2.1.1. Phân lập A.

oryzae từ mốc giống thương phẩm

 Mục đích:
Tiến hành phân lập Aspergillus oryzae từ mốc thương mại, tạo điều kiện thuận lợi cho
quá trình quan sát đặc điểm đại thể và vi thể của sợi nấm, giải trình tự gen, định danh và
các nghiên cứu tiếp theo;
Khuẩn lạc mã hóa theo
màu

A D

A D
B C Đĩa petri chứa
A D quần thể nấm
B C mốc
A D
B C

B
Cấy chuyềnC

Cấy chuyền

Cấy chuyền

Cấy chuyền

A B C D

A A C D

A B C D
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập D
A A C
 Cách tiến hành
Chuẩn bị môi trường: Cân 6.24g (39g/1000ml nước) PDA thương phẩm thích hợp để pha
loãng 160ml dung dịch PDA trong bình tam giác. Làm nút bông cho bình tam giác. Dùng
lò vi sóng làm tan môi trường trong bình tam giác. Hấp tiệt trùng ở 121 0C trong 15 phút.
Môi trường sau khi đã hấp xong để nguội tới 40-50 0C. Tiến hành đổ môi trường vào đĩa
petri sạch đã hấp khử trùng (lượng dùng 10 ml dung dịch môi trường thạch malt cho mỗi
đĩa). Chờ môi trường đông chiếu tia UV.
Dùng kẹp đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn. Lấy ngẫu nhiên từ 3-5 hạt chế phẩm
mốc thương mại đặt vào đĩa petri có chứa môi trường PDA đã chuẩn bị trước. Đặt đều
các hạt trong đĩa, ấn nhẹ hạt để hạt không di chuyển di chuyển trên bề mặt thạch. Tiến
hành bao gói và ủ nhiệt độ 300C [5].
Que cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, làm nguội bằng cách nhúng đầu que cấy
vào thạch để làm nguội. Từ những khuẩn lạc thật rời rẽ trên đĩa đếm khuẩn lạc (bằng
phương pháp đặt trực tiếp), dùng que cấy lấy một ít bào tử hoặc một búi nhỏ của hệ sợi
nấm. Sau đó đặt que cấy cấy 1 chấm lên đĩa thạch. Ủ đĩa thạch 5-7 ngày. Khi đã có khuẩn
lạc thuần, cấy chuyền sang môi trường thích hợp trên ống thạch nghiêng để giữ giống.
Đánh giá độ thuần bằng cách so sánh bề mặt khuẩn lạc mới mọc sau khi ủ [5].Bảo quản
ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 4 oC.
2.1.2. Định danh mốc

Mốc thuần nghi ngờ

Aspergillus oryzae

Định danh sơ bộ (Phương

pháp truyền thống)

Phương pháp đại thể Phương pháp vi thể

Định danh khẳng định (Phương

pháp PCR và giải trình tự)

Aspergillus
oryzae thuần
chủng
 Mục đích: Định danh chủng nấm mốc nghi ngờ Aspergillus oryzae phân lập được.

 Cách tiến hành: Sau khi đã có được khuẩn lạc thuần, tiến hành định danh sơ bộ bằng
phương pháp truyền thống bao gồm phương pháp đại thể trên môi trường PDA và
phương pháp vi thể quan sát trên kính kiển vi để kết luận sơ bộ nấm mốc nghi ngờ đựa
vào các đặc điểm vi thể, đại thể. Sau đó tiến hành định danh khẳng định lại mẫu mốc
nghi ngờ đó bằng phương pháp PCR và giải trình tự.
Nấm mốc Aspergillus oryzae nghi ngờ được nuôi cấy trên môi trường PDA, ủ ở 30 oC
trong vòng 7 ngày để tiến hành định danh.
 Định danh bằng phương pháp truyền thống:
Định danh bằng phương pháp đại thể nuôi trên môi trường PDA:
Sau khi có khuẩn lạc thuần, tiến hành cấy nấm và quan sát đặc điểm đại thể trên môi
trường PDA.
Dùng que cấy được khử trùng qua lửa, lấy một ít bào tử hoặc búi nhỏ của hệ nấm sợi cấy
1 chấm lên đĩa thạch. Ủ ở nhiệt độ 300C trong vòng 3-5 ngày.
Đặc điểm đại thể cần quan sát:
Hình dạng: thường là tròn hoặc gần tròn.
Kích thước: đường kính, chiều dày.
Dạng mặt: mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm, …
Màu sắc mặt trên
Màu sắc mặt dưới
Dạng mép khuẩn lạc; mỏng dày, phẳng hay nhăn nheo, …
Giọt tiết (exudat) nếu có (nhiều hay ít, màu sắc) [5].
Định danh bằng phương pháp vi thể: quan sát đặc điểm vi thể trên kính hiển vi:
Trong một đĩa petri sạch trống, để 1 lame vô trùng, cắt một miếng môi trường thạch hình
vuông từ đĩa petri có môi trường vô trùng cạnh 2-8 mm, dày sấp sĩ 1,5-2 mm. Đặt miếng
thạch vừa cắt vào lame trong đĩa petri. Lấy que cấy móc chấm vào khuẩn lạc nấm và cấy
vào mỗi góc của miếng thạch một chấm, đặt lên miếng thạch là một lammen sạch. Đậy
nắp nuôi 1-3 ngày khi thấy từ vết cắt của mỗi cạnh có phát sinh sợi nấm và bào tử thì đặt
lên kính hiển vi quan sát ở mặt kính 40X và 100X[5].
Các đặc điểm vi thể cầm quan sát:
Bào tử: typ phát sinh bào tử, hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt (nhẵn, có gai, gồ
ghề) cách sắp xếp (đơn độc, chuỗi gốc non (basipetal), chuỗi gốc già (acropetal), khối
hình cầu, …)
Nang bào tử và nang bào tử nhỏ (nếu có): hình dạng, kích thước màu sắc, bề mặt của
nang, cuống nang, không hoặc có nhành, …
Bộ máy mang bào tử trần (conidiophore): kích thước, bề mặt (nhẵn, có gai, có nốt sần,
…) màu sắc, có vách ngang hoặc không, có hoặc không có cấu trúc đặc biệt như tế bào
chân, sợi cứng (setae) tăng trưởng ở gốc hoặc ở ngọn. Có hoặc không dạng hình thái đặc
biệt như bó giá, đệm giá.
Các nhánh của giá bào từ trần: số lượng nhành, kích thước, bề mặt, màu sắc, các sắp xếp.
Tế bào sinh bào tử trần: typ tế bào sinh bào tử trần, hình dạng, kích thước, vị trí trên sợi
nấm.
Sợi nấm: có hoặc không có vách ngang, đường kính, màu sắc, bề mặt (nhẵn, có gai, có
nốt sần,…) có hoặc không các dạng hình thái đặc biệt như bó sợi, hạch nấm, đệm nấm[5].
 Nấu dịch malt: Chuẩn bị môi trường: cân 100g malt thêm 500g nước cất một lần
ở 52 ᵒC (tỷ lệ 1 malt : 5 nước), cho cốc chưa hỗn hợp trên vào bể ổn nhiệt 52ᵒC khuấy
trộn đều trong 30 phút. Sau đó nâng nhiệt độ lên 57ᵒC, duy trì ở nhiệt độ này 15 phút.
Tiếp tục nâng nhiệt lên 65ᵒC và giữ trong 60 phút rồi nâng nhiệt lên đến 75ᵒC để quá
trình đường hóa diễn ra cho đến khi kết thúc, nhận biết quá trình đường hóa kết thúc bằng
cách thử với dung dịch Iod. Nếu dung dịch Iod có màu xanh, tiếp tục quá trình đường
hóa đến khi thử dung dịch Iod mất màu thì tiến hành lọc dịch malt. Lọc dịch malt bằng
vải lọc để được nước trong. Sau khi lọc điều chỉnh độ Brix của dịch lọc về 7ᵒBrix bằng
nước cất. Cân khối lượng dịch sau chỉnh Brix và thêm 2.5% bột agar khuấy đều 5 phút để
đảm bảo agar không bị vón cục. Điều chỉnh hoạt độ nước bằng phương pháp sử dụng
glycerol điều chỉnh độ ẩm môi trường được các độ ẩm khác nhau.
Đun sôi dịch malt trong lò vi sóng đến khi tan hết agar. Rót dịch vào bình tam giác. Làm
nút bông cho bình tam giác. Hấp tiệt trùng ở 121ᵒC trong 15 phút. Môi trường sau khi đã
hấp xong để nguội tới 40-50ᵒC. Tiến hành đổ môi trường vào đĩa petri sạch đã hấp khử
trùng và sấy khô (lượng dùng 10 ml dung dịch môi trường thạch malt cho mỗi đĩa). Chờ
môi trường đông chiếu tia UV bao màng PE, ủ đĩa ở nhiệt độ thường sau 24 giờ kiểm tra
lại đĩa để đảm bảo môi trường nuôi cấy không bị nhiễm các loại nấm mốc khác.
 Sấy mốc
 Cách tiến hành:
- Vo loại tạp chất
Mục đích: Làm sạch bụi bẩn và tạp chất có trong nếp
Cách tiến hành: Cân khối lượng nế cần nuôi bằng cân điẹn tử rồi vo bằng nước sạch 3  4
lần.
- Ngâm
Mục đích: Làm mềm nguyên liệu, giúp tiết kiệm thời gian và năng lượng khi hấp.
Ngâm hạt còn nhằm mục đích làm hạt đậu hút nước và trương lên, tạo độ ẩm thích hợp
cho vi sinh vật và các phản ứng sinh hóa hoạt động. Trong quá trình ngâm, chất khô sẽ
hòa tan ra ngoài môi trường nước ngâm, dẫn đến hàm lượng chất khô và một số chất
khoáng bị mất. Khi đó các phân tử nước có tính lưỡng cực sẽ tác động lên các nhân tố
protein, lipid, glucid và cellulose [26]. Đồng thời tạo điều kiện cho quá trình nấu nhanh
hơn, tiết kiệm nhiên liệu. Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình ngâm: thời gian
ngâm, nhiệt độ ngâm, lượng nước ngâm [14, 16].
Cách tiến hành: Nếp sau khi vo cho vào thau sạch ngâm trong 12h. Lưu ý mực nước
trong thau gâm phải ngập mặt nếp.
- Hấp
Mục đích: Nhằm làm chín nguyên liệu, tiêu diệt triệt để các vi sinh vật có thể gây tạp
nhiễm trong quá trình lên mốc, làm thay đổi các đặc tính lý hoá của nguyên liệu giúp mốc
phát triển tốt hơn, giúp enzyme thuỷ phân dễ dàng hơn trong quá trình lên mốc.

Cách tiến hành: cho nếp sau khi ngâm vào xửng hấp hấp đến khi hạt nếp nở, chín
đều,không bị nhão.

- Làm tơi, để nguội, trãi rỗ

Mục đích: Làm tơi giúp cho quá trình làm nguội xảy ra nhanh hơn, đồng thời thuận lợi
cho quá trình trộn nguyên liệu với mốc. Làm nguội nhằm hạ nhiệt độ của khối nguyên
liệu sau khi hấp đến nhiệt độ thích hợp của nấm mốc, tránh làm ảnh hưởng đến các đặc
tính của nấm mốc do nhiệt độ cao. Trãi mốc đều trên rỗ nhằm giúp công đoạn cấy mốc
được đều hơn và quá trình nuôi mốc được thuận lợi hơn.
Cách tiến hành: Sau khi hấp trãi mốc ra rỗ đã được xịt cồn sạch.
- Cấy bào tử
Mục đích: Cấy đều mốc vào môi trường nếp, giúp mốc phân bố đều trong môi trường
nuôi cấy, tạo điều kiện cho quá trình lên mốc xảy ra đồng đều.
Cách tiến hành: Sau khi môi trường được làm nguội đến nhiệt độ thích hợp, tiến hành
trộn chung với mốc theo tỷ lệ 1 – 2 % [19] mốc so với nguyên liệu.
- Nuôi mốc
Mục đích: Nuôi mốc nhằm thu được số lượng và chất lượng enzyme protease và amylase
cao nhất để chuẩn bị cho quá trình lên men. Trong giai đoạn này, nấm mốc buộc phải sử
dụng các chất dinh dưỡng có trong nguyên liệu để tạo enzyme chuẩn bị cho quá trình
thuỷ phân.
Cách tiến hành: Nuôi mốc trong thùng nhựa ở nhiệt độ 30  34ᵒC
- Sấy
Mục đích: Làm giảm độ ẩm trong sản phẩm mốc thương phẩm, hỗ trợ.
Cách tiến hành: trãi mốc ra mâm sấy ở nhiệt độ và thời gian yêu cầu
- Xay mịn
Mục đích: Xay mốc nhằm hỗ trợ mục đích lấy bào tử cấy truyền ở các thí nghiệm sau
Cách tiến hành: Làm sạch và lau khô cối nghiền khô bằng cồn 70ᵒ rồi cho mốc đã sấy vào
xay mịn. Sau khi xay bảo quảng mốc trong túi zip ở nơi tránh ánh nắng trực tiếp.

Nếp

Vo loại tạp chất

Mốc sau phân lập Ngâm

Cấy truyền Hấp

Ống mốc giống Làm tơi, để nguội, trãi rỗ

Lấy bào tử mốc Cấy bào tử

Nuôi mốc

Sấy

Xay mịn

Mốc giống thương

phẩm