştur. Örneğin, Spizellomyces punctatus gibi mantarlarda ve Trypansosomes’lerde multiple,
dairesel moleküller bulunmuştur. Amoebidium parasiticum gibi diğer protistalarda mtDNA molekülü,
uçlarda ve uçlara yakın kısımlarda tekrar eden, farklı lineer molekül tipleri içerir. Ayrıca bu uç tekrar
motifleri, Tetrahymena’nın mtDNA’sının da bir özelliğidir.
Çoğu ökaryotlarda mtDNA’nın uzunluğu 15-60 kb’dır ama istisna olan durumlarda vardır.
sıtma parazitinin (Plasmodium spp.) mtDNA’sının uzunluğu sadece 6 kb iken, pirinçte (Oryza sativa)
490 kb’dır. Kabaklarda ise bu uzunluk 2 Mb kadar olabilir. mtDNA’nın kodladığı genlerin sayısı 5-100
arasında değişiklik gösterir. Örneğin, Plasmodium’larda 5, flagellatlarda 100 ve ökaryotlarda 40-50

302
[Metni yazın]

arasında değişir. Çok küçük mtDNA genomunun kodlama kapasitesi sınırlanmıştır ama gen sayısı
ve boyutu arasındaki ilşkiye bağlı olarak genom büyüklüğü arttıkça, kodladığı gen sayısı da
artar. Aksine, mtDNA’sı genomu boyutundaki farklılıklar, çoğunlukla intergenik bölgelerin
uzunluklarından ve içerdikleri ard arda tekrarlardan kaynaklanır. Çoğu hayvanların mitokondrial
genomları çok yoğundur. Ve daha küçük intergenik bölgere sahiptir ve intronları yoktur.
İntronlar mtDNA’nın genel bir özelliğidir ama alışılmadık gen yapıları da tanımlanmıştır.
Örneğin, bazı genler, DNA’nın her iki zinciri üzerinde yer alan 8 bölüme ayrılmıştır. Bu subgenic
bölümlerin ayrı ayrı transkripsiyonu farklı RNA parçalarının üretir.

Şekil 16.8 protistlerde bulunan bazı ender mtDNA yapılarının insan mtDNA’sı ile karşılaştırılması.

Ökaryotlarda Nüklear DNA’nın Organizasyonu

Kromozomların Yapısı Giemsa Boyama İle Ortaya Çıkar

Bazı ökaryotlarda, hücrelerin bölünmesi sırasında yapılan çeşitli muameleler, açık ve koyu
renkli bantların görünmesini sağlamıştır.(şekil 16.9). G-bandlaşmasında, kromozomlarda giemsa
boyamadan önce, tripsinle kontrollü parçalanmaya bağlı olarak, pozitif (koyu G bandları) ve negatif (R
bandları veya G bandları) bölgeler açığa çıkmıştır. Bazı memeli kromozomlarında ise 2000 kadar açık
ve koyu band görülebilir. Benzer bir band düzeni, DNA bazları arasına girebilen, guinacrine gibi
floresan boya ile Giemsa boyama tekrar yinelenirse görülebilir. Bandlar, kromozomun uzun kol ve
kısa kolları üzerindeki ilgili bölgelerine göre sınıflandırılmıştır. Mesela 12. kromozomun uzun
kolundaki 1 nolu band ; 12q1 anlamına gelir. Kromozomal DNA asitle muamele edilir, Giemsa
boyamadan önce de alkali ile muamele edilirse, sadece sentromeric bölgeler boyanır ve
heterokromatin olarak adlandırılır. Kromozomun boyanmamış kısımları ise ökromatin olarak
adlandırılır. Çünkü, Giemsa boyama, AT baz çifti bakımından zengin olan kısımları gösterir, koyu G

303
[Metni yazın]

bandları AT bakımından zengin olabilir ve açık G bandları, GC bakımından zengindir. Bu durum diğer
metodlarla da doğrulanmıştır (Zoubak ve ark, 1996; Saccone ve ark,1999).
CpG adaları kimyasal kompozisyonel heterojenliğin farklı formlarını temsil eder. Onlar orjinalinde
restriksiyon endonükleaz HpaII için birçok bölge içermesi nedeniyle başlangıçta HpaII Tiny Fragment
(HTF) adaları olarak anılan memeli DNA’sının kısa bölgeleri olarak belirlendi. Bu DNA adası memeli
genomunun yaklaşık %2’sinden sorumlu 1-2kb’lık kısa bölgelerde bulunur. Genomun geri kalanı
DNA ile karşılaştırıldığında burası ayırt edici özelliklere sahiptir. Metillenmeyen, GC ce zengin ve
dinükleotit CpG’nin herhangi bir baskılanmasını göstermez. Bunun aksine, yığın genomik DNA daha
düşük CpG metilli ve CpG dinükleotidi baz kompozisyonundan tahmin edileceğinden daha düşük bir
frekansta mevcuttur ve daha düşük GC içeriğine sahiptir. CpG adaları tüm housekeeping genlerin ve
ekspresyonun doku-sınırlı deseni ile genlerin büyük bir kısmının 5’ ucunda bulunmaktadır
(Craig&Bickmore 1994).

Şekil 16.9 Bantlama desenleri farklı boyama

yöntemleri ile kromozomlar üzerinde saptandı.
60 0C da giemsa boyası gibi interkalar floresan
boyamada aynı model üretti. C-bantlama
tekniği ile bazı heterokromatinler telomerlerde
tespit edildi.

Telomerler, Kromozomal Bütünlüğün Korunmasında Kritik Bir Rol Oynar

Ökaryotik kromozomların uçları aynı zamanda lineer, çift zincir DNA’nın uçlarıdır ve onların
korunmasını sağlamak için özel yapılar gereklidir ( Okuma parçası 16.2). Bu durum çift zincir
DNA’nın replikasyonuyla bağlantılıdır (şekil16.10). DNA sentezi 5’-3’ yönünde meydana gelir ve
RNA primerinin uzamasıyla başlar. Bu primer çıkarıldıktan sonra, molekülün 5’ucu tamamlanamaz.
Uçları tamamlamak için bir yöntemin olmaması sonucunda, kromozomlar hücre bölünmesinden sonra
daha kısa kalırlar. Telomerler, kromozomların uçlarını korumada rol sahibi olan nükleik asit
sıralarıdır. Çoğu ökaryotlarda telomerler, kısa, çok sayıda TTAGGG tekrarları içerir. Ancak
S.cerevisiae da tekrarlı üniteler TG1-3’dir. Bu tekrarların türler arasında uzunlukları oldukça
değişkendir (tablo 16.3). Ama her tür, ortalama uzunlukta bir telomerle kendi hücrelerini korumayı
sürdürür.
Şekil 16.11’den görülebileceği gibi, telomerlerin uçları küt uçlu değildir fakat 12 veya daha
fazla nükleotitli 3’ ucunda tek zincirli çıkıntılar vardır. Telomeraz enzimi, aynı zamanda telomer

304
[Metni yazın]

terminal transferaz olarak adlandırılır, RNA bileşeninin tek zincirli telomerin ucuna bağlanmasını
sağlayan ribonükleoprotein enzimidir.
Reverse transkriptaz aktivitesi ile ilişkili şekil 16.11 de gösterilen mekanizma ile telomerin
yapısı ve uzunluğu muhafaza edilebilmektedir. Telomer mekanizmasının ayrıntıları için Shore’nin
(2001) yazısına danışabilirsiniz.

Şekil 16.10 Primer çıkarıldıktan

sonra tamamlayıcı tek zincir 3’
kuyrukları ile iki kardeş molekülün
oluşumu.

Tablo 16.3 Farklı ökaryotik türlerde

telomer tekrarlarının uzunluğu.

Kutu 16.3 Telomeraz, Ölümsüzlük Ve Kanser

Telomer kromozomun ucunda bulunur ve rolü kromozom ucunu korumaktır. Ayrıca
kromozomların birbirleri ile kaynaşmasını durdurur. Telomerler uzunluğu 15.000bp kadar olabilen
TTAGGG tekrarlayan birimlerinden oluşur. Telomeraz enzimi RNA yapılarını tek zincirli telomer
uçlarına bağlayan bir ribonükleoprotein enzimdir. Reverse transkriptaz aktivitesiyle ilişki şekil 16.11
de gösterilen mekanizma ile telomerin yapısı ve uzunluğu korunabilmektedir.
Telomeraz fetal dokularda, yetişkin germ hücrelerinde ve kanser hücrelerinde bulunur. Normal
somatik hücrelerde telomerazın aktivitesi çok düşüktür ve hücrelerin her zaman bölünmesi telomerini
(25-200bp) kaybettirir. Telomer çok kısaldığı zaman kromozom artık bölünmez ve konak hücre
apoptozis olarak bilinen bir işlem ile ölür. Bu nedenle, normal somatik hücreler ölümlüdür ve doku
kültüründe onlar senesensten önce 50-60 bölünmeye (Hayflick sınırı) uğrayacaklardır. Bunun aksine
memelilerde belirli çok hücreli organizmalarda büyüyen (balık ve crustecea gibi) bütün hayatları

305
[Metni yazın]

boyunca sınırsız büyüme potansiyelini ve telomeraz aktivitelerini korurlar (inceleme için Krupp ve ark
2000).
Kanser hücreleri doku kültüründe sınırsız olarak bölünür ve böylece ölümsüz olurlar.
Telomeraz normal hücrelerden 10 ile 20 kat daha büyük aktiviteyle kanser hücrelerinde tespit
edilmiştir. Telomerazın bu mevcudiyeti kanser hücrelerinde seçici bir büyüme avantajı sağlar ve
kontrolsüz büyümeye izin verir. Bu enzim tümörler içerisinde aktif fakat çoğu normal hücrede inaktif
olduğundan, telomeraz kemoterapi için ideal bir hedeftir.
Rekombinant DNA teknolojisi, hücre kültüründe korunan insan somatik hücrelerini telomeraz
ile ekspres etmek için kullanılırsa, yaşlanma engellenir ve hücre ölümsüz hale gelir. Bu ölümsüzleşme
genellikle birçok kanser hücre hattında görülen seviyeler için c-myc onkogenin ekspresyonunun
artması ile olur.
Telomerler içeren kromozomların yeniden düzenlenmesi insan genetik hastalıklarının önemli
bir nedeni olarak ortaya çıkmaktadır (Knight&Flint 2000). Telomer spesifik klonlar konvansiyonel
sitogenetik analizleriyle anormalliklerin tespit edilmesi için floresan in situ hibridizasyonu ile birlikte
(FISH, sayfa 353 bakınız) kullanılmaktadır.

Ard Arda Tekrar Eden Sıralar İki Yolla Belirlenebilir:

Tekrar sıraları santrifüjde DNA’nın davranışları üzerine yapılan çalışmalar esnasında ilk kez
30 yıl önce keşfedildi. DNA, CsCl2 solüsyonunda santrifüj edildiğinde kendi yoğunluğuna uygun
gelen pozisyonda bir bant oluşturur. Bu değişim G+C içeriği yüzdesine bağlıdır.

P (yoğunluk)= 1.660+0.00098 (%GC) g/cm3

Ökaryotik DNA’lar bu şekilde santrifüj edildiğinde genomun ortalama G:C içeriğine tekabül eden
yoğunlukta bir merkezde toplanırlar. Sıkça bir ya da daha küçük satellit bantları şekil 16.12’de
gösterildi. Yoğunluk gradient santrifügasyonunda satellit DNA’sının davranışı satellitin baz bileşimi
kimyasal araçlarla belirlendiğinde yoğunluğu tahmin edildiğinden oldukça farklıdır. Bunun bir sebebi
de metilenmiş olmasıdır. Bu onun yüzen yoğunluğunu değiştirir.

306
[Metni yazın]

Şekil 16.11 Telomer replikasyonun diyagramı ve telomerazın rolü. (a) insan kromozomlarında
telomerlerin ucunda hekzamerik tekrar sıraları bulundu. (b) ve (c) telomeri çoğaltmak için ilerleyen bir
replikasyon çatalı. Okazaki fragmenti (mor ok) izci zincirin çoğu son kısımlarından başka bütün
replikasyona izin verir. (d) ve (e) Kendi RNA kalıbını (5’-CUAACCCUAAC-3’) taşıyan telomeraz
kromozomun ucundaki izci zinciri uzatır ve replikasyona izin verir.

Satellit DNA izole edildiğinde in vitroda radyoaktif olarak işaretlenebilir ve kromozom

üzerinde nereyi hibridize edeceğini belirlemek için bir prob olarak kullanılabilir. İn situ hibridizasyon
olarak bilinen bu teknikte kromozal DNA denatüre edilir ve bir membran kağıdı üzerine tutturulur.
Hibridizasyon alanlarının saptanması otoradyografi ile belirlenir. Bu tekniği kullanırken işaretli satellit
DNA’sının çoğu şu anda sentromer ve telomerler etrafında bulunan heterokromatini hibridize etmek

307
[Metni yazın]

için bulunur. Satellitlere homolog olan RNA sadece nadiren bulunduğu için heterokromatik DNA
kuvvetli ihtimalle kodlanmamıştır.
Satellit DNA restriksiyon endonüklez sindirimine uğrarken bir ya da birkaç farklı düşük
moleküler ağırlıklı bant takibindeki elektroforezde gözlemlendi. Bu farklı bantlar ard arda tekrar eden
sıraların bir göstergesidir. Bunun sebebi (şekil 16.13) ard arda tekrar eden bir sıranın her bir tekrarının
içinde özel bir restriksiyon endonükleaz alanının olmasıdır. Sonra sıra, bu enzim tarafınan
fragmentlere ayrılır.


DNA esas bandı

HinfI kesimi
DNA miktarı

Şekil 16.12 Toplam DNA’nın yoğunluk

denge santrifügasyonunda üç satellit
DNA bandının (koyu gölgeli) belirlenmesi

Elektroforez

Şekil 16.13 Saflaştırılan satellit DNA’sının

restiriksiyon endonüklezlar ile kesilmesi. Temel tekrar
dizileri 359 bp uzunluğundadır ve bir endonükleaz
kesim bölgesi Hinfl’yi içerir. Bunlar jel
elektroforezinden ve etidyum bromürle boyamadan
sonra diğer genomik fragmentlerin smearına karşılık
bir bant olarak görülebilmek için yeterince bol
bulunur. HaeIII endonükleazı ile DNA’nın kesilmesi
359 bp uzunluğunda çoklu merdiven fragmentler
üretir.

308
[Metni yazın]

DNA bant jelden izole edildikten sonra ya direkt olarak ya da klonlandıkdan sonra sekans
analizleri için kullanılabilir. Ama elde edilen sıra consensus bir sıradır ve herhangi bir özel tekrar
sırasına gerek yoktur. Çünkü sekans ayrılması kolayca yapılabilir. Bu tür sekans ayrılmalarının tekrar
eden birimlerde restriksiyon endonükleaz kesim alanı içinde meydana gelip gelmediğine dikkat et. Bu
durumda enzimle kesme, tekrar birimlerinin multimerlerini üretecektir (Daha yüksek derecede düzenli
tekrarlar) (şekil 16. 13).

Ardışık tekrar sıraları büyüklüklerine göre sınıflandırılır

Satellit DNA miktarı ve sırası türler arasında oldukça değişkenlik gösterir ve türler içinde aşırı
derecede polimorfik olabilir. Bu nedenle sıçan genomunun % 1-3’ü sentromerik satellit DNA’sı içerir.
Bu oran farede % 8 iken inekte % 23’tür. Satellit tekrar biriminin uzunluğu, farklı ribozomal RNA
türlerini kodlayan genleri oluşturmak için kara yengecinde bulunan d(AT)n: d(TA)n yapısından
kaynaklanır (Şekil 16.14). Minisatellitler, 14–500 bp uzunluğunda tekrar dizilerine sahip olan
yapılardır. Tür içi polimorfizim gösterirler, bu nedenle DNA fingerprinting’de kullanılmaktadırlar.
Microsatellit DNA’lar, basit sıra tekrarları (SSR) ya da basit sıra uzunluk polimorfizimleri (SSLP)
olarak ta bilinirler. Microsatelllit DNA’lar 1–13 bp’lik ardışık sıralardır. Microsatellitlerin iki özelliği
oldukça önemlidir. Birincisi, microsatellitler Mendel kalıtımına göre kalıtılırlar (Şekil 16.15). Bu
nedenle microsatellitler genetik akrabalıkların araştırılmasında kullanılabilirler. İkincisi, restriction
fragment length polymorphism (RFLP)’lerin oluşturulduğu mekanizmalardan biridir. Microsatellitler,
hayvan hırsızlığı, yiyecek orijinalliğinin araştırılmasının yanısıra cinayet materyallerinin adli tıp
analizleri için de kullanılmaktadır.
Microsatellitler, 2 kb’lik sekans başına ortalama bir SSR ile insan genomunun % 3’ünü
oluşturur. Bu SSR’lerden dinükleotid tekrarlar en yaygın olanlardır (genomun % 5’ini oluştururlar).
Bu dinükleotid tekrarlar genomun % 3’ünde (dAT.dTA)n şeklinde bulunur. Trinükleotid tekrarlar
oldukça nadirdir. Dinükleotid tekrarlarda, dGC.dCG tekrarları ile dAC.dTG ve dAT.dTA tekrarları
arasında büyük bir dengesizlik vardır. Normal genlerde bu tekrarların önemi bilinmiyor fakat bu
tekrarlar dengesiz bir şekilde uzarsa kalıtsal hastalıkların ortaya çıkmasına neden olabilir. Örneğin,
fragile X sendromlu hastalarda özel bölgelerde yüzlerce hatta binlerce CGG sırası görülebilir. Ancak
etkilenmemiş bireylerde (fragile X sendromu taşımayan bireyler) bu sayı yaklaşık olarak 30’dur.
Şimdiye kadar trinükleotid tekrarlardan kaynaklanan birçok hastalık belirlendi. Benzer trinükleotid
tekrarlar komple genom sekansından sonra bakterilerde de belirlendi. İnsanlarda olduğu gibi
mayalardaki mükemmel trinükleotid tekrarlar polimorfik büyüklük değişkenliğine maruz kalır.
Ardışık DNA tekrarları kodlama bölgelerinde de bulunabilir. Benzer ya da hemen hemen
benzer olan bağlı gen grupları bazen art arda tekrarlanabilir. Bunlar sayfa 326’da anlatılan gen
aileleridir. Ancak ardışık tekrarlar tek bir gende de olabilir. Örneğin Drosophila “glue” protein geni, 7
aminoasit kodlayan 21 baz çifti uzunluğunda 19 ardışık sıra içerir. Tekrarlar mükemmel değildir fakat
bilinen sekanstan farklılık gösterir. Bir diğer örnek tavuk, fare ve insanlarda bulunan α2(1) kollajen
309
[Metni yazın]

genidir. Bu gen 52 exon içerir, uzunluğu 80–2000 bp arasında değişiklik gösterir. Bununla beraber
bütün exon sekansları 9 bp ya da 9 bp’nin katları şeklindedir ve çoğunluğu 54 ya da 108 bp
uzunluğundadır. Bu durum üçüncü pozisyonunda glisin bulunan ve yüksek miktarda prolin ve lisin
içeren kollajen için geçerlidir.

Kutu 16.4 SSLPs’nin adli tıp uygulaması

Genetik bilgiden yoksun DNA örneklerinin, mevcut DNA profili yada parmak iziyle
mukayese edilmesini sağladığından beri ,SSLPs babalık testlerinde ve suçlu incelemelerinde geniş bir
kullanıma sahip olmuştur. Prensipde bir multilokus parmak izi DNA’sı; ya birkaç probun
kendiliğinden uygulanmasıyla yada birkaç lokusu kendiliğinden belirleyen tek bir DNA probunun
uygulanmasıyla oluşabilir. DNA profili ilk geliştirildiği zaman multilokus problar kullanılıyordu ve
bunlar myoglobin geninin intronunda tekrar eden diziden türevlenmişlerdi. Bu problar diğer otozomal
lokuslarile hibritleşebilirler. İlk olarak Bristol’de İngiltere,1987 yılında suçlunun parmak izi DNA’sı
kullanılarak bir hırsızlık olayı ile bir tecavüz olayı arasında bağlantı olduğu gösterilmiştir. Bunu takip
eden yıllarda parmak izi DNA kanıtları Amerikada da kullanıldı. DNA kanıtları suçluluğu ve
suçsuzluğu ispatlamak için kullanılmaktadır.
 Suçlu davalarında, multilokus probların en önemli dezavantajı mevcut parmak izi DNA’sı için
kompleksli olmasıdır. Suçsuzluğu göstermek
kolaydır fakat suçluluğu ıspatlamak sorunlarla
doludur. Bu olasılık hesaplarının altındaki asıl
mesele aynı insandan alınan örnekleri
karşılaştırılmasıyla iki profilin uyum göstermesidir.
Bunun sonucu için adli tıp bilim adamları tek
lokuslu problar kullanarak örnekleri jel üzerinde
yürütmüşlerdir;bir örnek şekil B16.16 da
verilmiştir. Teknik gelişmeler BSSLP lokuslarını
hedefler ve cinsiyet teşhisini sağlar. Her bir lokus
için bir çok allel vardır(tablo B16.2) ve her bir
farklı etnik grub için bilinirler. Bu nedenle aynı
profili paylaşan iki bireyin olma olasılığı milyonda
birden daha azdır.

Sekil.B.16.6 Bir tecavüz sanığının kimliğini

 belirlemek için tek lokuslu probun kullanımı.
Anorak ve vajinal bölgeden alınan semen
Tek lokuslu probların bir diğer avantajı, bir ileA,D,C sanıkların DNA profilleri
sayısal format içinde tek lokuslu probların DNA karşılaştırılıyor.Profiller A kişisine uygunluk
göstermektedir.

310
[Metni yazın]

profiline dönüştürme olasılığıdır. Bu olasılıklar bir veri bankasının kurulmasını ve tüm yeni profillerin
bu veriler ile karşılaştırılmasına olanak sağlar. Polis, bazı durumlarda örneğim; çözülmemiş cinayet
veya tecavüz olaylarında suçlunun DNA örneklerini veri bankasındaki örneklerle karşılaştırır.

TAblo B16.2 İnsan DNA profilinde kullanılan

farklı SSLPs’ler için allellerin sayısı
SSLPs’nin ortaya çıkması için yeterli miktarda DNA’nın
bulunması gerekir. Bu babalık testi için sorun değil fakat
adli tıp testleri için sorun olabilir. Eğer örnek DNA
miktarları istenenden azsa bunlar PCR’la çoğaltılarak
test edilebilir. Bunun sonucu olarak; bir hırsızın
maskesindeki kıldan, söndürülmüş bir sigaradan yada
mektup pulundan DNA kolayca sağlanabilir.

Dağınık tekrar eden diziler transpozal elementlerin iki tipinin çoklu kopyalarını oluştururlar

Ökaryotik genomlarının her yerinde bulunan dağınıklık transpozal elementlerin çoklu kopyasıdır. Bu
nedenle bu elementler dağınık tekrara eden dizilerdir. Kinetikle ilgili çalışmalarda bu transpozal
elementler tekrarlamalı DNA olarak karakterize edilmiştir. Ökaryotik transpozal elementler iki sınıfa
ayrılır. Sınıf 1 elementleri, elementler tarafından kodlanan Mrna’dan oluşur. Bu elementler
retrovirüslere benzetildiğinden beri onlar genellikle retrotranspozonlar olarak adlandırılır. Sınıf 2
elementleri DNA transpozonlarıdır. Transpozonların her iki sınıfıda otonom ve otonom olmayan
elementlere ayrılır. Otonom elementler transpozisyon için istenen gen ürünlerini kodlar. Otonom
olmayan elementler ise özel bir kodlama kapasitesine sahip değillerdir. Fakat transpozisyon için
gerekli DNA dizilerini bulundururlar. Transpozonları bütünleşmesi genellikle ilave bölgesindeki kısa
genomik dizilerin kopyalanmasıyla oluşur. Bu kopyaları dizisi ve büyüklüğü çeşitli transpozon aileleri
arasında değişir.

311
[Metni yazın]

Retrotranspozonlar Transpozisyonun Mekanizması ve Yapısına Dayalı Olarak İki

Gruba Ayrılabilir
Retrotranspozonların LTR grubu her iki uçta doğru oryantasyonda bulunan uzun terminal
tekrarlara sahiptir. Eğer bunlar otonomsa en az iki gen içerirler: bunlar kapsid benzeri bir protein
kodlayan gag geni ve proteaz, reverse transkriptaz, RnazH ve integraz aktivitelerine sahip bir
poliprotein üreten pol genidir. Otonom olmayan elementlerde gag ve pol genlerinin çoğu veya tamamı
eksiktir ve büyüklükleri değişiklik gösterebilmektedir. LTR retrotranspozon örnekleri; mantar Ty1-Ty5
elementleri, copia ve gypsy elementleri Drosophila’da doğal olarak bulunmaktadır. Ty1/copia ve
Ty3/gypsy ailelerinin, çalşılmış hayvan, bitki ve fungus türlerinde bulunduğu tespit edilmiştir. Fakat
onların organizasyonu ve dağılımı geniş varyasyon gösterir. Total kopya sayısı ve konak genom
büyüklüğü arasında bir ilişki yoktur ve total kopya sayısı bir cins içindeki yakın akraba türler arasında
geniş ölçüde değişebilmektedir (Kumar, 1996). Insan genomunun %7 kadarlık kısmı LTR
transpozonlara benzeyen Endojen Retrovirüsler (HERVs)’den oluşur. Bu HERV’lerin çoğu
saçma/anlamsız mutasyonlar içermektedirler ve artık fonksiyonel retroviral proteinler
üretememektedirler (Smith, 1999).

312
[Metni yazın]


Resim 16.18. Temel retroelement
tipleri.(a) bir retrovirüsün tüm
organizasyonu, avian lökosis virüs;
(b) bir transpozon, maya TY1
elementi; (c) LTR(Long Terminel
Repeat) olmayan bir
retrotranspozon Drosophila 1
faktörü. Open Reading Frame’ler
(ORF) mor kutularla
tanımlanmıştır. gag geni, virion
çekirdek proteinlerini kodlayan
gendir, bir nükleik asit bağlama
proteini içerir; env geni yapısal
zarf proteinini kodlar, hücreden
hücreye taşıma için gereklidir;
prot, primer translasyon ürünlerinin kesimi için gerekli bir proteazdır. Rt; reverse transkriptaz; RnazH,
ribonükleaz; endo, konak genomuna entegrasyon için gerekli endonükleaz; LTR, transkripsiyonun
başlama ve sonlanması için sinyaller içeren uzun terminal tekrarlar; 5’- TG………..CA-3’tipik olarak
sonlanan kısa ters tekrarlar (IRs), PBS, konak tRNA’sının 3’ ucuna komplementer primer bağlama
bölgesidir ve ilk (-) DNA zincirinin sentezi için kullanılır; PPT, ikinci (+) DNA zincirinin sentezi için
kullanılan poliürin parçası; DR, konak hedef DNA’sının kısa doğru tekrarı, insersiyonu
gerçekleştirmek için.

Non-LTR transpozonlar uzun ara nükleer elementler (LINEs) ve kısa ara nükleer elementler
(SINEs) olarak ikiye ayrılmaktadır. LINE’ler üç protein üretmektedirler; ORF1, gag benzeri bir
protein, bir endonükleaz ve reverse transkriptaz. LINE ve SINE’lerin her ikisi de basit bir sekans
tekrarıyla sonlanmaktadır ve bu dizi genellikle poli A’dır. SINE’lerin iyi çalışılmış bir grubu eski
dünya primatlarında bulunan Alu ailesidir (Batzer & Deninger, 2002). Bu aile, tipik bir Alu
restriksiyon endonükleaz bölge sekansının ismidir. Alu elementleri intronlardan yoksun olan
280nükleotid sekansına sahiptir ( Fig. 16.19.) ve insan genomunda onlardan en az 1 milyon kopya
bulunmaktadır. Bu bölgeler transkribe olur, fakat translasyona uğramazlar çünkü açık okuma bölgeleri
(ORF) bulunmamaktadır.

Şekil 16.19. Direkt tekrarlara yapışabilen 282 bp lik Alu elementinin tipik bir yapısı Alu
elementinin kendisinde, A nükleotidince zengin bir ara bölgenin iki monomer birimini birbirinden
ayrılmasıyla hatalı duplikasyon oluşmaktadır. Sağ monomer 30 bp lik ilave bir sekans içerir, yani sol
monomerde bulunmayan . korunmuş sekans genellikle poliA kuyruğuna benzeyen A’ ca zengin bir
bölgeyle takip edilmektedir.

313
[Metni yazın]

DNA Transpozonları Retrotranspozonlardan Daha Basittir

DNA Transpozonları, terminal ters tekrarlar içerir ve uzunluğu korunmuş olan hedef bölge
duplikasyonlarına sahiptirler.Otonom DNA transpozonları transpozonu kesme ve yeni bir lokasyona
yapıştırmadan sorumlu bir transpozaz kodlayan tek bir gene sahipitr. Otonom olmayan DNA
transpozonları genellikle otonom transpozonlardaki delesyonlarla oluşmuşlardır. En iyi bilinen DNA
transpozonları Tc1/ mariner süper aile ve non-otonom MITES (minyatür ters-tekrar transpoze
elementler)
Helitronlar bitki, nematod, sivrisinek, balık ve funguslarda bulunan iki transpozon sınıfının
yeni bir grubudur. (Kapitanov & Jurka, 2001, Paulter et al, 203). Onlar yuvarlanan halka
mekanizmasıyla replik olurlar ve bir replikaz ile bir helikaz ürtirler. Bazı helitronlar, helentrons olarak
adlandırılır, üstelik LINE’larda bulunanlara benzer bir endonükleaz kodlarlar.

Transpozon Aktivitesi Ökaryotlarda Oldukça Değişkendir

Ökaryotik genomlar, transpozonların kısmi yayılımları ve farlı delesyon oranları nedeniyle
önemli derecede çeşitlilik gösteren tekrarlı DNA dizileri içeir(Tablo 16.4). İnsan genomundaki
transpoze elementlerin dağılımı; meyve sineği, nematod, Arabidopsis genomlarında olandan oldukça
farklıdır. Birincisi, insan genomunun ökromatik parçası transpoze elementlerin oldukça yüksek kopya
sayısına sahiptir. Ikincisi insan genomu, eski transpozonların kopyalarıyla doludur. Halbuki diğer
organizmalardaki transpozonlar, özellikle meyve sineğinde olanlar daha yakın orijinlidir. Bu
muhtemelen genomik delesyon yoluyla ev temizliğinin (hausecleaning)etkililiğini yansıtır. Üçüncü
olarak iki tekrar ailesi (LINE1 ve Alu) insan genomundaki tüm yayılmış tekrar dizilerinin % 60’ını
oluşturmaktadır. Fakat çalışılmış diğer genomlar çok farklı transpozon aileleri içerirler. Benzer şekilde
DNA transpozonları insanlardaki yayılmış tüm transpozonların %6’sını kapsarken bu oranın meyve
sineğinde %25, Arabidopsis’ te %49 ve nematodlarda % 87 olduğu görülmüştür.
Genom analizleri transpozonların çok yakın akraba soylarda bile köklü şekillerde farklı
oranlara sahip olduğunu gösterdi (Eichler & Sankof, 2003). Örneğin büyük maymun türleri arasındaki
retrotranspozisyon sürüklenmesinin eski dünya maymunlarıyla karşılaştırıldığında yavaşlama
gösterdiği belirlenmiştir. Diğer memelilere göre farklı SINE ve LINE retrotranspozisyon oranlarının
ise, primatların genom büyüklüğünün artmasından sorumlu olduğuna inanılmaktadır. Genom
büyüklüğünün geniş bir oranı hububatlarda bulundu (420- 1600 Mb). Bu durum esas olarak yüksek
transozisyon aktivitesi nedeniyle transpozonlar içine transpozonların insörtünün gerçekleşmesinden
kaynaklanmaktadır. Yayılma bir tür transpozon çoğalmasıdır ki genetik şişmanlığı önlemek
içindelesyon mekanizmasının dengelenmesi gereklidir.

Tekrarlı DNA, Genomlar İçinde Ardışık Olmayan Biçimlerde Dağılır

Transpozonların replikasyonu onların genomik DNA’sının bütünlüğü açısından uygun bir
kromozom bölgesi seçmelerine bağlıdır. Farklı retroelementler ayırtedilebilen kromozomal bölgeleri

314
[Metni yazın]

hedefleme yoluyla bu duruma karşı koymaktadır (Bushman, 2003). Fare ve insan DNA’sı içinde L1
LINE’lar gen açısından AT’ce zengin bölgeleri tercih eder halbuki Alu SINE’lar GC ve gence zengin
bölgeler içine yerleşmiştir. Benzer şekilde tahıl genomları arasında, LTR retrotranspozonları,
çoğunlukla intergenik bölgelerde bulunmaktadır. Oysaki MITES’ler az kopyalı gen sekansları
içersinde yer almaktadır. Diğer ökaryotlarda ise tekrarlar, genomun yaklaşık %10’dan daha azını
oluşturmaktadır ve tekrarlar heterokromatik bölgeler içersinde yerleşmiş olarak bulunmaktadır.
Ökromatik bölgelerde daha az olarak yer alırlar. Bir organizma içinde tekrar sekanslarının dağılımında
çok büyük varyasyonlar görülebilir. Insan genomunun bazı bölgeleri, olağanüstü yoğunlukta tekrarlar
içerir, oysaki diğer bölgeler neredeyse bu tekrarlardan yoksundur. Örneğin X kromozomunun kısa
koolunun 11. segmentindeki (Xp11) 525 kb’lık bir bölge % 89 oranında tümüyle transpoze olmuş
elment yoğunluğuna sahiptir. Ve bu bölge, % 98’lik bir yoğunlukla 200 kb’lık bir segment içerir.
Aksine dört homeobox kümelerinde bu oran, %2’den daha azdır.

Ökaryatik genomlar, oldukça biçimlenebilir yapıdadırlar

Genomik DNA’nın, kalıtımın kararlı, değişmeyen bir parçası olduğu, büyük ölçüde uykuda ve
nokta mutasyonlarından da uzak olduğu düşünülür. Fakat gerçekten öteye hiçbir şey olamaz. DNA
dinamiktir ve transposıbıl elementlerin aktiviteleri sonucunda sürekli olarak yeniden düzenlenmelere,
insersiyon ve delesyonlara maruz kalmaktadır. Örneğin, LINE insörtlerinin hemofili ve Cooley
anemisinden sorumlu olduğu bulunmuştur. Özellikle göze çarpıcı bir örnek olarak; kalın bağırsak
kanserli bir hastanın adenokarsinom (karaçiger seviyesinde gelişen bir kanser) hücrelerinin APC
geninde bir LİNE insörtü bulunurken, etraftaki normal dokuların geninde bu insört bulunmamaktadır.
SINE’ler, rekombinasyonlar için önemli noktalar olabilirler ve insan genetik hastalıklarının
tanımlanmasında kullanılabilirler.
Genomların yeniden şekillenmesinde, transpozonların sorumlu olduğunu gösteren pek çok
çalışma bitkiler üzerinde yapılmıştır. Örneğin, retrotranspozon aktivitesinin artması, mısır
genomumun iki katına çıkmasıyla sonuçlanmaktadır. Kalender ve ark.(2000), yaban tip arpa
populasyonunu farklı seviyelerde su sitresine maruz bırakılmışlardır ve sonuçta bir LTR
tranpozonunun (BARE-1) kopya sayısının, populasyon içerisinde yaklaşık 3 kat değişiklik gösterdiğini
gözlemiştirler.

Pseudogenler tekrar eden DNA’dan meydana gelirler

Pseudogenler, norml gen sıralarına benzeyen genomik DNA sıralarıdır. Pseudogenlerin,
fonsiyonel genlerle yakın ilişkili olan non-fonksiyonel kopyalar olduğu düşünülüyor. Bunlar iki yolla
meydana gelirler. Ard-arda dizilmiş kopyalanmış genlerden birinin non-fonksiyonel olmasını
sağlayacak mutasyonların meydana gelmesiyle, klasik kopyalanmış pseuodogenler meydana
gelmektedir. Bu mutasyonlar, transkripsiyonu ve/veya translasyonu engeller. Bir genin yeniden

315
[Metni yazın]

düzenlenmesine sebep olacak mutasyonların meydana gelmesiyle, işlenmiş pseudogenler

oluşmaktadır. Pseudogenler, intronların yokluğuyla karakterize edilirler.

Segmental duplikasyonlar, düşük kopya sayılı tekrarlardır

Segmental duplikasyonlar, genomun 2 veya daha fazla yerinde bulunan ve 90%’dan daha fazla
benzerlik gösteren 1-200 kb‘lık bloklarıdır. Memeli DNA’larında, kromozomların perisentromerik ve
subtelemorik bölgeleri, segmental duplikasyonlarla doludur, fakat duplikasyonların sayısı türler
arasında değiştirmektedir. Örneğin, fare, sıçan ve insandaki segmental duplikasyonların tüm DNA’ya
oranı sırasıyla %1.5, %3 ve %5.5’tir. Saccharomyces, nematod ve buğday sineği genomundaki
segmental duplikasyonlar, aşağı yukarı ortaktır. Bunun aksine, Arabidopsis genomunun %58’ini
segmental duplikasyonlar oluşturmaktadır ve bu duplikasyonların sadece bir tanesi sentromerik
bölgededir.
Segmental duplikasyonlar iki katogoriye ayrılmaktadır: interkromozomal ve intrakromozomal
duplikasyonlar. İnterkromozomal duplikasyonlar; non-homolog kromozomlar arasında duplike olmuş
segmentler olarak tanımlanırlar. Örneğin, insan adrenolekodistrofiy lokusunda bir 9.5 kb’lık genomik
segment, 2., 10., 16. ve 22. kromozomlarının sentromerlerine yakın bölgelerde duplike olmuştur.
İntrakromozomal duplikasyonlar, ya kromozomun özel bir bölgesinde veya kromozom kolunda
meydana gelir. Bu katagori, birkaç duplike olmuş segmentleri içerir ve ayrıca düşük kopyalı tekrar
sıraları olarak da bilinir. Örneğin, 17. kromozom üzerinde, 5Mb’lik sekansla birbirinden ayrılan
200kb’lık bir tekrarın 3 kopyası ve ayrıca 1.5Mb’lik sekansla ayrılmış 24kb’lık bir tekrarın iki kopyası
bulunmaktadır. Bu sekanslar oldukça benzerdir ki, bunlar rekombinasyona uğrayabilirler.

Kutu 16.5. Bir LINE tarafından ekson shufflingi

Moran ve arkadaşları (1999), bir LINE sekansını kullanarak gen trandüksiyonunu kültür
edilmiş hücrelerde gösterebilmiştirler. Bir neomisin haberci (neo) geni bir LINE sekansının aşağı
kısmına yerleştirilir ve bu neo geninin promotor ve başlangıç kodonu, 3’ bağlanma sitesiyle yer
değiştirilir. Bu modifiye edilmiş noe geninin trandüksiyondan sonra ekspres edilebilmesinin tek yolu,
bu genin aktif olarak transkript edilen bir gene insörtlenmesi ve bu genden elde edilen transkript
üzerine bağlanabilmesiyle mümkün olur. Bu gibi olaylar, çeşitli genlerdeki LINE insörtlerinin
kullanılmasıyla kolaylıkla belirlenebilir ve karakterize edilebilirler.
LINE insörtleri, eksonların shufflinginde rol alırlar. X geni içerisindeki bir LINE elementinin
transkripsiyonu, bu elementin kendi zayıf poly(A) sinyalinde sonlanamaz; ancak genin poly(A)
geninde transkripsiyonu sonlanabilir(Şekil B16.7). Bu trankripsiyonun sonucu kodlanan revers
transkriptaz ve endonükleaz, poly(A) kuyruğuna bağlanır ve Y geni içerisine bir cDNA kopyası
insörtlenir. Bu adım, Y geni içerisinde X geninin transdüksiyonuyla sonuçlandığı için yeni bir gen
yaratılmış olur.

316
[Metni yazın]

Fig. B16.7 Ekson sufflinginde LINE insörtlerinin

muhtemel mekanizması. L1, LINE elementi; pA,
poliadenilasyon sinyali; An, poly(A) kuyruğu.
Revers transkriptaz ve endonuklez, gri renkte
gösterilmiştirler.

317
[Metni yazın]

İnsan Y kromozunu ender bir yapıya sahiptir

İnsan Y kromozunu memeli cinsiyet belirlenmesinde özel bir role sahip olduğu için
genetikçiler ve evrimci biyologların ilgisini çeker. Y ve diğer cinsiyet kromozomu X birkaç yüz
milyon yıl önce aynı ata otozomdan gelir. Bu ikisi dizide birbirinden ayrılır ve bugün sadece Y
kromozomunun sonunundaki nispeten kısa bölgeler X kromozomunun uygun bölgelerine homologdur.
Günümüzde Y kromozomunun %95’inden geriye kalan erkek spesifiktir ve MSY erkek spesifik bölge
tarafından dizayn edilir. MSY bölgesi heterokromotik dizilerin bir mozaiğidir ve üç tane ökromatik
sekans sınıfı vardır. Bunlar X-transposed,X-degerate ve ampliconic dir.
MSY’nin yaklaşık %15’i X transposed dizi içerir ve hala X kromozom kopyalarının %99’u ile
özdeştir.Bu diziler yüksek oranda dağılmış tekrar dizileri tarafından baskılanır ve sadece 2 gen içerir.A
MSY’den %20 daha uzaktır ve X kromozomu ile daha çok ilişkili X degenarate dizilerini içerir ve X
transposed dizilerinden daha yüksek gen içeriğine sahiptir.MSY kalıntısı Y spesifik tekrar dizi ağı
içerir buda palindrom serisi yapar.%99 özdeşliğe sahip 2 palindrom koluyla birlikte bu palindromlar
en yüksek 3 Mb uzunluğa kadar,çeşitli büyüklüklerde sıralanırlar..Ampliconic DNA en yüksek gen
içeriğine sahiptir ve çok yüksek bir yalancı gen içeriğini MSY’nin kolonuyla paylaşırlar.
Şekil:16:20 Y kromozomunun erkek spesifik bölgesi(a)Yalancı otozomalve heterokromatik bölgeler
içeren tüm kromozomun şematik gösterimi(b).Yp yalancı otozomal bölgesinin proksimal
sınırından,Yq heterokromatik bölgesinin proksimal sınırına kadar uzayan MSY’nin 24 Mb’lik
kısmına genişletilmiş bakış.Heterokromatik sekansların yanı sıra 3 ökromatik sekans sınıfıda
gösterilmiştir.A1-Mb barı diyagramın ölçeğini işaret eder.(c),(d),Gen,yalancı gen ve 3 ökromatik
sekans sınıfının arasına karışan tekrar içerikleri.(c)Kodlanan genlerin yoğunlukları(her Mb
numarası),kodlanmayan transkripsiyon üniteleri,toplam transkripsiyon üniteleri ve yalancı
genler.(d)Alu,retroviral,LINE1 içeren nükleotidlerin yüzdeleri ve toplam araya karışan tekrarlar.sssss

318
[Metni yazın]

Sentromerler, Tandem Tekrarlarıyla Ve Retroelementlerle Doldurulurlar.

Mitoz sırasında operasyonun yönünden sorumlu olan anahtar kromozomal element
sentromerdir ve kinetor kompleksiyle ilişkilidir.Birçok organizmanın monosentrik kromozomları
vardır.Sentromer kromozom üzerinde küçük bir noktada yerleşmiştir.Luzula ayak otu ve nematod
C.elegans gibi bikaç tür mikrotübüllerin kromozom uzunluğu boyunca bağlandığı holosentrik
kromozomlar içerir. Telomerlerin aksine sentromerler yüksek derecede korunmuş diziler tarafından
belirlenmezler.Gelişmemiş S.cerevisia’da sentromer tanımlanır ve orta iğ kaynaşmasında sadece 125
gene ihtiyaç duyulur.Buna karşın;Schizosaccharomyces pombe mayasının bölünmesinde sentromer
40-120 kb büyüklüğündedir ve insanlarda bu sentromer 3 Mb büyüklüğündedir.S.pombe’de inverted
tekrarlarla çevrili öz(core) dizi içeren 3 tane sentromer vardır,bunlar tandem ve dağınık tekrarlarla
çevrilidir.Drosophila sentromerleri farklı tiplerde satellit DNA’lardan oluşur ve eşsiz DNA sıralarıyla
içine gömülmüş transposable elementler içerir..Memeli sentromerlerinin anahtar komponenti alfoid
DNA’dır buda ardışık head to tail fashion içinde tekrarlanan motif 171 bp’de oluşmaktadır ve bunlar
düzgün tekrar dizilere organize edilir.Bitkilerde Arabidopsis insanlara benzer sentromer yapılarına
sahiptir fakat tahıl sentromerleri cereba olarak adlandırılan gypsy benzeri retroelementlerin 200
kopyasını içerirken,tandem tekrarlar 178 bp uzunluğundadır.

319
[Metni yazın]

Ökaryotik Kromozomların Yapısal Elementlerinin Özeti

Daha önceki bölümde tartışılan farklı yapısal elementler Fig:16:21’de özetlendi.Ökaryotik
DNA’nın anahtar özelliği genom büyüklüğünün tekrar DNA miktarının aşırı artmasıyla artması ve
burada kodlanan dizilerin azalmasıdır.Bunlar farklı DNA sekans projelerinden türeyen gen
yoğunluğundaki data tarafından düzenlenir.Farklı organizmalarda yada aynı organizmadaki farklı
tekrar DNA tipleri sıklığı(tandem tekrarlar,transpozonlar,yalancı genler segmental duplikasyonlar)
hakkında hiçbir genelleme yapılamaz.Bunun aksine Thumb’ın genel kuralı ortalama her gendeki
intron sayıları ve büyüklükleri artar.Böylece evrim ağacında ilerlemesi artar.
 Pratik görüş açısından bakacak olursak tekrar sekanslar problemin en büyük
kaynağıdır.Genomik klonlama deneyleri sırasında rekombinasyonlar tekrarlar arasında gerçekleşir ve
bu DNA sekanslarının karışmına neden olur.Eğer karışım gerçekleşmezse hatalar DNA sekanslarının
karışımına neden olur.Eğer karışım gerçekleşmezse hatalar DNA sekansının sentez fazı sırasında
gerçekleşir ve en önemlisi ise polymeraz mikrosatellit üzerinden uzaklaşır.Sonuç olarak oluşan data
tekrarları genomik fragmentlerin yanlış bir şekilde oluşmasıne neden olur.

Şekil:16:21 Tipik bir insan

kromozomu içinde tekrarlı
dizilerin lokasyonu

320
[Metni yazın]

17. BÖLÜM

GENOMLARIN
HARİTALANMASI VE DİZİLENMESİ

321
[Metni yazın]

346-352 Eksik. 353 den Başlanmış.

In situ hibridazyon kullanılarak sitogenetik haritada fiziksel markırlar

gösterilebilir
Burada sitogenetik, bağlantı ve fiziksel harita gibi birçok genom harita çeşiti vardır. Klasik
sitogenetik harita diğer haritalara ve kromozomun kendisine göre görsel gerçeklik verir. DNA
fragmentlerinin klonlanmasındaki tehlikelerden kaçınmak için bu yönteme güvenilmez, bu yöntem
özellikle YAC’larda kullanılabilir(bak syf. 213). Genetik bağlantı haritalaması birbiriyle ilişkili
kalıtsal markırların lokalizasyonuna izin verir. Sitogenetik haritalar, bağlantı haritaları gibi hücre
içindeki kromozomları incelerler. Bu metodoloji sitogenetik ve bağlantı haritalarının yapısını
oluşturmasına rağmen hatalara yol açabilir, bu yüzden yine fiziksel haritaları standart olarak
kullanırlar. İn situ hibridizasyonun önemi, bu karşılaştırmaların yapılmasının sağlamaktır. Tekrar eden
dizilerin hibridizasyonunun temin edilmesini ve mevcut DNA kimeralarını engeller, klonlanan bir
fragment yada restriksiyon fragmenti sitogenetik haritadaki tekli lokasyonunun sürdürülmesi için
gereklidir. Ayrıca, fiziksel harita düzeni in situ hibridizasyonla bulunarak eşleşmelidir. Sitogenetik
haritada bulunan genetik markırlar in situ hibridizasyonla fiziksel haritadaki yerleri belirlenebilir.
Aslında benzeri olmayan sekansların in situ hibridizasyonunda radyoaktif olarak işaretlenmiş
problar kullanılır ve bu teknik büyük beceri gerektiren bir yöntemdir. Bugün, Pinkel ve ark.(1986)
tarafından geliştirilen floresans in situ hibridizasyon(FISH) türevlerinde bu methodlar kullanılır. Bu
teknikte, DNA probuna haberci bir molekül eklenerek işaretlenir. Bu prob, formamidle denatüre edilen
DNA’nın bir mikroskop camı üzerinde havayla kurutulduktan sonra metafaz kromozomlarının
hazırlanmasıyla hibridize edilir. Hibridizasyonu takiben, fazla probu uzaklaştırmak için yıkanır,
kromozomun preperat, hibridize proba bağlanan aracı molekül - floresanla işaretlenmiş affinite
gösteren molekül- içeren bir solüsyonda inkübe edilir. Sonra preperat floresans bir mikroskopla
incelenir. Eğer hedefi gelişigüzel bağlayacak büyük bir DNA probu kullanılırsa, problar birçok tekrar
eden sekanslar içerecektir. Bu spesifik olmayan bağlanma, rekabetçi bir hibridizasyonun baskısıyla
elimine edilebilir. Ana hibridizasyondan önce prob, işaretlenmemiş tüm genomik DNA’nın sulu
solüsyonuyla karıştırılır. Prob tekrar eden elementlerden o kadar doygundur ki onlar benzeri olmayan
sekansların in situ hibridizasyonuna uzun süre müdahale edemezler.
Geleneksel FISH yöntemi yaklaşık 1 Mb’lik çözme gücüne sahiptir. Eğer yüksek bir
çözünürlük gerekliyse hedef olarak kullanılacak olan kromozomların daha az yoğunlukta olması
gerekir. Oldukça uzun metafaz kromozomları sitosantrifügasyonla mekaniksel olarak esnetilerek
hazırlanır. Bu sonuçlar kromozomların normal uzunluğundan 5-20 kat daha uzundur. Laan ve
ark.(1995) gösterdi ki bu uzatılmış kromozomlar mükemmel şekilde hızlıdır ve klonların güvenilen
sırası en az 200 kb‘a kadar birbirinden ayrılır. Onlar ayrıca bir klonun sentromer–telomer
oryantasyonunun tespit edilmesinde de kullanılabilir. Bu methodun dezavantajları; ne bir

322
[Metni yazın]

kromozomdaki bilinmeyen sekanslarının yerini bulabilir ne de sinyaller arasındaki uzaklığın güvenilir

bir ölçüsünü oluşturmakta kullanılabilir. Bu sebeple ayrı haldeki kromozomların uzunluğu oldukça
değişkendir.
İnterfaz çekirdeğindeki kromatinin yoğunluğu metafaz kromozomlarınınkinden daha yoğundur
ve ayrıca FISH‘in yüksek çözünürlüğü için iyi bir hedeftir(Trask et al. 1989, Yokota et al. 1995).
FISH’in çözünürlüğü , hücre preparatlarının konsantre tuz, alkali ve deterjan kullanılarak interfaz
kromatininin organizasyonu çözülerek daha da geliştirilebilir (Parra ve Windle 1993). Bu teknikler,
yaygın olarak fiber-FISH olarak bilinir, solüsyonda tekli yapıdaki bir probun bulunmasına olanak
sağlar. Teorik olarak, fiber-FISH’in çözünürlüğü ışık mikroskobundaki çözünürlük gücüyle aynıdır
(0,34 nm). Bu 1 kb ‘ye eşdeğerdir ve Florijin ve ark. (1995) tarafından başarılmıştır.

Kilit probları farklı allellerin eşzamanlı olarak incelenmesine olanak tanır

Çok renkli FISH’in diğer bir çeşidi kilit probların kullanılmasıdır (Nilsson ve ark. 1997). Kilit
probları oligonükleotidlerle yapışarak, eğer sekanslar doğru ve birbirini tamamlayacak şekilde
bağlanırsa, halkasal bir form alırlar. Oligonükleotitlerin yan kolları bükülerek DNA’nın çift helix
yapısını çevreler ve şartlar onları yan yana dizmek için dizayn edilir ki onlar enzimatik olarak
yapışabilirler. Nilsson ve ark. (1997) iki farklı oligonükleotid probu kullandı, bir sentromerin alfa-
uydu tekrarı ve sadece bir tane tekli baz çifti değişikliğinin farklı bir sekans çeşidi kullanıldı. İki
alternatif kilitlenmiş probun kapanması sadece mükemmel sekans tanındığı zaman olur(Şekil 17.9). İki
probun farklı floresans boyalarla işaretlenmesiyle aynı anda iki farklı sekansı gözlemek mümkündür.
Antson ve ark. (2000) sinyal amplifikasyon yöntemleri gerekli olmasına rağmen,
tek kopya dizilerindeki SNPlerin tespiti için kilit problarının kullanımı genişletti ve daha yakın
zamanda bu method yüksek verimlilik genotiplemesine uyarlanmıştır(Kutu 17.1).

Şekil 17.9 : SNP‘leri tanımlamak için kilit problarının kullanılması.(a) PCR’la kilit probların sentezi.
PCR primerlerinin 5’ ucu (koyu mor ve açık mor) kilit problarının yapısında bulunan iki hedef
323
[Metni yazın]

tamamlayıcı sekansın tanımlanması. 5’ fosfat(P) ucuna sahip bir primer diğer 5’ ucuna sahip
biyotin(B)le ligasyonuna izin verir ki bu zincir katı bir destek üzerinde tutularak taşımak için
kullanılır. Siyah noktalar PCR boyunca dahil edilen işaretlenmiş nükleotidleri uzaklaştırır.(b) Hedef
DNA sekansı için(mor) kilit probunun hibridizasyonu(siyah ve gri). Kilit prob bir ligaz tarafından bir
daireye dönüştürülebilir (solda) eğer probun ucu hedef bölgeyle eşleşmezse ve prob linear
kalırsa(sağ) ligasyonu inhibe edilir. (c) Doğrudan aktif bir probun bulunduran hedef dizinin
zincirleme serisi. (Reprinted from Baner et al. 2001 by permission of Elsevier Science).

Fiziksel haritalama klonlama süreciyle sınırlıdır

Fiziksel bir haritanın yapısının başlangıç noktası, genomik DNA ’nın parçalanması sonucunda
tüm çıkan parçaların klonlanmasıyla takip edilir. Her fragment eşsiz bir markır taşır, örneğin bir STS
kontig oluşturmak için yapıya katılmalı ve örtüşmelidir. Bu harita hazırlama sürecine rağmen
kavramsal olarak bu problemlerden bağımsız değildir. Örneğin, klonlanan ters bölgeler açılabilir
boşlukları takip eder. Bu bozukluk, klonlanan DNA yeniden düzenlendiğinde yada delesyon yada
klonlama süreci boyunca ayrı parçalar yapıştırıldığı zaman meydana gelir. Daha önce belirtildiği gibi,
in situ hibridizasyon tarafından bazı bozukluklar ortaya çıkarılabilir ama bu bozukluklar tamamen
önlenebilirse durum daha tatmin edici olacaktır. Bunu başarabilecek tek yol, DNA haritalamasında
direkt olarak klonlama sürecinden kaçınmaktır. Bunu yapmak için 3 tane method geliştirilmiştir: optik
haritalama, radyasyon hibrit haritalaması ve HAPPY haritalaması.

Optik haritalama tekli DNA moleküllerini gösterir

Optik haritalama, tekli DNA moleküllerinin restriksiyon enzimiyle kesilmesi süresindeki
resimlenmesini içerir. Schwartz ve ark. tarafından (1993) orijinal method tanımlanmıştır, akışkan bir
ortamda bir restriksiyon enzimiyle erimiş agarozda çözünen floresan boyayla boyanan DNA
moleküllerini uzatmak için kullanılır. Agaroz jelle moleküller karıştırıldığında jelle karıştırılan
magnezyum iyonlarının difüzyonuyla tetiklenen DNA molekülleri kesilir. Floresans mikroskobu,
kesilen yerleri göstermek için kullanılır, fragmentin ucundan kesilen bölgedeki DNA yoğunlaşmış
parlak havuzlar arasında bir boşluk olarak görünür.
Optik haritalamanı orijinal tanımlaması yapıldığından beri bir çok farklı metodolojik
gelişmeler sunuldu (Aston ve ark. 1999), bunlardan ikisinden burada bahsedilmiştir. İlki, orijinal
methodda her restriksiyon fragmentinin kütlesi, floresans yoğunluğu ve görünen uzunluğuyla
tanımlanırdı. Bu fragmentlerin kütleleri toplam klon boyutunun parçası olarak ve sonra klon
kütlesinden bağımsız olarak kilobaza dönüştürülür ( klonlana vektör sekansı). Ek olarak, haritalar
benzer sekansların oluşturduğu gruplardan türetilen son haritanın yapısını oluşturmak için ortalaması
alınmıştır. Lai ve ark. (1999) , test örneğiyle karıştırılan bakteriyofaj λ DNA’sını fragmentlerin
boyutlandırmasını kolaylaştırmıştır. Kesimden sonraki iç boyut standartları burada verilmiştir(Şekil
17.10). Onlar ayrıca enzim kesiminin etkililiğini gözlemek için kullanılabilir. İkinci olarak, method
otomatik olarak ve harita yapısındaki algoritmalar methodun gücünün artmasıyla geliştirilebilir

324
[Metni yazın]

(Giacolone ve ark. 2000). Son zamanlarda, bu methodda DNA tutulması için agaroza kıyasla bir
mikro-akışkan cihaz daha uygundur (Jendrejeck ve ark. 2003).

KUTU 17.1 Kilit problar kullanılarak yüksek verimli genotipleme

Bir popülasyondaki bireyler arasındaki en büyük farklılık SNP’ lerdir. SNP’ lerin çoğunlukta
olmasının biyolojik bir sonucu yoktur, bir parçanın yer değiştirmesi fonksiyonel olarak önemlidir ve
çeşitlilik gözlenmesi için temeldir. Örneğin, insanlarda iki birey arasındaki SNP farklılıkları yaklaşık
olarak 3. 2 milyondur ve fiziksel özellikler, hastalık duyarlılığı ve ilaç direnci gibi varyasyonlar için
küçük bir oran gerektirir. Şaşırtıcı olmamakla birlikte, ilaç şirketleri ve tıp alanının her bireyin SNP
profilini tanımlayabilmesi çok ilginçtir ki kişiler optimize ilaç seçimiyle tedavi olabilirler(
kişiselleştirilmiş tıp). Büyük ölçekli genotipleme için methodların kullanılabilirliği artar.
Methodların çoğunda, PCR kullanımını içeren SNP’ lerin bulunması ve her PCR reaksiyonu
için iki primer kullanılmasını gerektirir. Aynı anda 1000 ya da 10.000 SNP lokus analizi yapılırsa, bu
durum primer çiftlerinin aynı sayıda kullanımını gerektirecektir. Maalesef, daha sonra birkaç
primer çifti içeren çapraz reaksiyonlar üstesinden gelinemeyen sorunlar yaratabilir. Bu problemi
aşmak için, Hardenbol ve ark. (2003) kilit probları içeren, PCR uygulamaları için sadece tek bir
primer çifti gerektiren bir method geliştirdiler.
Yedi kısımdan oluşan her SNP yi tespit etmek için problar kullanılır ( Şekil B17.1a).
Probların terminalinde bulunan homoloji gösteren (H1,H2) iki bölge her SNP için tektir ve bunlar
tek bir tag sekansının bulunmasıyla tanımlanır. Her prob bir de iki yaygın primer bağlanma bölgesi
içerir ( P1, P2) ve iki yaygın bölünme bölgesi vardır (X1,X2). Bu probların kullanılması için gerekli
yol şekil B17.1b‘de gösterilmiştir. Genomik DNA’nın bir karışımı, 1000 yada daha fazla prob ve
termik ligaz ve DNA Polimeraz dört misli hazırlanır ve uzamaya uygun sıcaklıkta inkübe edilir.
Genomdaki tamamlayıcı dizilerin SNP hibridizasyonu için diziler homologtur, her probun
terminaliyle tekli bir nükleotid boşluğu arasında halkasal bir konformasyon yaratılabilir.
İşaretlenmemiş dATP, dCTP, dGTP ve dTTP dört reaksiyonun herbiri için sırasıyla eklenir.
Reaksiyonlara eklenen nükleotidler tekli baz boşluklarını tamamlar, DNA polimeraz nükleotid ekler
ve DNA ligaz boşlukları kapatır. Bu sonuçlar kovalent bağla kapanmış halkasal bir molekül, hibridize
olarak genomik zinciri çevreler (kilit prob gibi). Ekzonükleaz eklenir ve çıkarılan problar halkasal
yapı oluşturmazlar.
Kilit probları kullanılmadan önce, onların genomik DNA dan ayrılması gerekir. Bu urasil-N-
glikozilaz enzimi eklenerek yapılır, depunire birleşmiş urasil residüleri X1 bölgesinden ayrılır.
Isıtıldıktan sonra, zincirlerin abasic bölgelerinde ayrılma olur ve problar genomik DNA dan

325
[Metni yazın]

Optikal haritalamanın doğruluğu, E. coli ve Deinococcus radiodurans’ ın genomlarının DNA

sekanslarının tamamının analizleriyle restriksiyon haritaları oluşturularak bu organizmaların optikal
haritaları karşılaştırılır ve tanımlama yapılır. Bu iki durumda da hata oranı % 1 den daha azdır (Lin ve
ark. 1999a). Optikal haritalamanın gücü, malarial parazitin (Plasmodium falciparum) ve insan
genomunun DAZ lokusu ( Lai ve ark. 1999, Giacolone ve ark. 2000) için haritaların geliştirilmesinde
kullanılarak gösterilir. 24.6 Mb uzunluğundaki Sıtma genomunun sekanslanması için yapılan orijinal
plan titreşimli alan jel elektroforezi(PFGE) kullanılarak 14 kromozom ayrılarak düzenlendi ve sonra
kromozom-spesifik kütüphaneleri oluşturuldu. Bu yaklaşımda iki problem ortaya çıkmıştır. İlki, 5-9
arası kromozomlar PFGE kullanılarak ayrılamaz ve leke olarak görülürler. İkincisi, sıtma genomu AT
bakımından zengindir ve bu da güvenilir kütüphane oluşturmasında problem yaratır. Optikal
haritalama kullanılarak parçalanmamış P. Falciparum ‘dan meydana gelen BamHI ve NheI enzimleri
için restriksiyon haritaları düzenlenebilir ve kromozomlara karşılık gelen 14 contig birleştirilir. Bu
yöntemin nasıl kullanıldığı şematik olarak şekil 17.10’da gösterilmiştir.
Doğru bir fiziksel haritanın yapımı ve sekans verilerinin doğru bir şekilde üretimi yüksek
oranda tekrar eden DNA’lar içeren klonlar kullanıldığında çok zordur. Buna iyi bir örnek, DAZ
lokusudur, ki insan Y kromozomunun q kolunun haritalanmasında kullanılır. Optikal haritalamanın
öncesinde, bizim DAZ lokusunun yapısı hakkındaki bilgilerimiz eksikti fakat 16 farklı BAC klonunun
optikal haritalamasıyla lokusların hibridize yapısı görünür hale geldi(Giacolone ve ark. 2000). Orijinal
olarak düşünüldüğünde DAZ geninin iki kopyası olmasındansa gendeki lokusun 4 kopyası olması
tercih edilir, her biri tekrar eden elementlerin kendine özgü düzenlemesiyle olur(Şekil 17.11).

326
[Metni yazın]

Şekil 17.10 : Optikal haritalamanın şematik gösterimi. (Reprinted from Z. Lai et al. 1999 by
permission of Nature Publishing Group, New York.)

327
[Metni yazın]

Şekil 17. 11: İnsan Y kromozomunun DAZ bölgesinin haritalanmasının optikal haritayla üretimi.
Restriksiyon enzim bölgeleri şu şekilde gösterilmiştir: x, XhoI; b, BamHI; n, NheI; e, EagI; m, MluI.
(Giacolone ve ark. 2000 den izin alınarak tekrar çizilmiştir.)

Radyasyon hibrit taraması (RH) spesifik markırlar için DNA’nın tesadüfen kırılan
fragmentlerinin taramasını içerir
RH haritalaması insan genom haritalamasını kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. Bu methodda,
insan kromozomlarını fragmentlerine parçalamak için yüksek dozda X- Ray ışınları kullanılır ve bu
fragmentler kemirgen hücrelerindeki somatik hücre hibritlerini kullanarak iyileştirirler. (Kutu 17.2).
Kemirgen–insan hibrit klonları izole edilir ve özel insan DNA markırlarının varlığını yada yokluğunu
incelemekte kullanılır. Kromozom üzerindeki birbirinden uzak iki markırın arasındaki kromozomları
parçalamak için muhtemelen daha çok radyasyon verilmesi gerekir, iki ayrı kromozomal fragment
üzerine markırler yerleştirmek için. Kırılma frekansı tahmin edilerek, markırlar arasındaki uzaklık
geleneksel miyotik haritalamayla analog olan bir tutumla onların sıralarını belirlemek mümkündür.
Radyasyon hibrit haritalamasının geleneksel genetik (miyotik ) haritalamadan birçok avantajı
vardır. İlki, kromozomların kırılması rastgeledir ve rekombinasyonla birlikte görülen sorunlu bölgeler,
328
[Metni yazın]

engelleme yada cinsiyete bağlı farklılıklar yoktur. İkinci olarak, daha yüksek bir çözünürlük
sağlanabilir, örneğin radyasyon haritalamasında 100-500 kb , buna karşılık genetik haritalama da 1-3
Mb kullanılır ve çözünürlük radyasyon dozuna göre değişiklik gösterebilir. Sonuç olarak, polimorfik
markırların kullanılması zorunlu değildir, STS gibi monomorfik markırlar çok daha iyi sonuçlar
verebilir.
Bir radyasyon hibrit haritalama deneyinin olası sonuçları şekil 17.12’ de şematik olarak
gösterilmektedir. Bu şekilde, P tutma (koruma ) olasılığı, özel bir DNA segmenti içeren klonların
miktarı ya da bir RH klonunda bulunan DNA segmentinin bulunma olasılığıdır. P değeri radyasyon
dozunun işlevidir ve hücre hatları kullanılır ve genellikle P = %50 olduğu zaman haritalama gücü
%10-50 arasında maksimumdur. P değerinin küçük bir bölge üzerinde ya da kromozomun tamamında
sabit olduğu varsayılır ve bu segmentler birbirinden bağımsız olarak kaybolur ya da tutulur.
Kırılma olasılığı (θ), bir markırın bir ya da iki kırılmayla ayrılma olasılığıdır. İki markır
arasında bağlantı varsa, θ değeri sıfıra yakındır oysa bağlantısız markırlarda bu değer 1’dir. Burada
kırılma olasılığının radyasyon dozunun bir fonksiyonu olduğu dikkat çeker ve hücre hatları kullanılır.

KUTU 17.2 Somatik hücre melezleri

Somatik hücre melezleri

Somatik hücre melezlerindeki hücre hatları bir türün kromozomlarının tamamını ama sadece
bir ya da ikinci kromozomların sayısının sınırlandığı kromozomlar içerir. Onlar iki farklı türün
hücrelerini eriterek ve iki donor hücreye seçilmiş koşullar uygulayarak bunu sağlarlar.
Kaynaklardan biri belki özel bir ilaca hassas olabilir ve öteki kaynak büyümek için özel şartlar
isteyebilir, örneğin, timidin kinaz negatif hücreler hipoksantin, aminopterin yada
timidin(HAT)de büyümezler. Ortamda HAT yada ilaç olduğu zaman, sadece fonksiyonel bir
timidin kinaz geni içeren melez hücreler büyüyebilir. Eğer hibrit hücreleri ilk seçilimden sonra
seçici olmayan şartlar altında büyürse, kaynakların biri kromozomlarını daha az yada daha çok
kaybetme eğiliminde olurlar tesadüfü olarak. İnsan- kemirgen birleşmesi durumunda, ki bu
çok yaygındır, insan kromozomları tercihen kaybedilir. Sonuç olarak, bir kaynaktan sadece bir
yada birkaç kromozom aynı kalır. Bu yolla kemirgen hücre hatları bir yada iki insan
kromozomu içerir ve bunlar insan kromozomlarını -FAC-gibi ayrı halde izole etmede
kullanılabilir.

329
[Metni yazın]

Şekil 17.12 : Bir radyasyon hibrit deneyindeki farklı sonuçların olasılığı

Radyasyon hibrit haritalama uzaklıkları Ray yada santiRay ile ifade edilir, 1 cR %1 lik
kırılma frekansına eşittir. Uzaklıklar şu ifadeyle ölçülür:
Harita uzaklığı(D) = -loge(1- θ) Rays
Ve D’yle bir Poisson dağılımındaki kırılmaların sayısı tanımlanır. Bu değer genetik
haritalama için kullanılan Haldane’nin harita fonksiyonuyla analogtur. Yukarıdaki eşitlikte , eğer θ 0.1
ise uzaklık 11 cR ve θ 0.3 ise uzaklık 36 cR’ dır. Eğer herhangi iki markır arasındaki fiziksel uzaklık
biliniyorsa, fiziksel uzaklıklar radyasyon hibrit haritalamasına dönüştürülerek mesafeler
tanımlanabilir. Örneğin, insanın 11. kromozomunun q kolu 86 Mb ve 1618 cR dir. Bu yüzden, 1 cR 53
kb‘ye eşittir. Ayrıca, harita uzaklığının radyasyon doz uygulamasıyla olan ilişkisi Tablo 17.2 ‘de
verilmiştir.
Radyasyon hibrit haritalaması insan genomunu incelemek için geliştirilmiştir, ayrıca diğer
omurgalı genomları içeren fare, sıçan, köpek, domuz, at, babun ve zebra balığı gibi canlılar içinde
kullanılabilir(refererans için Geisler ve ark. 1999). Bir radyasyon hibrit paneli hazır olur olmaz,
herhangi bir fiziksel markırla( STS, EST, Basit sekans uzunluğu polimorfizmi(SSLP) vb.) harita
üzerindeki mevcut markırların bağlantısına bakılarak harita oluşturulabilir.

330
[Metni yazın]

Tablo 17.2 : Haritalama uzaklığındaki radyasyon dozunun çeşitleri

HAPPY haritalaması RH haritalamasının daha iyi bir alt versiyonudur

RH haritalama yöntemi operasyonel konularda bir dizi kısıtlama oluşturdu. Bunların ilki, bir
RH paneli oluşturmak için çok büyük efor sarfedilir, her memeli genomu için ve konakçı hücre
hatlarındaki ayrılma eğiliminden dolayı verici fragmentlerin biyolojik aktivitesinde oluşan
komplikasyonlar artar. İkinci olarak, melezlerdeki bir konak genomun varlığı, AFLP ve RAPD gibi
genel markırların kullanımını engeller. Son olarak, bu teknik bitkilere uygulanmaz. HAPPY
haritalaması kolay bir gösterimdir ve RH haritalamasına alternatif bir yöntemdir ve insan
genomu(Dear ve ark.1998), hayvan genomları( Konfortev ve ark. 2000, Piper ve ark. 1998) ve
Arabidopsis genomunun haritalanmasında kullanılır.
HAPPY haritalamasının prensipi şekil 17. 13‘te gösterilmiştir ve isteğe bağlı büyüklükteki
parçaların oluşması için ışınlama yada kesme yöntemiyle tesadüfü olarak kırılan genomik DNA‘yı
içerir. Sonra markırlar eşdeğer haploid bir genom içeren miktarlar(örnekler) vermek için elde edilen
fragmentler seyreltilerek ayrılır (bundan dolayı HAPPY methodudur).
Markırlar PCR kullanılarak belirlenir ve temsili bir örnekteki bağlı markır birlikte bulunma
eğilimindedir. Markırların harita düzeninde ve onların arasındaki uzaklık, onların birlikte ayrılma
frekanslarından sonuç çıkarılır. Bu methodun avantajı, hızlı olması, doğru sonuç vermesi ve klonlama,
miyotik rekombinasyon ve melez hücre formasyonlarının doğasında olan bozuklukları içermemesidir.
Bu teknik klonlama ve sekanslamada yüksek AT içeriğinden dolayı problem yaşanan birçok protista
genomunda başarılı olarak kullanılır(Piper ve ark. 1998, Konfortov ve ark. 2000) .
Yukarıdaki tartışmalardan şu kesin olarak çıkarılır, bu tekniğin kullanışlı bir çözünürlüğü ve
HAPPY haritalama paneli alanı DNA fragmentlerinin büyüklüğünden kaynaklanır ve bu büyüklük
ayrımıyla kontrol edilebilir. Kaba bir yaklaşımla, bir panel markırlar arası uzaklık 0.1 kereden daha
küçük olduğunda fragment büyüklüğünden kaynaklanan sorunları çözebilecektir. Aralarında daha az
boşluk bulunan markırlar neredeyse tamamen birlikte ayrılacak ve çözülmeyecektir. Bunun aksine, bu
teknik markırlar arasındaki bağlantıyı tespit edecek ve 0.8 den daha büyük fragmentleri ayrılacaktır.
Daha geniş aralıklı markırlar önemli derecede birlikte ayrılmazlar. Bu yüzden, DNA parçalanmasının
derecesini kontrol etmek için, paneller istenilen alanda ve çözünürlükte ayarlanabilir.

331
[Metni yazın]

Farklı haritalama methodlarının birlikte kullanılması zorunludur

Haritalama methodlarının her birinin avantaj ve dezavantajları yukarıda tanımlandı ve hiçbir
method tam olarak yeterli değil. Genomun büyüklüğü ve karmaşıklığını harita yapısındaki
metodolojileri büyük ölçüde etkileyebilir. Kullanılan farklı haritalama methodları farklı araştırma
grupları için yaygın değildir aynı genom üzerinde çalışıldığı zaman. En sonunda, harita üretimi için
farklı methodların birlikte kullanılmasına ihtiyaç duyuldu ve bu yapıldı. Örneğin, BAC klonları
bağlantı ve radyasyon hibrit haritaları referans alınarak insan sitogenetik harita yapımı için STS’lere
sahip olduğundan kullanılır(Cheung ve ark. 2001). Chen ve ark. (2001) bir radyasyon hibrit panelinde
STS ve PCR kullanılarak BAC klonlarının düzenlenmesi ve hızlı bir şekilde eklenmesi için bir
haritalama methodu tasarladılar. Benzer olarak, birleştirilmiş haritalar diğer türler içinde kullanılır,
örneğin sıçan (Bihoreau ve ark.2001), mısır(Yim ve ark. 2002) ve pirinç (Chen ve ark. 2002).
Çoğu genomik haritalama projesi bir diğeriyle ilişkili nesnelerin iki sınıfta düzenlenmesini
içerir. Bunlar kırılma noktaları ve markırlardır(Tablo 17.3). Kırılma noktaları, genomun
altbölümlerinde bulunduğu için böyle isimlendirilir ve özel bir deneysel kaynak olarak tanımlanır.
Markırlar genomdaki eşsiz bölgelerden meydana gelirler ve herhangi bir özel deneysel kaynaktan
bağımsız olmalıdırlar. Bu nesnelerin her ikisi de harita yapımı için zorunludur, harita kendini
markırlar bakımından tanımlayabilir, bunlar özellikle DNA sekansına dayanır. Bunun için bir neden de
markırlar kalıcıdırlar ve kolayca paylaşılırlar. Onlar DNA sekans bilgisinde hazır olarak saklanabilirler
ve bu şekilde dağıtılabilirler. Buna zıt olarak, kırılma noktaları dağıtım için geçici ve külfetli olma
eğiliminde olan deneysel kaynaklar olarak tanımlanırlar. Sekans tabanlı markırların kullanılmasının en
önemli sebebi onların herhangi bir DNA kaynağında kolayca taranabilir olmasıdır. Bu yüzden
birleştirilmiş haritaların yapımında çeşitli methodlar ve araştırmacılar kullanılabilir. Bazı birleşmeler
haritaların montajı ve değerlendirmesi için çok önemlidir.

332
[Metni yazın]

Şekil 17.13 : HAPPY haritalamasının ilkeleri ve markır tiplemesi. (a) genel görünüş, DNA’ nın
taşıdığı STS markırları (A, B,Z) hücrelerden çıkarılır (1) ve bir fragment havuzu oluşturmak için
rasgele parçalanır(2). Haritalama panelindeki bir seri örnek seyreltmeyi sınırlayıcı dağıtılır(3). Panel
bir tablo oluşturmak için PCR la taranır(4) bu tablo her örneğin markır içeriğini gösterir. Bağlı
markırlar(A,B) birlikte ayrılmış şekilde bulundu; ayrı markırlar ise böyle değildi(B,Z). Birlikte
ayrılma frekansları markır-markır arasındaki uzaklığı yansıtır, böylece bir harita oluşturulabilir(5). (b)
Markırların yayılmış görüntüsü üç aşamalı bir PCR kullanılarak taranır. Buradaki protokol harita
panelindeki bir örneği gösterir. Örnekteki tüm DNA’ların ilk ön-uygulaması primerlerin PCR
kullanılarak uzamasından 100 kat büyüktür(PEP). Bu madde seyreltilir ve taramanın çok kere
tamamlanması için altparçalarına ayrılır. Bir altparça çok sayıda markırın olduğu çoklu bir PCR da
uygulanır(faz I). Bu reaksiyonun ürünleri sulandırılır ve tekrar bölünür, ve dönüşte ayrı
markırlar(A,B,Z) yarı-içiçe geçmiş primerler kullanılarak taranır(Faz II). Sonuçlar jelde gösterilir,
böylece örneğin markır içeriği tanımlanır.

333
[Metni yazın]

Tablo 17.3 : Haritaların kategorizasyonu. (Cox ve ark. 1994 izniyle yayımlanmıştır, ©American
Association fort he Advancement of Science.)

Genom kırılma noktalarından bölünür, kırılma noktaları arasındaki bölgelere karşılık gelen
kutularda. Haritalama sürecinin değerlendirilmesindeki ilk aşamayı kutuların sayısı tanımlar, kutular
markırlar tarafından tutulur ve markırların dağılımı her kutu için olur. Bazı araştırmacıların harita
yapımı için sadece markırların toplam sayısının kullanılmasını söylemelerine rağmen, işgal edilen
kutuların sayısı gelişmelerin ölçülmesini sağlar. Kutu başına markırların sayısının dağılımı önemlidir
çünkü amaç tam olarak markırları yerleştirmektir yada en azından tesadüfen kümelenmeden ziyade
yayılmalarını sağlamaktır.
Gelişimi değerlendirmenin ikinci aşaması bunların işgal ettiği kutuları tanımlamaktır, kutular
bir diğeriyle ilişki halindedir ve düzenlemenin doğruluğunu tahmin eder. Unutmayın ki kutulardaki
markırların işaretlenmesi bir haritalama proje süresince devam etmelidir ama kutuların sırası sadece
tamamlanmış bir proje olduğunda mümkün olabilir. Bu sıralama tamamlanmanın derecesini göstermek
için iyi bir yoldur. Son olarak, bir haritadaki sıralı markırlar arasındaki uzaklığı ölçmek için
kilobazlara ihtiyaç vardır.
Tablo 17.3 ‘te söylendiği gibi, farklı deneysel kaynaklar farklı harita çeşitleri yapmak içi
kullanılır. Eğer uyum sağlanırsa sonra bunu farklı grupların benzer deneysel materyalleri kullanması
takip eder. Böylece haritalamanın anahtar bir kısmı genomik kütüphanelerin oluşmasını sağlar ve
hücre hatları bir araştırma grubu tarafından herkesin ihtiyacının karşılanmasını sağlar. Bu büyük bir
maliyet ve lojistik bir problemdir. Ayrıca, bazı kütüphaneler ve hücre hatları önceden yapılmıştır.
Örneğin, Osoegawa ve ark. (2000, 2001) evrensel referans materyalleriyle insan ve fare genomlarının
BAC kütüphanelerini oluşturmuşlardır. Benzer olarak, BAC‘lar insan genomunun sitogenetik
haritalanması (Cheung ve ark. 2001) için kullanılır ve çeşitli stok merkezlerinden de elde edilebilir.
Kaynakların durumuna bakıldığında, insan polimorfizm d’Etude du merkezinin(CEPH)
çalışmaları özel bir söylemi hak ediyor. Bu organizasyon insan genetiği üzerinde yapılan çalışmalar
için bir referans kaynak olmuştur. İnsanlardaki kabul edilebilir olmayan çiftleşmeleri engellemek için
referans bir kaynağa ihtiyaç vardı, çünkü insan üreme döngüsü deneysel olarak kullanmak için çok

334
[Metni yazın]

uzundu. Sonuç olarak, CEPH üç kuşak insan ailelerin hücre hatlarını saklayabilir, dört büyük ailenin
çoğu durumda, iki ailenin ve 8 çocuğun ortalamasını oluşturur(Dausset ve ark. 1990). Aslında 40
aileden alınan hücre hatları tutuldu ama sayıları şimdi çok daha fazla durumda. Bazı aileler genetik
haritalama için idealdir çünkü hangi aileden hangi alelin kalıtımla aktarıldığı sonucunu çıkarmak
muhtemeldir( Şekil 17.3’teki örneğe bakınız). CEPH bu ailelerin DNA’larının dağıtımı için dünyanın
her yerindeki araştırmacılarla işbirliği içindedir.

Genomların Sekanslanması

Yüksek Verimli Sekanslama İçin, Genom Sıralaması Gerekli Bir Önkoşuldur

Önceki bölümde bahsedildiği gibi, genomlardaki baz çiftlerinin büyüklüğü milyonlardan
yüzlerce milyona kadar değişebilir. Tekli bir Sanger sekanslama reaksiyonu 500-600 bazın
sekanslanmasına izin verir, bunun otomasyon için gerekli olduğu açıktır. Otomatik bir DNA
sekanslayıcısının teoritik sekanslama kapasitesinin ölçümü kolaydır. Dört boya içeren bir jel
sisteminin kapasitesi sekanslama reaksiyonlarının sayısını verir, bu her jel üzerinde uygulanabilir, her
örnekten bazların sayısı kadar okuma yapılır, jellerin sayısı kadar aynı anda çalıştırılabilir, bu durum
yılın her günü uygulanabilir. 24 kanallı bir sekanslayıcının kapasitesiyle yılda 2.7 milyon baz
ölçülebilir. Sekanslama için böyle bir alet kullanılmazsa insan genomunu sekanslama 1000 yılın
üzerinde zaman gerektirecektir ve bu kullanışlı bir öneri değildir.
Daha geniş ölçekli bir sekanslama yapabilmek için, 96 kanallı aletler ortak bir hale geldi ve en
az 384 kanallı bir araç geliştirilmiştir(Shibata ve ark. 2000). Slab jellerden kapiller sistemle arasında
değiş tokuş yapılarak elektroforez yürütme zamanı büyük ölçüde azaldı ve 24 saatlik bir periyot
içinde 9 yürütme yapıldı. Sekanslama reaksiyonlarının biyokimyası ve jel matriks kimyası için çeşitli
başarılar mevcut ve böylece okuma uzunluğu 500-600 bazdan 800 baza kadar artırılabilir. Bunun bir
sonucu olarak her ay her sekanslama cihazıyla 1-6 milyon baz civarında sekanslama yapabilmek
mümkün (Meldrum 2000b, Elkin ve ark. 2001) ve Amersham biyoloji bilimleri MegaBACE 4000
cihazıyla 24 saatte 2.8 milyon baz, yada 8 saatte 1 milyon baz okuyabildiğini iddaa ediyor. Bu
karşılaştırma yoluyla , 10 yıl önce sadece ayda sadece 40.000 bazın okuması yapılabilirdi(Fleischmann
ve ark. 1995). Bu laboratuvarlar büyük genomları sekanslamak için çok sayıda cihaza sahipler ve
günde milyonlarca baz sekans edebilirler, örneğin 18 milyondan daha fazla(Elkin ve ark. 2001).
Veri sekanslama düzeyini daha yukarılara taşımak için yüksek kapasiteli cihazlara sahip olmak
yeterli değildir. Elektroforez için hazırlanan jellerde yürütülecek örneklerden önce burada bir çok
uygulanacak aşama vardır. Örneğin, DNA izole edilir, parçalarına ayrılır ve sonra klonlanır yada
uygulanır. Sonra DNA önceden tanımlanan çeşitli sekanslama reaksiyonlarına bağlı olarak tekrar izole
edilir. Bu prosedürlerin her biri için yoğun bir çaba sarfedilir. Şaşırtıcı olmayarak, makinaların her biri
otomatik olarak çalışabilir ve bu makinelerin detaylarını Meldrum(2000a) verebilir.

335
[Metni yazın]

Burada genom sekanslaması için iki farklı yol vardır

Tüm genomların sekanslanması için iki farklı yol geliştirildi: ‘klonlamayla klon’ ve ‘tüm
genomların shutgun sekanslanması’ yaklaşımları. Bu iki stratejinin yararlarıyla ilgili çok sayıda
tartışma üretilebilir, özellikle de insan genomu sekanslanmasıyla ilgili. Bu tartışmayı daha iyi
anlayabilmek için terminoloji(kutu 17.3) kullanmak gereklidir ve bazı genom sekanslama yayınlarıda
bundan memnunlar. Son zamanlarda, genomların sekanslanmasındaki hibrit stratejilerinin kabul
edilmesiyle tartışmalar duruldu.
Daha önce bahsedildiği gibi, Sanger sekanslaması 500-800 baz uzunluğunu doğru bir şekilde
okuyabilir. Genom sekanslamadaki bir yaklaşım da shutgun yaklaşımıdır, büyük bir hedef DNA
sekansı, tesadüfü şekilde seçilen sekansların okunmasıyla toplanabilir. Yeterli sayıda bir örneklemle
(coverage) ayrı haldeki sekansların bir kısmı birlikte okunursa tüm genom sekansı hakkında sonuç
elde etmek mümkün olabilir. Uygulamada, iki sorunla karşılaşılacaktır. İlki, dağınık halde tekrar eden
sekansların varlığı, sekans montajını bozacaktır. İkincisi, kontiglerdeki sekansların montajı mümkün
olabilir ancak kontigler arasındaki boşlukların kapatılmasına ihtiyaç olacaktır. Bu problemlerin sayısı
analiz edilen genomun büyüklüğüyle doğrusal olarak artacaktır. Sonuç olarak, shutgun yaklaşımının
sınırlamasının kozmit büyüklüğünün hedef olarak gösterilmesi farzedildi. Bu yüzden, tüm genom, ilk
çakışan kozmidler kullanılarak fiziksel haritalamayla sekanslandı (Şekil 17.4). Bu ‘klonlama yoluyla
klon’ ve ‘harita oluşturma’ yaklaşımı olabilir ve Saccharomyces cerevisiae (Goffeau ve ark. 1996) ve
nematod Caenorhabditis elegans ‘ın (C. elegans Sequencing Consortium 1998) tüm genom sekansını
başarılı bir şekilde üretmek için kullanıldı.

336
[Metni yazın]

KUTU 17.3 Genom sekanslama projelerinde kullanılan bazı tanımlar

Contig : Kaynak genomun bitişik bir segmentine benzemek için sekans ya da klon dizilerinin
üst üste binerek okunması.

Coverage : Okunan sekans yada klon koleksiyonlarında genomik parçanın ortalama sayısını
ifade eder. Coverage , gereksiz çokluk-ihtiyaç fazlasıyla sinonimdir.

Minimal tiling path: Çakışan klonların küçük bir dizisi, birlikte bir genomik bölge karşısında
coverage sağlar.

Sequence ready map: Bakteriyal klon haritasındaki bir çakışmada gereksiz klon coverage’nın
, sekanslama için klonların rasyonel seçimine izin verir.

Finished sequence : Bir genom yada klonun sekansının tamamı, diğer bir ifadeyle doğruluk
yada yakınlık seviyesi.

Full- shutgun sequence : Sekansın bitmesi için okunan yeterli coverage’ ın yapılmasıyla
önceden bitmiş bir sekans çeşidi.

Prefinished sequence : Bir shutgun sekans projesi boyunca ön bir montajdan kaynaklanan
sekans.

Working draft sequence : Sekansın bitmesi için okunan yeterli coverage ın (8-10 katlanma)
yapılmasıyla önceden bitmiş bir sekans çeşidi.

337
[Metni yazın]

Şekil 17.14 : Venter ve ark.(1996) tarafından önerileriyle geleneksel sekans yaklaşımının

karşılaştırılması( tüm detaylar için metine bakınız.). BAC, bakteriyal yapay kromozom; STC, sarkık
sekansların birleştirilmesi (Nature’den özel izinle Venter ve ark. 1996 ‘dan tekrar çizilmiştir,
©Macmillan Magazines Ltd.).

Fleischmann ve ark. (1995) önceki harita olmaksızın Hemophilus influenzae bakterisinin

genomunu 1,830,137 bp olduğunu tanımladığında, shutgun sekanslama için büyüklük sınırının
kozmidler olduğu görüldü. Başlama noktası genomik DNA nın hazırlanmasıydı, sonra mekanik olarak
kesildi ve parçalara ayrıldı. Fragmetlerin büyüklüğü 1.6 ve 2.0 kb arasından seçildi, bu dar aralık
klonların büyümesinin minimum olduğu alandan sedçildi. Ek olarak, bir DNA fragmentindeki tüm
genlerin sayısı sadece 2.0 kb büyüklüğünde parçalara küçültüldü böylece zararlı gen ürünlerinin
ifadesinin olma olasılığı azaltıldı. Seçilmiş fragmentler bir sekanslama vektörüyle yapıştırıldı ve
serbest vektör ya da çift girişli kimeralardan kontaminasyonu azaltmak için tekrar parçalandı. Son
olarak, tüm klonlar tüm rekombinasyon ve restriksiyon fonksiyonları eksik olan konak hücrelerindeki
delesyonu ve eklemelerin tekrar düzenlenmesini önlenmesini sağladı.
Diğer birçok bakteriyal genom aynı temel methodlar kullanılarak H. influenzae genomunda
kullanıldığı gibi sekanslandı (Şekil 18.1). Bununla birlikte, gerçekte kontig montajını zorlaştırmak için
tekrar eden DNA içermeyen bakteriyal genomlardan (syf. 328) gelen methodların başarısının daha
fazla olduğunun farkına varıldı. Ayrıca, methodun başarısı takiben (Venter ve ark. 1996) fiziksel bir

338
[Metni yazın]

harita yapmaksızın tüm insan genomunun sekanslanması için bir method teklif etti. Maya yapay
kromozomlarını(YAC) ve kosmitleri kullanmaktansa, uzunluğu 350 kb den fazla gen sokulmasına izin
verebilen bakteriyal yapay kromozomları kullanıldı(Şekil 17.14). Bir BAC kütüphanesi ortalama 150
kb büyüklüğüne sahip ve genomun 15 defa katlanmasıyla hazırlandı. Kütüphaneyi oluşturan ayrı
klonlar mikrotiter kuyularda dizilerek manipülasyon kolaylığı sağlar. Vektör giriş noktalarındaki
başlangıç ve her BAC klonunun ucu, her uçtan 500 baz oluşturmak için sekans edilir. Bu BAC ucu
sekansları genomun her 5 kblik uzunluğunda doğrudan dağıtılacaktır ve sekansların %10 nunu
oluşturur. Bu sekans sarkık uçları (STC) ler her bir BAC klonunun yaklaşık 30 klonla ilişki kurmasına
izin verecektir. Gerçekte, STC’ ler STS’lere göre daha basittir.(syf. 348)

339
[Metni yazın]

KUTU 17.4 Restriksiyon enzimi parmak-izinin prensipleri

Restriksiyon enzimi parmakizinin prensipi aslında nematod Caenorhabditis elegans (Coulson ve ark.
1986) ve maya (Olson ve ark.1986) dan geliştirildi. Bunun orijinal formatında başlangıç materyali
kosmidlerden yapılmış bir genomik kütüphaneydi. Her kozmid klonu bir hekzanükleotit tanıma sekansıyla ve
bir restriksiyon endonükleazla sindirilir ve uçlar çakışmayacak şekilde düzenlenerk ayrılır, örneğin HindIII.
Fragmentlerin uçları radyoaktif bir nükleosit trifosfat varlığında reverse transkriptazla uç bölgeler
işaretlendi. HindIII ısıyla yok edildi ve fragmentler tekrar bir hekzanükleotit tanıma sekansıyla ve bir
restriksiyon endonükleazla ayrıldı, örneğin Sau3Al. Fragmentler yüksek çözünürlüklü bir jelde ayrıştı ve
otoradyografiyle incelendi, bir klonun parmak izi böyle üretildi(Şekil B17.2). Söylendiği gibi parmak izi
restriksiyon bölgelerinin bir basamağı değildir ; daha doğrusu bu olay klonların örtüşme olasılıklarındaki bant
kümelerinin oluşmasına dayanır.

Restriksiyon enzim parmak izine rağmen bunlar Drosophila (Siden-Kiamos ve ark. 1990),
Arabidopsis (Hauge ve ark. 1991), ve insan genomu (Bellané-Chantelot ve ark. 1992, Trask ve ark. 1992) gibi
bazı genomlar kullanıldı, bu method genellikle mikrobiyal genomlar dışında kullanılmaya uygun değildir(
Cole & Saint Girons 1994, Fonstein & Haselkorn 1995). Bu nedenler iki yönlüdür. İlki, kozmidler ortalama 40
kb‘lik bir giriş sekansıyla her tekli restriksiyon endonükleazı için birkaç bölgeye sahiptir. Bunun anlamı,
örtüşen önemli eşleşmelere istatiksel olarak izin vererek gerekli fragment sayılarını oluşturur ve bu
radyoaktif işaretleme ve çift seçimi kullanmak için gereklidir. Bu metodoloji tekrar üretilemez, büyük ölçekli
haritalama çalışmaları için uygun değildir (Marra ve ark. 1997, Little 2001). İkincisi , parmak izi
şablonlarından çakışmasında ortaya çıkan problemler katlanarak büyür, genomun boyutu haritada büyür.

Şekil B17.2 : Restriksiyon fragment parmakizinin prensibi. (a) işaretlenmiş restriksiyon fragmentlerinin
üretimi. (b) dört farklı klonun gelişim şablonu. 1, 2 ve 3 klonları arasında paylaşılan tüm bantlar gösteriyor ki
bu klonlar yakın durumdadır oysa klon 4 yakın değildir ve diğer 3 klonda birkaç bant ortaktır. (c) kontig
harita üretimi b deki verilerden gösteriliyor (Coulson ve ark. 1986’ dan izinle tekrar çizilmiş ve uyarlanmıştır).

340
[Metni yazın]

Restriksiyon enzimi parmak izinde güçlenme durumunu iki gelişme takip eder. Bunların ilki, büyük
girişli klonlar kullanılarak parmak izi methodun yüksek verimlilik elde edildi.(Marra ve ark. 1997). Bu
methodda bakteriyal yapay kromozomu (BAC) ve P1- kaynaklı yapay kromozom(PAC) klonları Coulson ve
ark.(1986) tarafından kullanılarak yerine konuldu. Çünkü bu klonlar 150 kb lik giriş büyüklüğüne sahip ve onlar
tekli bir restriksiyon enzimiyle sindiriminde fragmentler çok kolay ortaya çıkarılabilir(Şekil B 17.3).
Fragmentlerin bağıl hareketliliği ölçülerek,her klonun parmak izi gelişimi mümkündür ve diğer klonlar için de
aynı bağıl hareketlilik kullanılarak fragmentlerin geniş bir miktarı paylaşılabilir. Bu yolla kontig oluşturmak ve
klonların örtüşmesi mümkündür. Bu methodun iki diğer özelliği söylenmeye değerdir. İlki, çünkü sadece tekli
sindirim içerir, radyoaktif olmayan hasar methodları kullanılabilir. Bununla birlikte, DNA nın küçük miktarda
olması sebebiyle düşük kopya sayılı vektörlerle elde edilebilir, BAC ve PAC gibi, yüksek duyarlılık gösteren
hasarlar gereklidir. Bu floresans boylar ve yüksek hassaslıktaki floresans görüntüleyiciler kullanılarak
yapılabilir. İkinci, bu method her restriksiyon fragment boyutuna uygundur ve her klon kullanılabilir. Bu
özellikle sekans stratejileri dizayn edildiği zaman kullanışlıdır.

Restriksiyon fragment haritalaması ikinci aşamasını canlanma takip eder, parmak izi kontig(FPC)
olarak bilinen güçlü bir yazılımın yaratılması farklı klonların parmak izleri karşılaştırılarak ve örtüşenlerden
birinin incelenmesiyle büyük bir görev başarılmış olur. (Sounderlan ve ark. 2000). FPC yazılımı Marra ve ark.
(1997) nın metodolojisiyle bağlantılı olarak kullanılır. Eğer iki klonun çakışması incelenirse, paylaşılan
bantların sayısı sayılabilir, buradaki iki bant aynı büyüklükte olursa tolerans gösterilerek paylaşıldığı düşünülür.
Paylaşılan bantların sayısı tesadüfü olarak hesaplanır ve eğer bu sonuç kullanıcının belirtilen kesimin
aşağıdaysa, klonlar çakıştığı düşünülür. Bu yazılım test edildiğinde büyük kontig yapıları 9534 klondan oluşur.
Bazı kontigler manuel olarak oluşturulmaz. FPC yazılımını ek bir yararı ise sekans sarkık bölgeleri(STSler) vb.
gibi fiziksel markırların kullanılması yerleştirilmesini sağlar.

Şekil B17.3 : P1- kaynaklı yapay kromozomları(PAC) nın HindIII enzimiyle parçalanması tipik bir agaroz jel
haritasında gösteriliyor. Klonlar çapraz kontaminasyon olasılığı kontrolü için ve yayma sırasında stabilitesini
sağlamak için üç kopya halinde bulunur. DNA büyüklük standartları her 5. şeritte mevcuttur( Dr.M. Marra
tarafından verilmiştir.)

341
[Metni yazın]

Her BAC klonu giriş büyüklüğünü sağlamak için bir restriksiyon enzimi kullanarak parmak
izini sağlar ve çakışan klonların parmak izlerini karşılaştırarak artifakt klonları inceler. Merak edilen
BAC’ ların kaynağı sekans edilir ve STC’leri tanımlamak için BAC klonlarındaki 30 çakışma
veritabanı kullanılarak kontrol edilir. İki BAC klonu parmakizleri arasında iç bağlılık gösterir ve her
uçtaki minimal çakışma sekans edilir. Bu yolla insan genomunun tamamı 20.000 BAC klonu
kullanılarak sekans edilebilir. Bu öneri evrensel olarak kabul edilmedi fakat daha sonra Arabidopsis
thaliana (Lin ve ark. 1999b) ve insan genomunun (Uluslararası İnsan Genom Sekanslama
Konsorsiyumu) 2. Kromozomu (19.6 Mb) bu şekilde sekans edildi.
Oysa Venter ve ark. (1996) sekans uçlarında kullanılacak(STC) hiyerarşik bir shut gun
yöntemi önererek genom karşısında geniş alanlı süreklilik sağlamasında kullanıldı. Weber ve Myers
(1997) insan genomunun sekanslanması için total bir shutgun yaklaşımı önerdiler. Bu yaklaşımda,
DNA kesilir ve büyüklük seçilmeden önce E. coli klonlanır. Klonlama girişleri iki sınıfta toplanır: 5-
20 kb büyüklüğündeki uzun girişler ve 0.4-1.2 kb büyüklüğündeki kısa girişler. Sekans okuma
uzunluklarının yeterli büyüklükte olması iki sekansın kısa girişlerinin ucundan okunarak üst üste
getirilir. Uzun girişlerin iki ucu da sekans edilir çünkü girişlerin boşlukları ve oryantasyonu bilinir,
toplanabilen kısa sekanslar üzerinde bir yapı oluşturabilmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım çok iyi
algılanmadı (Green 1997, Marshall & Pennisi 1998) ama Myers ve ark. (2000) , Drosophila
melanogaster genomunun 120 Mb’ lık ökromatik bir parçasına bu yöntemi uygulayarak yaklaşımın
doğruluğunu gösterebildiler. Bununla birlikte, her iki durumda da sekans uçları BAC tan sağlanan
yardımcı bir yapı bilgisiyle 50 kb’lik girişler tanımlandı. Bir de, insan sekanslanmasında her sekans
sarkık bölgeleri (STS), fragmentlerin yerleşmesine yardımcı oldu, ayrıntılı bir STS haritasında. Bu
yolla insan genomunun sekanslanmasında adam başına düşen görev, Tablo 17.4 teki veriler göz
önünde tutularak elde edilebilir.

Tablo 17.4 : Venter ve ark. tarafından(2001) hazırlanan insan genomunun shutgun sekanslaması için
istatiksel sekanslar. Buradaki DNA sekansları 5 farklı ayrı sekanstan kaynaklanır(A,B,C,DveE).

342
[Metni yazın]

Şekil 17.15: Yeni oluşturulan bir genomun dizilimini belirleme stratejisi.(a) eBACların oluşumu. Bir
BAC tan ılımlı sekans koverajı(yaklaşık 1-8 katlanma) bir genomun aynı bölgesinden okunan tüm
genom sekansları yakalarken yem olarak kullanılır. Bu okumalar ve onların eş bazları, bir eBAC formu
oluşturmak için Phrap kullanılarak birleştirilir. Bu sıkı lokal montajı yakalanması %95 oranında tutulur.
(b) yüksek düzenli yapının oluşturulması. Çoklu eBAC lar sekansların örtüşmesinden kaynaklanan
bactiglere montaj edilir. Bactigler büyük klon eş baz bilgisiyle süperbactiglerde katılır(en az iki
bağlantı), ek bilgi kullanılarak ultrabactigler genişletilir(tekli bağlantılar, kontigler, markırlar, sinteni) ve
tamamlayıcı bir montaj oluşturmak için genom haritalama verisi en sonunda hizalanır(radyasyon hibrit
ve fiziksel harita).

Bugünlerde Shotgun sekanslama ve fiziksel haritalamanın kombinasyonu büyük

genomların sekanslanmasında kullanılan en favori methoddur
Hiç şüphe yok ki tüm bir genom sekansının montajı sekans okuması yapılan klonların
koleksiyonuna sahipse daha kolaydır ki zaten bir fiziksel harita üzerinde düzenlemiştir. Bununla birlikte,
harita yapımı çok zahmetli ve sekanslamadan çok daha fazla zaman alıcıdır. Buna zıt olarak, tüm
genomun shutgun sekanslaması çok hızlıdır fakat sekans montajı hata vermeye eğilimlidir. İnsan
genomunun sekanslanmasında, Venter ve ark. (2001) fiziksel haritaların kullanılması yaygın olmasını
Uluslararası İnsan Genom Sekanslama Konsorsiyumu (2001) tarafından sağlandı. Fare genom sekans
taslağı shutgun sekanslama ile üretildi fakat montajlanan sekanslar problemler sebebiyle duplike olan
bölgeleri gösterir(Fare Genomu Sekanslama Konsorsiyumu 2002).
Sınırlamaların üstesinden gelmek için genom sekanslama da iki temel yaklaşım vardır, Sıçan
Genom Sekanslama Proje Konsorsiyumu (2004), BAC sekanslama ve shutgun sekanslama içeren
kombine bir yaklaşımla adapte edilmiştir (Şekil 17.15). Bu kombine yaklaşımda, shutgun sekans verisi
zenginleştirilmiş BAC (eBAC) olarak adlandırılan verimli ara ürünler için ayrı haldeki BAC’ ların hafif
sekans coverage ile giderek karışır. eBAC’lar tüm genomu kaplar sonra bactig adı verilen uzun yapılara
343
[Metni yazın]

katılırlar. Bu bactigler daha uzun yapıdaki superbactigleri oluştururlar ve bu superbactigler de

ultrabactig yapısına bağlanırlar. Diğer veriler STC, DNA parmakizleri ve fiziksel markırlar gibi sekans
montaj sürecini kolaylaştıran uygun veriler kullanılır.

Sekanslardaki boşluklar tüm genom sekanslama metodolojileriyle oluşabilir ve

kapatılmaya ihtiyaç vardır
Hangi sekanslama stratejisinin kullanıldığının önemi yoktur, her yöntemde montajlama
aşamasında boşluklar oluşur. Bu boşluklar iki kategoride incelenir: sekans boşlukları bir kalıp içinde ve
fiziksel boşluklar bir kalıba ihtiyaç yoktur. Sekans boşlukları şekil 17.16 da gösterilen bir primer-hedefli
yürüme stratejileri kullanılarak kapatılır. Fiziksel boşlukları kapatmak çok daha zordur. H. influenze
genomunun shutgun sekanslaması durumunda teknik bir yöntem kullanıldı. Örneğin, oligonükleotit
primerleri dizayn edildi ve her kontigin ucundan sentezlendi. Bu primerler hibridizasyon
reaksiyonlarında varsayıma dayalı olarak kullanıldı, işaretlenmiş oligonükleotitler kontiglerin bitişik
uçlarıyla homolog DNA restriksiyon fragmentleriyle hibridize edilmelidir (Şekil 17.17a). Bağlantılar bir
peptit veritabanında her kontig ucu araştırmasıyla yapılabilir. İki kontiğin uçları aynı veri tabanında
sekansında eşleştirilir, sonra iki kontiğin geçici olarak bitişik olduğu varsayıldı(Şekil 17.17b). Sonuç
olarak iki λ kütüphaneleri genomik H. influenze DNA‘sından yapılmıştır ve kontiglerin ucundan dizayn
edilen oligonükleotitlerle incelenir. Positif plaklar için hazırlanmış plaklar kullanıldı ve sekanslar her λ
klon girişinin ucundan tanımlandı. Bu sekans fragmentleri tüm kontigler bir veritabanında araştırıldı ve
iki kontig aynı lamda klonlarının zıt uçlarından eşleşen sekanslar düzenlendi ( Şekil 17.17c). λ klonu
sekans haritasının şekli için kalıp sağlar.
Boşlukları kapatmak için kullanılan diğer bir method temsili fark analizi kullanılır(Lisitsyn ve
ark. 1993). Bu teknikte tüm genomik DNA’ dan DNA kütüphanesi eksiltici bir hibridizasyon yapar. Bu
yolla, Frohme ve ark. (2001) Xylella fastidiosa bakterisinin sekansında 13 boşluktan 11 i kapatılabilir.
Bu method sekans izolasyonu için kullanışlı olmasına rağmen, boşlukları artırır, izole edilen her sekans
için kullanışlı olmayacaktır, eğer sekanslar bir kontige montaj edilmezse bir boşluğun ucunda en az
güvenilen yerdir.

344
[Metni yazın]

Şekil 17.16 : Bağlı DNA sekans kontiglerinin yürütülmesi

DNA’nın direkt klonlanmasında transformasyon ortaklı rekombinasyon (TAR) kullanılarak

kütüphanelerde kaybolması mümkündür. Orijinal olarak tanımlandığında(Larionov ve ark.1996) YAC
içeren Alu sekanslarıyla başlandı. Bu vektör iki fragmenti oluşturmak için bağlanır, biri Alu
telomerinden oluşur ve diğeri Alu- sentromer- telomer den oluşur. Eğer bu fragmentler yüksek
moleküler ağırlıklı Alu sekansı içeren insan DNA’sıyla karıştırılırsa, büyük insan DNA girişleri içeren
yeni YAC lar oluşturmak için transformasyon boyunca rekombinasyon olur. Temel olarak, Alu
sekansları bir ‘kanca’ olarak rol oynar ve Noskov ve ark. (2003) sekans homolojisi için minimum
uzunluk için 60 bp gerektiğini göstermiştir. Kancaların Alu sekanslarına ihtiyacı yoktur ama sekanslar
kontig uçlarından kaynaklanır, sekans boşluklarını kapatmak için DNA tuzak olarak kullanılır.
Boşlukların bazıları, sentromer ve telomer içeren DNA klonlanmasının zorluğu sebebiyle tüm
genomda olabilir. Telomerlerin yokluğu, kolayca açıklanabilir: telomerlerde tekrar eden (TTAGGG)n de
restriksiyon bölgelerinin yokluğunun anlamı, onlar klonan vektörlere girmiş olabilirler. Bu problemin
çözümü için yarım YAC’lar kullanılır. Bu halkasal maya vektörleri tekli bir telomer içerir, telomerin
ucunda eşi olmayan bir restriksiyon bölgesine sahiptir(Riethman ve ark. 1989). Uygun bir restriksiyon
enzimiyle olan ayrılmada, bir ucunda (yarım-YAC) tekli bir telomer içeren doğrusal bir molekül
meydana gelir. Bu molekül lineer formda yeterli değildir, bu yüzden başka bir telomer eklenir. Bazı
yarım-YAC lar kullanılarak, Riethman ve ark. (2001) insan genom sekansını oluşturmak için 32
telomer bölgesi birleştirilebilir.

345
[Metni yazın]

Şekil 17.17 : Fleischmann ve ark. (1995) tarafından sekanslanmasında fiziksel boşlukları kapatmak için
kullanılan üç method. Her durumda kontiglerin ucundaki sekanslar dalgalı çizgiler olarak gösterilmiştir
ve ayrı sekanslara ayrı numaralar verilmiştir. Kontigler büyük harflerle gösterilmiştir. (b) deki ayrı
haldeki amino asitler standart tekli harf koduyla gösterilmiştir. Her methodun içeriğiyle ilgili detaylar
metinde mevcuttur.

Genom- sekans bilgi niteliklerinin tanımlanmasına ihtiyaç vardır

Gen manipülasyon teknikleri 1970’lerin sonu ve 1980’ lerin başında gelişmeye başladığı zaman,
klonlama genlerini tanımlamakta kullanıldı ve sonra gen sekanslama gen üretimini karakterize etmek
için kullanıldı. Yüksek verimli genom sekanslamanın gelişmesiyle, biyolojik araştırmalar bu yolla
önemli bir değişimi üzerine almış oldu. Bugün, genomların sekanslanması sadece yeni genlerin
keşfedilmesinin devam etmesiyle değil ayrıca organizmaların biyolojisi ve onların evrimini anlamak
için kullanılır. Bununla birlikte, eğer genom sekans bilgisi böyle devam ederse bu yol bunun
tamamlanması ve doğruluğu için gerekli olacaktır. 1997 yılında, bilim adamları liderliğinde insan
genomunun sekanslanması için standartlar oluşturuldu, ki bu Bermuda standartları olarak bilinir,
sekansın doğruluğu için: (http://www.gene.ucl.ac.uk/hugo/bermuda2.htm). Bu standartlarda, biten
sekansların doğruluğu %99.99 olmalı ve boşluklar olmadığı zaman sekanslar birbirine yakın olmalı, gibi

346
[Metni yazın]

özellikler ifade edilir. Daha önce bahsedildiği gibi, her ökaryotik genom, klonlama yada sekanslama
zorluğu olan bölgelere sahiptir. Bu bölge çeşitliliğinin farklı türlerde farklı şekildedir ve her sekanslama
konsorsiyumu pragmatik kararlar uygularlar, yayın için bu coverage lerin ne zaman yeterli düzeye
gelecekleri gibi(Tablo 17.5). Daha sonra fazla çalışılarak boşluklar elimine edildi. İnsan genomunu ele
aldığımızda, 24 kromozomun tamamının sekanslanmasının bitmesi 2004 ortalarını buldu.

Tablo 17.5 : Bazı ökaryotik genomların sekanslama istatistikleri

Yayınlanan tüm genom sekansları, okunan yüzlerce ya da milyonlarca sekansın uygunluğu ve

montajdaki her pozisyondaki korunmuş bir bazın ifadesinden kaynaklanır. Bir sekansın doğruluğu, bir
korunmuş sekanstaki baz çiftlerinde doğru bazların kullanımıyla ölçülmesidir. %99.99 oranındaki
doğruluğun anlamı sadece her 10,000 bp lik bir sekansta bazın birinin yanlış olmasıdır ve insan
genomunun sekanslanmasında bu durum arka planda kalan 3 milyon SNP toplamda 300,000 baz çifti
hata vermesiyle eşitlenir! Sekansların doğruluğu genellikle DNA baz-arama yazılımının (PHRED
sonuçları syf. 131) hata olasılığının belirlenmesiyle ve örtüşen klon sekansları arasındaki
uyumsuzluklarla tanımlanır. İnsan genom sekansının geçmişteki kalitesinin belirlenmesi gösterdi ki
konsorsiyum katılımcılarının çoğu istenen doğruluktaki standartla ve hataların en yaygın kaynaklarının
nasıl tanımlanacağını öğrenmiş oldular.

347
[Metni yazın]

17. QUESTIONS & ANSWERS

RECOMBINANT DNA TECHNOLOGY
CHAPTER 17 : MAPPING AND SEQUENCING GENOMES
1) What is the disadvantages of FISH method?

The disadvantages of the method are that it cannot be used to generate reliable
measurements of the distances between signals nor can it be used to localize unknown
sequences on a chromosome.This is because the stretching of individual chromosomes is
highly variable.

2) What is the properties of cytogenetic maps?

The classic cytogenetic map gives visual reality to other maps and to the chromosome itself.
Because it does not rely on the cloning of DNA fragments it avoids the pitfalls that this
procedure can introduce, particularly with YACs. As with cytogenetic maps, linkage maps
examine chromosomes as they are in cells.
Cytogenetic can lead to errors, they nevertheless are used as gold standards against which the
physical maps are judged. Where genetic markers have been located on the cytogenetic map
by in situ hybridization they also can be positioned on the physical map.

3) What are the duties of padlock probs? Explain.

Another variation on FISH is the use of padlock probes.
Padlock probes are oligonucleotides that can be ligated to form a circle if they bind to a
sequence of exact complementarity.
The lateral arms of the oligonucleotide twist around the DNA target forming a double helix
and their termini are designed to juxtapose so that they may be ligated enzymatically.
The closure of the two alternative padlocked probes occurred only when there was perfect
sequence recognition.

4) What are the methods used to DNA mapping without cloning?

The only way that this can be achieved is to avoid the cloning process by mapping DNA
directly. Three methods of doing this have been developed: optical mapping, radiation hybrid
mapping, and HAPPY mapping..

5) What is the optical mapping?

Optical mapping involves the imaging of single DNA molecules during restriction enzyme
digestion.In the original method, fluid flow is used to stretch out fluorescently stained DNA
molecules dissolved in molten agarose along with a restriction enzyme. When the agarose
gels the molecules are fixed in place and cutting of the DNA is triggered by the diffusion of
magnesium ions into thegelled mixture. Fluorescence microscopy is used to visualize the
cleavage sites, which appear as gaps between bright condensed pools of DNA on the fragment
end flanking the cut site.

348
[Metni yazın]

6) What is the HAPPY method and which has the advantages of HAPPY
method? Explain.
HAPPY mapping represents an easy and generic alternative to RH mapping and has been
used to map the human genome, animal genomes and the Arabidopsis genome.
The principle of HAPPY mapping involves breaking genomic DNA randomly by irradiation
or shearing followed by an optional size fractionation step. Markers then are segregated by
diluting the resulting fragments to give aliquots containing one haploid genome equivalent.
Markers are detected using the PCR and linked markers tend to be found together in an
aliquot. The map order of markers, and the distance between them, are deduced from the
frequency with which they co-segregate.

7) What are the features of ‘breakpoint and marker’ used terms in

genomic mapping?
Breakpoints, so called because they represent subdivisions of the genome, are defined by a
specific experimental resource. Markers consist of unique sites in the genome and should
be independent of any particular experimental resource. Although both types of object are
essential for map construction, the map itself should be defined in terms of markers,
especially those based on DNA sequence. One reason for this is that markers are
permanent and easily shared. They can be readily stored as DNA sequence information
and distributed in this fashion.

8) What is the genom shutgun sequencing? What is the disadvantages of

this approach?
In the shotgun approach, in which a random selection of sequencing readswould be collected
from a larger target DNA sequence. With sufficient oversampling (coverage) it should be
possible to infer the complete genome sequence by piecing together the individual sequence
reads.
In practice, two problems will arise. First, the presence of dispersed repeated sequences will
confound the sequence assembly.
Second, assembly of sequences into contigs will be possible but there will be gaps between
contigs that will need closing by other means. The numbers of these problems should increase
linearly with the size of the genome to be analyzed.
9) How to human genom were mapped using BAC?Explain.
Nevertheless, the success of the method led Venter et al. (1996) to propose a method for
sequencing the entire human genome without first constructing a physical map. Rather than
using yeast artificial chromosomes (YACs) and cosmids it would use bacterial artificial
chromosomes(BACs) , which can accept inserts up to 350 kb in length.
In this way the entire human genome could be sequenced with just over 20,000 BAC clones.
This proposal was not universally accepted but subsequently a modification of it was used to
sequence chromosome 2 (19.6 Mb) of Arabidopsis thaliana (Lin et al. 1999b) and the entire
human genome (International Human Genome Sequencing Consortium 2001).

349
[Metni yazın]

10) What are the methods used to close the gaps in sequences?
No matter what sequencing strategy is used there always are gaps at the assembly stage.
These gaps fall into two categories: sequence gaps where a template exists and physical gaps
where no template occurs. Sequence gaps can be closed using a primer directed walking
strategy.
Physical gaps are much harder to close. In the case of the shotgun sequencing of the H.
influenzae genome, a number of techniques were used.
Another method for closing gaps is to use representational difference analysis. In this
technique one undertakes a subtractive hybridization of the library DNA from the total
genomic DNA. In this way, were able to close 11 out of 13 gaps in the sequence of the
bacterium Xylella fastidiosa. Although this method is useful for isolating sequences that fall
within gaps, any sequences isolated will not be useful if the sequences cannot be assembled
into a contig that is anchored on at least one end of the gap.

350
[Metni yazın]

18. BÖLÜM

KARŞILAŞTIRMALI GENOMİKS

351
[Metni yazın]

Giriş
Karşılaştırmalı genomiks, değişik organizmaların genom yapıları ve organizasyonlarındaki
farklılık ve benzerliklerin çalışılmasıdır. Örneğin, insan ve diğer organizmalar arasındaki farklar
genomumuza nasıl yansır? İnsan, meyva sineği, kurt, bitki, maya ve bakteri gibi çeşitli canlılarda
protein tip ve sayıları birbirine ne kadar benzerlik gösterir? Esasında karşılaştırmalı genomiks,
biyoinformatik metodların, 9. Bölümde açıklanan biyolojik prensiplerin tanımlanması amacıyla
yapılan tüm genom dizi analizlerine uygulanmasından daha başka bir şey değildir. Okuyucunun
yakında anlayacağı gibi, karşılaştırmalı genomiks, çok güçlü bir tekniktir ve başka bir yolla elde
edilmesi mümkün olmayacak bir biyolojik yeteneğe imkan sağlar.
Karşılıklı genomiks çalışmalarını sürükleyen iki güç vardır. Birincisi,evrim sürecini temel
seviyede, daha detaylı bir şekilde anlayabilma arzusudur(organizmaların temel sınıflarının kökeni) ve
lokalde de (akraba türleri birbirinden farklı kılan nedir?)
İkincisi, DNA dizilerindeki bilgilerin, belli görevleri yürüten proteinlere dönüşümünün anlaşılması
ihtiyacıdır. Buradaki temel mantık, gereksiz gereksiz fonksiyonları kodlayan diziler ve kodlama
yapmayan dizilere göre, önemli hücresel fonksiyonlardan sorumlu dizilerin, canlılar arasında
korunmuş olma ihtimalinin daha yüksek olmasıdır.
Son zamanlara kadar, karşılaştırması yapılacak ideal türlerin, mümkün olduğunca birbirlerine şekil,
fizyoloji ve davranış olarak benzer olanlar olduğu düşünülüyordu ve bunlar, fonksiyonu olmayan
dizilerin birbirinden uzaklaşmasına imkan tanıyacak kadar zaman geçerek, etkili bir şekilde
evrimleşmişlerdi. Daha sonraları Botelli (2004), genom kıyaslamaları ile göstermiştir ki, birbirine çok
uzak olan memeli ve balık gibi canlılarda, çok önemli vazifesi olduğu düşünülen korunmuş dizilerin
tespit edilmesi mümkündür.

Ortolog ve paralogların formasyonu gen evriminde anahtar roldedir.

Farklı canlılardaki genom organizasyonlarını kıyaslamak için, ortolog ve paraloglar arasındaki
farkların ortaya konması gereklidir. Ortologlar, farklı canlılarda aynı işlevi gören proteinleri kodlayan
homolog genlerdir ve direktgeçişle (vertical descent) evrimleşmişlerdir.
Paraloglar ise, bir organizma içindeki kodlanan proteinlerle ilişkili fakat farklı vazifelere
sahip homolog genlerdir. Bu tanımlarla belirtilmek istenen, ortologların basitçe mutasyonların aşamalı
birikimi sonucu evrimleştiğidir. Paraloglar ise mutasyonların birikimini takiben gen duplikasyonu ile
oluşmuşlardır. Paralogra 16 kısımda tanımlanan protein süper aileleri iyi bir örnektir ( şekil 16.6 ve
tablo 16.1 ).
Bir çok canlı organizma için ortak çok sayıda biyolojik aktivite vardır. Sitrik asid döngüsü,
ATP üretimi, nükleotid sentezi, DNA replikasyonu..vb.
Bu ve benzeri tüm biyolojik olaylarda anahtar proteinlerin ortologlar olduğu düşünülebilir.
Hatta, tüm archaea, eubakterya ve ökaryotlarda rastlanan “ evrensel protein aileleri” tanımlanmıştır (
Kyrpides 1999 ).
352
[Metni yazın]

Bununla beraber, görevce özdeş proteinlerin ne dizi benzerliğine ne de hatta ortak üç boyutlu
katlanmalara ihtiyaç duymadığı ile ilgili artan deliller ortaya konmaktadır (Galperin et al. 1998,
Huynen et al. 1999).
Farklı organizmalarda benzer fonksiyondan sorumlu iki veya daha fazla ayrı ortolog setinin
varlığı non-orthologous gene displacement olarak adlandırılır. Şimdiye kadar 200’ e yakın farklı
genom sekans edilmiştir ve açıkça görülmüştür ki gene displacement çoğu temel gende meydana gelir.
Böylece, her hücre gereksinimi için, en az iki biyokimyasal çözümün olduğu görülür.
Şimdiye kadar sadece gene displacement olayının gözlemlenmediği 60 kadar gen tanımlanmıştır.
Bunların çoğu da transkripsiyon ve translasyon sistemlerinin bileşenlerini kodlamaktadırlar ( Koonin
2003 ).

Exon shuffling ve protein evrimi

Proteinlerin sekans ve üç boyutlu yapılarının analizleri, proteinlerin farklı domainlerden
oluştuklarını ortaya koymuştur. Mozaik proteinler olarak adlandırılan proteinler başlıca metazoada bol
miktarda bulunmaktadır. Mozaik proteinler çoğunlukla hücre dışı oldukları veya membran-bağlı
proteinlerin hücre dışı kısımlarını oluşturdukları için, çok hücreliliğin evriminde önemli rol almış
olabilecekleri düşünülmüştür. Bir mozaik proteinin kendi domainlerinin, proteinin tüm aktivitelerine
destek sağlayan, özel vazifelerle ilişkili olduğu görülür.
Bu domainler evrimsel olarak mobile dır. Yani evrim sırasında yayılmış oldukları düşünülür.
Mobile domainler bağımsız katlanma yetenekleri ile karakterize edilirler. Bu onlar için temel
bir karakteristiktir çünkü yeni bir protein ortamına aktarıldıklarında hatalı katlanmalardan korunmuş
olurlar.
Şu ana kadar 60 mobile domain tanımlanmıştır.
Mozaik proteinleri kodlayan genler üzerine yapılan araştırma, domain organizasyonu ve
intron-ekzon yapısı arasında kuvvetli bir bağlantı olduğunu ortaya koymuştur. (Kolkman& Stemmer
2001);
Örneğin, her bir domain, ekzonların ve aracı dizilerin içindeki rekombinasyonca oluşturulmuş
yeni ekson kombinasyonlarınca kodlanma eğilimindedir.
Bu süreç genlerin yeniden düzenlenmesi ve böylece fonksiyonlarının değişmesini kapsar. Bu
olay, exon shuffling olarak adlandırılır.
Ortalama intron, ortalama ekzondan daha uzundur ve rekombinasyon frekansı DNA uzunluğu
ile orantılıdır, genetik değişim büyük oranda kodlanmayan dizilerde görülür.
Homolog olmayan genlerin rekombinasyonu ve yanlış hatalı eşleşmelerin etkisiyle, çok
sayıdaki transposable element ve intronların tekrarlı dizileri exon shuffling i kolaylaştırmaktadır.
Exon shuffling için, homeostatik poteinler örnek olarak gösterilebilir.

353
[Metni yazın]

Şekil 18.1 Kan pıhtılaşması ve fibrinoliz, inaktif zimojenlerin aktif enzimlere dönüştüğü çok kademeli
enzimatik bir süreçtir. Bu zimojenler, serin proteaz ailesine dahildirler ve aktive olmaları, belli
sayıdaki peptid bağlarının proteolizi ile sağlanmaktadır. Homeostatik proteazlar ve tripsin gibi arketip
model proteazların aminoasit dizilerinin karşılaştırılması, asıl olanın, geniş N-terminal uzantılara sahip
olduğunu gösterir. Bu uzantılar, substratı tanıma, kofaktöre bağlanma gibi çeşitli vazifeleri olan farklı
domainlerden oluşmaktadır. Farklı domainler, kodlayıcı genlerin ekzon yapısı ile güçlü bir bağlantı
gösterir.

Mozaik proteinler, başlıca metazoada (çok hücrelilerde) olmakla beraber, bir hücrelilerde de
bulunmaktadırlar. Archae, Eubacteria ve Eukarya ya ait mikrobiyal genom analizleri bu durumu
göstermiştir. Bu verilerden yola çıkarak, domainlerin evrimsel hareketini tespit etmek mümkün
olabilir. Wolf isimli araştırmacı, 2000 yılında, 15 bakteri, 4 arkea ve bir ökaryot genomunu
incelemiştir. 37 tane native domainleri oluşturan protein ve bir tane horizantal olarak edinilmiş
yabancı (alien) domain bulmuştur.

Bakterilerin karşılaştırmalı genomiksi

2004 yılına kadar, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi web sitesinde, genom sekansı yapılmış,
173 bakteriye (19 Archaea,, 154 Eubacteria) ait liste yayınlanmıştır.
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/MICROBES/Complete.html).
Bu sekans analizlerinden elde edilen bilgiler iki dikkate değer durumu ortaya koymuştur.

354
[Metni yazın]

Birincisi, genom boyutları , 0.49 Mb (Nanoarchaeum equitans) den, 9.1 Mb (Bradyrhizobium

japonicum ve Streptomyces in iki türü) e 18 kattan fazla değişmektedir.
İkincisi gen yoğunluğu, dikkate değer şekilde tüm türler arasında benzerdir ve her kilobaz
DNA için yaklaşık 1 gendir. Bu da büyük prokaryotik genomların küçük olanlara kıyasla, daha fazla
gen içerdikleri manasına gelir.
Bunun tersi olarak, insan genomu, Drosophila ya kıyasla sadece iki kat fazla gen içerir.
Bu yüzden, prokaryotların genom büyüklüğündeki çeşitlilik, incelenmeye değerdir.
Çeşitli organizma genomları, büyüklüklerine göre sıralanınca ilginç durumlar göze çarpar.
İlki, arkelerin çok daha küçük genoma sahip olduklarıdır. Bu az sayıda arke genomunun
araştırılmış olması yüzünden hatalı bir değerlendirme olabileceği gibi, muhtemelen onların sadece
belli özel bölgelerde yaşamaları ve çok az metabolik çeşitliliğe ihtiyaç duymalarından da
kaynaklanıyor olabilir.
Bir istisna olarak, Methanosarcina Acetivorans gösterilebilir. Bu canlının farklı çevrelerde
gelişim gösterebildiği ve 5.8 Mb lik en büyük arkeal genoma sahip olduğu bilinmektedir.
İkincisi, en küçük eubacterial genomlar, insan ve hayvanlar ile ilişkili organizmalarda
bulunur (örnek olarak, mycoplasma, rickettsia, chlamydiae).
Ayrıca, sürpriz olmayacak şekilde, genom büyüklüğü, metabolik ve fonksiyonel çeşitlilik
arasında kuvvetli bir ilişki olduğu görülür.
Bu duruma örnek olarak Bacillus ve Streptomyces (spor oluşumu, antibiyotik sentezi),
rhizobia (simbiyotik nitrojen fiksasyonu), ve Pseudomonas (çok çeşitli aromatik bileşiklerin
degredasyonu) ların genom boyutları verilebilir.

Karşılaştırmalı genomiks kullanılarak bir organizmanın bağımsız olarak varlığını

sürdürebilmesi için ne kadarlık bir minimal gen seti içeriğine sahip olması gerektiği
tespit edilebilir.
N. equitans genomu şu ana kadar sekansı çıkartılan en küçük genomdur ( Waters, 2003). Fakat
bu organizma zorunlu bir simbiyonttur. Bu durum serbest bir yaşayan organizmanın, minimal genom
ihtiyacının ne kadar olduğunu sormaya bizi yönlendirir. Aslında bu canlının yaşadığı ortamın çevre
koşulları tanımlanmadan gereksiz bir soru hükmündedir. Aslında, mutlak minimal gen içeriği, canlının
tüm temel besinlerini temin edebildiği ve hiçbir çevresel stres faktörünün olmadığı en uygun koşullara
göre tanımlanmalıdır. Eğer biri, fonksiyonel açıdan önmli RNA moleküllerini ve kodlama yapmayan
dizileri göz ardı ederse, bu durum minimal protein setini tanımlamadaki problemlerden biri olarak
karşımıza çıkar.
Minimal protein seti ile ilgili ilk çalışma Hemophilus influenzaeve M. Genitalium da bulunan
ortolog protein listelerinin hazırlanması ile yapılmıştır ( Mushegian ve Koonin 1996). Umulan bu
listelerin özellikle parazit bakterilerin hücre yaşamı için öncelikli gerekli integral proteinleri
içermesiydi. 244 ortolog tanımlandı fakat bu liste ‘’non – orthologous gene displacement’’ nedeniyle

355
[Metni yazın]

tam olmaktan uzaktı. Bazı gen displacement ları organizmaların temel metabolik yollarındaki
eksikliklerden anlaşılabilir. Bu yolla, Mushegian ( 1999) minimal protein setini 256 gene çıkardı.
Yukarıdaki yaklaşımla alakalı bir problem olarak, eğer ortologların oluşturan iki protein
arasındaki benzerlik derecesinin tanımlanması çok kısıtlı ise, o zaman minimal protein seti değerinin
altında hesaplanabilir. Yukarıdaki metodun bir varyasyonu, ortolog gruplarının tanımlanmasıdır.
Örnek olarak; ortologları içeren gen grupları, ek olarak gen duplikasyonunu takiben gen kaybı
meydana gelen paraloglar. Bu yaklaşım 4dört eubakteri, bir arkebakteri ve bir mayaya uygulanmış ve
816 ortog grup demeti ( COGs ) tanımlanmıştır. Bunların 327 si üç alemin de temsilcisini kapsamıştır
( Mushegian 1999). Bu 327 protein setine dayanarak tüm biyosentetik adımları yeniden oluşturmak
mümkündür. Ek üç arkebakteri ve 12 eubakteriden elde edilen sekans verileri de eklenip analizler
tekrarlanınca, minimal protein set içeriği 322 COGs a kadar az da olsa düşmüştür.

Şekil 18.1 Genomları tamamen sekanslanmış archaeabacteria, bazı eubacteria lar ve bir ökaryotun
genom büyüklükleri.

356
[Metni yazın]

Büyük mikrobiyal genomlar, küçük olanlara kıyasla daha fazla paralog içerirler.
P. aeruginosa (6.3 Mb) ve E. coli (4.5 Mb) genomlarının karşılaştırması, P. Aeruginosa nın
büyük genoma sahip olmasının, genom organizasyonundaki farklılıktan değil de büyük genetik
kompleksliğinden kaynaklandığını gösterir. Open-reading frame (ORF) boyutları ve inter-ORF
boşlukları neredeyse her iki genomda da aynıdır.

357
[Metni yazın]

Eğer daha büyük genomu olan P. aeruginosa bunu sonradan bir gen duplikasyonu ile
sağladıysa, beklenen bu canlının diğer büyük genoma sahip canlılarınki kadar benzer sayıda paraloğa
ve daha çok sayıda ORF ye sahip olmasıdır. Gerçekten, Pseudomonasdaki paralog grupların ORFleri
diğer genomlardakine benzemektedir. Bu yüzden çevresel değişkenlik seçimi, genetik kapasiteyi
arttırarak, farklı fonksiyonları kodlayan çok sayıda küçük paralog gen ailelerinin gelişimine imkan
tanımıştır.
Genel bir kural olarak, prokaryotik genom büyüklüğünün artışı ile birlikte, paralog sayısının artışı
da beklenebilir ve gözlemlenen de budur ( Tablo 18.1 )
Dahası, paraloglardaki bu biyokimyasal durum konak organizma biyolojisini yansıtır ( Kutu 18.2 )
Bugüne kadar analiz edilen prokaryotik genom sekansları, merak uyandırıcı iki gözlemi ortaya
koymuştur.
Birincisi, tanımlanan ORF lerin neredeyse yarısı, bilinmeyen biyolojik fonksiyonlarla ilgilidir. Bu
da alışılmışın dışında bir dizi biyokimyasal yolun aydınlatılmayı beklediğini gösterir.
İkincisi, tamımlanan tüm ORF lerin yaklaşık % 25 i, diğer mevcut hiçbir proteinin sekansı ile bariz
bir benzerlik göstermez. Bu da bakteriler arasında gözlemlenen inanılmaz biyolojik çeşitliliği
destekler.
Daha da önemlisi, bu durum, daha keşfedilmeyi bekleyen ( örneğin Bacillus subtilis, E. Coli, ve
Deinococcus radiodurans ın herbirindeki 1000 in üzerindeki proteinler) çok sayıda yeni protein
ailelerinin bulunduğuna işaret eder.
Çünkü, DNA ve protein databankaları günlük olarak güncellenir. Zaman zaman onları,
tanımlanmamış bir proteinin homoloğu tespit edilmiş mi öğrenmek için, tekrar ziyaret etmede fayda
vardır. Aynı zamanda bunlar, sekans bilgilerini yeniden analiz etmek için kullanılabilir. Hem yeni hem
de daha sofistike biyoinformatik araçlar geliştirilmiştir. Bunun faydası Robibson’un ( 1994)
çalışmasından anlaşılabilir. Onlar 18 Mb prokaryotik DNA sekansını yeniden incelemişlerdir ve daha
önce gözden kaçan 450 den fazla geni ortaya çıkarmışlardır. Daha spesifik bir örnek Dandekar’ınkidir
( 2000). Mycoplasma pneumoniaenın sekans bilgileri üzerinde yeniden çalışmıştır. Onlar ek 12
ORFs tanımlamışlardır. Ayrıca daha önce tanımlananlardan birini elemişler ve ilave üç RNA geni
bulmuşlardır. Ayrıca, sekiz protein okuma çerçevesini kısaltmış, diğer 16 tanesini de uzatmışlardır.

358
[Metni yazın]

Tablo 18.1 Paraloglar ve genom büyüklüğü arasındaki ilişki

Horizontal gen transferi, evrime yönlendirici kayda değer bir güç olabilir ancak bunu
tespit etmek çok kolay değildir.
Horizontal veya lateral gen transferi farklı soylar arasındaki genetik değişikliktir. Horizontal gen
transferinin meydana geldiği genellikle farkedilebilse de meydana gelirken ki büyüklüğü hakkında
hatırısayılır tartışmalar da vardır. Örneğin, Gogarten ( 2002 ), şimdiye kadar tanımlanandan daha çok
meydana geldiğini söylerken, Kurland ( 2003 ), bunun genom filojenisi üzerinde çok az bir etkisi
olduğunu düşünmektedir. Şimdilerde o kadar çok mikrobiyal genom analizi yapılmıştır ki, lateral gen
transferinin tespitinin çok kolay olduğu düşünülebilir ancak bunun tespitinde kullanılan bazı
metodların geçerliliği hakkında bazı şüpheler vardır.
Temel olarak tartışmalı olsa da iki metod kullanılmaktadır.
Birincisi, olağandışı nükleotid kompozisyonu sekanslarının tespiti ve yakın türler içinde tamamıyla
kaybolmuş bir fonksiyondan sorumlu gen veya genlerin tespitidir.
Örneğin, iki bakteriyal termofilin genom analizi, genlerinin % 20-25 inin Eubacteria’dan ziyade
Archaeabacteria ya benzer olduğunu göstermiştir ( Aravind 1998, Nelson 1999 ).
Bu arkevari genler, genomdaki özel bölgelerde bulunurlar ve kayda değer farklı nükleotid
kompozisyonuna sahiptirler. Bu durumun, horizontal gen transferinden kaynaklandığı düşünülür.
Garcia ve Valve de 2000 yılında, bir genin horizontal olarak mı edinildiğini tespit etmek için,
istatistiki bir prosedür geliştirmiştir.
Bu prosedür, G + C içeriği, kodon kullanımı, aminoasit kullanımı ve gen pozisyon analizlerine
dayanır.
Bu metod, 24 adet sekansı çıkarılmış genoma uygulanınca, genlerin % 1,5 – 14,5 unun horizontal
transfer edildiği ve bu genlerin çoğunun sadece bir veya iki soyda bulunduğu iddaa edilmiştir.
Bununla beraber Koski ( 2001 ), codon bias ları ve baz kompozisyonlarının horizontal gen transferi
tahmininde kullanımında temkinli olunması uyarısını yapmıştır. E. Coli ve Salmonella typhi gibi,
tahminen 100 milyon yıl önce farklılaşmış, iki yakın bakterinin ORFlerini, kıyaslamışlardır. E. Coli
genlerinin normal kompozisyonunun S. Typhide karşılığının olmadığını bulmuşlardır. Tersi olarak, E.
359
[Metni yazın]

colideki çoğu genin alışılmamış kompozisyondadır ve S. typhide de bulunmaktadır. Bunlar genomda

aynı pozisyonda bulunmaktadırlar. Bunlar pozisyonel ortologlardır.
Karlin( 2001) bazı genleri, ‘’olası (putative) yabancılar’’ olarak adlandırmıştır. Eğer bu genlerin
ortalama bir gene göre kodon kullanım farkı, belli bir eşik değeri aşıyorsa ayrıca ribozomal protein ve
şaperon genlerine göre kodon kullanım farkları yüksekse bu şekilde adlandırılabilirler. Bu metod
kullanılırken, G+C içeriğindeki varyasyonlara tercihen O, anormal kodon kullanımı ile DNA
uzamasının sıklıkla patojeni adaları ile ilişkili olduğunu vurgulamıştır. Bunlar çeşitli virulens faktörleri
kodlayan büyük DNA uzamalarıdır (35-200 kb). Bir türün tüm patojenik izolatlarında bulunurlar ve ve
genellikle patojenik olmayan izolatlardan yoklardır. Buna uygun olarak, bunlar direkt tekrarlarla
çevrelenmiş, bir integrazı kodlarlar, tRNA genlerine bitişik kromozom içine girerler ( Hacker 1997 ).
Bu bağlamda, patojeni adaları ılımlı fajlara benzerler ve transdüksiyon ile yeni hücrelerce
edinilebilirler ( Boyd 2001).
Alternatif olarak, yayılma konjugatif transpozonlarla başarılabilir. Horizontal gen transferi ile ilgili
muhtemel pek çok örnek vardır ( liste için, Gogarten 2002 ye bakınız). Fakat transmisyonun bu şekilde
olduğuna dair delil patojeni adalarına göre oldukça yetersizdir, muhtemel RNA polimeraz eksikliği ile
beraber ( Iyer 2004 ).

Yakın akraba bakterilerin karşılaştırmalı genomiksi mikrobiyal evrim üzerine faydalı

öngörülerde bulunmaya imkan verir.
Şu ana kadar o kadar çok mikrobiyal genom sekanslanmıştır ki yakın veya uzak akraba bakteriler
arasındaki karşılaştırmalı genomiks çalışmaları artık mümkündür. İki tür çalışma da farklı bilgilere
ulaşmaya imkan sağladığından çok değerlidir. Uzak akraba bakterilerle ilgili çalışmalara gelecek
bölümde yer verilmiştir. Bu bölümde filojenik olarak yakın akraba olan bakteriler üzerinde
durulacaktır. En kapsamlı karşılaştırmalı analizler, Enterobacteriaceae nın 3 cinsi üzerinde yapılmıştır:
Escherichia, Shigella ve Salmonella (Chaudhuri 2004 ). Başlangıç olarak, E.colinin bir laboratuvar
suşu ve iki O157 enteropatojenik izolatlarının bir karşılaştırması yapılmıştır ( Hayashi 2001, Perna
2001 ). Daha sonra buna uropatojenik suş ilave edilmiştir ( Welch 2002 ).
Bu çalışmalar sonucu, genomik omurganın homolog olduğu görülmüştür. Fakat homoloji soya
özgü tüm genoma dağılmış DNA adalarınca bölünmüştür. Ayrıca, patojenik suşlar, laboratuar
suşlarından 590 – 800 kb daha büyüktür ve bu boyut farkı tümüyle ada DNA miktarındaki
değişiklikten kaynaklanmaktadır.
Bu adaların çoğu farklı patojenlerde, aynı ilişkili omurga pozisyonundadır fakat ada dizileri ilişkili
değildir.
Bir diğer ilginç bulgu ise her bir suşun kodladığı proteinlerin yalnızca % 39 unun tüm suşlarda ortak
bulunmasıdır. Dahası, patojen genomların birbirinden farkları, zararsız suşlara oldukları kadardır.

360
[Metni yazın]

Daha sonraki bir analizde, Shigella flexneri ( dizanteriye sebep olur)nin E. Coli ile aynı genom
yapısına sahip olduğu görülmüştür. Hatta farklı bir cins olarak anılmasındansa, E. Coli nin farklı bir
suşu olarak tanımlanmasının daha iyi olacağı düşünülmüştür ( Wei 2003 ).
Daha önce belirtildiği gibi, ayırtedici kodon kullanımı, horizontal gen transferi için bir indikatör
olarak düşünülür. Değişik E. coli genomlarının analizleri göstermiştirki, adalar oldukça uzak farklı
kodon kullanımına sahiptir ve 3 - 4,5 kat daha yüksek belli nadir kodon kullanılmıştır. Patojenlerde
bulunan adalardaki genlerin yaklaşık 2000 tanesinin sadece % 10 u paylaşılmıştır. Bununla beraber,
paylaşılan bu genlerin çoğu bakteriyofajlarla veya insersiyon sekansları ile bağlantı kuran genlerle
ilişkilidir. Bu durum, bunların horizontal gen transferi olayında rol aldığını gösterir. Diğerlerinin çoğu,
payşlaşılmayan ada genleri, bilinen patojenite determinantlarını kodlar. Farklı üropatojenik suşlar
karşılaştırıldığında, örneğin, cystisis, pyelonephritis ve ürosepsisden sorumlu olanlar, ada genlerinin
çoğunun bir suşa özgü olduğu da görülür. Bu sonuç, E. colinin hem patojenik olan hem de patojenik
olmayan suşlarının kompleks bir süreç ile evrimleştiğini ortaya koyar. E. coliyi tanımlayan atasal
omurga genleri dikey edinilmiş sekans değişikliklerinin yavaş birikimine uğramışlardır. Fakat bu
genlerin geri kalanı çok sayıda horizontal gen transferi oluşu ile oluşmuştur.
E. coli ye yakın akraba olduğu düşünülen Salmonella türlerinin ve iki serovar ( S. typhi ve S.
typhimurium) ın tam sekans analizleri yapılmış ve çok miktarda aynı gen sırasına sahip oldukları, E.
coli genomu ( şekil 18.2 ) ile kıyaslanmışlardır (McClelland 2001, Parkhill 2001).
Beklendiği gibi, S. typhi ve S. typhimurium birbirine, S.typhi ve E. coli ye oranla çok daha yakın
çıkmıştır. Tabii arada bariz farklar da vardır.
S. Typhimurium a kıyasla 601 (%13.1) gen S.typhi ye özeldir. 479 (%10,9) gen de S.typhi ye kıyasla
S. typhimurium a özgüdür.
Bunun tersi olarak, 1505 (%32,7) gen E. coli ye göre S. typhi ye özelken, 1220 (%28,4) gen de
S.typhi ye göre E. coli ye özgüdür. S. typhi ve S. typhimurium arasındaki diğer bir fark da ilkinde 204,
ikincisinde de 39 pseudogenin varlığıdır. Çoğu durumda bunlar sonradan ortaya çıkmıştır çünkü
bunlar tek bir çerçeve kayması veya stop kodon sebebi ile oluşmuşlardır. Yakın akraba türlerin genom
çalışmalarının tamamlanmasının pseudogenlerin tespitini kolaylaştırdığını kayda değer bir bilgidir.
Çünkü bir çerçeve kayması veya prematüre bir stop kodon, diğer bir genomda ancak fonksiyonel bir
homolog genle eşdeğer ise tanımlanabilir. İki Salmonella serovarı arasındaki diğer bir biyolojik fark
da; S. typhi nin sadece insanları enfekte ederken, S. typhimuriumun çok çeşitli türde memelileri
enfekte edebilmesidir. Bu durum pseudogen içeriğindeki faklılıklardan kaynaklanıyor olabilir. Çünkü
S. typhideki bir çok pseudogen housekeeping vazifesindedir ve virulans kompenentleridir.

361
[Metni yazın]

Bacillus anthracis bakterisi, anthraxa sebep olması nedeniyle günümüzde çok ilgi
çekmektedir. Bu canlı biyoterorizm ajanı olarak kullanılmaktadır. Bu canlının çok uzun süredir gıda
zehirlenmesine sebep olan B. cereus ve bazı sineklerde patojen olan B. thuringiensis ile yakın akraba
olduğu düşünülmektedir. Bu üç suş üzerine yapılan karşılaştırmalı genom analizleri, bunların
kromozom omurgaları yüzünden farklı olmalarına rağmen patojenilerindeki asıl farkın plasmid –
borne genlerden kaynaklandığını ortaya koymuştur ( Radnedge 2003, Rasko 2004 ). Esasında B.
cereusun, PxO1 ve PXO2 plazmidleri gibi, öldürücü toksin kompleksleri ve poli –gama-glutamik asit
gibi virulans faktörlerini kodlayan plazmidlerden yoksun olduğu düşünülüyordu. Bununla beraber,
benzer plazmidler B. cereusun patojenik olmayan suşlarında bulundu. Bu benzer plazmidler, B.
anthracisinkilerden sadece çeşitli toksin genleri içeren patojenite adalarının eksik olması ile
ayrılıyordu.
Mycobacteriumların değişik türleri üzerinde yapılmış bir dizi karşılaştırmalar da
bulunmaktadır. Bunlardan en ilginç olanı tüberkülaz ve cüzzama sebap olan M. tuberculosis ve
M.leprae üzerine yapılan çalışmadır ( Tablo 18.2 ). M. lepraedeki 1604 ORF nin 1439 unun M.
tuberculosisde homoloğu vardır. 1116 pseudogenin çoğu translasyonel olarak durağandır fakat M.
tuberculsiste fonksiyonel olarak karşılığı vardır. Yine de, leprosy basillerinde büyük bir gen azalması
vardır. Oksidatif solunum zinciri ile alakalı bölümler kayıptır ayrıca mikroaerofilik ve anaerobik
olanlarda çeşitli katabolik sistemlerde bu kayıplara rastlanır. Bu kayıplar muhtemelen
mikrobiyologların M. lapraeyi hayvan vücudu dışında kültüre etmelerinden kaynaklanmaktadır.
Genom organizasyonu seviyesinde, 65 segment aynı gen sırasındadır. Fakat akraba sırası ve
dağılımda farklılık gösterirler. Bu dizideki kırık, genellikle yayılmış tekrarlar, tRNA genleri, veya gen
362
[Metni yazın]

bakımından az bölgelerden, ve kesikli bağlantılardaki tekrarlayan dizilerden kaynaklanmaktadır. Bu

bilgi, genomdaki yeni düzenlemelerin, tekrarlayıp duran diziler arasındaki çoklu rekombinasyon
olaylarının bir sonucu olduğunu ortaya koyar.

Tablo 18.2 İki Mycobacterium türünün genomlarının kıyaslanması ( Cole 2001).

Filojenik olarak farklı bakterilerin karşılaştırmalı analizleri bugüne kadar açığa

kavuşmamış ortak yapısal temaların anlaşılmasına imkan tanıyacaktır.
Belli yapısal temalar, gittikçe artan bakteriyel genomların sekanslanması ve bu sekanslar arasında
karşılaştırmalar yapılması çalışmaları sayesinde ortaya çıkmaya başlamıştır. Bu tarz bir tema,
patojenlerdeki patojenite adalarının varlığı ve patojen olmayanlarda da yokluğudur. Bir diğeri, yakın
akraba bakterilerdeki, çoğunlukla replikasyon orjini veya terminusunun oralarda meydana gelen
kromozomal inversiyonlardır ( Eisen 2000, Suyama ve Bork, 2001 ). Sonuç olarak, çoğu genom profaj
ve profaj artıklardan ortaya çıkmıştır. Fakat bu durumun tam bir manası bilinmemektedir.
Bakteriyel ve arkeal genomlarının gen sıralamalarının sistematik karşılaştırması göstermiştir ki;
filogenetik olarak uzak olan genomlar arasında, çok az gen sırası muhafaza edilmiştir. Her ne zaman
istatistiksel olarak anlamlı gen dizileri gözlemlenirse, o zaman bu durum genlerin operonlara doğru
organize olduğunun bir göstergesi olabilir. Wolf (2001), tüm sekanslanmış prokaryotik genomlardaki
gen sıra karşılaştırmasını üzerine aldı ve bir dizi potansiyel operon buldu. Bu operonların çoğu,
fiziksel olarak birbirini etkileyen proteinleri kodluyordu. Örneğin; ribozomal proteinler ve ABC – tip
taşıyıcı kasetler. Daha önemlisi, bu analizler genlere atfedilen vazifelerin öğrenilmesine, özellikle
operon fonksiyonu tahminleri üzerine imkan sağlar (Bölüm 23).

Karşılaştırmalı genomiks fizyolojik fenomeni analiz etmede kullanılabilir.

Deinococcus radiodurans bakterisi aşırı doz iyonize radyasyona maruz kaldıklarında bile hayatta
kalabilmeleri ile karakterize edilirler. Tüm genom tamamen sekanslanmış olsa da bu durum,

363
[Metni yazın]

gözlemlenen fizyolojik fenotipi tatminkar bir şekilde açıklamaya yetmemektedir(18.2 kutu, sayfa
377).
Poblemin bir yönü, karşılaştırma yapmak için aynı derece radyasyon direnci gösteren bir başka
organizmanın olmamasıdır. Bununla beraber, Makarova(2003) hipertermofilliğin anlaşılmasında
ilerleme göstermiştir. Bu bağlamda, hipertermofillik, 75 C yi aşan sıcaklıklarda gelişim gösterebilme
kabiliyeti iken, termofillik 55-75 C sıcaklık aralığında gelişim gösterebilmektir. Altı farklı soydan
sekiz arkea ve ayrı şubelerden üç bakteriyi içeren 11 hipertermofilin tamamlanmış genom sekansları
mevcuttur. 14 termofilin de sekansları mevcuttur. Başlangıç olarak COGs için yapılan bir araştırma
aşağıdaki kriterleri ortaya koymuştur:
1. COG proteinleri kodlamalıdır ve en az üç hipertermofilde bulunmalıdır.
2. Belirli COG a sahip hipertermofil sayısı, mezofillerin sayısından çok olmalıdır.
3. Belirli bir COG a sahip organizmaların % 50 den fazlası termofil olmalıdır.
290 COG birlikte yukarıdaki kriterleri sergiler fakat çoğu arkeal hipertermofillerde bulunur. Bundan
dolayı, araştırma derinleştirildi böylece en az bir eubakteriyal hipertermofil, her bir COG yi
kodlamalıydı. Bu yolla, 58 COG, hipertermofilik fenotiple alakalı olarak tanımlandı. Bu COG ler, bir
dizi farklı hücresel fonksiyonu kodlarlar (Şekil 18.3) ve daha önceki karakterize edilmemiş protein
ailelerini içerirler.

Şekil 18.3 Hipertermofililikle alakalı 58 COG un vazifeleri ( Makarova 2003 ).

Organellerin karşılıklı genomiksi

Mitokondriyal genomlar şaşırtıcı derecede yapısal çeşitlilik sergilerler

Mitokondriler ökaryotlarda bolca bulunurlar. Elektron transportu ve oksidatif fosforilasyon ile ATP
üretiminde anahtar roldedirler. Mitokondrilerin vazifesi oldukça korunmuş olsa da, mitokondriyal
genomların yapısı, dikkate değer ölçüde çeşitli konformasyon ve boyut sergiler ( Şekil 18.4 ) (Burger
2003 ).

364
[Metni yazın]

Şekil 18.4 Mitokondriyal genomun boyut ve gen içeriği yönünden Alfa- proteobakteriyal (Rickettsia)
genomu ile karşılaştırılması. Daireler ve düz çizgiler, sırasıyla, halkasal ve lineer genomları temsil
etmektedir ( Gray 1999 ).

Hayvan ve mantar mitokondriyal DNAları oldukça küçük olmalarına rağmen (15-20 kb), bitkilerin
ki oldukça büyüktür (200-2000 kb). Bitki mitokondrisi, büyüklükte ökaryotik nukleusla yarışır,
özellikle bitki nukleusu ile. Bu bağlamda karşımıza yine C- değeri paradoksu çıkar:
Örneğin; daha büyük bitki mitokondrileri daha küçük olanlardan daha fazla gen içermezler fakat
daha fazla spacer DNAları vardır. Bitki mitokondrileri kloroplast, nukleus, virüs ve diğer bilinmeyen
kaynaklardan türemiş bol miktarda DNA içerirler. Bu süreç muhtemelen aktif, transmembran bağımlı
bir DNA alım mekanizmasının varlığı ile kolaylaştırılmıştır ( Koulintchenko 2003 ).
C- değeri paradoksu bitki ve hayvan kıyaslamalarında da karşımıza çıkar:
Arabidopsis (çiçekli bir bitki) mitokondriyal DNAsı, insan mtDNAsından 20 kez daha büyüktür
ama iki kat daha az gen içerir ( Şekil 18.5). Hatta, tek bir cinste, bu durumda, Schizosaccharomyces
maya mantarının farklı türlerinde , kodlama yapmayan DNA miktarında dört kat çeşitlilik olabilir (
Bullerwell 2003 ).

365
[Metni yazın]

Sürekli olarak yeni sekans bilgilerinin toplanmasının bir sonucu olarak, mtDNAların, iki temel
tipten meydana geldiği anlaşılmaktadır. Bunlar ‘atadan kalma ’ ve ‘ türevlenmiş ’ şekilde dizayn
edilmiştir ( Gray 1999 ) ve bunların karakteristiği Tablo 18.3 te özetlenmiştir.

366
[Metni yazın]

Tablo 18.3 Atadan gelen ve türev mtDNAların kıyaslanması

Atasal mtDNA
1.Hayvan mtDNAsına kıyasla çok sayıda ekstra gen
2. rRNA kodlayan genleri eubakterilerdeki gibi: 23S, 16S ve 55 rRNAlar
3. Tam yada tama yakın tRNA gen setleri
4. Az sayıda veya hiç intronsuz sıkı genetik bilginin paketlenmesi
5. Eubakteriyel gen kümeleri
6. Standart genetik kod kullanımı

Türevlenmiş mtDNA
1.Yoğun gen kaybı
2. rDNA ve rRNA yapılarında bariz ıraksama
3. Hem protein kodlayan hem de rRNA genlerinde artmış sekans ıraksama hızı
4. Hayli etkilenmiş kodon kullanımı, bazı durumlarda, belli kodonların elimine edilmesi
5. Standart olmayan kodon görevlerinin bulunması

Genellikle mitokondrilerin, nukleus içeren bir hücre ile endosimbiyant ilişki kurmuş bir bakterinin
soyundan geldiğine inanılır. Böylece mitokondriyal genom, bu öbakteriyel atasının bir kalıntısıdır.
mtDNAlar için bir prototip miras olarak Reclinomonas americana ( kamçılı heterotrof bir protozoon)
nınki verilebilir. Bu organizmanın mtDNAsı 97 gen içerir ve bunlar diğer tüm sekanslanmış
mtDNAlarda bulunan protein kodlayan genleri kapsarlar.Türevlenmiş, değişikliğe uğramış
mitokondriyal genomlar ise atalardan kalanlardan bariz bir şekilde ayırtedilebilirler. Hayvanlarda ve
çoğu protistlerde, bu durum, kendini boyut ve gen içeriğinde var olan azalma ile ortaya koyar.
Bitkilerde ve özellikle angiospermlerde, yoğun bir gen kaybı vardır ama kloroplast ve nukleustan dizi
alımları ve DNAnın sık duplikasyonu sonucunda boyut artmıştır ( Marienfeld 1999 ).

367
[Metni yazın]

Eğer mitokondriler bakterilerden kökenlenmişse, o ata bakteriye en yakın akraba tür, bugün var olanlar
içerisinde hangisidir?
Şu anki mevcut görüşe göre Rickettsiya prowazekiidir(tifüse sebep olan bir organizma). Bu
organizma hücre içi yaşam sitili ile mitokondrilerin endosimbiyotik evrimini başlatmış olabilir.
R. prowazekiinin genomu sekanslanmış ve genlerinin fonksiyonel profili mitokondrilere benzerlik
göstermiştir ( Anderson 1998 ). Bakterinin yapı, organizasyon ve gen içeriği en çok Reclinomonas
americananın mtDNAsına benzemektedir.

mtDNA ve nukleus DNAsı arasında gen transferi meydana gelmiştir.

Mitokonrinin temel görevi, oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretmektir. Oksidatif
fosforilasyonda kritik rolü olan proteinleri kodlayan en az 21 gen vardır ve bunların hepsinin
mtDNAda konumlanması beklenir. Aynı şekilde mtRNA translasyonu için gerekli 14 ribozomal
proteini kodlayan genin de mtDNAda
bulunması beklenir. Ancak sekans analizleri
mitokondriyal genomların bir dizi anahtar
genden yoksun olduğunu ve bu kayıp genlerin
nukleusta bulunduğunu göstermiştir(Şekil
18.6).

Mitokondriyal genlerin, nukleusa

fonksiyonel transferi hayvanlarda durmuştur.
Çünkü bunların boyutlarında tutarlılık vardır.
Ayrıca daha başka transferler de mitokondriyal
genetik koddaki değişiklikler sayesinde
bloklanmıştır. Bununla beraber bu gen transferi
bitkilerde ve protistlerde devam etmektedir.
Çünkü transfere engel olacak bir genetik
bariyer bu canlılarda bulunmamaktadır. Bunun
sadece Woischnik ve Moraes ( 2002) in
çekirdek genomunda bulduğu insan
mitokondriyal pseudogenleri için transfer
edilecek bozulmamış genler için olmadığına
dikkat edin. Bu pseodogenlerin çoğu iki bitişik
mitokondriyal genden oluşmuştur.
Mitokondriyal cox 2 geninin durumuna
bakarsak, nukleusa transfer legümlerde halen

368
[Metni yazın]

devam etmektedir( Palmer 2000 ). 25 farklı legümün analizi ile bazılarının mitokondrilerinde,
bazılarının nukleusunda bazılarının da her iki genomunda cox 2 geni yer alan farklı generalar
tanımlanmıştır. Genin her iki kopyasının bulunduğu çoğu durumda, genlerden sadece biri
transkripsiyonel olarak aktiftir. Ancak her iki genin de transkribe olduğu en az bir genera vardır.
Adams (2000), 277 angiospermde rps 10 geninin dağılımı üzerinde çalışmış ve mtDNAdan gen
kaybının yaşandığı 26 olay tanımlamıştır. Bu kayıp soyların 16 sında, nuklear gen ayrıntılı olarak
karakterize edilmiştir. Nukleusta aktif olmak için, mtDNA dan edinilen bir gen, olgun bir transle
olabilen mRNAnın üretildiği şekilde nukleus genomuna sokulmalıdır. Dahası, protein ürünü
sitoplazmada yapılır. Bu protein hedeflenmeli ve mitokondriye alınmalıdır. Bu durumdan ortaya
çıkan; bazı durumlarda, önceden var olan diğer nukleus genlerinin kopyalarının rps 10 kodlama dizisi
ile parazitize olduğudur. Bir çok örnekte, bir mitokondriyal hedef sekansının, RPS10 proteininin
mitokondriye dönüşünü sağlamak için bulunduğu görülür. Fakat farklı nuklear genler bu diziyi temin
eder, farklı bitkilerde. Diğer durumlarda, RPS10 proteini, bariz bir hedef sekans olmaksızın transfer
edilmiştir. Bu sonuçlar ve diğer mitokondriyal genler için benzeri bulgular (Adams 2001), nuklear
transferin halen devam ettiğini ve geçmişte çok sayıda ayrı olayda meydana geldiğini doğrulamaktadır.
Nuklear transferin mitokondriyal genler için sınırlı olmadığını düşünen Millen (2001) kloroplast
genleri ile benzer gözlemler yapmıştır. Henze ve Martin (2000) bu transferin nerede gerçekleştiği ile
ilgili bir makale yazmıştır.

Horizontal gen transferi mitokondriyal genomlarda tespit edilmiştir

Bir önceki bölümde, mitokondri ve nukleus arasında genlerin taşınması ile meydana gelen hücre içi
horizontal evrimi tartıştık. Bununla beraber, çaprazlamalar sonucu bitkisel mitokondri genomlarınca
elde edilen DNAlar da tespit edilmiştir. Tespit edilen ilk örnek, bir homing grup I intronudur ( Palmer
2000 ). Bu intronlar, göreceli olarak uzun hedef bölgeleri olan, genetik melezlerlerdeki aynı intron
içeren allellerden intron içermeyen allellere etkileri yayılmış site- sipesifik endonükleazları kodlarlar.
Bu intron, 281 i test edilmiş 48 angiospermin mitokondriyal cox 1 geninde tespit edilmiştir. İntron ve
konak genomunun sekansından elde edilen bilgilere dayanılarak, bu intronun karşı çaprazlama ile
konağa horizontal olarak bağımsız şekilde, çeşitli durumlarda aktarıldığı görülür. Tam olarak belli
olmayan şey, her bireysel olayda verici ve alıcının kimliğinin belli olmamasıdır. Bu grup I intronun
tersi olarak, angiosperm mtDNAsındaki diğer 23 intron grup II ye aittir ve tamamı bütünüyle yatay bir
şekilde geçiş yapmıştır.
Daha sonraları, Bergthorsson ( 2003 ) monokotiledon ve dikotiledon bitkileri de içeren uzak akraba
angiospermler arasında mitokondriyal genlerin geniş ölçüde horizontal transferini rapor etmiştir. Bu
genomiks çalışmaların sonuçlarına göre; mtDNA – mtDNA transferleri gen duplikasyonları, daha
önceki nukleusa transferde kaybedilen genlerin yeniden yakalanması ve kimerik ( yarı monokot, yarı
dikot ) ribozomal protein genleri kapsamaktadır.

369
[Metni yazın]

Ökaryotların karşılaştırmalı genomiksi

Minimal ökaryotik genom bir çok bakteriyal genomdan daha küçüktür

Minimal genomun tespiti, cevaplanması gereken bir dizi farklı sorunun cevaplanmasını
sağlayacaktır. Serbest yaşayan bir hücreli bir ökaryotun minimal genomboyutu nedir ve bunun
minimal bakteriyal genomla karşılaştırılması nasıl olur? Prokaryotik ve ökaryotik hücreler arasındaki
temel farklılıklar nelerdir? Dahası, çok hücreliliğin organizasyonu için ek genetik bilgi gereksinimi
nelerdir? Hayvanlarda, omurgalı ve memeli genomları için minimum boyut nedir? Son olarak, çiçekli
bitkilerin minimum genom büyüklüğü ne kadardır? Çok sayıda ökaryotik genomunun büyük miktarda
kodlama yapmayan DNA içerdiği bilindiğine göre, bu sorunun cevaplanması için, hem hem genom
boyutu hem de kodlanan protein sayısı birlikte değerlendirilmelidir.
Bugüne kadar sekanslanmış en küçük ökaryotik genomu bir zorunlu hücre içi parazit olan
Encephalitozoon cuniculi dır (Katinka 2001). Bu canlı, yakın akrabası E. intestinalis 2,3 Mb dan bile
küçük genoma sahipken, 2,9 Mb lık bir genoma sahiptir. Bu organizmalardaki genom kompaktlığı,
genler arası boşlukların azaltılması ve diğer ökaryotlardaki ortologlarına göre çoğu olası
proteinlerinin kısaltılması ile sağlanır. Bütün bunlara rağmen, E. cuniculi, minimal bakteri
genomundakinin 7-8 katı kadar, yaklaşık 2000 ORF ye sahiptir. Bir maya olan Schizosaccharomyces
pombe yaklaşık 4800 ORF ye sahiptir (Wood 2002). Fakat, E. cuniculi çoğu metabolik ve biyosentetik
olaydan sorumlu temel genlerini kaybetmiş bir canlı olarak ninimal genoma sahip canlı kabul
edilmiştir. Bu maya ise serbest yaşayan bir formdur. Çok hücreli bir mantar olan Neurospora crasa
yaklaşık 10.000 ORF ye sahiptir (Galagan 2003) ve bu rakam, meyve sineği Drosophila
melanogasterinkinden (Adams 2000) % 25 daha azdır. Bu genlerin çoğu Saccharomyces cerevisiae
veya S. pompe de (Borkovich 2004) homoglara sahip değildir fakat bunların kaç tanesinin çok
hücreliliğin varoluşu için zorunlu olduğu araştırılmayı beklemektedir.

Karşılaştırmalı genomiks, genleri ve düzenleyici elementleri tanımlamada kullanılabilir

9. Bölümde belirtildiği gibi, tüm bir genom dizisindeki genlerin tam doğru bir şekilde
tanımlanması çok zordur ve hatta düzenleyici elementlerin tanımlanması daha zordur. Genler ve
düzenleyici bölgeler için fonksiyonel elementlerin bulunmasında, değişik türlerin ortolog genom
sekanslarının sıralanması ve korunmuş sekans bölgelerinin araştırılması güçlü bir metottur. Bu
yaklaşımın mantıksal temeli, fonsiyonel DNA daki mutasyonların zarar verici olacağıdır ve böylece
bunun karşılığı olarak fonksiyonel elementlerin evrim hızının azalacağıdır. Karşılaştırmalı analiz
sonuçlarını etkileyen en önemli iki faktör, tespit edilen ıraksama miktarı ve sıralanan sekansların
filogenetik kapsamıdır (Cooper ve Sidow 2003). Iraksama miktarı, analizlerin gücünü ve ayrım
kabiliyetini etkiler. Tüm analiz edilmiş sekansları kapsayan en küçük taksonomik grup olarak
tanımlanan kapsam, sonuçların uygulanabilirliğini ve genelliğini etkiler. Örneğin, bir difteri çalışma
kapsamı, Drosophila (meyve sineği) ve Anopheles (sivrisinek)leri içerir. Ve bu kapsam, bu canlıların

370
[Metni yazın]

ortak atasında bulunan elementleri bulmak için olduğu kadar hexapod, arthropod ve metazoanın
biribirinden farklılaşmasından önce bir zaman bulundukları yerde tespit edilmede de kullanılabilir
(Şekil 18.7).
Dar bir kapsamda karşılaştırmalı analize bir örnek olarak, S. cerevisiae ve üç farklı Saccharomyces
in ganomik karşılaştırmaları verilebilir (Kellis 2003). Gen analizi, S. cerevisiae nin gen kataloğununun
yeniden gözden geçirilmesi için temelden etki yaptı. Tüm genlerin % 15’i, toplam rakam 500 gen
kadar düştü ve 43 yeni küçük ORF tanımlandı( 50-99 aminoasitlik). Bu sonra elde edilen bulgu,
özellikle kayda değer derecede önemlidir. Çünkü, küçük ORF ler, fonksiyon yokluğundaki olası
genler veya farklı türlerdeki korunum olarak olarak düşünülüyordu. Daha çok ıraksamaya uğramış iki
canlının karşılaştırmalı analizi için kirpi balığı ( Fugu rubripes) ve insanın genomları kullanılabilir
(Aparicio 2002). Bu çalışma insan genom sekansı ile alakalı daha önce yayınlanmış iki raporda yer
almayan olası 1000 gen tanımlanmıştır.
Düzenleyici genlerin direkt tanımlanması, kısa olmaları (6-15 bp), belli düzeyde sekans
değişikliklerini tolere etmeleri, çalışma prensiplerinin tam bilinmemesi nedeniyle çok zordur. Bilinen
gen setleri ile birleşmiş promotorlar gibi düzenleyici elementlerin tanımlanmasında, genomun
bilişimsel analizi başarıyla kullanılmaktadır. Bununla beraber, bu yaklaşım göreceli olarak, gen
ekspresyonunda (enhancer lar ve silencer lar) ve kromatin organizasyonunda (insulatörler, matriks
tutunma bölgeleri) rol alan düzenleyici elementlerin tanımlanmasında, küçük bir değere sahiptir.
Aşağıda verilen örneklerin de göstereceği gibi, karşılaştırmalı analizler çok daha fazla faydalıdır.
Dar bir kapsamda yapılacak karşılaştırmalar, neredeyse tüm genomun düzenleyici bölgeler için
taranmasına izin verdiğinden ötürü oldukça faydalıdır. Bu yolla Kellis (2003), zaten bilinen 42 tane
düzenleyici protein motifine ek olarak, 9 tane daha tanımlayabilmiştir.
Enhancer lar, transkripsiyonal aktivatörlerin sekans spesifik bölgeleri ile gen ekspresyonunu
düzenleyen, düzenleyici elementlerdir. Enhancer la, yüzlerce kilobazlık hedef genlerinin içinde
bulunmalarına rağmen, pozisyon ve oryantasyondan bağımsız fonnksiyon fonksiyon görürler.
Karşılaştırmalı analiz kullanarak, Spitz (2003) memeliler ve Fugu arasında korunmuş bir dizi enhancer
element bulmuştur. Bu enhancer lar Hoxd genleri ve evrimsel olarak akraba olmayan yakın genler
arasındaki ekspresyonu koordine ederler.
Silencer lar, transkripsiyonu baskılama kabiliyetine sahipelementlerdir. Çoğu, uygun
promotorlarınınyakınında bulunur fakat diğer tipler de vardır. CD4 tavuk geninin sekanslanması
göstermiştir ki; bu gen memeli CD4 geni ile benzerdir ve fonksiyonel insan silencer ına sahiptir
(Koskinen 2002). Bu derece uzak muhafaza olayı, bu silencer ın, gen ekspresyonunun kontrolünde
temel role sahip olduğunu gösterir.
İnsulator elementler, kromatin içindeki domaşnleri ayıran, düzenleyici elementlerin uygun
hedeflerine etkilerini sınırlayanbariyerlerdir. Yakındaki bölgelerden, kromatin yoğunlaşmalarının
yayılmasının önlenmesini sağladıkları gibi, enhancer ların aktivitelerini de bloklayabilirler. Farell

371
[Metni yazın]

(2002), fare ve insanda, Beta-globin locuslarının yanında yer alan korunmuş genomik bölgeler
keşfetmiştir. Bu bölgeler, CTFC için bağlanma bölgeleri içerir. CTFC, enhancer bloklayıcı insulatör
aktivitesinde önemli bir proteindir.
Matriks tutunma bölgeleri (MARs), nüklear matrikse bağlanmada işlevi olan DNA bölgeleridir.
Glazko (2003), fare ve insanın intergenik sekaslarını dizilemiş ve korunmuş bir kısım tespit etmiştir.
Daha sonraki analizler de göstermiştir ki bunların % 11’i MAR için karakteristik sekans motiflerine
sahiptir ve bunların çoğu genlerin 5’ uçlarından önde yer alır. Bu sonraki gözlem, transkripsiyonun
düzenlenmesinde bir rolleri olduğuna işaret etmektedir.

Karşılaştırmalı genomiks anahtar proteinlerin evrimine ışık tutar

Koonin(2004), yedi tane tamamıyla sekanslanmış ökaryotik genomda ( üç hayvan: insan,
nematoda, meyve sineği, bir bitki: Arabidopsis, tomurcuklanabilen bir maya, ikiye bölünebilen bir
maya ve mikrosporlu: E. cuniculi ) kodlanan proteinlerin ayrıntılı evrimsel sınıflandırması işine
girişmiştir. Temelde, Koonin ve arkadaşları ortolog grupların (KOG) ökaryotik kümelerini
aramışlardır. Sonuçlar şekil 18.8 de gösterilmektedir.

372
[Metni yazın]

Şekil 18.8
Proteinlerin KOG ler için görevlendirilen bir bölümü genom büyüklüğünün artışı ile birlikte
azalma eğilimindedir. Bu durum için, zorunlu parazit E. cuniculi bir istisnadır. Buna karşın, paralog
grupların soya özgü yayılımları, en gelişmiş ökaryotlarda en büyük sayılarda olmaları ile zıt bir trend
göstermektedir. Sadece KOGların az bir kısmının kolayca tespit edilebilen prokaryotik emsalleri
vardır.
Toplam 131 KOG yedi genomun her birinde tek bir gen ile temsil edilir. Bu KOG lerin E.
cuniculi nin minimal genomunda bulunmasından dolayı, bunlar temel biyolojik fonksiyonları
kodlamalıdır sonucunu çıkarabiliriz. Bunların neredeyse tamamı multiprotein komplekslerinin alt
ünitelerini kodlarlar ve bunların çoğu rRNA sürecinde, ribozom birlikteliğinde, intron splicing inde,
transkripsiyonda, protein birlikteliğinde ve trafiğinde rol alır.

Türlerin evrimi genom düzeyinde analiz edilebilir

Saccharomyces paradoxus, S. mikatae ve S. bayanus mayalarının S. cerevisiae den 5-20 milyon yıl
kadar önce ayrıldığı tahmin edilmektedir. Bu canlıların dördünün de genomu sekanslanmış ve Kellis
ve arkadaşları (2003) karşılaştırmalı analizlerini gerçekleştirmiştir. Telomer civarı bölgelerde yüksek
düzeyde genetik çalkalanma bulmuşlardır. Ayrıca bu bölgelerdeki gen ailelerinde sayı, sıra ve
oryantasyon olarak bariz farklılıklar olduğunu bulmuşlardır. Telomer bölgelerin dışında yalnızca
birkaç yeniden düzenleme görmüşlerdir ve bunlar tablo 18.4 te özetlenmiştir. 20 inversiyonun tamamı,
ters transkripsiyonel oryantasyonda tRNA genlerince yandan kuşatılmıştır ve bunlar genellikle aynı
izoacceptor ların tipleridir. tRNA genlerinin genomik inversiyondaki rolü daha önce belirtilmemiştir.
Dokuz translokasyonun yedisi Ty elementleri arasında gerçekleşmiştir ve ikisi hayli benzer ribozomal
genler arasında gerçekleşmiştir.
373
[Metni yazın]

Tablo 18.4 S. cerevisiae ile kıyaslandığında üç maya türünün genomik yeniden düzenlemesi

Gen düzeyinde, beş gen S. paradoxus a, sekiz gen S. mikatae ye, 19 gen S. bayanus a
özgüdür. Bunların çoğu şeker metabolizması veya gen regülasyonu ile ilişkili fonksiyonları
kodlar. Bu özel genlerin ekseriyeti (%86) bir telomer veya Ty elementinin yakınına
konumlanmıştır. Bu lokasyonlar hızlı genom evrimi ile uyumludur. Çok hızlı evrimleştiği
düşünülen bir gen tanımlanmıştır. Bu gen, dört türe de geçmiş, % 32 nükleotid özdeşliği ve %
13 aminoasit özdeşliği göstermiştir. İşlevsel olarak, mayanın üremesi esnasında bir evre olan
sporulasyonda işlevi olduğu görülmektedir. Bu bakımdan, bu durum diğer organizmalardaki
pozitif seleksiyonun en iyi çalışılmış örneklerinin gamet fonksiyonu ile alakalı genler olduğu
gözlemi ile uyumludur. Aminoasit ve nükleotid düzeyinde kusursuz % 100 koruma gösteren
bir gen de tamımlanmıştır. Bu ikinci çalışma çok alışılmadıktır. Çünkü genetik kodun fazlalığı
görülmektedir. Bu durum genin antisense RNA kodlamış olabileceğini gösterir.

Çift kanatlı böcek genomu analizleri çok hücreli organizmaların evrimini analiz etmeye
imkan tanır
Meyve sineği Drosophila ve sıtmaya sebep olan sivrisinek Anapheles gambiae nin her ikisi de
yüksek derecede adapte olmuşlardır. Başarılı difteri türleri 250 milyon yıl kadar önce birbirinden
farklılaşmışlardır. Bunlar benzer bir vücut planını ve dikkate değer sayıda diğer özellikleri paylaşırlar.
Fakat ekoloji, morfoloji ve yaşam sitilleri ile birbirleri arasında farklılık gösterirler. Örneğin,
Drosophila çürümüş meyveler ile beslenirken, Anopheles belli konakların kanı ile beslenir. Belli
sayıda bariz farkı tüm genom seviyesinde (Tablo 15) görebilirsiniz. Fakat bu evrimsel süreci anlamaya
çok az katkı sağlar.

374
[Metni yazın]

Tablo 18.5 Sivrisinek ve meyve sineğinin genom istatistikleri

İki genom protein seviyesinde karşılaştırılırsa (Zdobnow, 2002) beş sınıf protein tanımlanabilir
(Şekil 18.9). Toplam 6089 ortolog iki türde tanımlanmıştır ve bunların ortalama sekans benzerliği %
56 dır. Bunun tersi olarak, 450 milyon yıl önce farklılaşmış olan, kirpi balığı ve insan arasında
ortologların % 61 sekans özdeşliği vardır. Bu durum, böcek proteinlerinin omurgalı proteinlerine göre
daha yüksek bir hızda farklılaştığını gösterir. Bunun sebebi böceklerin daha kısa bir yaşam döngüsüne
sahip olması ve farklı seçici baskılara maruz kalmaları olabilir. Ortologlar gen ontolojisine göre
sınıflandırıldığında, bağışıklıkla ilgili proteinlerin en fazla farklılığı gösterdiğini ve yapısal
proteinlerin de en fazla korunduğunu görmek sürpriz olmaz.
‘Many –to- many’ ortologları şekil 18.9 da görülüyor. Bunlar farklılaşmadan sonra bir veya her iki
türde meydana gelmiş olan gen duplikasyonlarındaki gen gruplarını temsil eder. Örneğin paraloji.
Bunlar ve homologlar muhtemelen hücresel ve fenotipik özelliklerdeki değişikliklere sebep olan,
çevresel faktörlere ve yaşam stratejilerine adaptasyonları temsil ederler. Örneğin, Drosophilada
karşılığı olmayan dört Anopheles paraloğu, leukotriene B4 12-hydroxy dehydrogenase
(proinflammatory leukotrine B4 ü inaktif eden bir enzim) ı kodlayan insan genine benzerdir. Anofel
türü sivrisinek bu geni kan içerikli besininialımı kolaylaştırmak için edinmiş olabilir. Toplam 579
ortolog Anpheles ve Drosophila için sınırlıdır. Ve hatta genomu sekanslanmış diğer organizmalarda
tanımlanmış proteinlerle ortak domainleri yoktur. Bunların çoğu kodlanan spesifik tad ve koku
reseptörlerini, kütikül proteinlerini, feromon ve feromon-bağlı proteinleri ve böceklere özel savunma
molekülerini açıklayabilir.
Gen evriminin dinamikleri, 1:1 ortologlarının intron ve ekzon yapılarının karşılaştırılması ile analiz
edilebilir. Örneğin, Drosophila daki eşdeğer intronlar Anopheles dekilerin uzunluğunun yarısına sahip
iken ekzon boyları ve intron frekansları kabaca benzerdir. 1:1 ortologlarındaki Anpheles intronlarının
yaklaşık %55’i, Drosophila’da eşdeğer pozisyona sahiptir fakat iki tür arasında neredeyse 1000 intron
kaybolmuştur ya da kazanılmıştır. İntronların kaybedilmesi veya kazanılmasının hızı her 125 milyon
yılda bir gen için bir olarak hesaplanmaktadır.

375
[Metni yazın]

Şekil 18.9 Anopheles gambiae (Ag) ve Drosophila melanogaster (Dm) in proteom analizi

Üzerinde çalışılan iki kanatlıların 250 milyon yıl önce farklılaştığı tahmin edilmektedir.
İntron/ekzon yapılarındaki değişikliklere ilave olarak genom yapısında da bariz varyasyonların
bulunması beklenir. Gerçekten, 1:1 ortologlarının gen sırası çok kısa uzaklıklarda sürmektedir ve bu
mikrosynteny yeişaret eder. Bununla beraber, makro düzeyde, kromozomal kollar iki tür arasında bariz
homoloji kalıntıları sergiler ve gen sırasının başlıca kollar arası transferleri ve kollar içi devşirimi
tespit edilebilir (Şekil 18.10).

376
[Metni yazın]

Bazı memeli genomları sekanslanmış ve elde edilen veriler evrim analizlerini

kolaylaştırmıştır
İnsan, fare ve sıçan genomları tamamen sekanslanmıştır. Şempanze genomunda da iyi gelişmeler
kaydedilmektedir. Şekil 18.11 tamamen sekanslanmış üç genomun analizini göstermektedir.

377
[Metni yazın]

Yaklaşık 1 milyar nükleotid(sıçan genomunun % 40’ı), üç türde de sıralanır. Bu atasal bölge,

bilinen kodlama yapan ekzonların % 94-95’ini ve genomun % 1-2 sini oluşturan düzenleyici bölgeleri
içerir. Diğer bir % 30 luk sıçan genomu, sadece fareninki ile benzer sıralama gösterir ve kemirgenlere
özgü geniş tekrar bölgelerinden oluşurlar. Diğer bir % 15 lik sıçan genomu, sıçanlara özgü tekrar
bölgelerinden oluşur. Kemirici soyunda, insanlardakinden daha fazla genomik değişiklik tespit

378
[Metni yazın]

edilmiştir.Kemiricilerin olağan atası ve insan arasında 250 kadar büyük yeni düzenlemeler vardır. Bu
ata ile sıçan arasında 50 kadar yine bu ata ile fare arasında da 50 kadar yeni düzenleme vardır.
Fare,sıçan ve insan genomları benzer sayıda gen kodlar. Ve ekseriyeti ortak atadan beri delesyon ve
duplikasyonsuz sürüp gitmektedir. Genlerin yaklaşık % 90’ı, üç genomda da sıkı ortologlara sahiptir.
Fakat insanlara nazaran kemiriciler, üreme, bağışıklık, koklama…vb. ile ilişkili fonksiyonlar için
genişlemiş gen ailelerine sahiplerdir. İnsanlarda hastalığa sebep olan neredeyse tüm genlerin, fare ve
sıçan genomlarında ortoloğu vardır. Fakat şaşırtıcı bir bulgu vardır: İnsanlarda hastalıklara sebep olan
çoğu SNPler(Single Nucleotide Polymorphism) farelerde de bulunur ancak fareler fenotipik olarak
normaldir.
Tüm genom kıyaslamaları içinde, insanın şempanze ile kıyaslanması belki de en ilginç olanıdır.
Çünkü şempanze bize en yakın tür çıkar. Temelde, karşılaştırmalı analizler, kavrama, iki ayak üstünde
yürüme ve konuşmanın genetik temellerini ortaya koymaya yardım eder. Bu kitap yazılırken
şempanzenin daha tüm genomu çıkarılmamıştı. Fakat 33,3 Mblık 22. Kromozomunun dizi analizi
tamamlanmıştı ( Uluslararası Şempanze 22. Kromozomu konsorsiyumu, 2004 ). İnsandaki eşdeğeri
(21. kromozom) ile kıyaslandığında, % 1.5luk baz farklılığı, bunun yanında 68000 insersiyon veya
delesyonlar tespit edilmiştir. Bu farklılıklar 231 kodlama yapan dizinin çoğunda değişiklik
oluşturmada yeterlidir. Ek olarak, belli bazı transpozon alt aileleri, farklı soylarda farklı yayılım
göstermektedirler. Bu durum, şempanze ve insan evriminde retrotranspozisyonların farklı etkileri
olduğunu düşündürmektedir. Bu değişikliklerin araştırılması gerekmektedir.

Karşılaştırmalı genomiks, yeni gen yapılarının oluşturulmasına sebep olan moleküler

mekanizmaları çözmede kullanılabilir
Önceki bölümde açıklanan karşılaştırmalı analizler, yeni gen kökenlenmesinde genel bir süreç
olduğuna işaret eder. Bu, yeni genlerin kökeni nedir sorusunu ortaya atar. Çeşitli moleküler
mekanizmaların yeni gen yapılarının oluşturulmasında rol aldığı bilinmektedir ( Şekil 18.12 ). Ve
bunlar tek veya birlikte çalışabilirler ( Long 2003 ). Buna iyi bir örnek, jingweidir. Evrim süreci
boyunca (2 My) önce ortaya çıkan, ilk tanımlanmış gendir ( Şekil 18.13 ). Bu gen iki Drosophila
türünün ortak atasında ortaya çıkmıştır. Başlangıç noktası, sarı imparator geninin, sarı imparator ve
yande genlerini vermek üzere duplike edilmesi idi. Sarı imparator orijinal fonksiyonlarını korurken,
yande geni modifikasyona uğradı. Temelde, alkol dehidrogenaz geninin mRNAsı, yandenin üçüncü
intronuna arkaya doğru yer değiştirir ve ilk üç yande ekzonu ile rekombine olur. Bu form jingwei
oluşturur ( kimerik bir protein ).
Oluştuktan sonra, jingwei gibi yeni genler, tanınmanın ötesinde modifiye olabilirler. Bu tarz
değişikliklere örnek olarak, protein-protein etkileşimlerinde rol alan domaşnler verilebilir. Willebrand
A, fibronektin tip III, immunoglobulin ve SH3 modülleri. Bu domainler, yüksek yapılı ökaryotlarda
yoğun artış gösterir fakat prokaryotlar ve düşük yapılı ökaryotlardaki homologlarla sadece uzak bir
ilişkileri vardır.
379
[Metni yazın]

Şekil 18.12 Yeni gen oluşum mekanizmaları

a) Ekzon yakalanması ( exon shuffling )

b) Bir genin duplikasyonu. Devamında da duplike olanın dizi olarak ıraksaması.
c) Yeni bir organizmaya transfer edilen genin ıraksaması.
d) İki farklı genin birleşmesi veya birleşmiş iki genin ayrılma aktiviteleri.
e) Mesajcı RNA etkileşimleri ile bir gen dizisinin hareketi. Devamında da bir promotor ile eşlenmesi.
f) ( TE ) Transpozabl bir elementin tutulması, devamında da TE dizisinin dejenerasyonu.

380
[Metni yazın]

Şekil 18.13 Yeni gen jingweinin oluşumuna sebep olan olaylar

Okunması tavsiye edilen kaynaklar

Kellis M., Patterson N., Endrizzi M., et al. (2003)
Sequencing and comparison of yeast species to identify genes and regulatory elements. Nature 423,
241–54.
This is rapidly becoming a classic paper on the use of comparative genomics to decipher genome
sequences but it also provides insights to the genomic changes that exist between species.

Koonin E.V. (2003) Comparative genomics, minimal gene-sets and the last universal common
ancestor. Nature Reviews Microbiology 1, 127–36.

Koonin E.V., Federova N.D., Jackson J.D., et al. (2003)

A comprehensive evolutionary classification of proteins encoded in complete eukaryotic genomes.
Genome Biology 5, R7.

Eugene Koonin probably knows more than anyone about extracting evolutionary information from
sequence databases. The two papers cited above are but a tiny sample of his analyses.

Koonin E.V. (2005) Virology: Gulliver among the Lilliputians. Current Biology 15, R167–9.
An analysis of the genome of a virus that is much bigger than many parasitic bacteria.

381
[Metni yazın]

Long M., Betran E., Thornton K. & Wang W. (2003)

The origin of new genes: glimpses from the young and old. Nature Reviews Genetics 4, 865–75.
This is one of the few reviews that attempt to discuss where new genes come from.

Paterson A.H., Bowers J.E., Chapman B.A., et al. (2004)

Comparative genome analysis of monocots and dicots, towards characterization of angiosperm
diversity. Current Opinion in Biotechnology 15, 120–5.

Pedulla M.L., Ford M.E., Houtz J.M., et al. (2003) Origins of highly mosaic mycobacteriophage
genomes. Cell 113, 171–82.

Bu sayfa, bu bölümde yer almayan konuları içermektedir.Bitkilerin ve virüslerin karşılıklı genomiksi.

Her ikisi de okunmaya değer.
Her yıl 1 Ocak tarihinde, Nucleic Acids Research, kısa özetler şeklinde farklı moleküler biyoloji ve
genomiks databaseleri yayınlar. Hatırı sayılır adette databaseler yayımlanması, karşılaştırmalı
genomiks ve ilişkili web siteleri içindir. Aşağıda bu sitelere bir örnek verilmiştir.

Faydalı Web sitesi

http://colibase.bham.ac.uk

Bu web sitesi coliBASE içindir. E. coli ve onun yakın akrabalarının karşılaştırmalı genomiksi için
online bir databasedir. Şu ana kadar E. colinin bir dizi farklı suşunun tamamen sekansı yapılmıştır.
Açıkça görülmüştür ki beklendiğinden çok fazla genomik heterojenite vardır.

382
[Metni yazın]

18. QUESTIONS AND ANSWERS

COMPARATIVE GENOMICS – CHAPTER 18 - MURAT
SABRİ SADIKLAR
1.What is comparative genomics? And What are compared?
Comparative genomics is the study of the differences and similarities in genome structure and
organization
in different organisms. We compare:
Gene location
Gene structure
Exon number
Exon lengths
Intron lengths
Sequence similarity
Gene characteristics
Splice sites
Codon usage
Conserved synteny

2. What are the main steps of Whole-genome shotgun sequencing?

1. Genome is cut into small sections

2. Each section is hundreds or a few thousand bp of DNA
3. Each section is sequenced and put in a database
4. A computer aligns all sequences together (millions of them from each chromosome) to form
contigs
5. Contigs are arranged (using markers, etc) to form scaffolds

3. Explain the orthologs and paralogs simply.

Orthologs are homologous genes in different organisms that encode proteins with the same function
and which have evolved by direct vertical descent.
Paralogs are homologous genes within an organism encoding proteins with related but non-identical
functions.

4. How do orthologs and paralogs evolve?

Orthologs evolve simply by the gradual accumulation of mutations, whereas paralogs arise by gene
duplication followed by mutation accumulation.

5. What is exon shuffling?

Each domain tends to be encoded by one or a combination of exons and new combinations of exons
are created by recombination within the intervening sequences.
This process yields rearranged genes with altered function and is known as exon shuffling.

6. Explain the endosymbiont hypothesis for mtDNA evolution.

It is generally believed that mitochondria are the direct descendants of a bacterial endosymbiont that
became established in a nucleus-containing cell and an ancestral mitochondrial genome is one that has
retained clear vestiges of this eubacterial ancestry.

7. If mitochondria are derived from a bacterium, what is the closest relative of that bacterium
that exists today?
The current view is that it is Rickettsia prowazekii, the causative agent of epidemic typhus. This
organism favors an intracellular lifestyle that could have initiated the endosymbiotic evolution of the
mitochondrion.
383
[Metni yazın]

8. Although functional transfer of mitochondrial genes to the nucleus has stopped in animals, it
continues in plants and protists. Explain this situation.

Functional transfer of mitochondrial genes to the nucleus has stopped in animals, hence their
consistency in size.
Part of the reason for this is that further transfer is blocked by changes in the mitochondrial genetic
code.
However, this gene transfer continues to occur in plants and protists because there is no genetic code
barrier to transfer.

9.What are the results of comparing genomics of chimpanzee and human?

Nearly 1.5% of the chimpanzee genome had single base substitutions when compared with its human
equivalent (chromosome 21) in addition to approximately 68,000 insertions or deletions. These
differences are sufficient to generate changes in most of the 231 coding sequences.
In addition, different expansion of particular subfamilies of retrotransposons was observed between
the different lineages, suggesting different impacts of retrotransposition on human and chimpanzee
evolution.

10. What are the genomics events leading to the formation of the new gene jingwei?
This gene arose in the common ancestor of two Drosophila species. The starting point was the yellow
emperor gene that duplicated to give the yellow emperor and yande genes. Whereas yellow emperor
maintained its original functions, yande underwent modification. In particular, mRNA of the alcohol
dehydrogenase gene retroposed into the third intron of yande as a fused exon and recombined with the
first three yande exons. This formed jingwei, a gene that is translated into a chimeric protein.

384
[Metni yazın]

26. BÖLÜM

REKEOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ

UYGULAMALARI

385
[Metni yazın]

508-528 EKSİK. 528’DEN BAŞLAMIŞ

Metabolik Mühendislikler Çeşitli Kimyasal Yapıları Üretmek İçin Bitki Hücrelerinde
Yada Bitkilerde Uygulanabilir
Bitkiler, inanılmaz şekilde çeşitli olan kullanışlı kimyasalların bir kısmını sentezlerler.
Bunların çoğu, ek fonksiyonları sağlayan kompleks moleküllerdir fakat hücrenin temel
gereksinimlerinin sentezlendiği biyokimyasal yollarla üretilmeyen sekonder metabolizmanın
ürünleridir. Örneğin bu fonksiyonlar polinatörlerin cezbedilmesi, patojen ve haşerelere karşı dirençtir.
Çoğu durumda, bu sekonder metabolitler insanlarda özel ve güçlü farmakotik özelliklere sahiptirler: en
iyi bilinen örnekler kafein, nikotin, morfin ve kokaindir.
Bitkiler uzun zaman boyunca farmakotik maddelerin kaynağı olarak kullanıldılar, ve türlerin
bir kısmı ilaçlar ve diğer değerli maddelerin ekstraksiyonu amacı için özellikle kültüre edilmiştir.
Yukarıda, yeni kimyasallar üretmek için bakterilere ve mayalara nasıl gen aktarıldığı tartışıldı bu
yüzden, teoride geniş çaplı üretim için bu kullanışlı bitkilerden gerekli maddeleri mikroplara transfer
etmek mümkün olmaktadır. Fakat, bitkilerin sekonder metabolit yolları oldukça geniş ve kompleks
olduğundan dolayı çoğu durumda bir strateji geliştirmek mümkün değildir. İyi ki, bitki
transformasyonundaki ilerleme, bitkilerin kendilerinde metabolik mühendisliği oluşturmayı mümkün
kılmıştır (Capell & Christou 2004), ve önemli fitokimyasalların üretimi için geniş çaplı bitki hücre
kültürleri aynı tarzda mikrobiyal kültür olarak kullanılabilmiştir (yayınlandı Verpoorte 1988,
Verpoorte et al. 2000).

Catharanthus Hücre Kültürlerinde Vinblastin ve Vinkristinin Üretimi Metabolik

Yoldaki Kontrol Noktaları ve Çoğu Basamaktan Dolayı Bir Problemdir
Çoğu bitkinin sekonder metabolik yolları aynı temel moleküler iskeletler üretirler fakat, bunlar
yüksek spesifik yollarla fonksiyonel gruplar şeklinde üretilmişlerdir, bu yüzden belirli maddeler
sadece bir ya da çok az bitki türlerinde bulunuyor olabilir. Dahası, böylesi moleküller sıklıkla oldukça
az miktarlarda üretilirler, bu yüzden ekstraksiyon ve saflaştırma oldukça pahalıdır. Örneğin,
Madakaskar menekşesi Catharanthus roseus, vinblastin ve vinkristin olarak adlandırılan iki güçlü anti
kanser ilacının kaynağıdır. Bu terpen indol alkoloidleri laboratuarda sentezlemek için oldukça
karmaşıktır ve alternatif başka doğal kaynak yoktur. C. roseus’da bu moleküller oldukça düşük
miktarlarda üretilirler ki bir hektar bitki her ilacın tek bir gramını üretmek için hasat edilir ve ticari
değer 1 milyon doların üzerindedir.
Bunun gibi ilaçları kültüre bitki hücreleri içeren fermantörlerde üretmek daha uygun olabilmektedir,
ve bu maddelerin bir çoğunda gerçekleştirilmiştir, ikiside (paklitaksel ve şiklonin) ticari üretime
kavuşmuştur ( bakınız Verpoorte et al. 2000). Fakat, hücre süspansiyon kültürleri sık sık ana bitki
tarafından alt ürünler olarak üretilmezler. Bu C. roseus’dan vinblastin ve vinkristin ayrıca,
hiyosiyamin, kodein, morfin gibi diğer önemli ilaçlara uygulanmıştır. Bunun için sorunlardan bir

386
[Metni yazın]

kısmı sekonder metabolitlerin karmaşıklığıdır. Tüm bir yol tek bir hücrede tamamlanmaz, fakat
sıklıkla farklı hücre tiplerinde, hücreler arası ara mekik yöntemi ile ayrılmıştır. Hücreyle birlikte,
metabolik yolun farklı basamakları ayrıca bölümlenmiştir böylece ara ürünler organeller arası transfer
olmaktadır. Bakterilerde olduğu gibi, hedef biyosentetik yolun bilgisi bu nedenle metabolik
mühendislik için temeldir, fakat bitkilerde sadece birkaç sekonder yol tüm detayları ile anlaşılmıştır.
Örnekler, fitoaleksinler (antimikrobiyal maddeler) ve antosiyaninler (bitki pigmentleri) sağlayan,
fenilpropanoid ve flavonoid içeren, vinkristin ve binblastin gibi önemli alkoloidler indol alkoloidler
yapan biyosentetik yollardır. Daha fazla genomlar sekanslandıkça, bizler bunun gibi metabolik yollar
hakkında daha fazla bilgiler öğreneceğiz.
Tüm terpen alkoloidleri sitriktosidin olarak isimlendirilen tek bir evrensel öncüden köken alır. Bu
terpenoid (triptaminde yüksek olan) ve iridoid (sekologaninde yüksek olan) yollar olan iki metabolik
yolun birleşmesi ile oluşmuştur. Striktosidin, striktosidin sentaz ile katalizlenen sekologanin ve
triptaminin kondensasyonu ile oluşur ve değerli alt alkoloidleri üretmek için sonraki basamaklarda
daha sonra modifiye edilir (şekil 26.7). Triptofandan triptamine dönüşüm terpenoid yolda bir oran
limitleyen basamaktır, ve bu C. roseus hücre süspansiyon kültürlerinde aşırı enzim triptofan
dekarboksilaz üretiminde belirtilmiştir. Fakat, transform olmuş hücreler yüksek seviyelerde triptamin
ürettiğinde hiçbir alt alkoloidler sentezlenmemiştir (Goddijn et al. 1995, Canel et al. 1998). Bazı
kültürlerde, yoldaki bir sonraki enzim olan striktosidin sentazın eş zamanlı aşırı sentezi kullanışlı bir
yatıştırıcı olan alkoloid ajmalisinin seviyesini yükseltmedi, fakat vinblastin yada vinkristinin
senteziyle sonuçlanmadı (Canel et al. 1998).

Şekil 26.7: Triptofan karboksilaz enzimi ile triptofanın triptamine dönüşümünü, tritamin ve
sekologaninin striktosidine kondenzasyonunu ve son basamakta vindolin, ajmalisine dönüşümünü
gösteren terpen indol alkoloid biyosentezi

387
[Metni yazın]

Bu yüzden tek basamaklı mühendislik bir sonraki pozisyonu açığa çıkarmak için sadece
bilinen tıkanıklığı ortadan kaldırır. Tek gen yaklaşımlarının limitli başarısı, transkripsiyon faktörlerini
kullanarak tüm metabolik yolun regülasyonunun koordinasyonu için alternatif stratejilerin
geliştirilmesiyle sonuçlanmıştır. ORCA2 olarak isimlendirilen maya bir-hibrid sistemi kullanan bir
transkripsiyon faktör; aynı yolda enzim kodlayan birçok diğer farklı genler ile striktosidin sentaz,
triptofan dekarboksilaz için genlerde cevap elementlerine bağlandığı belirlendi. İlgili bir protein,
ORCA3, kendi entegrasyon bölgesine bitişik genleri aktive eden insersiyonel vektörler kullanılarak
tanımlandı. Deneyci kontrolü altında bunun gibi transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu getiren
tüm metabolik yolları haricen kontrol edilebilmektedir (bakınız, yayınlandı Memelink et al. 2000).

Tahıldaki vitamin A’nın Üretimi Genişleyen Endojen Metabolik Yolun Bir Örneğidir
Vitamin sentezi için metabolik yollar bitkilerde mikroplardakilerden daha fazla şekilde
aydınlatılamamasına rağmen, hızlandırılmış vitamin sentezi için bitkilerin mühendisliği şuanda
oldukça dikkat çekmiştir (Herbers 2003). Vitamin A, ya da 11-cis retinal, tüm insan hücrelerinde
gerekli olan bir diyet maddedir fakat özellikle görme pigmenti opsinin bir lipid prostetik grubu olarak
fonksiyonu gözde önemlidir. Vitamin A eksikliği gelişen dünyada önemli bir sağlık tehditidir, ve
gelişen ülkelerde körlüğün (önlenebilir) yaygın sebebidir. İnsanlar genellikle vitamin A’yı direk olarak
hayvansal kaynaklardan alırlar, fakat bazı sebzelerde ve meyvelerde yüksek seviyede mevcut olan
provitamin A (β-karoten), kendi ara metaboliti sağlanırsa sentezlenebilir. Vitamin A’nın önerilen
günlük toleransı retinol eşdeğer olarak eksprese edilmiştir ve bu günlük 6 mg β-karotene eşittir. Bu
oldukça az bir miktardır ve dünyanın en fakir insanlarının çoğu için temel diyet olan β-karoten tahıl
ürünlerinde vardır.
Bitkilerdeki karotenin sentezi öncü fitoene oluşturmak için 2 geranil geranil difosfat moleküllerinin
bağlanması ile başlar (Şekil 26.8). Fitoene’nin β-karotene dönüşümü bundan başka 3 farklı enzimatik
basamağa ihtiyaç duyar. Tüm dört basamak tahıl endosperm dokusunda yoktur, bu yüzden tahıl
ürünleri geranil geranil difosfat biriktirir fakat yolda alt metabolitler yoktur. Tahıllardaki β-karoten
sentezi bu nedenle metabolik yolların bir örneği olan yeni enzimatik aktivitelerin bitkide başlatıldığı
ve kendisi endojen olan ve noktalarının ötesinde yolu uzatmak için endosperm içinde ekspress edildiği
genişletmeyi sunmaktadır. Tahıl tanelerinde β-karoten sentez yolundaki 4 enzimin aktiviteleri kayıptır.
Bunlar fitoene sentaz, fitoene desaturaz, ζ-karoten deasturaz ve likopen β-siklazdır (şekil 26.8). İlk ana
buluş, fitoene biriktiren pirinç tanelerinin geliştirilmesidir. Burkhardt et al. (1997) bu ara metabolitleri
yüksek seviyelerde biriktiren daffodil fitoene sentaz (Narcissus pseudonarcissus) geni ile transform
olmuş pirinç bitkilerini açıklamıştır. Aynı grupla yapılan ileriki çalışmalar (Ye et al. 2000) fitoene
sentaz ve likopin β-siklaz kodlayan, ve hem ζ-karoten desaturaz hemde fitoene desaturaz aktivitesi
gösteren enzimi kodlayan Erwinia uredovora bakterisinden crtI geni ve daffodil genleri ekspres eden
transgenik pirinçler üretmişlerdir. Daffodil genleri endoderm spesifik olan glutelin-1 promotoru
kontrolü altında ekspres ediliyorken, bakteriyal gen temel cauliflower moszaik virüs (CaMV) 35S
388
[Metni yazın]

promotoru ile kontrol edilirler. Bu çığır açan çoklu gen mühendislik yaklaşımı vitamin A için
RDA’nın yaklaşık %10’unu sunan 100g orta pirinç öğünü olduğu durumda, β-karotenin 2µg/g’a kadar
olduğu altın renkli pirinç taneleri ile sonuçlanmıştır. Enterasan şekilde, benzer sonuçlar fitoene sentaz
ve bakteryal crtI geni içeren fakat likopin β-siklaz içermeyen pirinç bitkilerinde de gerçekleşmiştir
(Beyer et al. 2002). Bu, ya pirinç tanelerinin bir artık endojen likopin β-siklaz aktivitesi içerdiğini
yada endojen enzimin yaban tip tanelerde dormant fakat ara metabolitlerin yüksek seviyesi ile
transgenik tanelerde uyarılmış olduğunu göstermiştir.

Şekil 26.8: Tahıl tanelerinde eksik olan β-karoten biyosentezindeki metabolik ürünler ve enzimatik
basamaklar

Altın pirinç projesi sadece teknolojik şekilde çığır açmamıştır ayrıca besin güvensizliğini adres
gösteren diğer ürünlerin geliştirilmesi için bir örnek sağlayan insancıl bilimin bir modeli olmuştur.
Başlangıçtan beri, proje organizatörlerinin açık amacı kullanma özgürlüğü sağlamak ve gelişen
ülkelerdeki yaşamını sürdürecek kadar kazanan çiftilere ücretsiz şekilde bu teknolojiyi sağlamaktır ve
başarı için 100’den fazla entellektüel ile ve teknik özellik hakları için dikkatli tartışmalar yapılmalıdır.
Altın pirinç kriterleri acil gereklidir; bu vitamin A eksikliği için geleneksel müdahalelerin
tamamlayıcısıdır ve önemli bir dünya sağlık problemini vurgulamak için gerçek bir fırsattır. Bu
fakirlere ve avantajsızlara yarar sağlamak için geliştirilmiştir, ve gerekli çiftçilere sabit durumlar
olmadan verilecektir. Bunlar diğer pirinç varyeteleri ile karşılaştırıldığında ek bir ihtiyaç gereksinimi
duymaz. Biyogüvenlik endişelerini uzaklaştırmak için, altın pirinç sıraları, seçilim için herbisidler ve
antibiyotiklerin kullanımını uzaklaştıran ve sadece karbon kaynağı mannoz olduğu zaman bitki
oluşumunu sağlayan mpi zararsız metabolik seçilim markırı ile oluşturulmuştur.
Pirinçlerdeki β-karoten sentezi sağlık problemleri ve gerçek besin güvenliğini gösteren
muhteşem potansiyele sahiptir. Diğer bitkilerdeki çalışmalar, bu önemli metabolik yollar hakkında
ileri derecede kullanışlı bilgileri göstermiştir. Arabidopsis thalinana’dan β-siklaz geni kadar (Rosati et
389
[Metni yazın]

al. 2000) crtI (Romer et al. 2000) ve E.uredovora fiton sentaz (crtB) (Fraser et al.2000) ekspresleyen
transgenik domatesler anlatılmıştır. İlk durumda, crtB’nin meyve spesifik ekspresyonu, domates fiton
sentaz-1 transit dizisi kullanan kromoplastlara yönlendirilen rekombinant protein ve domates
poligalakturonaz promotoru kullanılarak meydana çıkarıldı. Toplam meyve karotenoidleri yaban tip
bitkilerden 2 ila 4 kat daha fazla olduğu bulundu. Romer et al. (2000) CaMV 35S promotor kontrolü
altında yapısal olarak ekspres edildi. Bu beklenmedik şekilde yaklaşık %50 oranında toplam karoten
miktarını azalttı. Fakat, β-karotenin seviyesi kuru ağırlıkta 520 µg/g olarak arttı. Bu büyük ihtimalle,
farklı bazı seviyelerde rol alan kompleks geri besleme mekanizmasının varlığını etkilediği Giuliano et
al.tarafından belirtilmiştir (2000). Rosati et al. (2000) meyvelere özgü olan domates fiton desaturaz
promotorunu A. Thaliana’da β-likopen siklaz genini sentezletmek için kullanmıştır ve transgenik
bitkilerde β-karoten seviyesi 60µg/g taze ağırlığa kadar yükselmiştir. Çalışmalar β-karoten metabolik
yolunun nasıl regüle edildiğini belirlemek ve geri besleme mekanizmasını düzenlemek için hangi
basamakların çıkarılmasının gerektiği üzerinde devam etmektedir.

Daha Fazla Vitamin E Üretmek İçin Bitkilerin Geliştirilmesi Ve Tercih Edilen Yönde
Akış Yönlendirmesi ve Bazı Metabolik Yolların Dengelenmesinin Bir Örneğidir
Vitamin E aslında sekiz hidrofobik bileşenin bir grubudur: α-, β-, γ- ve δ-tokoferol ve doymamış
eşdeğerlikleri α-, β-, γ- ve δ-tokotrienol’dur. Beslenmeye ait olan vitamin E temelde tohumlardan
alınır ve vücuttaki fonksiyonu ise doymamış yağ asitlerinin polimerizasyonu ve oksidasyonunu
engellemektir. Eksikliği ise, genellikle karaciğer deformasyonuna ve kısırlığa sebep olur. α-, β-, γ-, ve
δ-türevleri şekil 26.9’da gösterildiği gibi kroman halkasının etrafındaki metil gruplarının pozisyonuna
ve numaralarına göre farklılık gösterir. En güçlü vitamer RRR-α-tokoferoldür, fakat doğal vitamin
E’nin soya yağı gibi yaygın besin kaynakları α-tokoferolün %10 aktivitesini gösteren γ-tokoferolce
daha zenginken, α-tokoferolün kendisi sadece küçük bir bileşendir. Toplam vitamin E piyasasının
%10-15’ini oluşturan doğal vitamin destekleri γ-tokoferolün kimyasal yollarla α-tokoferole
çevrilmesiyle soya yağından üretilmektedir.

390
[Metni yazın]

Şekil 26.9: Vitamin E’nin yapısı.α-türevleri için R1,2 ve 3; β-türevleri için R1 ve 3; γ-türevleri için R2
ve 3; δ-türevleri için sadece R3 metillenmiştir.

Bitkilerdeki tokoferol üretimi iki metabolik yolun birleşmesini gerektirmektedir. Şikimeyt

metabolik yolu homogentisik asit oluşturur ki buda maddelerin aromatik halkalarını yapar öte yandan,
yan zincirleri üreten fitildifosfat ise metileritritol fosfat (MEP) yolunun ürünüdür (resim 26.10). bu
öncü maddeler ara ürün olan 2-metil-6-fitilbenzoquinol (MPBQ) üretmek için prenil transferaz enzimi
tarafından birleştirilirler. MPBQ iki enzim için subsrattır; bunlar tokoferol siklaz ve MPBQ
metiltransferazdır. Katalizleyen enzim ilk önce δ-tokoferol üretir çünkü daha sonraki basamaklarda δ-
tokoferole, 2,3-dimetil-5-fitilbenzoquinol üretmek için ikinci bir metil grubu takılır. Bu ara
basamaktaki tokoferol siklazın etkisi γ-tokoferol üretir. Hem γ-tokoferol hemde δ-tokoferol sırasıyla
α-, β- tokoferol üreterek α-tokoferol metil transferaz (γ-TMT) için substrat olarak rol oynarlar. Farklı
bitkilerdeki dört tokoferolün fark edilebilir olan artışı yukarıda bahsedilen enzimlerin aktivitelerine
bağlıdır.

391
[Metni yazın]

Şekil 26.10: Tokoferol biyosentezinde son basamaklar. MPBQ = 2-metil-6-fitilbenzoquinolx

A.thaliana kullanılarak yapılan son çalışmalar bu bitkinin tohumlarındaki vitamin E

aktivitesinin nasıl yükseldiğini göstermiştir. Bu iki şekilde olmuştur ya vitamin E’nin toplam miktarını
arttırarak yada vitamer öncülerini en güçlü form olan α-tokoferol’e dönüştürerek yapmışlardır.
Shintani ve Della Penna (1998), havuç tohum spesifik DC3 promotoru kullanarak A.thaliana’da
A.thaliana ve Synechocystis PCC6803’te γ-TMT kodlayan geni ekspres etmişlerdir. Bu, toplam
vitamin E seviyesi değiştirmeden bitkilerdeki besin geliştirilmesinin mümkün olduğunu γ-
tokoferolden α-tokoferole dönüşüm ile göstermiştir. Aksine, Savidge et al. (2002) normal tohumlarda
bulunan vitamin E miktarının 2 katını A.thaliana HPT’nin aşırı üretimi sonucu sağlarken, Geiger et al.
(2001) vitamin E miktarının 3 katını E. coli’nin iki fonksiyonlu enzim kodlayan tyrA genini (korismat
mutaz ve prefenat dehidrogenaz) ekspress ederek başarmıştır. En son yapılan çalışmalar geliştirilmiş
besinsel düzeylerle soya fasulyelerinin üretilmesi, besin endüstrisine yarar sağlayacak olan bilgilerin
nasıl elde edildiklerini göstermektedir. Altın pirinç için, bu çalışmaların başarısı çoklu genlerin aynı
anda ekspres edilmesine bağlıdır ve A.thaliana durumunda ise, VTE3 ve VTE4 genleri, MPBQ metil
transferaz ve γ-tokferol metil transferaz genleri kullanılmaktadır (Van Eenennaam et al. 2003).
Transgenik soya fasülyeleri normal yaban tip benzerlerinden 5 kat daha fazla toplam vitamin E
seviyesinde artış olduğunu göstermiştir. Bu durumda, çoklu gen transferi metabolik yolu genişletmek
için değil, fakat arzu edilen metabolitleri arttırmak için var olan basamakları düzenlemek için
kullanılmıştır.

392
[Metni yazın]

Konu 2: Genetik Modifikasyonla Tarımsal Özelliklerin Geliştirilmesi

Yüzyıllardan beridir, bitkiler ve evcil hayvanlar, kullanışlı ürünleri, görünüşleri ve benzeri arzu
edilen özellikleri için beslenmişlerdir. Geleneksel yetiştirmede, çiftçi yada besleyici özel
çaprazalamalar yapıldığında genlerin yararlı kombinasyonlarını bir araya getirmek için rekombinasyon
değişimlere güvenirler. Genetik mühendisliği geleneksel yetiştirmeye bunun gibi genleri direkt olarak
genoma yerleştirerek bir kısayol sunmaktadır. Genetik mühendislik ayrıca, çaprazlamalar devam
ederken cinsiyet uyumluluğunun oluşturduğu kısıtlamaları da ortadan kaldırır çünkü herhangi bir
kaynaktan (bakteri, hayvan yada bitki) bir gen alıcı canlıya aktarılabilir. Son zamanlarda özellik
geliştirilmesi bitki biyoteknolojisinden daha fazla kullanılmaktadır ve ticari olarak modifiye edilmiş
olan bitkiler (GM) 20 ülkeden fazla, 75 milyon hektar tarım arazisinde üretilmektedir (Christou ve
Twyman 2004). Bu bölümde genetik manuplasyonla geliştirilen bitkilerin tarımsal özelliklerinin
bazılarını tartışacağız.

Ticari Transgenik Bitkilerde En Yaygın Özellik Herbisit Dirençliliğidir

Herbisitler, amino asit biyosentezini ve fotosentezi etkileyen, zararlı otları öldürmek için kullanılan
bir kimyasaldır (bkz. Tablo 26.5). Hem mahsüller hemde zararlı otlar aynı işlemleri paylaşırlar ve
geliştirilen herbisitleri zararlılara göre spesifik üretmek oldukça zordur. Bir alternatif yaklaşım mahsül
veren bitkileri modifiye etmektir böylece, kimyasal seçicilikten çok bitkinin kendisi ile birleşmesi gibi
geniş çaplı herbisitlere karşı dirençli olurlar. Herbisit bitki yaratmak için iki strateji benimsenmiştir.
İlkinde, hücredeki hedef molekül ya duyarsız hale getirilir yada fazlaca üretilir. İkincisinde ise,
herbsisitleri degrede veya detoksife eden bir metabolik yolun bitkiye aktarılması ile gerçekleşir. Her
iki örnekte aşağıda tartışılmıştır.

393
[Metni yazın]

Glifosfat, bakteri ve bitkilerde aromatik amino asidlerin biyosentezi için anahtar enzim olan
5-enol-prüvilşikimeyt-3-fosfat sentaz (EPSP) enzimini inhibe eden bir seçilmeyen herbisittir. Bir
glifosfat toleranslı Petunia hybrida hücre suşu gen çoğaltmasının sonucu olan EPSP üretimi için
glifosfat dirençli olarak seçilirler. Enzimi kodlayan bir gen izole edilir ve petunya bitkisine CaMV
promotorunun kontrolünde aktarılır. Transgenik bitkiler ekspresyon ile glifosfata önemli derecede
toleranslı olurlar ve EPSP sentaz seviyesini arttırırlar (Shah et al. 1986). Glifosfat dirençliliğine
alternatif bir yaklaşım ise, mutant bir ESPS sentaz kodlayan geni aktarmaktır. Bu mutant enzim kendi
spesifik aktivitesini korur fakat herbisitler için affinitesinde azalma meydana gelmektedir. Bir opin
promtorunun kontrolü altında bu geni ekspresleyen transgenik domatesler ayrıca glifosfat toleranslı
olmuşlardır (Comai et al. 1985). Bu araştırmalardan sonra, bazı şirketler ticari olarak pamuk ve soya
fasülyesi ile bazı mahsülleri glisfoasfat toleranslı şekilde satışa çıkarmışlardır (Padgette et al.et al.
1996, Nida et al. 1996). Şuanda, dünyadaki tüm transgenik bitkilerin yüzde 75’i glifosfata karşı
dirençlidir (James 2004).
Fosfinotrisin (PPT) bitkilerde ve bakterilerde geri dönüşümsüz şekilde glutamin sentazı inhibe
etmektedir. Bialaphos, iki alanin amino asidi ve PPT’den oluşur ve Streptomyces hygroscopicus
tarafından üretilir. Bu amino asidler bir peptidaz ile ortadan kaldırılırsa herbisit olan PPT salınır.
Büyüme sırasında kendini inhibe etmesinden kaçınmak için bialaphos üreten suşlar ayrıca
fosfinotrosin asetil transferaz (PAT) üretirler ki buda asetilasyonla PPT aktivitesini durdurur. Asetilaz
kodlayan bar geni Agrobacterium’la birlikte patatese, tütüne ve domates hücrelerine aktarılmıştır.
Ortaya çıkan bitkiler saha çalışmalarında (De Greef et al.1989) ve laboratuar çalışmalarında (DeBlock
et al. 1987) (Şekil 26.11) bialaphos ve PPT’nin ticari çeşitlerine karşı dirençli olmuşlardır. Son
çalışmalarda, bialaphos dirençli transgenik pirinç bitkileri hastalığa sebeb olan fungus ile enfekte
olmalarına rağmen hem herbisite karşı hemde enfeksiyona karşı tam bir koruma sağlandığı
gösterilmiştir (Uchimiya et al. 1993). Bu tarımsal açıdan önemli olan sonuç bialaphosun herbisit
olarak funguslara karşı toksik olduğunun gözlenmesine dayanmaktadır. PPT dirençliliği geniş çapta
bitkilerde seçici marker olarak kullanılmaktadır (bkz. Syf. 284), fakat pirinç ve şeker kamışının içinde
bulunduğu bitkilere zararlı kontrolü için aktarılmıştır (Gallo-Meagher ve Irvine 1996, Oard et
al.1996).

Şekil 26.11: Fosfofinotrisin dirençli tütün bitkilerinin saha çalışmaları. (a) Transform olmamış kontrol
bitkileri, (b) Transgenik bitkiler. (Fotograflar, Dr.J. Botterman ve Biotechnology’nin editörü)

394
[Metni yazın]

Herbisit dirençli transgenik bitkilerin yararları, yaban tiplerle karşılaştırıldığında yüksek ürün
verimi ve tohum kalitesi ile elemine olmuştur. Fakat, çevreye ciddi derecede zararı olan herbisit
kullanımının artmasının zararları ile ilgili endişeler vardı. Bu tahminlerin aksine, herbisit dirençli
bitkilerin üretimi gerçekten herbisit kullanımını bazı alanlarda %80 oranında azltmıştır. Herbisit
toleransı için oluşturulan transgenlerin diğer bir riski ise, süper zararlıların oluşumudur (Kling 1996).
Bunun bir problem olduğunu söylemek için oldukça erken olacaktır. Herbisitdirençli bitkilerin yüksek
çoğunluğu test edilmiş olmalarına rağmen hala ticari olarak glifosfat ve bromoksynil’e dirençli olan
bitkiler ticari olarak satılmaktadır. Herbisit dirençli bitkilerin yararları ve zararları yayınlanmıştır
(Gressel 1999, 2000). Zararlı kontrolü için herbsit direnci yaygın bir strateji olmasına rağmen, kendi
inhibitör maddelerini üreten bitkilerin modifiye edilmesi başka bir yaklaşımdır (Duke et al. 2002
tarafından yayınlandı). Tipik olarak, ilk ürünler modifikasyonun hedefidir fakat, bu yaklaşımlar ilk
bitki dikilmeden önce zaralıları inhibe eden agresif kaplama bitkilerin üretimi içinde kullanılabilir.
Son zamanlardaki ilginç çalışmalar ise, yılın doğru zamanında kendisini parçalamasına neden olan
kaplama bitkilerini uyarmak için intihar genlerinin fotoperiyot veya ısı ile uyarılması üzerinde
yoğunlaşmıştır (Stanilaus ve Cheng 2002). Tercihen zararlılara saldırabilen mikrobiyal patojenleri de
modifiye etmek ayrıca mümkündür (e.g. Amsellum et al. 2002).

Virus-Dirençli Ürünler Viral ya da Viral Olmayan Transgenlerin Ekspresyonu ile

Üretilebilir
Büyük ürün kaybı her sene viral enfeskyonların sonucunda gerçekleşmektedir. Örneğin, tütün
mozaik virüsü (TMV) domates endüstrisinde senelik 50 milyon dolarlık kayba sebep olmaktadır.
Çapraz koruma olarak bilinen kullanışlı bir fenemon vardır. Burada, bitkiyi bir virüs enfekte ettiği
zaman ilgili suşun ikinci virüsü bu bitkiyi enfekte edemez şeklindedir. Çapraz korumanın
mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır fakat, viral zarf proteinin önemli olduğuna inanılmaktadır.
Powell-Abel et al. (1986) TMV ekspres eden transgenik bitki geliştirdi ve virüs enfeksiyonuyla oluşan
semptomlarda düşüş meydana gelmiştir. Bu gözlemlerden beri, heterolog zarf protein ekspresyonun
ilkeleri farklı bir çok virüs ve bitkilere uyarlanmıştır ( Beachy et al. 1990 yayınlandı). TMV karşı
direnç durumunda, zarf proteini virüsün sistemetik olarak yayıldığı vasküler dokularda ve epidermiste
ekspres edilmelidir (Clark et al. 1990). Çoklu viral zarf protein geni içeren ve salatalık mozaik
virüsüne, karpuz mozaik 2 virüsüne ve zucchinni sarı mozaik virüsüne direnç gösteren transgenik
kabak ticari amaca ulaşan ilk virüs dirençli transgenik bitki olmuştur (Tricoli et al. 1995). Transgenik
pirinç bitkilerinde ekspres olan viral replikaz ise bu bitkileri pirinç sarı benek virüsü (RYMV)’nin
farklı izolatlarına karşı koruma sağlamıştır. Çünkü viral replikaz enzimi zarf proteinlerinden daha fazla
korunmuştur. En iyi performans gösteren suşlarda, viral replikaz bazı jenerasyonları tamamen
bloklamıştır (Pinto et al. 1999).
Heterolog viral zarf yaklaşımı başarılı olsada, bazı durumlarda RNA seviyesinde sentezin protein
seviyesindekinden daha kolay olduğu gözlendi. Bu, tütün mozaik virüsü kullanılarak ilk defa 1992’de

395
[Metni yazın]

Lindbo ve Dougherty tarafından zarf protein geni taşıyan fakat fonksiyonel bir ürün üretmeyen
transgenik bitkiler yapılarak kanıtlandı. Transgen RNA belliki viral replikasyona müdahale etmektedir
(bu fenomon RNA-kolaylaştırılmış viral direnç isimlidir). Bu transgen ve hedef gen arasında bir
homoloji ve post-transkripsiyonel gen susturulmasına benzer özellikler, düşük seviyede transkript
birikimi fakat yüksek seviyede ise transgen transkripsiyonu gerektirir (syf.314).
Bitki virüs enfeksiyonun etkilerini azaltan diğer bir method Gehrlach et al. tarafından geliştirildi
(1987). Bilim insanları tütün rigspot virüsünün satellit RNA’larını sentezleyen bitkiler ürettiler ve
bunun gibi bitkiler bu virüsün enfeksiyonlarına karşı dirençli olmuştur. Transgenik bitkilerde antiviral
proteinlerin üretimi virüslere karşı direnç methodlarından bir başkasıdır. Bir bitki, ribozom inaktif
edici özelliğe sahip olan dianthrin olarak isimlendirilen antiviral protein üretmektedir. Bu protein için
cDNA tütüne klonlanıp ekspres edilirse (Lin et al. 1991), Afrika cassava mozaik virüsüne (ACMV)
karşı direnç sağlanacaktır (Hong et al. 1996). Bu deneyde enteresan olarak, ACMV promotoru
kontrolü altında dianthrin ekspres edilmiştir. Bu şekilde antiviral protein sadece viral enfeksiyon
sırasında üretilecektir. Bir manada, transgen ekspresyonunun toksik etkisi ortadan kaldırılmıştır.
Viral olmayan genlerin ürünlerinin bazı sınıfları virüslere karşı spesifik korumayı sağlamada
kullanılabilir. Örneğin, protein sentezini bloklayan (Moons et al.1997, Tumer et al. 1997) ribozom
inaktif edici proteinler, virüs genomunu parçalayan (Watanabe et al. 1995) ribonükleazlar,
replikasyona müdahale eden (Ogawa et al. 196) 2’-5’ oligoadenilat sentazlar ve viral genomun
hücresel enzimlerle (de Feyter et al. 1996, Kwon et al. 1997) degrede olmasını sağlayan ribozimlerdir.
Virion proteinler için spesifik antikorlar virüslerden bitkileri korumak için kullanılmıştır. Bu
yaklaşımın ilk gösterisi, Tavladoraki et al. (1993) transgenik N. Benthamiana ‘da ACMV için bir tek
zincir Fv fragmentinin spesifik olarak üretilmesiydi. Diğer gruplar enfektiviteyi azaltacak şekilde,
tütün mozaik virüsü için spesifik antikolar ekspres eden trasgenik tütün bitkileri şeklinde oluşturuldu.
Voss et al. (1995) tam boyutlu IgG immunoglobulinler sentezlerken, Zimmerman et al. (1998) scFv
fragmenlerini sentezlemiştir. Plazma membranını hedef alan scFv fragmentleri ayrıca virüs
enfeksiyonuna karşı korumada sağlamıştır (Schillberg et al. 2001).

Doğal Bitki Savunma Mekanizmalarını Manuple Ederek Fungal Patojenlere Karşı

Direnç Başarılmıştır
İşlem, patojen fungulara geleneksel yollarla çevreye zararlı ve pahalı olan fugusitlerle yapılan
uygulamaların yanı sıra bitkilere patojen funguslara karşı dirençlilik oluşturmaktır. Çığır açan
yaklaşım ise, heterolog türlerden elde edilen antifungal proteinleri bitkilere aktarılmasıdır. Bu ilk defa
Broglie et al. (1991) tarafından gösterilmiştir. Burada, fasülye kitinazının sentezi bitkileri Rhizoctonia
solani ‘nin neden olduğu zararlardan koruduğunu gösterilmiştir. Bitkiler patojen ilgili protein (PR)
olarak adlandırılan maddeleri geniş çapta üretirler. Bunlar, kitinaz ve glukonaz gibi mikrobiyal
enfeksiyon ile uyarılırlar. Bitkileri funguslara karşı koruyan bunun gibi bir çok örnek mevcuttur. Bazı
durumlarda, çoklu PR proteinleri sinerjik etkilerle sentezlenirler. Tütün, havuç ve domatesin her biri

396
[Metni yazın]

hem kitinaz hemde glukonazı aynı anda sentezleyecek şekilde oluşturulmuşlardır ve bu bitkiler iki
enzimin sinerjik çalışmasıyla muazzam bir fungal dirençlilik göstermişlerdir (van den Elzen et al.
1993, Zhu et al. 1994, Jongedijk et al. 1995).
Bitkiler ayrıca defensin adında anti-fungal peptidler sentezlerler. Transgenik bitkilerde fazla şekilde
sentezlenince patojenlere karşı dirençlilik sağlayan diğer anti-fungal proteinler gösterilmiştir (Cary et
al. 2000, Osusky et al. 2000, Li et al. 2001); bunlardan bazıları saha çalışmaları sonucunda koruma
sağladığı gösterilmiştir (Gao et al. 2000). Bu proteinlerin bir çoğu için bu genler, transgenik bitkilerde
sürekli şekilde sentezlenen ve artış gösteren sayılarında klonlanmış ve karakterize edilmiştir (Punja
2001). Örneğin, tütün ozmotin Phytophthora infestans’a karşı direnç için patatese aktarılmıştır ve aynı
şekilde R. Solani’ye karşı transgenik pirinçte direnç oluşumuna neden olmuştur (Lin et al. 1995).
Direkt koruma için proteinlerin kullanılması yerine metabolikmühendislik stratejileri
kullanılabilmektedir. Fitoaleksinler antifungal aktiviteye sahip alkoloidlerdir. Ve biyosentetik
genlerin transgenik bitkiye aktarılması sonucu kendi sentezleri artmıştır. Hain et al. (1993) stilbene
sentaz için üzüm geni sentezleyen domates bitkileri oluşturmuştur ve bu bitkiler Botrytis cinerea
tarafından oluşturulan enfeksiyona karşı direncin arttığını göstermiştir. Üzüm stilbene sentaz geni
diğer bir çok bitkilerde bu şekilde kullanılmış ve fungal patojenlere karşı geniş çaplı bir koruma
sağladığı belirlenmiştir (Stark-Lonzen et al. 1997, Thomzik et al. 1997, Leckband&Lorz 1998,
Fettig&Hess 1999).
Antifungal proteinlerin veya metabolitlerin alternatif bir kullanımı saldıran patojenleri durdurmak
için bitkiler tarafından kullanılan fizikososyal defans mekanizması olan hiperduyarlılık cevabının
kullanılmasıdır. Direnç patojendeki avirülans genine (avr) cevap olarak bir direnç geni taşıyan bitkide
meydana gelir. Patojenler tarafından salınan sinyal proteinleri bir tarafından defans cevapları
oluşturarak tanınır. Önemli olarak, hiperduyarlılık sistematiktir, bu yüzden, komşu hücreler patojen
işgaline birleşirler. Son geliştirilen stratejiler patojenden bir virülans geninin bir patojen-uyarıcı
promotor kontrolü altında bitkiye aktarılması şeklindedir. Bu, Clasopsporium fulvum’dan avr9 geni ile
transforme eilmiş domates bitkilerinde fungal, bakteriyal ve viral hastalıklara karşı dirençlilik
olduğunu göstermiştir ( Keller et al. 1999, Melchers ve Stuiver 2000 yayınlandı).

Küfe Karşı Dirençlilik Bitkilerin Bakteriyel Patojenlere Karşı Nasıl Korunduğunun Bir
Örneğidir
Bakteriyal hastalıklar bitki ürünlerinde önemli kayıplara sebep olmaktadırlar ve birçok farklı
transgenik stratejiler bazı semptomları ortadan kaldırmak veya enfeksiyonu uzaklaştırmak için
geliştirilmiştir (Herrara-Estrella&Simpson 1995, Mourges et al. 1998, Punja 2001). Pirinçte bulunan
baktariyal hastalıklardan en yaygın olanı Asya’da tek başına 250 milyon dolarlık kayba sebep olan
bakteriyal küftür. Bu hastalık, O. Longistaminata’nın yaban türlerindeki bir direnç geni kompleksinin
keşfinden dolayı dikkatleri üzerine çekmiştir. Deneme, IR-24 pirinç suşunda gerçekleştirildi,
Hindistan ve Filipinler’deki küf patojeni Xanthomonas oryzae pv. Oryzae’nin bilinen bütün

397
[Metni yazın]

izolatlarına karşı dirençlilik oluştuğu gösterildi (Khush et al. 1990). Direnç geninin ileri çalışmaları
ise, reseptör tirozin kinaz kodlayan Xa21 isminde bir genin izolasyonuyla sonuçlanmıştır (Song et al.
1995). Duyarlı pirinç suşlarını bu genin transferi ise bitki suşlarının patojenin büyük bir çoğunluğuna
karşı güçlü bir dirençlilik oluşturması ile sonuçlanmıştır (Whang et al. 1996, Tu et al. 1998, Zhang et
al.1998). Xa21 geni, böcek zararlılarının büyük bir bölümünü ve bakteriyal küflenmeye dirençli pirinç
suşları üretmek için böcek dirençliliği için 2 gen ile birleştirilmiştir. Ve bu yakın gelecekte Çin’de
ticari olarak dağıtılacaktır (Huang et al. 2002a). Böcek dirençlilik geni ile birlikte, tek bir direnç
faktörü taşıyan transgenik bitkilerin geniş çaplı kullanımı farklı durumlara kendilerini uyarlayabilen
yeni patojenlerin ortaya çıkmasını sağlayabilir. Bu yüzden, diğer küf-dirençlilik transgenleri Xa21 ile
oluşabilecek kombinasyonları ve tek başına kullanılabilirlikleri test edilmektedir. Örneğin, Tang et al.
Bir ferrodoksin benzeri protein sentezleyen pirinç bitkileri üretti ve sonraki çalışmalarda ise,
Pseudomonas syringae pv. syringae ‘ye karşı olan hiperduyarlılık cevabının geciktirildiği
gösterilmiştir. X.oryzae ile yapılan inokülasyon testleri ve tüm transgenik bitkiler patojene karşı
gelişmiş direnç göstermiştir.

Basillus thuringiensis Bakterisi Böcek Direnç Genlerinin Ana Kaynağıdır

Böceklerin oluşturduğu zarar ürün üretimine karşı en ciddi biyotik kısıtlamaları sunmaktadır.
Örneğin, böcek zararlarından dolayı dünyada üretilen pirincin %25’inden fazlası kayıptır ve yaklaşık
zarar 50 milyar dolar civarıdır. Yalnızca bu bitki için kullanılan insektisitlerin maliyeti ise 1,5 milyar
dolardır. Böcek dirençli bitkiler bu yüzden, sadece potansiyel mahsülün arttırılmasından dolayı değil
ayrıca, insektisitlerin elemine edilemiş olması ile çevrede biriken kimyalların uzaklaştırılacak
olmasından dolayı önemlidir. Tipik insektisitler seçici değillerdir bu yüzden, zararlılar kadar zararsız
ve yararlı böcekleride öldürür. Bu sebeplerden dolayı, bazı böcek türleri için seçici olan toksinleri
sentezleyen transgenik bitkiler yaratılmıştır.
Araştırmalar farklı kaynaklardan geniş çaplı insektisidal proteinler üzerinde sürdürülmektedir.
Fakat, ticari olarak üretilmiş tüm böcek dirençli transgenik bitkiler Gram-pozitif bir bakteri olan
Basillus thuringiensis’e ait olan toksin proteinini kodlar (Bt) (Peferoen et al. 1997, de Maagd et al.
1999). Diğer Basillus türlerinin aksine, Bt türü sporulasyon sırasında kristal üretir. Boyutları küçük
olan bu protoksin 130kDa civarındadır ve kristal proteini olarak isimlendirilir. Bu proteinler güçlü ve
oldukça spesifik insektisitlerdir. Spesifite böcek orta bağırsağındaki reseptörler ile kristal proteinleri
arasındaki reaksiyon sonucu gerçekleşir. Duyarlı türlerde, vücuda alınan kristal bağırsaktaki alkali
ortamda çözülür ve bağırsak proteazları ile protoksinler aktifleştirilir. Aktifleşen toksinler orta
bağırsağın epitel hücrelerinin reseptörlerine bağlanırlar, plazma membranından içeri girerler ve
ozmotik lizis ile hücre ölümüne sebep olan porları oluştururlar. Hemen hemen 150 farklı Bt toksini
tanımlanmıştır ve herbiri kendisine özgü aktivite spektrumu göstermektedir (van Frankenhuyzen &
Nystrom 2002).

398
[Metni yazın]

Bt toksinleri 1930’lardan beridir güncel insektisitler olarak kullanıldılar, fakat asla geniş çapta
kullanım kazanmadı çünkü, gün ışığı ile etkileştiği zaman etkisiz olmaktaydı. Bu yüzden, mevsimlerin
bazı zamanları uygulanabilir olmaktaydı. Ek olarak, sadece foliar uygulama yapılmış bitkilerin
yüzeylerine maruz kalan böcekler ölmektedir. Bu problem kristal proteinlerinin transgenik bitkilerde
ekspres edilmesini ortaya koymuştur. Bt genleri başlangıçta domatese (Fishhoff et al. 1987), tütüne
(Vaeck et al. 1987, Barton et al.1987) ve pamuğa ( Perlak et al. 1990) aktarılmıştır. Bu çalışma
sonucunda ise, böcek istilalarından bitkilerin insektisidal proteinlerin üretilmesiyle korunduğu
gösterilmiştir. Fakat, bu bitkilerin saha çalışmaları ticari manada kullanışlı bitkiler elde etmek için bu
toksinlerin bitki dokularına yüksek seviyelerde üretilmesi gerekmekte olduğunu göstermiştir
(Delannay et al. 1989). Bitkilerde, farklı promotor, füzyon proteini, ve lider dizi kullanımı ile toksin
geninin ekspresyonunun arttırılmasına dair teşebbüsler başarız olmuşlardır. Fakat, bakteriyal cry1Ab
ve cry1Ac genlerinin incelenmesi bir çok bakımdan bitki genlerinden önemli derecede farklı
olduklarını göstermiştir (Perlak et al. 1991). Örneğin, bitki intronlarına benzeyen AT zengin bölgeleri,
potansiyel bitki adenilasyon sinyal dizileri, mRNA’yı kararsız kılan ATTTA dizileri ve nadir olan
bitki kodonları bulunmuştur. Konak türleriyle kodon kullanımı yapılan suşu getirmek için
modifikasyonlar ve istenmeyen dizilerin eleminasyonu insektisidal toksinlerin oldukça gelişmiş
şekilde ekspresyonu ile ve saha denemelerinde transgenik bitkilerin güçlü böcek dirençliliği ile
sonuçlanmıştır (Koziel et al. 1993). Bu geliştirmeleri ilerleterek, Perlak ve arkadaşları Colorado
böceğine karşı dirençlilik sağlamak için cry3A genini patates içine aktarıp modifiye etmişlerdir (Perlak
et al. 1993). 1995’te, bu ürün Monsanto tarafından ticari olarak üretilen ilk transgenik dirençli bitki
olarak NewLeaf ismi ile piyasaya sürülmüştür. Aynı şirket, bu şekilde modifiye edilmiş olan mısır,
pamuk bitkisinin varyetelerinide ticari olarak piyasaya sürmüştür. Çoğu diğer biyoteknoloji şirketleri,
çoğu böceğe karşı dirençli Bt-transgenik bitkileri üretmektedirler (Schuler et al. 1998, de Maagd et al.
1999, Hilder-Boulter 1999, Llewellyn-Higgins 2002). Bunlardan bazıları ise oldukça başarılı olmuştur.
Örneğin, Tu et al. cry1Ab ekspres edebilen bir Bt ticari hibrid varyetesini yaban tiplere oranla %28
fazla ürün alarak Çin’de üretmiştir.
Son zamanlarda Bt-transgenik bitkilerin marketleri domine etmesine rağmen, insektisidal proteinler
için bir çok araştırma yapılmaktadır. Proteinlerin iki tipi özellikle çalışılmıştır: böcek bağırsağında
sindirici enzimleri inhibe edenler ve lektinler. Bu alternatif araştırmalar, bilinen Bt-toksinleriyle
etkilenmemiş olan böcekler üzerinde sürdürülmektedir. çoğunlukla özsuyu emen çekirgeler gibi
homopteran böcekler bu kategoriye girmektedirler, fakat Galanthus nivalis agglutinin (GNA) gibi
lektinlere duyarlı olduğu gösterilmiştir. Bu lektin patates (Shi et al. 1994, Gatehouse et al. 1996),
pirinç (Bano-Maqbool&Christou 1999), dometes ve tütün (Schuler et al. 1996) gibi çoğu bitkilerde
sentezlenmektedir.

399
[Metni yazın]

Abiyotik Streslere Karşı Bitkilerin Nasıl Korunduğu Kuraklık Dirençliliğine Güzel Bir
Örnektir
Zararlılar ve hastalıklardan sonra tercih edilmeyen çevre koşulları (abiotik stres) ürün
üretimindeki bir sonraki temel sınırlayıcılardır. Bu koşullardan en yaygın olanı kuraklıktır, ve
kuraklığa dirençli transgenik mahsüllerin geliştirilmesi besinlerin global üretimini %30 arttırabilir.
Çoğu bitkiler artan tuzluluğa ve kuraklığa karşı çok kolay çözülebilen ve küçük olan betainler,
şekerler, amino asidler ve poliaminler gibi moleküller ile cevap verirler. Bunlar ozmotik çözücüler
olarak isimlendirilirler ve bitkideki osmotik potansiyeli arttırırlar, bu yüzden uzun zamanlı olarak iyon
dengesinin ve kısa zamanlı olarakda su kaybını önlerler (Yancey et al. 1982). Ozmotik çözücüler
yüksek konsantrasyonlarda bile toksik etki yaratmazlar ve bu yüzden, bir strateji bu maddelerin bitkide
fazla şekilde birikmesini sağlamaktır (Chen&Murata 2002, Serrj&Sinclair 2002). Örneğin bazı türler,
yüksek seviyede betain ve glisin üretmesi için modifiye edilmiştir fakat, normal tuz stresi altındaki
bitkiden taze ağırlıktan 5-40 µmol/g daha az madde birikmesi sağlanabilmiştir (Sakamoto&Murata
2000,2001). Fakat, bu maddelerin metabolik yolunun anahtar enzimi olan BADH (betain aldehit
dehidrogenaz) transgenik pirinç bitkilerinde yaklaşık 5µmol/g birikim sağlanmıştır (Sakamoto et al.
1998). Çinde, BADH ekspres yapabilen transgenik pirinç bitkileri abiyotik strese karşı ticari satışa
sunulan ilk üründür ve küçük çaplıda olsa çiftçilere ve büyük üreticilere ulaşmıştır (Huang et al.
2002b). Ozmotik çözücüler kadar, bitkiler ayrıca tuz ve kuraklık stresine karşı dehidrinler olarak
isimlendirilen ozmo koruyucu proteinler de üretirler. Bu proteinleri fazla sentezi sonucu kuraklık
toleranslı ürünler üretmek için başka bir strateji ortaya çıkmaktadır. Xu et al. (1996) transgenik
pirinçte arpa HVA1 dehidrinini sentezletti, ve transgenik bitkiler tuz ve su yoksunluğu streslerine
dirençli oldukları gözlemlendi. Son çalışmalarda, buğday dehidrinleri kuruma toleransını arttırmak
için, transgenik pirinçlerde ekspres edildi (Cheng et al. 2001,2002).

Bitkiler Fakir Toprak Kalitesi İle Başa Çıkması İçin Modifiye Edilebilir
Dünya’nın ekilebilir topraklarının %65’i yüksek toksik metal iyonlarına (Marshner 1995)
sahip, sınırlı mineral ve aşırı pH içeren verimsiz topraklardan oluşmaktadır. % 40’ı ekilebilir olan
asitli topraklar düşük demir ve fosfor seviyesine sahiptir fakat yüksek aluminyum seviyesine de
sahiptir. Asidik bir çevrede, hem demir hemde alüminyum fosforu ya çözülebilir verimsiz
moleküllere ayırır veya çözünmez kılmaktadır. Alüminyum, kendi başına oldukça toksiktir, ana etkisi
ise kök gelişiminin inhibisyonudur. Ekilebilir toprakların %25’i alkali topraklardır. Alkali
topraklardaki ana problem, yüksek seviyedeki kalsiyum ve magnesyum iyonlarının fosforu çözünmez
yada az çözünebilir yapmasıdır. Kalsiyum bitkilerde ana sinyalizasyonda temel moleküldür ve bu
metal iyonunun yüksek seviyeleri normal bir bitkinin büyümesine ve metabolizmasına müdahale
etmektedir. Bu problemlerin aksine, çoğu bitki verimsiz topraklarda büyümeye adapte olmuştur ve
bazı tolerans çeşitlilikleri ise geleneksel bakımla ve mutasyonla oluşturulmaktadır. Bu toleranslı
bitkiler arasındaki en yaygın faktör kökteki okasalat, malat ve sitrat gibi organik asitlerin seviyesinin

400
[Metni yazın]

artmasıdır. Bu maddeler rizosferde bulunurlar ve birkaç koruma etkileri vardır (Lopez-Bucio et al.
2000b). Transgenik bitkilerin üretimi yüksek seviyede organik asitlerin dışarı salınması için modifiye
edilmiştir ve bu yüzden, verimsiz toprakların kullanımı arttırmak için etkileyici bir stratejidir. Bazı
türler, fakir toprakların toleransını uyarmak için baktariyel ve bitki sitrat sentaz geni ile modifiye
edilmişlerdir (de la Fuenete&Herrera-Estrella 1997, Koyoma et al. 2000, Lopez-Bucio 2000a). HPLC
ile yapılan kök eksratlarının analizleri, sitrat seviyesinin normalden 10 kat fazla olduğu ve daha
önemlisi kök salgılarındaki kaydedilen sitratın 4 kez daha fazla olduğu gösterilmiştir. Bu bitkiler,
normal bitkilerin büyümesini engellemek için gerekli olan konsantrasyondan 10 kat daha fazla
alüminyum seviyesi varlığında büyüdükleri ortaya konulmuştur, ve kök zararları yapan alüminyum
kanıtları bulunmamıştır. Transgenik bitkiler, ayrıca alkali topraklarda daha iyi büyürler. Normal
şekilde büyür, çiçek açar ve tohum verirlerken, kontrol bitkileri bunları gerçekleştirememiştir (Lopez-
Bucio et al. 2000a). Transgenik bitkilerin köklerindeki fitaz salınımı organik maddelerde
kilitlenmiştir, çünkü organik fosforun bir çoğu fitaz olarak mevcuttur (Hayes et al. 1999). Fitaz
salgılayan Arabidopsis’le yapılan başlangıç çalışmaları fitat besiyerinde kontrol gruplarından daha
iyidir. organik asidler ve fitaz sentezleyen mahsül bitkilerinin geliştirilmesi bu yüzden gelecek için
önemli bir amaçtır.

Bitki Biyoteknolojisindeki En Önemli Amaçlardan Biri Besin Ürünlerinin

Arttırılmasıdır
Tarım bitkilerinden elde edilen kullanılabilir besin miktarı müthiştir, ve yapılan çalışmalarda,
tarım yöntemlerini pratikleştirme ve geleneksel yetiştirme ile ürünlerin arttırılması için teşebbüslerde
bulunulmuştur. Genetik mühendisliği, ürünlerin kaybının azaltılmasının yanısıra bitkilerin asıl ürün
potansiyellerini yükselterek geniş çaplı stratejiler sağlamaktadır. Ürün geliştirilmesi yönünden,
fotosentez belkide genetik buluşlar için en açık hedeftir çünkü, karbon fiksasyonunun oranını ve bu
yüzden organik karbon havuzunun toplam boyutunı belirler. Fotosentetik aktiviteyi arttırmak için
geliştirilen stratejiler fitokromların ve anahtar fotosentetik enzimlerin modifikasyonudur. İşlem,
mahsül ürünlerinde fotorespirasyonla fikse olmuş karbonlarını kaybeden C3 bitkilerine enerji verimli
C4 bitkilerinin fotosentetik yollarının bileşenlerini koymaktır. C4 fotosentezindeki ana basamak,
mezofil hücrelerinde fosfoenolpirüvat karboksilaz (PEPC) enzimi ile CO2’nin C4 organik asitlerine
dönüşmesidir. PEPC kodlayan mısır geni bazı patates (Ishimaru et al. 1998), pirinç (Matsuoka et al.
1999) gibi C3 bitkilerine karbon fiksasyonunun seviyesini arttırmak için aktarılmıştır. NADP-malik
enzim (Ku et al. 2000) ve ortofosfat dikinaz (PPDK) ekspresleyen transgenik pirinç bitkileri ayrıca
üretilmiştir. Çin ve Kore’deki ilk saha çalışmalarında sırası ile PEPC ve PPDK transgenik bitkilerinde
%10-30 ve %30-35 ürün artışı tespit edilmiştir.
Toplam ürün miktarını arttırmak için yapılan metabolik çalışmalar karbohidrat gibi şekerlerin
depolanması ve fotosentez ürünlerinin ki içinde şekerinde bulunduğu maddelerin dönüşümü üzerinde
odaklanmıştır. Bazı dokularda karbon akışını arttırmak için doku kaynağında regülasyon ve enzim

401
[Metni yazın]

aktivitesinin manüplasyonlarını içeren stratejiler uygulanmıştır (Paul et al. 2001). Şekerin nişastaya
dönüşümünü arttıran transgenik yaklaşımlar ilk başta plastidiyal nişasta sentezi yolunun
manuplasyonuna odaklanmıştır. Örneğin, transgenik patateslerdeki plastidiyal adenilat kinazın
inhibisyonu adenilat seviyesinde önemli bir artış sağlamıştır ve tüber mahsüllerinde %40, nişasta
seviyesinde ise %60 bir seviye artışı gözlenmiştir (Regierer et al. 2002).
Diğer stratejiler ise, kaynakları elde edilebilir ürünlere çevirmek için bitki mimarisinin
modifikasyonlarıdır. Pirinçte, bir mutant arabidobsis GAI geninin fazla ekspres yapılmasıyla giberillin
metabolik yolunun manuplasyonu bir yarı-rozet dominant fenotipini uyarmak için yeterliydi.
Gelişimsel genler mısırda başakların sayısını arttırmak için ekspres edilirken (Cacharron et al. 1999)
diğer araştırmacılar her yıl hasatlanabilir ürün miktarını ve erken çiçeklenmeyi uyarmak için gün
ışığına veya mevsimsel olaylara karşı oluşan cevap yollarını modifiye etmişlerdir.

Konu 3: Hastalıkları Çalışma, Uzaklaştırma ve Tedavi Etmek İçin Genetik Modifikasyonların

Kullanımı

İnsan Hastalıklarının Modellenmesinde Transgenik Hayvanlar Kullanılabilir

Memeliler uzun yıllardır insan hastalıklarının modellenmesinde kullanılmışlardır, çünkü insanlardaki
klinik testler için öncü maddelerin geliştirilmesinde ve hastalıkların temel moleküler analizlerinin
detaylandırılmasında faydalanılmıştır. Transgenik hayvan teknolojisinin keşfinden önce, genetik
hastalıkların modellenmesi oldukça zordu. Bilim insanları, kendiliğinden meydana gelen mutasyonları,
uygun mutant hayvanlarını belirlerdi ve duyarlı hayvanları seçici üretim ile alırlardı. Gen
manuplasyon şimdilerde, spesifik hastalık modelleri yaratmak için geniş çaplı alternatifler
sunmaktadır (Smithies 1993, Bedell et al. 1997, Petters&Sommer 2000.
En erken yapılan transgenik hastalık modellerinin bazıları kanserin özel formları için buna yatkın
farelerde yapıldı çünkü, bu fareler dışarıdan onkogen kökenli germ hücreleri içermektedir (e.g. Sinn et
al. 1987). Bu baskın bir allelin neden olduğu işlev kazanma hastalığıdır ve basitçe bir yumurtanın
içine mikroenjeksiyonla normal genoma alelin eklenmesiyle modellenebilir. Bu yolla modellenmiş
başka bir işlev kazanma hastalığı Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) sendromudur ve bir mutant
olmuş baskın prion proteinin neden olduğu sinirsel dokuyu dejenere eden bir hastalıktır. Bu hastalıktan
muzdarip olan bir hastada, prion protein geninin 102. kodonunda bir mutasyon belirlenmiştir. Yaban
tip farelere ek olarak bu mutasyona sahip transgenik fareler oluşturulmuştur ve insanlarda oluşturduğu
hastalık gibi benzer bir nörodejeneratif patoloji gelişmesi gösterilmiştir (Hsiao et al. 1990). İşlev
kazanma hastalıklarının modellerine örnekler; amiloid öncü maddesinin fazla sentezlenmesi sonucu
oluşan Alzheimer hastalığı (Quon et al. 1991), ve üçlü tekrar spinocerebellar ataksiya tip 1
bozukluğudur (Burright et al. 1995). Basit transgen eklenmesi, Werner sendromunda (Wang et al.

402
[Metni yazın]

2000), prematür yaşlanma hastalığı için gösterilen baskın negatif allellerin neden olduğu hastalıkları
modellemede ayrıca kullanılmıştır.
Çekinik olarak aktarılan hastalıklar genellikle işlev kayıplarına sebep olurlar ve bunlar gen
knockout ile oluşturulur. Bu stratejinin ilk bildirileri, HRPT için bir genin bozulması ile oluşturulan,
HRPT eksikliği için oluşturulan model fareydi (Kuehn et al. 1987). Sistik fibrosis (CF) (Snouwaert et
al. 1992, Dorin et al. 1992), fragile-X sendromu (Dutch-Belgian Fragile X Consortium 1994), β-
talesemi (Skoe et at. 1983, Ciavatti et al. 1995) ve mitokondriyal kardiyomiyopati’nin (Li et al. 2000)
bulunduğu genlerin bir çoğu, bu şekilde modellenmiştir. Gen hedefleme, RB1 ve TP53 gibi tümör
baskılayıcı genlerin inaktivasyonu sonucu meydana gelen insan kanserlerinin modellenmesinde geniş
çaplı olarak kullanılmıştır (Ghebranious&Donehower 1998, Macleod&Jacks 1999).
Çalışmalar, insanlardaki tek gen bozukluklarının modellerini sağlarken, dikkatler çoklu genler
içeren daha karmaşık hastalıkların modellenmesine doğru kaymaktadır. Bu araştırmanın büyüleyici
alanıdır fakat, cesaretlendiren erken başarılarda vardır. Bazı durumlarda, farklı modifiye olmuş fare
suşlarının çaprazlanması, ilginç buluşlara neden olmaktadır. Örneğin, transkripsiyon faktörü Pax-
1’den yoksun dalgalı mutant fare ve yamalı mutant fare büyüme faktörü geninden köken alan
pulcukların hiçbir alleli için heterozigot değildirler. Bu iki suşun çiftleşmesiden elde edilen hibrid
döller insanlarda doğumdan sonra kalan spina bifida occulta hastalığı için model oldukları
gösterilmiştir (Helwig et al.1995). Başka bir durumda, bunun gibi yapılan çaprazlamalar yeni
terapilerin mümkün olduğunu göstermiştir. Örneğin, insan α-globinini fazla sentezleyen transgenik
fareler ve polimerizasyonu yürüten insan α-globin geninin bir mutant formu hücre anemisi için güzel
bir model sağlamaktadır (Trudel et al. 1991). Fakat, erginken insan fetal hemoglobin ekspres etmesi
için çaprazlanmış olan bu fareler, transgenik hibridlerde hastalık semptomlarının farkedilebilir
düşüşünü göstermiştir (Blouin et al. 2000). Benzer şekilde, yavaş retinal degredasyonu gösteren rds
mutantları ile Bcl-2 anti-apoptotik proteinini aşırı sentezleyen transgenik farelerin çaprazlanması ile
oluşan yeni hibridlerde bu degredasyonun çarpıcı şekilde azaldığı gözlenmiştir. Bu insan retinal
degredasyon sendromunu (Nir et al. 2000) tedavi etmek için gen terapisinde Bcl-2’nin kullanılabilir
olduğunu göstermiştir.
Bir çok geni içeren en karmaşık hastalıklar ve transgenik modelleri oluşturmak çok zordur. Fakat,
en sık rastlanan durum, çeşitli etkilerle majör genlerin bir kısmı ile minör genlerin büyük bir kısmı
azaltılabilir. Böylece, kromozom 21’in üç kopyasının varlığı ile ortaya çıkan down sendromunun fare
modellemesini yaratmak mümkündür. Eşdeğer fare 16. kromozomu için trizomi verimsiz bir modeldir
çünkü, iki kromozomda aynı genlerin tümünü içermezler. Fakat, down sendromu için kritik bir bölge
kromozom 21 duplikasyonlarıyla down hastalarının çalışılmasıyla belirlenmiştir. Bu temel bölgeyi
taşıyan YAC transgenik farelerin oluşturulması hastalığın kullanışlı bir modelini sağlamaktadır ve
hastalığa eşlik eden, öğrenilen kusurların önemli maddeleri olarak Dyrk1a (minik beyin) geninin

403
[Metni yazın]

dozunun artması belirlenmiştir. Down sendromunun hayvan modelleri gösterilmiştir (Kola&Hertzog

1998, Reeves et al. 2001).

Hastalıkları Tedavi Etmek, Uzaklaştırmak İçin Nükleik Asidlerin Kullanımı Gen

İlaçlarıdır
Hastalık modellemeleri model organizmalarda hastalıkları yaratmak için gen manuplasyonunu
kullanıyorken, gen ilaçları insanlardaki hastalıkları kalıcı olarak tedavi etmek yada iyileştirmek için
aynı teknolojinin kullanımını önermektedir. Gen ilaçları; geniş faaliyet alanına sahiptir ve hastalıklı
hücrelerin direkt ölümü için DNA aşılarını, ilaçlar olarak oligonükleotidlerin kullanımını ve gen
terapisi için gen transferinin kullanımını içermektedir. Gen transferi, hastalara yeniden aktarılabilen
kültüre edilmiş hücrelerde sürdürülebilir ve DNA in vivo olarak hastaya ya direkt olarak yada viral
vektörler aracılığı ile aktarılabilir. Ex vivo yaklaşım sadece kültüre edilemeyen hücrelerin oluşturduğu
kemik iliği dokuları gibi dokular için uygulanabilmektedir. Gen terapisi enfeksyonel hastalıklar kadar
hastanın kendisinde oluşan mutasyonlardan dolayı ortaya çıkan hastalıkların tedavisinde ve özellikle
geleneksel tedavi yöntemleri-tedavisi kalıtsal olarak riskli olan durumlarda kullanılabilir. Stratejiler
aşağıdaki gibidir (Şekil 26.12):

Şekil 26.12: Gen terapisi stratejilerinin genel görünümü

• Kayıp gen ürününün değiştirilmesi amacıyla DNA’nın eklendiği gen arttırma terapisi (GAT)
• Doğru mutant allelleri hedef alan genler
• Baskın rol oynayan hastalıkları tedavi etmek için antisense RNA ekpresyonu veya hücre içi
antikor gibi tekniklerin kullanıldığı gen inhibisyon terapisi
• Özel bölgenin hedeflenip çıkartılması.
Terapötik gen transferi etkin bir biçimde transgenik insan hücresi kolonileri oluşturur ve bu yüzden
sadece somatik hücreler bu hedef için kullanılmaktadır. Germ hücrelerinin kullanılması etik endişeler
404
[Metni yazın]

doğurmaktadır ve ilerleyen teknoloji ile germline transformasyon ve nüklear transferlere izin

verilebilir. Bu endişeler yakın zaman ortadan kalkacaktır (Johnson 1998). Kalıcı gen transferine bir
alternatif olarak, transient gen terapisidir. Bu olay, birçok seviyede gen ekspresyonunu bozan
oligonükleotidlerin kullanılması ile başarılmıştır fakat, hücrenin genetik matertalini kalıcı olarak
değiştirmez (Pollock&Gaken 1995).
Gen terapisi için teknikler ve araçlar herhangi bir hayvan hücresine gen transferi için
kullanılanlardan çokta farklı değildir. Transfeksiyon, direk aktarım veya transdüksiyon DNA’yı
hücrelere aktarmada kullanılabilmektedir. Viral vektörler in vivo gen transferinin verimliliğinden
dolayı oldukça popülerdirler. Fakat, ekstrem önlemler, rekombinasyonla oluşabilecek viral
enfeksiyonlardan ve potansiyel problemlerden arındırılmak için ve bu vektörlerin güvenliğini
onaylamak için gerekmektedir. Onkoretrovirüsler, lentivirüsler, adenovirüsler, adeno-ilgili virüsler,
herpes virüsler ve ana virüslerden farklı avantajlı elementler içeren rekombinant virüsler gen terapisi
için geliştirilmiştir. Viral vektörlerle ilgili riskler lipozomların, gen tabancalarının, plazmid
bombardmanlarının kullanımı ile desteklenmektedir. Bunlar viral vektörlerden genetik olarak daha
güvenli olmalarına rağmen, genellikle düşük verim göstermektedirler (Scheule&Cheng 1996,
Tseng&Huang 1998, Kay et al. 2001).

İmmun Sistemi Uyaran Ürünlerin Ekspresyon Yapıları DNA Aşılarıdır

İmmun sistem patojenler tarafından taşınan diğer büyük moleküllerin ve proteinlerin tanınmasına
karşı cevap olarak antikorları üretmektedir. Tipik aşılarla, aşının fonksiyonel maddeleri olan proteinler
immun sistemi uyarması için konağa aktarılmaktadır. DNA’nın hayvanlara aktarılması DNA
molekülüne karşı bir immun cevap oluşturmaz, fakat eğer bu DNA bir protein ekspres ederse, oluşan
protein immun sistemi uyarabilir (Reyes-Sandoval&Ertl 2001). DNA aşılamasının temeli de budur, ilk
defa Ulmer et al. (1993) keşfedilmiştir (Şekil 26.13). DNA aşıları genellikle, hücre tarafından tanınan
güçlü bir promotorun kontrolü altında uygun antijenleri kodlayan bir gen taşıyan bir bakteriyal
plasmidden oluşur. Bu methodun avantajları, basitliği, geniş çaplı kullanımı olması, büyük miktarda
aşı üretmenin oldukça kolay şekilde yapılabilmesidir. DNA partikül bobardmanı, lipozomlarla ve
enjeksiyonla aktarılabilir. Orijinal çalışmada, Ulmer ve arkadaşları influenza virüs nükleoproteininin
DNA’sını aktarmıştır ve influenza enfeksiyonuna karşı koruma sağlamışlardır. Bundan sonra bir çok
DNA aşısı hedef virüslere göre hazırlanmıştır. Bunlar arasında HIV (Wang et al. 1993, Fuller et al.
1996, Hinkula et al. 1997); Ebola virüs (Xu et al. 1998), diğer patojenler ve hatta farede insan hücresel
prion proteini vardır.

405
[Metni yazın]

Şekil 26.13: Geleneksel aşılama ile DNA aşılarının karşılaştırması

DNA aşılama yaklaşımları ek olarak bazı avantajlara sahiptir. Bunlar:

• Bazı bakteri DNA dizileri immun sistemi kendiliğinden uyarma kapasitesine sahiptir (Klinman
et al. 1997, Roman et al. 1997)ç
• İmmun sistemin işlevini kolaylaştıran proteinleri kodlayan diğer genler aşıyla aktarılabilir
(Kim et al. 1997).
• DNA aşılaması bir kronik enfeksiyon olarak zaten tanımlanmış olan hastalıkları tedavi etmek
için kullanılabilir (Mancini 1997).
• DNA aşılaması bir kronik enfeksiyon olarak zaten tanımlanmış olan hastalıkları tedavi etmek
için kullanılabilir (Mancini et al. 1996).
Prensipte, DNA aşılaması gen terapisiyle birlikte oldukça yaygındır, çünkü her ikiside benzer
methodlar kullanılarak DNA’nın insanlara transferini içermektedir. Fakat, gen terapisinin amacı,
baskın çalışan genlerin baskılanması veya kayıp genlerin değiştirilmesi ile hastalığı hafifletmek iken,
DNA aşılamasının amacı, immun sistemi uyaran bir antijenin ekpresyonun neden olduğu hastalığı
uzaklaştırmaktır.

Genoma Genin Fonksiyonel Bir Kopyasının Transferini Kapsayan Çekinik Hastalıklar

İçin Gen Çoğaltıcı Terapi
İlk insan genetik mühendislik deneyi gen terapisinden ziyade gen işaretlemeydi, ve bir genin
hastaya güvenli bir şekilde aktarılıp aktarılmadığını öğrenmek amacıyla geliştirilmiştir ve, hastadan
alınan hücrelerde gen kolayca tespit edilmiştir. Tümör- infiltre lenfositler (TNF gibi proteinler
salgılayarak doğal olarak kanserli hücreleri öldüren hücreler) ileri kanserli hastadan izole edilmiştir.
Hücreler, daha sonra neomisin direnç geni ile genetik olarak işaretlendi ve aynı hastaya geri aktarıldı
(Rosenberg et al. 1990). Terapötik gen transferi prosedürü kullanılan ilk klinik çalışma, ADA enzimi
eksikliğinde oluşan ve immun yoksunluğa sebeb olan hastalıktan muzdarip dört yaşındaki Ashanti
DeSilva isimli hastadır. Bu hastalık gen terapisi deneyleri için ideal kriterlerin çoğuna uygundur.
Hastalık yaşamı tehdit edicidir (bu yüzden tedavinin yan etkileri etik olarak kabul görmüştür), fakat
ilgili gen klonlanmış ve hastalığın temel biyokimyası anlaşılmıştır. ADA eksikliğinin geleneksel

406
[Metni yazın]

tedavisi uygun vericiden alınan kemik iliği naklini içermektedir. Temel olarak, gen terapisi için
kullanılan prosedür gibi aynıdır fakat, kemik iliği hücreleri hastanın kendisinden köken alır ve ex vivo
genetik olarak modifiye edilebilirler (Şekil 26.14). hastadan alınan lökosit ve mononüklear hücreler
izole edilirler. Bunlar T-lenfosit aktivasyonunu uyaran koşullar altında kültürde büyütülür ve
büyüyenler normal ADA geni taşıyan (neomisin dahil) retroviral bir taşıyıcı ile hastaya aktarılır. Bu
modifye hücrelerin infüzyonuna müteakip hem bu hasta hemde ikincisi in vivo ve in vitro
çalışmalarda tatmin edici klinik sonuçlar vermişlerdir (Anderson 1992). Fakat, bu hastalarda
rekombinant ADA üretimi geçicidir, bu yüzden rekombinant T-lenfositlerin düzenli infüzyonu devam
etmelidir. Araştırmalar, doğru hücrelerin kalıcı desteğini sağlayabilen kemik iliği kök hücrelerinin
transformasyonu için prosedürler üzerinde devam etmektedir.

Şekil 26.14: ADA eksikliğinin tedavisini temel alan ex vivo gen terapisinin prosedürü

Çekinik tek gen hastalıklarının küçük bir kısmı için gen arttırma terapisi şuan klinik
çalışmaları devam etmektedir. Sistik Fibrosis bir örnek olarak düşünülebilmektedir (Davies et al.
2001). CF pankreası, akciğeri ve karaciğeri etkileyen bir hastalıktır. Hastalık cAMP bağımlı klor
membran kanallarının kaybı sonucu ortaya çıkmaktadır. Bu solunumun durmasına sebeb olan mukus
birikmesine ve elektrolit dengesizliği ile sonuçlanmaktadır. CF genin fonksiyonel bir kopyasının
aktarılmasıyla doğrulanan fonksiyon kaybına sebeb olan çekinik bir hastalıktır. Gerçekten, CF
hastalarından izole edilen epitel hücreleri klonlanmış sistik fibrosis transmembran düzenleyicisinin
cDNA’sının aktarılmasıyla normale döndürülmüştür. ADA eksikliğinin aksine, CF tarafından
etkilenmiş hücreler kültüre edilemezler ve hastaya yeniden aktarılamazlar. Bu yüzden in vivo
seçenekler kabul edilmiştir. Etkilenmiş hücrelere CFTR cDNA’sının aktarılması hedefi solunum
sistemindeki epitel hücrelere doğal olarak afinitesi olan adenoviral vektörler kullanılarak başarılmıştır.
CFTR cDNA’sı taşıyan rekombinant virüsler solunum yoluyla hastaya aktarılmıştır (Zabner et al.
1993, Hay et al. 1995, Knowles et al. 1995). CFTR cDNA’sı lipozom kullanılarak da aktarılmıştır

407
[Metni yazın]

(Caplen et al. 1995). Fakat ne nasal epitel dokuda nede CF semptomlarının azalmasında bir kayda
değer başarı gözlenmemiştir.

Kanser İçin Gen Terapi Yöntemleri Kanser Hücrelerinin Öldürülmesini Hedefleyebilir

Yada Aşırı Aktif Genin Baskılanmasını İçerebilir
Kanser gen terapisi başlangıçta erken gen işaretleme deneylerinin bir uzantısıdır. Tümör
infiltre lökositler TNF salgılayan hücrelerin sayısı arttırılarak tümörleri öldürmek amacıyla TNF ye ek
olarak neomisin direnç geni ile transforme edilmişlerdir.TNF vücut ağırlığına göre 10 µg/kg gibi çok
düşük seviyede toksik olmasına rağmen, TNF salgılanan organlarda ve vücutta herhangi bir yan etki
görülmemiştir (Hwu et al. 1993). Alternatif başka bir yöntem ise tümör hücrelerinin kendisinin
transform edilmeleridir. Yabancı bir antijen yada sitokin ekpresyonu ile immun sisteme karşı şüpheli
yapılabilmektedir. Diğeri ise, fibroblastları transform etmektir. Hem kültürde büyütmek kolaydır
hemde geri aktarıldığı zaman tümöre karşı immün sistemi uyarmaktadır. Bu yardımlı öldürmelerin bir
çoğu klinik testlere tabi tutulmuşlardır (Ockert et al. 1999).
Kansere sebep olan gene direk olarak müdahale mümkündür. Baskın olarak çalışan genler
(onkogenler) antisense teknolojisi kullanılarak hedeflenebilmektedir. Antisense oligonükleotidler ile
kanser gen terapisinin ilk çalışmaları kronik miyeloid lösemi için Szczylik et al. (1991) tarafından
yapılmıştır. Bilim insanları bu özel kansere sebep olan kromozomal translokasyonla oluşturulan BCR-
ABL gen birleşmesi için 2 18-mer spesifik kullandı, ve hastadan alınan hücrelerde koloni oluşumunun
baskılandığı belirlendi. Kanserler, etkilenmiş hücreye uygun genin işlevsel kopyaları aktarılmasını
gösteren tümör baskılayıcı genin işlevini kaybetmesiyle oluşurlar. İleri bir strateji, kanser hücrelerinde
toksik olmayan durumdan toksik olan öncü maddeye dönüştüren özel enzimlerin aktivasyonunu içeren
prodrug aktivasyon terapisidir. Kanser hücrelerinde seçici intihar genleri olarak aktarılan genlerin
ekpresyonunun sürmesiyle başarılmıştır. Prodrug gansiklovir ile birleşmiş olan HSV timdin kinaz geni
bir örnektir. Timidin kinaz gansikloviri DNA ile birleşip DNA polimerazı inhibe ederek replikasyonu
bloklayan nükleotid analoglarına çevirmektedir. Kanser hücrelerinde özellikle enzimin aktivasyonu
onkoretrovirüslerin kullanımı ile bölünen hücrelerin tercihli aktarımı ile başarılmıştır (Moolten 1986,
Culver et al. 1992, Klatzmann et al. 1996). Diğer bir yöntem ise sadece kanser hücrelerinde aktif olan
transkripsiyonel düzenleyici elementlerin kullanılmasıdır (Harris et al. 1994, Su et al. 1996).

408
[Metni yazın]

26. QUESTIONS AND ANSWERS

1. What is strictosidine? Why so important?
Strictosidine is a universal precursor of all terpene alkoloids. And it is also important
because, when scientists produce vinblastin and vincristine, they required biosynthesis of
strictosidine. After biosynthesis of strictosidine, it can be modified by adding some radical
groups such as metyl etc.
2. What are the basic components of vitamin E? And what is the difference between
these components?
Vitamin E consist of α-, β-, γ-, δ-tocopherol and α-, β-, γ-, δ-tocotrienol. Their differences
are methyl groups. For example, for α derivatives; first, third and fourth carbon of
chroman ring are methylated. For γ derivatives; third and fourth carbons are methylated.
For δ derivatives; only fourth carbon is methylated.
3. What are the requirements of tocopherol biosynthesis?
Tocopherol biosynthesis requires the input from two metabolic pathways. The shikimate
pathway generates homogentisic asid, which forms the aromatic rings and MEP pathway
which generates phptydiphosphate forms side chains.
4. What does herbiside means? What are the disadvantages as compared other
strategies?
Herbisides are toxic chemicals which are used to kill weeds, and generally affect
processes that are unique to plants. Their disadvantages are more than biological
strategies. For example, when herbisides used for a weed, it affect both weed and crops
because, these plants share same pathways. Another reason for their disadvantages are
accummulation of chemical substances on enviroment which are so harmfull for all
animals.
5. What are the strategies to generate herbiside resistant plants? Give an example for
each strategy.
There are two strategies to generate herbisite resistant plants. First strategy is target
molecule in the cell either is rendereed insensitive or is overproduced. For example, in
petunia hybrida, we can introduce EPSP enzyme which is inhibited by presence of
glyphosate. When the gene which encodes EPSP enzyme, CaMV promotor is used for
controlling this gene by overproducing. As a result, if this gene is overproduced, the plant
that is engineered for glyphosate resistant can be protected. Second one is, a pathway that
degrades or detoxifilies the herbisite is introduced into the plant. For example, we can
introduce the bar gene to provide PPT resistant. The bar gene encodes acetylase which
inactivates PPT.

6. What are the Bt toxins? What are their functions in insect resistant?
Bt toxins consist of protoxins called crystal proteins that are 130 kDa. These crystal
proteins are produced by Basillus thuringiensis during sporulation. These proteins are
potent and highly spesific insectisides. The specificity reflects interactions between the
crystal proteins and receptors in the insect midgut. Their functions are so important for
avoiding insect from the plants. In susceptable species, ingested crystals dissolve in the

409
[Metni yazın]

alkaline conditions of the gut and the protoxins are activated by gut proteases. The active
toxins bind to receptors on midgut epithelial cells, become inserted into the plasma
membrane, and form pores that lead to cell death. So when the gene that encodes Bt toxins
inserted any targeted plant, it would be insect resistant by overexpressing these toxins.
7. What are the strategies to provide resistant plants against abiotic stresses?
Many plant respond to drought and increased salinity by synthesizing small, very soluble
molecules such as betaines, sugars, amino asids, and polyamines. These molecules are
termed compatible solutes. These molecules stabilize plant’s osmotic pressure. If some
genes that encodes these soluble molecules introduce into plants to provide resistant
against abiotic stress. First strategy is to maintain accummulation of these molecules in
plants. Another is; overexpressing compatible solutes to response drought and salinity
stress.
8. What are the strategies of gene therapy? Explain each one shortly. Please define your
concerns about gene therapy.
Strategies are:
• Gene augmentation therapy (GAT), where DNA is added to the genome with the
aim of replacing a missing gene product;
• Gene targeting to correct mutant alleles;
• Gene inhibition therapy using techniques such as antisense RNA expression or the
expression of inracelluler antibodies to treat dominantly acting diseases;
• The targeted ablation of specific cells
First of all; gene therapy is used for clinical treatments. But in these experiments, only
somatic cells are used because somatic cells are not transferred to next offsprings. But if
the germ-line cells are used for his treatment, these cells can transfer to next generation.
Because of this, mutations are occurred reluctantly. But in the future, these cells will be
used for his aim via new technologic developments.

9. What does DNA vaccine mean? And what are the advantages of them?
The introduction of DNA into animals does not generate an immune response against the
DNA molecule, but, if that DNA is expressed to yield a protein, that protein can stimulate
the immune system. So if these DNA is transferred by using liposome or viral vectors,
proteins will be produced which stimulate the immus system to generate antibodies. This
case is termed DNA vaccine.
• Certain bacterial DNA sequences have the innate ability to stimulate the immune
system.
• Other genes encoding proteins influencing the function of the immune response
can be co-introduced along with the vaccine.
• DNA vaccination can be used to treat diseases that are already established as a
chronic infection.
10. What does ex vivo- in vivo gene therapy mean? Give an example for each one.
Ex vivo gene therapy: target cells isolated from the patient and is grown in culture under
conditions that stimulated some features of the cells and the transduced with a retroviral
410
[Metni yazın]

vector a normal gene. This technique first is used for Ashanti DeSilva who suffers from
ADA deficiency, resulting from the absence of the enzyme adenosine deaminase (ADA).
In vivo gene therapy: isolating cells are not used in this technique. Viral vectors,
liposomes and biolistic gene guns are used for transfering DNA to patient. This prosedure
first is used for Cystic Fibrosis. CF patients restored to normal by transfecting them with
th cloned cystic fibrosis trasmembrane regulator (CFTR) cDNA.

411
[Metni yazın]

26. QUESTIONS AND CEVAPLAR

26. Bölüm
Topic:Recombinant therapeutic proteins are produced commercially in bacteria, yeast, and
mammalian cells

Soru: Rekombinant teropatik proteinlerinin üretiminde kullanılan maya, bakteri ve memeli

hücrelerin avantaj ve dezavantajlarına kısaca değininiz.

Bakterilerinin üretimi kolay ve ucuzudur fakat üretilen proteinler basit, katlanmamış ve

glikolizlenmemiştirler. Maya hücrelerininde üretimi bakteri hücreleri gibi ucuz ve kolaydır ama
ökaryot olduklarından daha kompleks, katlanmış proteinler üretebilirler ve glikolizasyon işlemi
vardır. Fakat üretilen proteinlerin miktarları ve plasmid stabilitesi düşüktür. Memeli hücrelerinin
saklanması ve üretimi maliyetlidir ama bunun karşılığında insan proteinlerini doğru şekilde
glikolizlerler.

Topic:Transgenic animals and plans can also be used as bioreactors to produce recombinant
proteins

Soru: Transgenic canlıların bioreaktör olarak kullanımını örneklerle açıklayınız

Transgenik fareden insan büyüme hormonunun üretilmesi rekombinant proteinlerin üretilebileceğinin

ilk kanıtıydı. Daha sonra bilimadamları rekombinant proteinlerin farenin sütünde de salgılandığını
keşfettiler. Proteinler yüksek konsantrasyonda sütte salgılanıyordu fakat sütün miktarı azdı. Bundan
ötürü koyun, keçi, inek gibi süt verimi daha yüksek olan hayvanlar biyoreaktör olarak kullanılmaya
çalışıldı. Bu hayvanlar sadece yüksek miktarda süt üretmekle kalmıyor, regülasyon açısından da sütleri
daha kabul edilir oluyordu. Araştırmacılar 30g/l oranında insan a1-antitripsin’i sütte üretmeyi
başardılar. Yapay olarak döllenen yumurtalara b-lactoglobulin promotoru altında AAT genini
mikroenjeksiyonla aktarıldı. Taşıyıcı annenin 112 yavrusundan 4 ünde istenilen genin kopyalarına
rastlandı. Süt verme döneminde bu canlılar 250- 800 litre süt üretebildiklerinden, üretilen protein
miktarı çok iyiydi. Aynı teknik ile insan tPA geni keçi sütünde üretildi. 29 dölden 1 erkek ve 1 dişinin
transgenik yapıda olduğu keşfedildi. Transgenik dişi 2 kere dogurdu ve 5 yavrusunun transgenik
olduğu tespit edildi. Dişinin sütünün litresinden birkaç mg Tpa elde edildi. Ama geliştirilen
ekspresyon yapısı bu miktarının artmasını sağladı.

Topic:Metabolic Engineering allows the directed production of small molecules in bacteria

Soru: Fenilalanin üretimi örneğiye bakterilere istenilen metobolitlerin nasıl ürettirildiğini

anlatınız.

Yapay tatlandırıcı üretiminde en fazla kullanılan kimyasal fenilalanindir. Bu madde kimyasal olarak
sentezlenebilir ama çok pahalıya mal olmaktadır. 1980’lerde geleneksel ıslah yöntemleri kullanarak
fazla fenilalanin üreten suşlar belirlenip iyileştirildi. Aynı dönemde farklı araştırmacılar bir suş
geliştirdiler. Suşu geliştirmek için Krosismatın fenilalanine dönüşmesini engelliyen biyokimyasal
yolun engellemeyi başardılar. Bunu, fenilalanin analoğuna dirençli suşlar seçilerek başardılarr. 2.
aşamada gerek duyulmayan proteinlerin (tirozin ve triptofan) sentezini englellediler. Bunun için

412
[Metni yazın]

oksostrof hale getirilirler. Stabil oksostrof bireyler ilgili genin tamamının yada bir kısmının
silinmesiyle elde edildi. Bu sayede fenilalanin üretimi için kullanılabilecek daha fazla serbest karbon
atomu ortaya çıkmış olur.

Topic:Metabolic engineering can also be achieved in plants and plant cells to produce diverse
chemical structures (550)

Soru: Bitkilerce üretilen ikincil metobolitler hakkında bilgi veriniz.

Bitkilerce üretilen çoğu ürün ikincil metabolittir ve sentezlenen maddeler hücreye gerekli olan
maddeler değildir. Bu maddeler daha kompleks yapıda ve ekstra fonksiyonu olan maddelerdir. Mesela
pestisistlere ve pathojenlere direnç örnek olarak verilebilir. Çoğu durumda ikincil metobolitler ilaç
sanayinde kullanılır. Bunlardan en iyi bilinen örnekler kokain, morfin ve nikotindir.

Topic:Production of vinblastine and vincristine in Catharanthus cell cultures in a challenge

because of the many steps and control points in the pathway. (551)

Soru:Vinblastin ve vinkristinin hücre kültüründe üretilmesi neden zordur?

Bahsi geçen kimyasallar kansere karşı kullanılabilcek potansiyel ilaç hammaddeleridir. Bu maddeler
sadece madagaskardaki bir bitki tarafından üretilmektedir. Üretim miktarı çok düşüktür, 1 hektarlık
alandan sadece 1 -2 gram civarında ürün elde edilmektedir ve bununda ticari değeri yaklaşık 1 milyon
dolar kadardır. Bu ve benzeri ilaçları bitki kültür hücresi içeren fermantörde üretmek daha uygun
olacaktır. Bu yöntem bazı bileşenlerin üretimi için başarılmıştır (Paslitaksel ve şikonin). Ama hücre
kültürleri genellikle ana bitklinin üretebildiği downstream ürünleri üretememekjtedir. Bunada örnek
vinblastin ve vinkristindir. Bunlarla birlikte morfin, kodein içinde durum aynıdır. Bunun sebeplerinden
biri ikincil metabolitlerin kompleksliğidir. Bütün üretim işlemi tek bir hücrede gerçekleşmemekte,
birden fazla farklı hücre işlemde görev almaktadır.

Topic:The productşon of vitamin A in cereals in an example of extending an endogenous

metabolic pathway (552)

Soru: Beta karotenin bitkilerce sentezi nasıl yaptırılır?

Bitkilerde Beta karoten sentezi 2 geranil geranil difosfat molekülünün fitona dönüşmesiyle başlar.
Fitonun beta karotene dönüşmesi için 3 enzimatik basamak gerekmektedir. Bahsedilen bu 3
basamağın hiçbiri tahılların endosperminde yoktur. Yanı tahıllar geranilgeranil difosfatı bünyesinde
barındırır ama bundan beta karoten üretemez. Mısırda olmayan 4 enzimatik yol; fitone sentaz, fiton
denatüraz, karoten denatüraz ve lizofin beta siklazdır. Konuyla ilgili ilk gelişlim prinçte fiton
birikiminin sağlanmasıytla başlamıştır. Pirince aktarılan nergiz çiçeğinin fiton sentetaz geni fiton ara
ürünün üretilmesini sağlamıştır. İlerleyen aşamada fiton sentetaz ve lizofin beta siklazı ifade eden
genler pirince aktarılmıştır daha sonra r. uredovora adındaki bakteriden alınan crtI geni de
aktalışmıştır (fiton desatüraz ve karoten desatüraz ı kodlayan gen). Nergiz çiçeğinin genleri pirinç
endospermine özgü olan glutelin-1 promotoru altında ekspreslenmeye başlamıştır. Bakteriden alınan

413
[Metni yazın]

gen ise CaMV 25s promotoru altında ekspreslenmektedir. İşlemler sonucunda gramda 2 mikrograma
kadar beta karoten üretebilen pirinç elde edilmiştir.

Topic:Herbicide resistance is the most widespread trait in commercial transgenic plants(556)

Soru Herbisitlere dirençli bitkiler kaç yolla elde edilir açıklayınız.

İki yolla elde edilebilmektedir. İlkinde hücredeki hedef molekül hassaslaştırılır yada aşırı miktarda
ürettirilir. Diğerinde ise bitkiye verilen herbisisit indirgenir yada detoksifiye edilir.

İlk Olarak: Glifosfat 5-enol-piruvilşikimeyt-3-fosfatı (EPSP) engelleyen seçici olmayan bir

herbisisttir. EPSP enzimi baklteri ve bitkilerde aromatik amino asit üretiminde rol oynar.
Glikofosfata dirençli Petunia hybrida hücreleri EPSP ‘leri aşırı miktarda üreten örnekler aranarak
bulunmuştur. Enzimi kodlayan gen daha sonra izole edilmiş ve petunya bitkkisinin CaMV
promotorunun altına aktarılmıştır. Transgenik bitki kloroplastlarında yüksek miktarda EPSP sentezine
başlamştır ve glifosfata karşı daha dirençli hale gelmiştir.

İkinci olarak: Phosphinothricin (PPT) glutamin sentezinin bitki ve bakterilerde sentezini

engelleyicidir. Streptomyces hygroscopicus’ un ürettiği Bialophus PPT ve 2 alenin rezidüsünden
oluşur. Peptidaz tarafından bu rezidüler uzaklaştırılınca PPT’ler serbest hale gelir. Kendi büyümesini
engellememesi için bu canlılar aynı zamanda Pat adında bir enzim daha üretir ve bu enzim PPT’yi
asetilleyerek aktivitesini engeller. Asetilazı kodlayan bar geni çeşitli bitkilere aktarılımıştır ve bu
bitkiler ticari PPTlere karşı dirençli hale gelmiştir.

Virus-resistant crops can be produced by expressing viral or non-viral transgenes (558)

Soru Virüslere direçnli bitkilerin üretimini açıkklayınız

Virüsler tarım ürünlerine her yıl ciddi zararlar vermektedir. Çapraz koruma denilen bir yöntemle
bitkiye bir virüs verilerek diğer bir virüse karşı direnç sağlanmaktadır. Çapraz korumanın
mekanizması tam olarak bilinmemekte fakat viral kılıf proteinlerden kaynaklandığoına
inanılmaktadır. Araştırmacılar TMV virüsünün kılıf proteinini üreten transgenik bir bitki üretmeyi
başarmışlardır ve virüsten kaynaklı hastalık belirtileri ciddi miktarda azalmıştır. Yapılan bu
gözlemden sonra kılıf protein ekspresyonu bir çok bitkiye aktarılmıştır. TMV ye karşı direnç
geliştirilmesinde , kılıf proteileri epidermis ve dolaşım sisteminde expreslenmelidir çünkü sistematik
olarak virüs buralara yayılır.

414