Professional Documents
Culture Documents
Molekularna Genetika
Molekularna Genetika
MOLEKULARNA GENETIKA
1
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
36.2. Z
a
č
e
t
e
k
podvajanja DNA.
Sprva se na molekulo DNA veže helikaza,
encim, ki razklene verigi in skrbi za
nastanek replikacijskih vilic. Da verigi
ostaneta razklenjeni se nanje vežejo
določeni proteini (SSB ali RPA).
Encim, ki izgrajuje novo verigo, se
imenuje DNA polimeraza. Polimeraza se
veže na verigo DNA, vendar za to
potrebuje začetni oligonukleotid
(primer), ki ga sestavlja 8-10 nukleotidov
RNA in ga izgradi encim primaza. Poleg
tega, da služi kot vezavno mesto za
encim, ima začetni oligonukleotid tudi pomembno vlogo pri zmanjševanju možnosti nastajanja
napak. Učinkovitost polimeraze je namreč odvisna tudi od števila že vezanih nukleotidov, saj manj
2
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
ko jih je, počasneje in manj zanesljivo deluje. Brez oz. s prekratko začetno verigo, bi na začetku
vsakega fragmenta nastalo veliko napak.
3
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
Evkarionti:
Podvajanje DNA pri prokariontih se bistveno
razlikuje samo pri sintezi sledilne verige.
4
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
5
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
6
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
Ж Timinski dimeri močno prizadenejo strukturo DNA molekule; pod vplivom UV svetlobe se
sosednja timina iz iste verige povežeta in tvorita dimer (ciklobutanski obroč).
♪ Demetilacija je zelo drag proces, ker posamezen encim katalizira samo eno reakcijo
demetilacije in ko se le ta zaključi, se encim
deaktivira in razgradi.
♪ Fotoreaktivacija je proces fotolize DNA, ki
omogoča popravilo timinskih dimerov, za ločitev
timina pa potrebuje en foton modre svetlobe.
♪ Izrezovanje je energetsko zahteven proces, ki poteka v večih stopnjah:
1. prepoznava okvare
2. odstranitev napake tako, da se izreže del novo nastale verige
3. zapolnitev vrzeli z uporabo genetske informacije komplementarne verige
4. ligacija prekinjene verige
7
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
Pri E. colli:
Kompleks iz 4 proteinov se veže na DNA in jo 'skenira' do mesta tvorbe dimera.
A proteini v kompleksu prepoznajo mesto dimera.
B proteini odmaknejo verigi na mestu napake in nastane mehurček. A proteini
oddisocirajo.
D proteini, ki imajo tudi helikazno aktivnost, s svojo endonukleazno aktivnostjo
cepijo okoli 15 nukleotidov za ali pred dimerom.
Polimeraza I ali II zapolni vrzel in ligaza ponovno zlepi verigi.
V evkariontih pri enakem procesu sodeluje vsaj 25 proteinov z različnimi funkcijami. Edina razlika
v mehanizmu je, da se odcepi košček dolg 25-35 nukleotidov.
Poznamo bolezenska stanja pri katerih je ta proces okrnjen zaradi napak na genih, ki zapisujejo
sodelujoče proteine. Okvarjenih je lahko tudi do 7 genov. Oboleli s to gensko boleznijo se morajo
izogibati sončne svetlobe, saj morajo maksimalno zmanjšati možnost nastanka timinskih dimerov.
Pri E. colli je DNA veriga metilirana, kar pomeni, da ima na adenine dodano metilno skupino, saj
se le metilirana veriga lahko pravilno prepiše v proteine. Takoj po zaključitvi podvajanja je
molekula še hemimetilirana, ker metilaza DNA še ni imela časa, da bi dodala metilne skupine na
novo verigo. Mismatch repair pri E. colli je mehanizem popravljanja napačno povezanih baz.
Popravilo mora poteči hitro, dokler nova veriga DNA še ni metilirana.
MutS in MutL tvorita kompleks, ki se veže na mesto okvare. MutS mesto
prepozna, MutL pa koordinira potek
nadaljnjih procesov.
MutH ima endonukleazno aktivnost
in cepi novo verigo na 5' ali 3' koncu. Med
novo in staro verigo loči na podlagi
metilnih skupin, zato mora, zaradi
orientacije, pričeti novo verigo cepiti v
bližini mesta z metilno skupino na stari
verigi in prenehati pri naslednji metilni
skupini. Odrezani deli verige so lahko dolgi le nekaj ali pa 1000 nukleotidov. Takšni dolgi
odseki so razlog, da se tvori zanka, pri vznožju katere se zberejo vsi encimi, ki pri
procesu sodelujejo.
Polimeraza izgradi novo verigo, zadnjo vrzel zapolni ligaza.
Pri evkariontih je postopek enak, le da še ni znano, kako encimi ločijo novo od stare verige.
8
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
38.1. Značilnosti molekul RNA in njihova vloga pri prenosu genske informacije.
9
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
Evkarionti:
Pri transkripciji sodeluje veliko več proteinov. Ogledali si bomo primer sinteze mRNA, kjer je
potrebna polimeraza II.
Poznamo TBP (TATA binding protein), številne splošne transkripcijske (TF) in elongacijske (EF)
faktorje. TFII A (B,E,F in H) skrbijo za prepoznavo promotorske regije in se vežejo med seboj
ter z RNA polimerazo II. Nekateri imajo tudi helikazne aktivnosti, tako kot TFII H, ki ima tudi
kinazno aktivnost in omogoča interakcije z nekaterimi proteinskimi kompleksi, ki sodelujejo pri
posttranslacijskih modifikacijah.
Sprva se sestavi kompleks iz splošnih transkripcijskih faktorjev, ker polimeraza
sama ni sposobna prepoznave promotorske regije. Zapovrstjo se vežejo TBP, TFII A, TFII
F, TFII E in TFII H. Nastane zaprt kompleks.
DNA se odvije in dobimo odprt kompleks.
Polimeraza ima na C domeni več kot 50 ponovitev zaporedja 7 AK: tirozin-serin-
prolin-treonin-serin-prolin-serin. Fosforilacija nekaterih od teh AK, ki jo omogoči TFII
H, povzroči konformacijske spremembe, ki omogočijo začetek transkripcije. Pritegne pa
tudi nekatere proteine, ki sodelujejo pri posttranslacijskih modifikacijah.
10
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
Polimeraza I in III za sestavljanje potrebujeta drugačne proteine. I tako potrebuje UAF, H3,
H4, TBP, CF in Rrn3p, III pa TFIII. Zanimivo pri slednji je, da se promotor nahaja na mestu, ki
se tekom transkripcije prepiše.
38.5. Inhibitorji sinteze RNA pri evkariontih in prokariontih ter raven njihovega
delovanja.
11
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
12
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
intronov razvila iz II skupine, saj vsebuje adenin, katerega OH skupina deluje kot nukleofil.
Četrto signalno mesto je pirimidinsko zaporedje. Poleg teh zaporedij so za vezavo spliceosoma
pomembni še regulatorni proteini, ki se vežejo na ekson in olajšajo vezavo snRNA ter tako
13
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
Na 3' konec mRNA se posttranskripcijsko doda poli A rep, ki pri evkariontih zaščiti molekulo
pred 3' proti 5' razgradnjo. Pri prokariontih poli A rep povzroča nestabilnost molekule.
Primarni prepis mRNA je daljši, saj se DNA prepiše dalj, kot le do mesta, kamor se doda rep.
Mesto dodajanja repa spredaj in zadaj obdajajo specifična nukleotidna zaporedja, ki označujejo
mesto cepitve. Na ta zaporedja se vežejo specifični proteini, od katerih imajo nekateri encimsko
delovanje. Endonukleaza cepi verigo na mestu dodajanja repa, poliadenilat polimeraza pa doda
prvih 10 adeninov. Na te adenine se vežejo proteini, ki stimulirajo poliadenilat polimerazo, da
izgradi še približno 10 adeninov ter tako dokonča poli A rep. Za reakcijo je potrebna energija.
14
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
Poliadenilat polimeraza je sposobna vezave AMP brez podlage, saj ji mRNA predstavlja začetni
oligonukleotid. Reakcija, ki jo katalizira se glasi:
Poli A rep se med translacijo krajša, ker takrat nanj niso vezani zaščitni proteini. Zato, več
translacij opravi mRNA, krajši ima rep. Sčasoma je dosežena kritična dolžina repa in mRNA
počasi razpade.
Evkarionti:
♦ V skupni 45S molekuli pre-rRNA niso
prisotni zapisi za tRNA molekule, ampak
samo zapisi za 18S, 5,8S in 28S rRNA.
♦ Metilacija poteče na celotni molekuli, na
OH skupinah drugega mesta riboze.
♦ Pri cepitvah sodelujejo kompleksi
proteinov in snRNA, se pravi ribocimi.
15
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
16
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
Genetski kod je degenerativen, kar pomeni, da več različnih kodonov specificira isto aminokislino.
Najpogosteje se takšni kodoni med seboj razlikujejo zgolj v 3. bazi (gledano 5' proti 3' koncu).
Izjemoma se pojavijo tudi razlike v prvem oz. drugem nukleotidu, kot je primer pri argininu.
Genetski kod je tudi skoraj univerzalen. Gledano s strani citoplazemske evkariontske in
prokariontske mRNA je kod univerzalen, kar pomeni, da isti kodon pri vseh organizmih zapisuje
isto AK. Vendar se odstopanja pojavijo pri mRNA, ki nastane v kloroplastih in mitohondrijih.
O odprtem bralnem okvirju govorimo, kadar fragment DNA vsebuje vsaj 50 zaporednih kodonov,
ki ne vsebujejo STOP kodona. V primeru pogostih STOP kodonov ne moremo govoriti o odprtem
bralnem okvirju.
Takšni načini vezave organizmu omogočajo nemotene procese z manj kot 61 (število kodonov brez
STOP kodonov) različnimi tRNA. Vsak organizem ima najmanj 32 različnih tRNA. Šibkejše vezi
omogočajo tudi lažjo disociacijo molekule tRNA z mRNA in s tem hitrejšo translacijo.
17
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
Prva stopnja v poteku sinteze proteina je aktivacija aminokislin, to je proces vezave AK na tRNA.
Reakcija poteče v dveh stopnjah:
Najprej se COOH AK poveže z α-fosfatom na
ATP molekuli z anhidridno vezjo. Pri tem se
odcepi pirofosfat.
Nato se aminokislinski ostanek veže na 3' mesto
riboze tRNA z estersko vezjo. Dobimo
aminoacil-tRNA.
Pri procesu sodelujejo encimi sintetaze, ki jih
glede na njihovo delovanje razdelimo v dva
razreda. Nekatere AK ostanek takoj dodajo na
3' mesto, medtem, ko ga druge prvo povežejo z
2' mestom riboze. V slednjem primeru sledi
transesterifikacija in AK ostanek se prav tako na
koncu znajde na 3' mestu. Vsaka sintetaza je
specifična za določeno AK.
Tako kot za vsako reakcijo, pri kateri nastane PPi, je tudi za to potrebna energija dveh ATP.
S purini bogato zaporedje mRNA se veže na s pirimidini bogato področje na 16S rRNA. AUG
zaporedje molekule se veže na malo podenoto in sicer na peptidno mesto. Tako se prične tvoriti
iniciacijski kompleks.
Prva se veže tRNA, ki nosi formil
metionin.
18
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
Na tem mestu vidimo, da mora imeti vsaka celica dve različni molekuli tRNA za prenos metionina.
Ena je potrebna za prenos prvega metionina, ki označuje začetek sinteze proteina, druga pa za
vse metionine, ki so vgrajeni na drugih mestih v proteinu. Poleg tega je razlika tudi v mestu
vezave tRNA s formil metioninom in vseh ostalih tRNA.
♪ Nazadnje se veže IF-2 z vezanim GTP. Poteče hidroliza GTP molekule, vsi IF se odcepijo in
dobimo funkcionalen ribosom iz dveh podenot, z vezano mRNA in tRNA.
19
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
V procesu terminacije je ključnega pomena cepitev esterske vezi med polipeptidom in tRNA. Pri
tem pomagajo trije terminacijski faktorji, ki so po strukturi zelo podobni molekulam aminoacil-
tRNA, RF-1, RF-2 in RF-3. Ko pride v ribosom STOP kodon, ga prepozna RF-1 ali RF-2, odvisno
od tega, za kateri kodon gre, in sporočilo predata RF-3, ki ob porabi ene molekule ATP omogoči
konformacijske spremembe na ribosomu, ki omogočijo vsem komponentam da oddisociirajo.
Komponente so obe podenoti ribosoma, tRNA, mRNA in peptid.
Pri evkariontih je edina razlika v tem, da imamo namesto treh samo dva faktorja. RF-1 v
evkariontih namreč sam prepozna vse tri STOP kodone. Preostali mehanizem delovanja je
identičen.
Sinteza poteka hitreje pri prokariontih, ker transkripcija in translacija nista prostorsko ločeni,
obe potekata v citosolu. Medtem, ko se mRNA še vedno sintetizira, na njenem sintetiziranem
koncu že poteka translacija. V evkariontih mora prvo poteči transkripcija v jedru, nato se že
končana mRNA prenese v citosol, kjer šele poteka translacija.
Zaradi časovne potratnosti se nikoli ne zgodi, da bi na eni molekuli mRNA potekala translacija
samo na enem ribosomu. Vedno govorimo o polisomih, kar pomeni, da je na isto molekulo mRNA
nanizanih več ribosomov. Takoj, ko konec molekule mRNA pogleda iz ribosoma, se nanj že veže
naslednji.
20
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
21
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
V procesu glikozilacije se lahko dodajajo različni sladkorji, vendar morajo biti v aktivni obliki.
Sladkorji se ne vežejo direktno na encime, ampak na donorske molekule. To sta UDP in GDP.
22
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
23
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
24
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
Ko je holesterola dovolj, je SREBP (sterol response element binding protein) vezan v membrani
ER skupaj s proteinom, ki zaznava koncentracijo holesterola v celici. Če koncentracija holesterola
pade, se SREBP prenese v cis GA. Aktivirajo se proteaze, ki odcepijo terminalne dele proteina in
mu omogočijo prehod v jedro. Aktiviran protein se veže na SRE1 (sterol response element)
mesto na genu in prične se izgradnja preiniciacijskega kompleksa, ki signal od SRE1 mesta
prenese do promotorja. Vežejo se acetilaze, nanje pa še nadaljnji proteini, dokler informacija ne
doseže promotorja. Zdaj se prične gradnja iniciacijskega kompleksa in transkripcija.
25
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
Če en gen zapisuje dva različna proteina, se šele s posttranskripcijsko modifikacijo določi, kateri
protein se bo izrazil. Pri enaki molekuli mRNA se lahko izrežejo različni introni ali pa se poli A
rep doda na različna mesta v molekuli. V obeh primerih so nastale molekule med seboj različne.
Zaradi alternativnega izrezovanja intronov je število genov, ki jih organizem potrebuje, manjše,
kot bi bilo sicer. V povprečju en gen zapisuje tri proteine. Poleg tega omogoča veliko raznolikost
in specifičnost vrst, kljub zelo majhnim razlikam v genih sesalcev. Kar ¼ alternativno izrezanih
intronov je specifičnih za posamezno vrsto.
Obe molekuli, tako miRNA kot siRNA, zavirata delovanje specifičnih genov v celici. Kljub temu za
svoje delovanje uporabljata dva podobna, a
še vedno različna mehanizma:
Delovanje siRNA lahko razdelimo na dve
fazi:
V prvi fazi Dicer, RNaza III encim,
prepozna in razreže eksogeno dsRNA na
manjše, 21 do 24 nukleotidov dolge koščke
siRNA. Takšna velikost molekulam siRNA
zagotavlja maksimalno specifičnost in
minimalne stranske učinke v obliki
nezaželenih povezav. Specifičnost siRNA
molekule za vezavo na mRNA je tako
velika, da že sprememba enega samega
nukleotida prepreči njeno RNAi-delovanje.
26
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
V drugi fazi helikaza loči verigi siRNA. Protismiselna (antisense) veriga se veže na protein
argonaut in se tako vključi v multiproteinski kompleks, imenovan RISC (RNA-induced silencing
complex). Smiselna (sense) veriga se razgradi med procesom aktivacije RISC kompleksa.
Teoretično bi se lahko katera koli veriga vključila v kompleks, vendar je ponavadi izbrana tista z
bolj stabilnim 5'-koncem, saj ima pričakovano daljšo življenjsko dobo.
Antisense veriga se v okviru kompleksa lahko veže na mRNA, ki ima njej komplementarno
zaporedje nukleotidov. Znotraj RISC kompleksa Slicer, zaenkrat še neindentificirana RNaza,
prične z razgradnjo prostega dela mRNA molekule. Začetek razgradnje predstavlja 10. nukleotid
na 5'-koncu tarčne mRNA.
V RISC se lahko vklopijo tudi sintetično vnesene siRNA ali siRNA molekule divjega tipa. V tem
primeru je razlika le v tem, da prva faza ni potrebna, saj so v celici že prisotne majhne molekule.
Delovanje miRNA se od delovanja siRNA razlikuje predvsem v začetnih fazah nastanka male RNA
molekule.
V jedru se najprej prepiše primarna miRNA
(primary miRNA, pri-miRNA), ki jo specifična
ribonukleza, imenovana Drosha, preoblikuje v
prekurzorsko miRNA (precursor miRNA, pre-
miRNA), 70 nukleotidov dolgo lasnično zanko.
Le-ta se transportira iz jedra v citosol, kjer
jo Dicer razreže v zrelo miRNA. Zrela
enoverižna molekula se vključi v kompleks, ki
je analogen ali celo identičen RISC, miRNP.
Povezava miRNA na mRNA nato sproži
uničenje ali zavrtje delovanja tarčne
molekule.
Molekula miRNA običajno nima popolnoma
komplementarnega zaporedja nukleotidov
tarčni mRNA, zato se lahko veže na več
molekul s podobnim zaporedjem. miRNA
deluje na mRNA na več različnih načinov:
ф Lahko deluje na translacijo tako, da se veže na mRNA in s tem prepreči iniciacijo,
upočasni elongacijo z vezavo na mRNA in polisome, povzroči prezgodnjo terminacijo ali
razpad proteina med samim procesom.
ф Drugi način delovanja je razgradnja poli A repa in s tem povzročitev razgradnje mRNA.
ф miRNA lahko povzroči zadrževanje mRNA v GW telescih, imenovanih tudi citoplazemski
(P) faktorji, ki so zgrajeni iz številnih encimov, ki so vključeni v regulacijo količine mRNA v
celici: decapping proteini, deadenilaze, eksonukleaze, Argonavti, ipd. V P telescih se mRNA
razgradi ali ohrani v mirujoči fazi. GW telesa delujejo kot shramba mRNA in ob potrebi
molekule sprostijo v citoplazmo. Na ta način je reguliranih le malo molekul mRNA.
Stabilnost mRNA:
Koncentracija mRNA v celici je odvisna od hitrosti nastajanja in razgradnje molekul. Pri
prokariontih je življenjska doba mRNA nekaj min, pri evkariontih pa od nekaj h do nekaj dni.
Razgradnja mRNA lahko poteče na več načinov. Za človeka je najpogostejši proces
deadenilacije. Splošno za evkarionte pa je značilna eksonukleazna aktivnost od 3' proti 5' (za
nižje organizme od 5' proti 3'). Vendar, ko se razgradi večina poli-A repa, se razgradi tudi
kapa in pride tudi do razgradnje od 5' proti 3'.
27
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
28
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
Restrikcijaki encimi so encimi, ki spoznajo specializirana mesta na DNA verigi in verigo v teh
mestih cepijo. Pogosto delujejo na palindromna zaporedja, to so zaporedja, ki se enako berejo s
5' proti 3' in s 3' proti 5' koncu. Včasih je lahko na nekem mestu katerikoli nukleotid, vendar
mora biti večina zaporedja palindrom. So endonukleaze in za svoje delovanje ne potrebujejo
energije.
DNA verigo lahko režejo na dva različna načina:
Vsako verigo razrežejo na drugem koncu, tako da novo
nastala delca nista povsod dvoverižna, ampak imata na koncu
previs ali lepljiva konca.
Verigi cepi na obeh straneh tako, da sta novo nastala
fragmenta ves čas dvoverižna in nastanejo topi konci.
Restrikcijski encimi izvirajo iz bakterij, ki jih potrebujejo za obrambo pred tujo bakterijsko
DNA. Danes večinoma uporabljamo umetno sintetizirane encime, ki nam pomagajo pri združevanju
različnih fragmentov DNA. Ko neko DNA razrežemo, ji lahko dodamo komplementarne fragmente
in s časom se bodo fragmenti med seboj združili. Ta čas bo zelo kratek, če bomo delali z
lepljivimi konci in rahlo daljši, če imamo opravka s topimi konci. Vrzel, ki po povezavi še ostane,
zapolni ligaza. Dobimo rekombinantno molekulo.
Če želimo novo molekulo DNA pomnožiti, jo moramo vstaviti v vektor, molekulo, ki tujo DNA lahko
vnese v gostiteljsko celico. Poznamo različne vrste vektorjev: plazmide, bakteriofage γ, kozmide
in umetne bakterijske kromosome. Med seboj se razlikujejo v velikosti DNA fragmenta, ki jim ga
lahko vstavimo in tarčnih gostiteljskih celicah. Za bakterije najpogosteje uporabljamo
plazmidne vektorje.
29
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
30
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
(tarčnih) fragmentov pa eksponentno. Običajno cikel ponovimo okoli 30-krat, ko imamo že okoli
milijardo tarčnih molekul. Le te iz zmesi dobimo z gelsko elektroforezo.
Pozitivni strani metode sta predvsem hitrost in zanesljivost, ki je posledica številnih ponovitev.
Ima pa metoda tudi negativne strani, saj se lahko primerji hitro pritrdijo na napačne dele DNA
ali po pomoti pomnožujemo napačno DNA (npr. DNA iz prejšnjega poskusa, ki ni bila dobro izmita
iz epruvete).
PREGLEDOVANJE KNJIŽNIC
V gojišču imamo bakterije, ki vsebujejo različne plazmide in posledično različne koščke genoma.
Da bi našli iskani fragment, bakterije razmažemo po trdem gojišču tako, da dobimo kolonijo za
vsak plazmid posebej. Problem nastane pri določanju katera kolonija vsebuje iskani fragment.
Čez gojišče položimo filter, na katerega se bodo prijele bakterije, iz vsake kolonije nekaj.
Izvedemo alkalno lizo, tako da na membrani dobimo enoverižne molekule, ki jih z UV žarki ali
pečenjem stabiliziramo na membrano. Z označeno sondo izvedemo hibridizacijo. Nevezano sondo
speremo, tako sonde ostanejo izključno na delih, kjer so vezane na iskani fragment. Sonde so
najpogosteje radioaktivno označene, zato membrano postavimo pod rentgen in pogledamo, kje se
pojavi črna barva. Nato primerjamo sliko z gojiščem in določimo v kateri koloniji je želen
fragment.
31
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
32
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
specifičnost sonde poleg dolžine in komplementarnosti, vplivajo še razmerje AT:GC, ionska jakost
in prisotnost denaturantov.
Kadar poznamo protein in želimo iz njega napraviti sondo, moramo paziti na degeneriranost
genskega koda. Izbrati moramo predel proteina, kjer je najmanj različnih možnosti za zapis ene
AK, nato pa izdelamo vse možnosti in poskusimo, katera bo prava.
Postopek hibridizacije:
zmes nukleinskih kislin ločimo z elektroforezo na gelu
nukleinske kisline denaturiramo tako, da jih izpostavimo ekstremnim vrednostim pH-ja ali
T › 80oC, in jih prenesemo na trden nosilec (introcelulozna ali najlonska membrana)
vežemo jih z UV obsevanjem ali segrevanjem pri 80oC
membrano damo v hibridizacijsko raztopino visoke ionske jakosti, ki vsebuje označeno in
denaturirano sondo. Ker je sedaj pH nevtralna oz. T znižana, dosežemo naključno povezavo
med molekulami na osnovi komplementarnosti.
po hibridizaciji nespecifično vezano sondo speremo s pufrom nižje ionske jakosti kot jo
ima hibridizacijska raztopina
membrano izpostavimo filmu, ki ga izberemo glede na način označevanja sonde
33
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
Ker so fragmenti radioaktivno ali fluorescenčno označeni, zaradi označitve nekaterih komponent,
lahko preberemo njihovo zaporedje nukleotidov. Zaporedje beremo od spodaj (najkrajši
fragmenti) navzgor.
*Poznamo še druge postopke določanja nukleotidnega zaporedja, vendar imajo vsi enak osnovni princip in se
razlikujejo zgolj po količini DNA, ki je potrebna, vrsti uporabljene polimeraze, v načinu označevanja ter
posledično ločevanja sintetiziranih verig, dolžini določenega nukleotidnega zaporedja in stopnji natančnosti.
DNA FINGERPRINTING
DNA fingerprinting je metoda za ugotavljanje sorodnosti in razlik v genetskem materialu na
osnovi mikrosatelitske DNA. Mikrosatelitske DNA so majhni fragmenti DNA, ki se v genomu
velikokrat ponovijo, število in mesto ponovitev pa je pri vsakem posamezniku drugačno.
Verjetnost, da imata dva različna človeka enako razporeditev mikrosatelitskih DNA je
zanemarljiva, zato to metodo uporabljamo za dokazovanje sorodnosti, odkrivanje osumljencev
kaznivih dejanj, ipd.
Potek:
DNA dodamo restrikcijske encime, ki jo razrežejo na različno dolge fragmente, glede na
zaporedje nukleotidov.
DNA inkubiramo.
Sledi elektroforeza v agaroznem gelu in analiza rezultatov s primerjavo fragmentov DNA.
34
Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08
Glavni vir
• Breskvar, K., Črešnar, B., Dolžan, V., Plemenitaš, A., Rozman, D. in Žakelj-Mavrič, M.
Biokemija II: Navodilo za vaje. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, 2007.
• Predavanja prof. Bronislave Črešnar 2007/08
• Predavanja prof. Vite Dolžan 2007/08
• Seminar: PCR 2007
• Seminar: Alternativno izrezovanje intronov 2008
• Seminar: miRNA in RNA interferenca 2008
35