AYIRMA VE İZOLE ETME METODLARI

(Süblimasyon - Distilasyon )

Fraksiyonlu Distilasyon: Uçucu yağların deterpene edilmesi ve başlıca komponentlerin saf halde
elde edilmesi amacıyla uygulanır.
Fraksiyonlu Ayırma: Sulu çözeltideki  alkaloit tuzları belli oranlarda alkali ile karıştırılırsa ilk
önce en az zayıf baz açığa çıkar, bu en kuvvetliye doğru giderek devam eder. Eğer, her baz
ilavesinden sonra çözelti uygun bir organik çözücü ile çalkalanırsa değişik kuvvetlerdeki bazlar
değişik fraksiyonlara geçerler ve böylelikle birbirlerinden ayrılmış olurlar.
Fraksiyonlu Kristallendirme: Bir karışımdaki maddelerin belli bir çözücüdeki çözünürlük
farklarından yararlanan bir metottur. Maddelerin kolay kristallenebilen türevleri yapılarak
ayrılmaları amaçlanır. Örneğin: Alkaloit pikratlar, şeker ozazonları, steroit asetatlar gibi.

KROMATOGRAFİ
Kromatografi, bir karışımdaki maddelerin başlangıçta bulunduklarından farklı bölge veya
fazlarda ayrılmalarını sağlayan analitik bir tekniktir. Saflaştırma ve karşılaştırma amacıyla
kullanılmaktadır. Günümüzde bütün kimya ve biyoloji alanlarında geniş şekilde de kullanılmakta
olan bu teknik sürekli olarak gelişmekte ve yeni uygulama alanları bulmaktadır. Kromatografik
tekniklerin kullanılmadığı bir analiz laboratuvarını düşünmek bugün imkansızdır. Ayrıca bitki
kemotaksonomisinde, adli tıpta karşılaştırma yoluyla sınıflandırma ve sahtekarlıkları ortaya çıkarma
amacıyla da kullanım sahasına girer.
Kromatografi esas itibariyle bir mikro tekniktir. Yani mikrogram miktardaki maddeleri
birbirinden ayırır. Kalitatif olması yanında kantitatif kullanımı da çok geniştir. Ayrıca preparatif
kullanımı sonucu saf madde elde etmek kromatografinin en yararlı özelliklerinden biridir.
Bazı şartlara bağlı olarak kromatografide görülen 4 mekanizma şunlardır:
1) Adsorpsiyon
2) Partisyon
3) İyon değiştirme (iyon değişimi)
4) Jel geçirgenliği (jel filtrasyonu)
Bütün kromatografik tekniklerde, birbiri ile karışmayan iki faz {hareketli (mobil) ve
hareketsiz (stasyoner) faz} vardır. Bu fazlar, katı, sıvı, gaz gibi farklı fiziksel hallerde olabilirler.
Bundan dolayı kromatografi çeşitleri faz adlarına göre: katı-sıvı, gaz-sıvı, vs. veya özel karakteristik
faz düzenlerine göre: ince tabaka kromatografisi (İTK), kağıt kromatografisi (KK) vs. şeklinde
sınıflandırılabilir.

MEKANİZMALAR Adsorpsiyon Partisyon İyon Değiştirme Jel Filtrasyonu

1
 FAZLAR
Hareketsiz (Stasyoner) Katı Sıvı Katı Katı
Hareketli (Mobil) Gaz veya Sıvı Gaz veya Sıvı Sıvı Sıvı

Tabloda da görüldüğü gibi hareketsiz faz sıvı veya katı olabilir, hareketli faz ise sıvı veya gazdır.
Hareketsiz fazın sıvı olduğu durumlarda, sıvı bir katı destek maddesi üzerine kaplanır.
1) Adsorpsiyon: Gaz, sıvı veya çözünmüş maddelerin bir adsorbanın yüzeyinde tutunması olayıdır.
Adsorban yüzeyi ile tutunan madde arasındaki kimyasal bir bağ oluşmaz. Sadece geçici olan
fiziksel bir bağ meydana gelir. Bu durumda madde adsorban yüzeyine elektrostatik kuvvetler, dipol-
dipol çekimi ve Van der Waals kuvvetleri ile geçici bir süre için tutunur. Adsorpsiyon çeşitli
faktörlerden etkilenir. Adsorbanın kimyasal yapısı ve aktivite derecesi çok önemlidir. Adsorpsiyon
kromatografisi hareketli fazda çözünmüş halde bulunan madde ile adsorbanın yüzeyinde tutunmuş
olan maddelerin molekülleri arasında bir dengenin sağlanması esasına göre işler. Ayırma birbirine
karşı olan kuvvetlerin etkilenmesi sonucu meydana gelir. Bunlar hareketli fazdaki sürükleyici
kuvvet ile hareketsiz fazdaki tutucu kuvvettir. Ayrılmada fazlara bağlı faktörler yanında ayrılması
istenen maddelere bağlı faktörler de önemlidir (karışımdaki maddelerin konsantrasyonu ve
polaritesi gibi). Maddelerin polariteleri hem hareketli fazdaki sürüklenme hızını, hem de adsorban
yüzeyinde tutunma derecesini tayin eder. Genel kural olarak polar maddeler polar çözücülerde,
apolar maddeler ise apolar çözücülerde iyi sürüklenir. Bir molekülün polaritesi yapısında bulunan
fonksiyonel grupların cinsi, sayısı ve pozisyonuna bağlıdır.
 -Cl, -NH2 ve -OH grupları polariteyi arttırır, -CH2 ise azaltır. Adsorptivite genellikle şu sırayı takip
eder: -COOH> -OH> NH2> -CH3COO-> -NO2> -Cl
İdeal bir adsorban şöyle olmalıdır:
1. Hareketli fazda çözünmemelidir.
2. Sistemdeki maddelerle kimyasal reaksiyona girmemelidir, yani inert olmalıdır.
3. Partikülleri (parçacıkları) eşit büyüklükte olmalıdır.
4. Ayrılması istenen maddeler ve hareketli faza bağlı olarak aktivitesi istenen düzeyde olmalıdır.
Eğer adsorban çok aktif ise (yani çok az su ihtiva ediyorsa veya kuvvetli adsorbansa) maddenin
sürüklenmesi çok yavaş olur, yani madde adsorban yüzeyine sıkıca tutunur. Az aktif adsorbanlarda
ise tutunma hemen hiç olmaz.
5. Beyaz renkli olmalıdır.
En çok kullanılan adsorbanlar şunlardır:
Zayıf olanlar: Şeker, nişasta, selüloz, talk, kieselguhr ve selit.
Orta kuvvette olanlar: Kalsiyum karbonat, kalsiyum fosfat, magnezyum fosfat, magnezyum
hidroksit, kalsiyum hidroksit.
Kuvvetli olanlar: Magnezyum silikat, alumina (Al2O3), silikajel (SiO2.nH2O), aktif kömür, aktif

2
magnezyum oksit, kaolin, bentonit, aluminyum silikat.
Alumina içinde taşıdığı su oranına göre 5 dereceye ayrılır:
1. derecede aktif (%0 su), 5. derece ise en az aktif (% 15 su) olanıdır.
Bir maddenin sürüklenme oranı belli bir adsorban için, kullanılan çözücüye (solvan) bağlı
olacağından çözücüler elüsyon kuvvetlerine göre elüotropik seri adı altında sınıflandırılırlar: Petrol
eteri, hekzan, karbontetraklorür, toluen, benzen, diklorometan, kloroform, eter, etilasetat, aseton,
izopropanol, etanol, metanol, su (apolardan polara doğru).
2) Partisyon: Bir karışımda bulunan maddelerin birden fazla çözücü içinde çözünürlükleri oranında
dağılmasıdır. Yani eğer bir madde iki fazlı bir sisteme sokulursa ve iki sıvıda da çözünebilirse,
çözünürlüğü  oranında iki faz arasında dağılacaktır. Bu solvan ve maddenin özelliklerine bağlı bir
fonksiyondur. Maddenin iki fazda dağılma oranı Partisyon Faktörü (a) olarak bilinir ve belli
konsantrasyon limitlerinde ve sabit temperatürde sabittir.
CA ve CB : A  ve B çözücülerindeki madde konsantrasyonlarıdır.
Partisyon kromatografisinde hareketli faz gaz ya da sıvı hareketsiz faz ise sıvıdır. Partisyon
mekanizmasının rol aldığı kromatografi tekniklerinde hareketsiz fazı, teşkil eden sıvı (genellikle
su); porlu bir destek maddesi üzerine kaplanır. Eğer iki faz da sıvı ise sıvı-sıvı kromatografisinden,
hareketli fazın gaz olduğu durumlarda ise gaz-sıvı kromatografisinden söz edilir.
Partisyon kromatografisinde bir maddenin hareketi adsorpsiyona değil, hareketsiz fazdaki
çözünürlüğüne bağlıdır. Çok çözünür maddeler, kromatografi sütununda, az çözünür maddelerden
daha yavaş hareket ederler (gaz-sıvı kromatografisi). Bu geçiş sırasında maddeler iki faz arasında
partisyona uğrarlar ve partisyon faktörleri arasındaki farktan dolayı birbirlerinden ayrılırlar.
Hareketsiz fazın su veya sulu çözelti değil, apolar bir organik sıvı olduğu durumlarda "ters faz
partisyon kromatografisinden" (reversed phase partition chromatography) bahsedilir. Bu teknikte
hareketli fazı su veya sulu bir çözücü (asetik asit, asetonitril, alkol veya bunların karışımları)
oluşturur. Hareketsiz faz ise kaynama noktası yüksek bir hidrokarbon veya bir silikon yağıdır.
3) İyon değiştirme (iyon değişimi): İyon değiştirici kimyasal bağlarla bağlı yüklü gruplar taşıyan,
suda erimeyen bir hareketsiz faz ve sıvıyla sürüklenen hareketli fazda karşı yükte iyonlar ihtiva
eden ortamda faaliyet gösterir. Karşı iyonlar hareketsiz fazdaki eşit yüklü iyonlarla geri
döndürülebilir (reversible) şekilde yer değiştirebilirler.
Hareketsiz faz - SO3-H+    +    A+B-  ______________     Hareketsiz faz - SO3-A+  +   H+ B-
(katyon değişitirici)         (iyonize karışım)
Hareketsiz faz - NR3+OH- +    A+B- ______________   Hareketsiz faz - NR3+B-  +   A+ OH-
(anyon değişitirici)          (iyonize karışım)
İyon değişimi kromatografisinde karışım halindeki maddelerin ayrılması için önce bütün maddeler
hareketsiz fazı meydana getiren eden iyon değiştiriciye bağlatılır sonra her bir iyon türü teker teker
ortamdan elüe edilerek ayrılır. Her bir iyon türünü hareketsiz fazdan sökmek için gerekli olan

3
şartlar (pH, iyonik kuvvet) türün elektriksel özelliklerine bağlı olduğundan ve türlerinin elektriksel
özellikleri birbirinden farklı olduğundan ayrım sağlanmış olur.
4) Gel Geçirgenliği (Jel Filtrasyon): Moleküllerin ebatlarına dayanarak uygulanan bir ayırma
tekniğidir. Bu teknikte hareketsiz faz olarak tabii (selüloz veya agar) veya sentetik (Sephadex) bir
jel sistemi ve hareketli faz olarakta ayırmak istediğimiz karışımdaki tüm maddeleri tamamıyla
çözebilen bir çözücü kullanılır. Jel parçacıkları (partikülleri) bir sıvı ile şişirildiklerinde porlu bir
sistem oluştururlar. Tabii ve sentetik bir jel ile doldurulmuş olan sütuna çözünmüş haldeki madde
karışıma ilave edildiğinde, karışımdaki moleküllerden çapı jel matriksindeki porlardan büyük
olanlar jel parçacıklarının içine nüfuz etmeksizin, parçacıkların aralarından geçerek sütunu
terkederler. Çapı pordan geçebilecek büyüklükte olanlar partiküllerin yapısına nüfuz eder ve
porlardan geçerek, difüzyon yoluyla ilerlerler. En küçük yapıdaki moleküller ise sütunu en son
terkederler.
Kullanılan jel sistemi iki fazdan meydana gelir: Dağıtılmış faz ve dağıtım fazı (su).
Jel parçacıkları bir solvanda şişmeye bırakıldığında yukarıda adı geçen iki faz meydana gelir. Yani,
jel parçacıkları içinde ve dışında aynı solvan bulunur. Hareketli ve hareketsiz fazlarda aynı solvan
bulunduğundan bu teknik bir nevi partisyon kromatografisi olarak görülebilir. Jel geçirgenliğinin
mekanizması, özet olarak şu üç prensiple ifade edilebilir: a) atılma b) difüzyon, c) partisyon.

KROMATOGRAFiK TEKNİKLER
Kromatografik teknikler kapalı sütun kromatografisi ve açık sütun kromatografisi adları
altında da sınıflandırılabilirler.
Kapalı Sütun Kromatografisi Teknikleri: Kapalı sütun kromatografisinde hareketsiz faz bir sütun
içine yerleştirilmiştir. Hareketli faz karışımdaki maddelerle birlikte sütun içinde sürüklenir ve
böylelikle maddelerin birbirinden ayrılması gerçekleşir.
Hareketli fazın sıvı veya gaz olmasına göre ikiye ayrılır:
A) Sıvı Kromatografisi: Sütun Kromatografisi (SK, Column Chromatography - CC), Yüksek
Basınçlı Sıvı Kromatografisi (YSBK, High Performance Liquid Chromatography - HPLC), Orta
Basınçlı Sıvı Kromatografisi (OBSK, Medium Pressure Liquid Chromatography - MPLC), İyon
Değişimi Kromatografisi (Ion Exchange Chromatography), Jel Kromatografisi (Gel Filtration
Chromatography).
B) Gaz Kromatografisi: Gaz-Katı Kromatografisi (GKK, Gas-Solid Chromatography - GSC) ,
Gaz-Sıvı Kromatografisi (GSK, Gas- Liquid Chromatography - GLC)
Açık Sütun Kromatografisi Teknikleri: Açık sütun kromatografisinde hareketsiz faz düz bir
yüzey üzerinde tutulur.
A) Kağıt Kromatografisi (KK, Paper Chromatography - PC): Hareketsiz faz destek madde olan
kağıttır.

4
B) İnce Tabaka Kromatografisi (İTK, Thin Layer Chromatography - TLC): Hareketsiz fazı teşkil
eden adsorban madde cam, ince plastik  v.b. maddeler üzerine kaplanır.  

SINIF  TEKNiKLER MEKANiZMALAR

Kapalı Sütun
Sütun Kromatografisi  a, c, d, b
Kromatografileri
Gaz-Sıvı Kromatografisi  b
Yüksek Basınçlı Sıvı
 b, c, d, a
Kromatografisi
Orta Basınçlı Sıvı
 a, b, c, d
Kromatografisi
Açık Sütun Kromatografisi Kağıt Kromatografisi  a, b, c
İnce Tabaka Kromatografisi  a, b, c, d
                a = adsorpsiyon, b= partisyon, c=iyon değişimi, d= jel geçirgenliği

SÜTUN KROMATOGRAFİSİ (Kolon Kromatografisi)

Bu tekniğin ilk olarak 1903 yılında Tswett tarafından bitki pigmentlerini ayırmada
kullanıldığı bilinmektedir. Sütun kromatografisinde çeşitli büyüklükte cam veya dayanıklı plastik
maddelerden yapılmış sütunlar kullanılır. Bu sütunların altta bir musluğu olmalıdır. Bazı sütunlarda
musluğun hemen üstünde cam filtre bulunur. Filtre yoksa sütunun alt kısmına cam yünü yerleştirilir.
Sütun ya kuru halde veya çözücüyle süspansiyon haline getirilmiş adsorban madde ile doldurulur.
Daha çok ikinci şekilde kullanımı yaygındır. Bunun için musluk kapatılır, elüsyonda kulllanılacak
çözücüden bir miktarı sütuna koyulur. Aynı çözücü ile hazırlanmış adsorbanla doldurulduktan sonra
sütunda hava boşluğu, yarık ve çatlak olmamasına dikkat edilmelidir. Devamlı çözücü ilave
edilmeli ve adsorban kurutulmamalıdır. Bundan sonra dairevi şekilde de kesilmiş bir süzgeç kağıdı
adsorbanın üst yüzeyine yerleştirilir. Çözücü seviyesi bu filtre kağıdının biraz üstüne gelecek
şekilde ayarlanır. Çözücüde çözünmüş halde bulunan madde karışımı ya doğrudan doğruya filtre
kağıdı üzerinden tabakayı rahatsız etmeyecek şekilde tatbik edilir veya bir miktar adsorban ile
karıştırılır ve çözücü uzaklaştırıldıktan sonra adsorbana emdirilmiş kuru toz haldeki karışım
sütundaki filtre kağıdı üstüne yerleştirilir ve üzerinde asit ile yıkanmış kum tabakası eklenir.
Bundan sonra çözücü üstten devamlı olarak ilave edilir ve sütunun musluğu açılarak damla damla
fraksiyon toplamaya başlanır. Devamlı aynı miktar fraksiyonlar (10, 25, 50, 100, 250 ml gibi) cam
kaplarda toplanır.
Elüsyon sırasında karışımdaki maddeler kullanılan çözücüdeki çözünürlükleri ve
adsorpsiyon gücü oranında sütundan aşağıya doğru ilerlemeye başlarlar. Ayrılan maddeler sütunda
bantlar teşkil eder. Eğer maddeler renkli ise sütunda değişik büyüklükte renkli bantlar gözlenebilir.
Her bant sırayla sütundan elüe edilir. Yeni bantların oluşmadığı durumda elüotropik serideki daha
polar bir çözücü veya çözücü karışımı ile elüsyona devam edilir. En son olarak sütunda kalan en
polar maddeler polar bir çözücü ile (örneğin metanol) elüe edilir. Ayrılan maddeler renksiz ise
5
toplanan fraksiyonlar yoğunlaştırıldıktan sonra ince tabaka kromatografisine tabi tutulur. Böylelikle
aynı maddeleri taşıyan fraksiyonlar birleştirilir. Buraya kadar açıklanan şekliyle adsorpsiyon
mekanizmasına göre ayırım yapan sütun kromatografisi bugün sadece preparatif amaçlarla
kullanılmaktadır. Benzer şekilde iyon değiştirici ve jel geçirgenliğine uygun hareketsiz fazlarla
hazırlanan bir sütunda adı geçen mekanizmaların kullanımıyla ayrımlar gerçekleştirilebilir.
Adsorpsiyon mekanizması için en çok kullanılan adsorbanlara örnekler ve ayırımlarında kullanıldığı
maddeler:
Alumina: Steroitler, vitaminler, esterler, alkaloitler, inorganik maddeler
Silikajel: Steroitler, amino asitler
Aktif Kömür: Peptitler, karbonhidratlar, amino asitler
Hareketli Faz: Tek bir organik çözücü kullanılabileceği gibi elüotropik serideki çözücüler
apolardan polara doğru, polaritenin yavaş yavaş arttırılması şeklinde belli oranlarda karıştırılarak
kullanılabilir.

GAZ KROMATOGRAFİSİ
Bu teknikte hareketli faz gazdır. Hareketsiz faz katı (adsorban) ise gaz-katı kromatografisi,
sıvı ise gaz-sıv kromatografisi isimlerini alır. Bugün gaz kromatografisi denince akla sadece GSK
gelir. Bu bakımdan bu bölümde sadece GSK incelenecektir. Gaz-sıvı kromatografisi ilk defa 1952
yılında Martin ve James tarafından kullanılmıştır. 400°C ye kadar bozunmadan buharlaşabilen
maddelerin ayrılmasında kullanılır.
GSK' de rol oynayan mekanizma sadece partisyondur. Hareketli fazı genelde azot gazı teşkil
eder. Hareketsiz faz ise porlu katı destek maddesi etrafına kaplanmış, yüksek ısıda buharlaşmayan
bir sıvıdır. Sütun cam veya paslanmaz çelikten yapılmıştır. İç çapı 2-6 mm ve uzunluğu en az 1 m
dir. Kapiler kolonlar da iç çap 0.25-0.5 mm, boy 30-100 m dir. Sıvı haldeki hareketsiz faz yüzeye
kaplanmıştır. Uzunluğundan dolayı fazla yer kaplamaması için sütun helezon şekline getirilir.
Sütunun bir ucu enjektör ve gaz giriş kısmına, diğer ucu ise dedektör kısmına bağlıdır.
Sütun özel bir fırında bulunur ve içinden devamlı azot veya helyum gazı geçirilir. Giriş ucunda
bulunan enjektör girişinden madde karışımı uygun bir çözücüde çözünmüş halde enjekte edilir.
Karışımdaki maddeler gaz basıncıyla sürüklenir, partisyon faktörlerine göre gaz ve sıvı fazlar
arasında dağılırlar. Sütunu terkeden maddeler dedektör vasıtasıyla tesbit edilir. Sonuçlar bir kayıt
cihazında kağıt üzerine pik şeklinde kaydedilir. Maddenin sütuna girişi (enjeksiyon) ve çıkışı
(kayıt) arasında kalan süreye RT (retention time=tutunma zamanı veya alıkonma zamanı) adı
verilir. Her maddenin RT değeri aynı şartlar sağlandığında aynıdır.
Destek Madde: Kieselguhr, ateş tuğlası gibi adsorban özellikte maddelerdir. Partikül büyüklükleri
farklı olabilir. Yüzeyleri porlu yani pürtüklüdür. Bu bakımdan yüzey alanları epey geniştir.
Hareketsiz faz: Destek madde etrafına film halinde kaplanan Apiezon yağları, polietilenglikol,

6
silikon yağları gibi sıvılardır (Carbowax, Chromosorb, Porapak).
Hareketli  faz:  Azot, helyum, argon.
Dedektör: Çok çeşitli dedektörler kullanılır. Bunlardan biri Katarometre (Isı iletken Dedektör,
Thermal Conductivity Detector - TCD). Bu cihaz içinde sabit elektrik akımıyla ısıtılan platin bir tel
vardır. Tel ısı kaybettiği anda ısı kaybını yok etmek, tekrar sabit hale gelmek için tele verilen akım
miktarında artma meydana gelir. Tel, üzerine bir madde çarptığı zaman ısı kaybeder. Bu esnada
devredeki akımdan artma olacağından ve bu akım artışı ölçülebileceğinden dedektöre bağlı olan
kayıt cihazının kalemi kayıt kağıdı üzerinde artan akım şiddetine bağlı büyüklükte bir pik çizer. Bu
pik o anda sütundan çıkan maddenin ayrılma süresini (RT) ve karışım içindeki bağıl (relatif) yüzde
miktarını belirlemekte  kullanılır. Bu ve benzeri dedektörlerle pikin hangi bileşiğe ait olduğunu
söyleyebilmek için standart maddelerle kromatografi işleminin önceden aynı şartlarda yapılmış
olması gerekir.
Alev iyonlaşma Dedektörü (Flame  İonisation Detector- FID), Elektron Yakalama Dedektörü
(Electron Capture Detector - ECD), Isı İletkenliği Dedektörü (Thermal Conductivity Dedector-
TCD) gibi dedektörler kullanılabileceği gibi günümüzde Kütle Spektrometresi (Mass Spectrometer
- MS)’nin (GC/MS) ve Fourier Transform/Infrared Spektrofotometresi (GC/FT/IR)’nin dedektör
olarak kullanılmasıyla oluşturulan sistemler ile yapılan çalışmalar değer kazanmıştır. Kütle
Spektrometrisi dedektör olarak kullanıldığında kolondan çıkan her bir bileşiğin kütle spektrumu
alınmakta ve bileşiklerin kütle spektrumlarının bulunduğu kitap veya bilgisayar kütüphanelerinden
yararlanılarak bileşiklerin tanımlanmaları mümkün olmaktadır.
Uygulaması: Uçucu maddeler taşıyan organik karışımlar (hidrokarbonlar esterler, alkoller, uçucu
yağlar gibi) yanında uçucu olmadığı halde bir kimyasal reaksiyonla uçucu hale getirilebilen
maddeler (Trimetilsilan ile türevlendirilen amino asitler, metillenen şekerler, esterleşen karbonik
asitler, sülfonik asitler gibi) incelenebilir. Maddeler 400°C ye kadar bozulmadan buharlaşabilmeli,
uçucu hale geçebilmelidir.

YÜKSEK BASINÇLI SIVI KROMATOGRAFİSİ

1966' dan beri kullanılan en son geliştirilmiş sütun kromatografisi tekniğidir. Tekniğin
enstrümantasyonu ve uygulaması gaz-sıvı kromatografisine benzese de aralarında temel bazı
ayrılıklar vardır. GSK de sadece partisyon mekanizması rol oynarken YBSK' de her dört
mekanizma da rol alır. Hareketli faz GSK deki gibi gaz değil sıvıdır. YBSK de analizi yapılacak
maddelerin buharlaşmasına gerek yoktur. Maddelerin herhangi bir çözücüde çözünmesi yeterlidir.
Uygulamada YBSK nin GSK' ye tercih edilmesi analiz süresinin kısalığındandır.
Cihazın GSK' den farkı araya pompanın girmesi ve hareketli fazın sıvı olmasıdır. Bu
teknikte dört mekanizma da kullanılabilir. Kolon uygun bir adsorbanla doldurulmuş ise temel olarak
adsorbsiyon mekanizması  gözlenir. Partisyon mekanizması için apolar bir hareketsiz faz GSK' deki
7
gibi porlu bir inert madde üzerine adsorpsiyon yoluyla veya kimyasal bağlarla film şeklinde
kaplanır.
Kalın cam veya paslanmaz çelik sütunların iç çapı 3-5 mm, boyu 10-25 cm dir. İçine
hareketsiz faz yerleştirildikten sonra hareketsiz faz ile kısmen doyurulmuş hareketli faz sütun içine
pompalanır. Birkaç saat bu halde bırakılıp hareketsiz fazın sütun içindeki konsantrasyonu sabit hale
getirildikten sonra ayrılması istenen karışım, kullanılan hareketli fazda çözünmüş halde sütunun
başından enjekte edilir. Esas itibariyle partisyona uğrayarak ilerleyen ve birbirinden ayrılan
maddeler sütunu terkedip dedektörden geçtikten sonra bir kap içinde toplanır. Sütunun içinde
bulunduğu fırının sıcaklığı 50°C yi geçmez.
Destek madde: Corasil, Zipax, vs.

Hareketsiz faz: , '-oksidipropionitril (BOP), hidrokarbonpolimer (HCP), siyanoetilsilikon , vb.

Hareketli faz: Su, organik çözücüler veya karışımları
Dedektör:  UV - VIS spektrofotometre, refraktometre, kondüktometre, dedektör olarak
kullanılabildiği gibi floresans dedektör, DAD (Diode Array Dedector) ve kütle spektrometresi de
kullanılmaktadır. Sonuçlar GSK de olduğu gibi kayıt cihazındaki kağıda pikler şeklinde kaydedilir.
Uygulaması: Bir çözücüde çözünebilen bütün organik ve inorganik maddelere uygulanabilir.

İYON DEĞİŞİMİ KROMATOGRAFİSİ

Kromatografi sütununun iyon değiştirici reçine veya modifiye selülozun kağıda emdirilmesi
yollarıyla kullanım sahasına girer.
Hareketsiz faz iyon değiştirici reçinedir. Aromatik bir hidrokarbon olan stiren' in belli miktar
divinilbenzen ile çapraz polimerleşmesi sonucu elde edilir. Çapraz bağlanma uzun zincire 3-boyutlu
bir sistem görünümü verir. Bu sistemde çeşitli büyüklükte porlar bulunur. Bu reçine su ile şişer ve
su organik çözücülerde çözünmez. Ayrıca oksidasyon ve redüksiyona dayanıklıdır.
Bu reçine iyonize olabilen grupların (sülfonik asit, katerner amonyum veya tersiyer amin)
bağlanmasıyla veya metakrilik asit polimerlerinde bulunan karboksilik asit grupları ile anyon ve
katyon değiştirici reçineler elde edilmiş olur. Bazik reçineler anyon; asidik reçineler ise katyon
değiştiricilerdir.
İyon değiştirici reçine taneleri suda şişirildikten sonra bir cam sütuna doldurulur. Ayrılması
istenen karışım uygun bir çözücüde çözüldükten sonra sütuna tatbik edildiğinde çözeltide iyonize
hale geçen karışımdaki maddeler reçine yüzeyindeki iyonize olabilen gruplarla iyon değişimi
yaparak bağlanır. Sonra uygun tampon çözeltilerle elüsyon yaparak karışımdaki maddelerin ayrı
ayrı eldesi sağlanır. İyon değiştirici reçineler sütundaki bütün maddeler elüe edildikten sonra asit
veya bazlarla yıkanarak tekrar eski durumlarına getirilebilir ve defalarca kullanılabilirler.
Hareketsiz faz: İyon değiştirici reçineler
kuvvetli asit(-SO3H ) efektif pH alanı 1-14, Amberlit IR-120, Dower 50, Zeo-Karb 225

8
zayıf asit (-COOH) pH 5-14, Amberlit IRC-50, Zeo-Karb 226
kuvvetli baz (kuaterner amonyum) pH 1-14, Amberlit IRA-400, Dowex-1
zayıf baz (-N(C3H7)2) pH 1-9, Amberlit IR-45
Hareketsiz faz: Tampon çözeltiler
Uygulaması: Amino asitler, proteinler, şekerler (borat kompleksi halinde), peptitler, nükleik asitler

JEL KROMATOGRAFiSi
Jel geçirgenliği (jel filtrasyon) mekanizmasına göre faaliyet gösterir. Yani karışımdaki
maddelerin molekül büyüklüklerine göre ayrılmalarını sağlar.
En çok kullanılan hareketsiz faz dekstran (1,6-diglikoz polimeri) ve epiklorhidrin' in çapraz
polimerleşmesiyle elde edilmiş olan Sephadex' tir. Bu madde su ile şişerek bir jel teşkil eder. Ayrıca
poliakrilamit jelleri, agar ve agaroz da aynı maksatla kullanılır.
Bir çözücü ile şişirilerek hazırlanan jel sütuna doldurulur. Sonra aynı çözücüde çözünmüş
olan madde karışımı üstten tatbik edilir. Büyük moleküller jel matriksine girmeyip jel partikülleri
arasından geçer ve ilk olarak elüe edililer. Küçük moleküller jel partikülleri içinden difüzyon
yoluyla geçerek ilerlerler. En küçük moleküller ise jel matriksi içinde en yavaş hareket ederler ve
son elüe edilirler.
Hareketsiz faz: Dekstran + epiklorhidrin (Sephadex G),  dekstranhidroksipropil eter (Sephadex LH
20), poliakrilamit jeli (Bio-Gel P), poliakriloil morfin (Enzacryl Jeli), polistiren (Bio-Beads S),
polivinilasetat (Merck-o-Gel OR), agaroz jel (Sepharose, Bio-Gel A).
Hareketli faz: Sulu veya organik çözücüler
Uygulanması: Bu teknik proteinler, peptitler, aminoasitler, polisakkaritler, enzimler gibi büyük
moleküllerin ayrılmasında kullanılır.

ORTA BASINÇLI SIVI KROMATOGRAFİSİ

1984 yılından beri kullanılan yeni bir tekniktir. Preparatif amaçla kullanılır. Çözücü pompası
35-38 bar basınç sağladığı için orta basınçlı sıvı kromatografisi olarak anılır. Kullanılan kolon
ebatları: iç çap 2-7 cm, boy 20-50 cm dir. Kolon dolgu materyalinin özelliklerine göre ayırım dört
mekanizma ile de mümkündür. 1-5 gr lık karışımların ayırımı sağlanabilir. YBSK'da kullanılan
dedektörler bu teknik için de uygundur. Elüat bir fraksiyon toplayıcıda toplandığından, benzer
fraksiyonlar birleştirilerek hızlı bir şekilde  büyük miktarda madde izolasyonu gerçekleştirilir.

KAĞIT KROMATOGRAFİSİ
Destek madde olarak kağıdın kullanıldığı kromatografik ayrıma tekniğinde rol alan başlıca
mekanizma partisyondur. Jel filtrasyon haricindeki diğer iki mekanizma da ayırmada rol oynar. Bu
teknikte partisyon mekanizmasının ağır basması kağıdı meydana getiren mikrofibriller arasına
nüfuz eden sudan dolayıdır. Selülozun adsorban özelliklerinden dolayı bir miktar adsorpsiyon da
9
meydana gelir. Kağıt yapımı sırasında lignini yok etmek için asit kullanılır. Bu sırada selülozun
alkol gruplarından bazıları asite çevrilir. İyon değişimi mekanizmasının yer alması bu karboksilik
asit (-COOH) gruplarından dolayıdır. Yani, kısaca kağıt kromatografisinde selüloz yüzünden
adsorpsiyon, su yüzünden partisyon, karboksilik asit grupları yüzünden iyon değişimi mekanizması
rol oynar.
Bu teknikte kullanılan kağıt, ıslandığında kolay parçalanmayan bir nevi süzgeç kağıdıdır.
Şerit şeklinde kesilen kağıdın bir ucuna yakın noktaya (start) ayrımı istenen karışımın çözeltisinden
bir kaç ml, bir kılcal boru ile uygulanır. Leke kuruduktan sonra kağıt şerit sulu ve organik
çözücülerden oluşan çözücü karışımı ile develope edilir. Kağıt kromatografisinde 2 ana usulden biri
kullanılır:
1) inen usul
2) çıkan usul
1) İnen usulde çözücü karışımı kromatografi tankının tepesinde bulunan bir küvete doldurulur ve
kağıt nümune tatbik edilen tarafı üste gelecek şekilde küvetteki çözücü veya çözücü karışımına
daldırılır. Kağıdın çözücü karışımı ile temasta olan ucundan itibaren kapilarite ve yerçekimi tesiri
ile çözücü sürüklenmeye başlar ve karışımdaki maddeleri birbirinden ayrır.
2) Çıkan usulde ise kağıdın numune uygulanan tarafı alta gelecek şekilde kromatografi tankının
dibindeki çözücü karışımına daldırılır. Çözücü kapiler etki sebebiyle kağıt üzerinde yukarı doğru
sürüklenir. Belli bir süre sonunda çözücü kağıt üzerinde belli bir seviyeye yükseldiğinde kağıt
tanktan çıkarılır ve çözücünün yükseldiği seviye (front) işaretlenir. Kağıt hava cereyanında
kurutulur. Ayrılan maddeler çeşitli kimyasal reaktiflerle renklendirilerek tespit edilirler.
Aynı şartlar altında kromatografiye edilen maddeler aynı özellikleri gösterir, aynı mesafede
sürüklenir. Bu özelliklerinden dolayı maddenin kağıt üzerinde yürüdüğü mesafenin (A), çözücünün
yürüdüğü mesafeye (B) cm cinsinden oranı Rf (Retention factor = tutunma faktörü, alıkonma
faktörü) değerini verir.
            A
Rf =  -----
            B
Bu değer 0-1 arasındadır. Değerin ondalıklı sayılarla ifadesi istenmiyorsa hRf değerleri verilir. Bu
Rf x 100 dür. Yani Rf değeri 0.4 olan maddenin hRf değeri 40 tır. Isı, kağıt ve çözücü sistemine
bağlı pek çok faktör yüzünden sabit Rf değerleri elde etmek pek mümkün değildir. Bu sebebten
şahit maddeler kullanılmalıdır. Örneğin karışım, Afyon alkaloitleri karışımı ise morfin, kodein,
tebain vs. şahit maddeler olarak aynı kağıtta kromatografiye edilmelidir. Rf değerlerindeki
tutarsızlıklar Rx değerini bularak azaltılabilir Rx değeri, ayrılması istenen karışıma ne olduğu
bilinen bir madde katıp onun sürüklenme mesafesinin diğer maddelerin sürüklenme mesafelerine
oranını hesaplamakla bulunur.

10
               Bilinmeyen lekenin starta uzaklığı
Rx =      -----------------------------------------
             Bilinen madde lekesinin starta uzaklığı
Kağıt kromatografisinin kalitatif kullanımı yanında kantitatif ve preparatif kullanımı da
vardır. Kantitatif kullanım için karışımın ve şahit maddelerin standart çözeltileri hazırlanır ve
bilinen miktarlar kağıda tatbik edilir. Kromatografi sonunda beliren veya belirtilen lekelerdeki
madde miktarları çeşitli usullerle (kolorimetrik, densitometrik, spektroskopik, vs.) tayin edilir.
Preparatif kullanım için lekenin bulunduğu bölge kesilir ve uygun bir çözücüye geçer. Çözücünün
uçurulmasıyla madde elde edilmiş olur. Preparatif maksatlarla daha kalın kağıtlar kullanılır ve
madde karışımı çözeltisi nokta değil, bir hat teşkil edecek şekilde kağıda tatbik edilir. Developman
sonucu lekeler değil, bantlar meydana gelir.
Hareketsiz faz:  selüloz (Whatman No 1, 3 ve 4 gibi)
Hareketli faz: Su (Sulu çözelti) + organik çözücü (örn: n-butanol:asetik asit: su ; 4:1:1)
Uygulaması: Amino asitler, peptitler, şekerler, nükleik asitler, fenolik maddeler, alkaloitler vb.

İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ

En çok kullanılan kromatografik tekniktir. Destek madde üzerine homojen olarak kaplanmış
bir adsorban tabakası üzerine , µL düzeyinde uygulanan madde karışımlarının uygun çözücü veya
çözücü  karışımları yardımıyla ayrılmasıdır.
Kağıt kromatografisine üstünlüğü:
- çabuk olması
- yakıcı reaktiflerin revelatör (kimyasal belirteç) olarak kullanılabilmesi
- yüksek ısı uygulanabilmesi
- developman sonrası tesbit edilen ayrılmış maddelerin kazınarak elde edilebilmesi
- Rf değerlerinin KK'ne nazaran daha güvenilir olması
- lekelerin şeklinin daha yuvarlakça ve muntazam olmasıdır.
 Genel olarak 4 mekanizma da rol oynar. Ancak asıl ayırım adsorpsiyondan dolayı meydana gelir.
Hareketsiz faz ise bir çözücü veya çözücü karışımıdır. Destek madde olarak cam kullanılır.
Plağın Hazırlanışı:
1) 20x20 cm veya 20x5 cm ebatındaki 5 ila 20 cam plak iyice temizlendikten sonra 1 m
uzunluğundaki plak dökme aletine yerleştirilir.
2) Adsorban madde su ile (1:2) oranında bir balon veya erlende karıştırılır (5 tane 20x20 cm plak
için 30 g adsorban ve 60 ml su)
3) İyice homojen bir süspansiyon elde edildikten sonra plak dökme aletindeki hazneli kabın plaklar
üzerinde bir yönde, bekletilmeden, yürütülmesi ile plaklar ince tabaka halinde adsorbanla kaplanmış
olur.

11
4) Plaklar oda ısısında kurumaya terkedilir.
5) Sonra etüvde (100-120°C) 30 dk veya 1 saat aktive edilir (suyu tamamen uçurulur).
6) Kapalı kutularda toz ve rutubetten muhafaza edilerek saklanır. Analitik amaçlar için 0.25 mm;
preparatif amaçlar için ise 0.5 veya 1 mm kalınlıkta adsorban tabakası kullanılır.
Tankın Hazırlanışı:
Kromatografi tankı kalın camdan yapılmış üstünde kapağı bulunan kutu şeklinde bir kaptır.
1) Tank atmosferinin çözücü buharı ile doymasınıı çabuklaştırmak için tankın iç yüzeyine süzgeç
kağıdı kaplanır.
2) Çözücü veya çözücü karışımı taze olarak hazırlanır ve tankın dibinde 1.5 cm lik bir tabaka teşkil
edecek miktarda dökülür (100 ml).
3) Tankın kapağı vazelin ile yağlanır ve sıkıca kapatılır. Bir müddet tank atmosferinin çözücü ile
doyması beklenir.
 Madde Karışımının Plak Üzerine Uygulanması:
1) Karışım, bir tüpte uygun bir çözücü ile tamamen çözülür.
2) Plağın bir kenarından 3 cm içeride düz bir hat üzerinde kapiller (kılcal) boru ile karışım çözeltisi
küçük leke oluşturacak şekilde uygulanır.
3) Lekenin kuruması beklenir. Gerekirse aynı leke üzerine ikinci bir uygulama yapılır.
4) Şahit maddelerin % 1' lik çözeltileri hazırlanır ve aynı şekilde diğer lekenin en az 1 cm uzağına
uygulanır.
5) Bütün lekeler iyice kurulduktan sonra plak, uygulama yapılan kenar alta gelecek şekilde tank
içine yerleştirilir ve develope edilir.
Plak çözücüyle karşılaştığında kapiler etki ile çözücü adsorban yüzeyinde yükselmeye başlar. Bir
müddet sonra uygulanan maddelerle temasa geçer, maddeleri çözünürlükleri oranında çözer ve
yükselmeye devam eder. Aynı çözünürlükte, aynı polariteye ve özelliklere sahip maddeler birlikte
veya birbirlerine çok yakın hareket ederler. Değişik polariteye sahip maddelerin hareketi ise ya daha
hızlı, ya da daha yavaş olur. Böylelikle karışımdaki maddeler birbirlerinden ayrılırlar.
Çözücü seviyesi 10, 15 veya 20 cm yüksekliğe ulaşınca plak tanktan çıkarılır, çözücünün yükseldiği
mesafe (front) işaretlenir ve hava akımında kurutulur.
Örnek: Çözücü olarak benzen ve adsorban olarak silikajel veya alumina kullanıldığında eter ve
esterler kromatogramın üst kısmında, keton ve aldehitler ortada, alkoller onların altında bulunur.
Asitler ise başlama noktasında kalır, yani hiç sürüklenmezler. Organik asit ve kuvvetli bazlar ya
daha az polar olan türevleri haline sokulduktan sonra ya da  bazik veya asidik çözücülerde ayrılırlar.

Lekelerin Belirlenmesi:
1) Madde renkli ise gün ışığında
2) Floresan ise kısa (254 nm) ve uzun (365 nm) dalga ultraviyole ışığında

12
3) Floresan değilse, floresan madde ihtiva eden adsorban kullanılmışsa, kısa dalga UV ışığı altında
parlak yeşil zeminde siyah leke halinde görülür.
4) Renksiz maddeler genel veya spesifik kimyasal reaktifler (revelatörler) ile renklendirilirler.
İTK' nin KK' ne bir üstünlüğü yakıcı reaktiflerin revelatör olarak kullanılabilmesidir (sülfürik asit,
nitrik asit ). Bu teknikte kullanılan genel bir reaktif püskürtülür ve 200°C civarında ısıtılırsa bütün
organik maddeler kömürleşir ve beyaz zemin üzerinde siyah lekeler halinde belirirler. Uygulamada
daha çok belli madde grupları için spesifik reaktiflerin plağa püskürtülmesiyle lekelerin
renklenmesi sağlanır.

Reaktif  Isı  Gözlem şartı  Teşhis edilen maddeler

Dragendorff   -  Gün ışığı Alkaloitler
%5' lik vanilin-H2SO4  -  " Terpenler
% 60 sulu H2SO4  120°C  Gün ışığı ve UV Steroitler
Anilinhidrojenftalat   105°C  " Şekerler
Ninhidrin  110°C  Gün ışığı Amino Asitler

Sonuçların dokümantasyonu:
Lekeler adsorbanın yüzeyinde belirdikten sonra, ince şeffaf kağıtlar üzerine plağın kopyası
çıkarılarak saklanır. KK' de olduğu gibi İTK'de de Rf veya Rx değerleri tesbit edilebilir. Rf
değerlerinin maddelerin kesin teşhisinde kullanılması sakıncalıdır. Bu yüzden şahit madde
kullanmak en çok kullanılan ve güvenilen yoldur. Birkaç değişik çözücü sisteminde şahit madde ile
aynı Rf değerini veren bilinmeyen  maddenin büyük bir olasılıkla aynı madde olduğu düşünülür.
 İTK ile miktar tayinleri de yapılır. Bunun için karışım ve şahit maddelerin standart çözeltileri
hazırlanıp, bilinen miktarlar plağa uygulanır. Developman sonrası maddelerin UV veya görünen
bölgedeki absorbsiyon özelliklerine göre densitometre denen cihazlarda miktar tayini yapılır.
Ayrıca kolorimetrik ve spekroskopik tayinlerde yapılabilir.
 İTK' nin de KK gibi kalitatif ve kantitatif kullanımı yanında preparatif kullanımı da vardır. Bunun
için 20 x 20 cm veya 20 x 40 cm ebatında plaklar 0.5 mm veya 1 mm kalınlıkta adsorban tabakası
ile kaplanır ve maksimum 30 mg maddenin çözeltisi plak üzerine ince bir hat teşkil edecek şekilde
uygulanır ve bilinen usule göre develope edilir. Ayrılan maddeler bantlar şeklinde gözlenir. Bu
bantların kazınıp, uygun bir çözücü ile elüe edilmesiyle maddeler adsorbandan ayrılıp, saf halde
elde edilirler.

TAS FIRINI
Uçucu olan veya sıcakta buharlaşabilen maddeleri, drogtan doğrudan doğruya İTK plağına
uygulamaya yarayan bir cihazdır. Cihaz 300°C ye kadar ısınabilen termostatlı küçük bir fırın, fırın
içindeki silindirik boşluğa girebilen cam kartuş ve ITK plağını tutan kısımdan ibarettir. Fırın belli
bir sıcaklığa getirildikten sonra kartuşun içine toz drog yerleştirilir. Yanına su ihtiva eden silika
13
(indikatör: pembe) konur. Kartuşun arkası kapatılır. Isı ile bir anda buharlaşan maddeler su buharı
ile sürüklenir ve İTK plağı üzerinde küçük bir leke şeklinde kondanse olurlar. Bundan sonra plak 
develope edilir. Bu teknik özellikle uçucu yağ ve alkaloit taşıyan droglara uygulanır.

KROMATOTRON
Santrifüj gücüyle radyal yönde ayırım sağlayan preparatif bir ince tabaka kromatografisi
yöntemidir. Bu yöntemle preparatif İTK yöntemlerinde olduğu gibi ayrılan bantlar kazınarak
alınmaz, fraksiyonlar halinde toplanabilir. Bu nedenle kolon kromatografisi ile preparatif İTK
yönteminin birlikte uygulandığı bir yöntemdir. Daha kısa zamanda daha az adsorban ve çözücü
kullanılarak gerçekleştirilebilir. Daire şeklindeki cam plak istenen kalınlıkta (1 mm, 2 mm, 4 mm
gibi) CaSO4 oranı İTK' da kullanılanlara oranla daha fazla olan adsorban ile kaplanır. 45° eğimli,
bir motor yardımıyla, sabit bir hızla dönebilen bir cihaza yerleştirilir. Kullanılan adsorban ve
çözücüler İTK' de olduğu gibidir. Karışım merkeze yakın bir yere halka şeklinde uygulanır. Çözücü
sistemi uygulama noktasından damla damla ilave edilir. Ayırım dairesel zonlar  (halkalar) halinde
gerçekleşir. Plağın kenarlarına ulaşan maddeler dışarı atılır ve fraksiyonlar halinde toplanır.
Kullanılmış adsorban tabakası polar çözücü geçirilip temizlendikten sonra tekrar tekrar
kullanılabilir.

DİĞER AYIRMA TEKNİKLERİ

KAĞIT ELEKTROFOREZİ
Elektroforez, bir çözeltideki iyonların elektriksel bir alanın etkisi altında yaptıkları hareketi
anlatmak için kullanılır. Kromatografik bir teknik olarak kabul edilmez. Maddelerin ortamdaki
hareketi kromatografideki esas dört mekanizma ile değil, elektriksel alanın etkisiyle meydana gelir.
Bu teknikte iyonize olabilen maddeler birbirinden ayrılır, iyonize olmayan maddeler ise hareket
etmezler.
Bu teknikte uçları, içi tampon çözelti dolu iki küvet ile temasta olan bir kağıdın ortasına
madde karışımı  uygulanır. Sistem küvetlere daldırılmış olan elektrotlar ile bir elektrik devresine
bağlanır. Devre kapatıldığında kağıdın bir ucu anot (+) diğer ucu ise katot (-) yükle yüklenmiş olur.
Kağıdın ortasına uygulanan karışımdaki maddeler sıvı ortamda iyonize olur ve (+) yüklü iyonlar
katota, (-) yüklü iyonlar ise anota doğru hareket ederler. Alkaloitler yapıları nedeniyle zayıf bazlar
olduklarından katyon gibi hareket edip anota; flavonoitler ise anyon gibi hareket ederek katota
doğru giderler.
Elektroforezde iyonun hareketi şu noktalara bağlıdır:
1) Elektrik akımının direkt etkisi: Bu etki ile iyonlar anot veya katota hareket ederler. Akım
yükseldikçe iyonların hareketi de hızlanır.
2) Buharlaşma sonucu meydana gelen sıvı akımının etkisi: Bir çözeltiden elektrik akımı geçirilirse

14
ısı meydana gelir, bu da çözeltilerinin direncini kıracağından buharlaşma oluşur. Kağıt yüzeyinden
buharlaşma sonucu küvetlerden kağıda elektrolit çözeltisi akımı olur. Bu akım hareket etmekte olan
iyonun karşı yönünde olduğundan iyonun hareketini yavaşlatacak niteliktedir.
3) Elektrik akımı sebebiyle oluşan sıvı akımının etkisi: Kağıt tam nötr değildir. Selüloz
molekülündeki alkol gruplarından bazılarının kağıt yapımı sırasında karboksilik asite
dönüşmesinden dolayı, nötr ve alkali ortamda bu gruplar ( -COO- H+) (-) yükle yüklüdür. Bu (-)
yüklü gruplar doğal olarak anota gitmek isteyeceklerdir. Fakat ortam (kağıt) hareketsiz olduğundan
bu imkansızdır. Bu etkiyi karşılamak (nötralize etmek) için (+) yüklü su moleküllerinin (H3O+)
katota doğru hareket ettileri görülür. Nötr olan moleküllerinde bir miktar katot yönünde hareket
ettikleri görülür. Nötr olan gama-globulin'in katot yönündeki hareketi bu yüzdendir.
Elektroforez tekniği daha çok nötr, asidik ve bazik amino asitlerin ayrımında kullanılır. Ayrılan
maddelerin yerlerinin belirlenmesi KK' deki tekniklerle yapılır.
Kağıt elektroforezi 3 şekilde uygulanır:
1) Yatay Elektroforez: Yukarıda anlatıldığı şekilde uygulanır.
2) Dikey Elektroforez: Bu teknikte kağıt orta yerinden bir çubuk üzerinde eğilir ve uçları tankın
dibindeki iki küvette bulunan elektrolit çözeltisine daldırılır ve elektroforez tekniği uygulanır.
3) Devamlı Elektroforez: Bu teknikte yüksekte asılı duran bir küvet içine elektrolit çözeltisi
doldurulur ve enli bir süzgeç kağıdının alt kenarı üçgenler teşkil edecek şekilde kesilir, alt sağ ve
sol uçları elektrolit çözeltilerine daldırılır. Numune çözeltisi kağıdın üst tarafında bir kenardan
devamlı olarak kağıda uygulanır. Ayrılan maddeler akan elekrolitin tüplere doldurulmasıyla elde
edilirler. Bu teknikle primer, sekonder ve tersiyer aminler birbirlerinden ayrırlar.
 Elektroforez süzgeç kağıdı dışında, ince tabaka halinde yayılmış silikajel üzerinde, alümina, cam
yünü veya jel (agar, nişasta) dolu sütunlarda da yapılabilir.

KAPİLER ELEKTROFOREZ
Hızlı ve verimli ayırım sağlayan modern bir tekniktir. Karışımlardaki yüklü ve nötral, az
miktardaki maddelerin ayırımını sağlar. 60 cm uzunluğundaki kapiler kolona µL düzeyindeki
karışım çözelti halinde 25 kV akım altında uygulanır. Tampon çözelti ile dolu olan kolonunun anot
ucundan uygulama enjektörle yapılır, diğer uç olan katoda elektro-osmoz prensibi ile sürüklenir.
Kolondan ayrılmış olarak çıkan maddeler uygun dedektörlerle (örneğin UV spektrofotometre)
algılanır. Sonuçlar bir yazıcı ile kromatogramlar halinde alınır, pik alanları esas alınarak kantitatif
çalışmaların da yapılması mümkündür.

KARŞI AKIMLA DAĞITIM (Counter Current Distribution)

Kromatografik bir teknik olmamakla beraber prensip olarak partisyon kromatografisine
benzeyen bir ayırma tekniğidir. Bu teknik bir karışımdaki maddelerin çözünürlükleri oranında
birbiriyle karışmayan iki sıvı arasında dağılma prensibine dayanır.
15
Bu teknikte kullanılan cihaz bir seri tüpten (50-400) meydana gelir. Birbirleriyle karışmayan iki
çözücünün karışımı 50:50 oranında çözmesi gereklidir. Bu çözücülerden ağır olanı hareketsiz fazı
oluşturur ve sistemdeki bütün tüplere eşit miktarda yerleştirilir. Karışım (20 g), hareketli fazı
oluşturan üst fazın ilk pozisyonunda çözülür ve ilk tüpe ilave edilir. Sonra sistem hafifce ezilir ve
bağlantı borusu ile üst fazın 2. tüpe geçmesi sağlanır. Aynı anda 1. tüpe depodan taze üst faz ilave
olur. Üst faz 2. tüpten 3.  tübe, oradan da 4. tübe doğru hareket ederek aynı şekilde son tüpe kadar
hareket eder. Bu işlem modern cihazlarda otomatik olarak yapılır. Bu işlem sırasında numunedeki
maddeler çözünürlükleri oranında bu iki faz arasında devamlı partisyona uğrarlar. Sonunda
karışımdaki maddeler belli tüplerde konsantre halde toplanarak birbirlerinden ayrılırlar. Bu tüpler
İTK ile tesbit edilir ve aynı maddeyi taşıyan tüpler birleştirilir. Çözücü uçurulduğunda madde saf
halde elde edilmiş olur. Karşı akımla dağıtım kapsam olarak hem analitik hem de preparatif bir
tekniktir.

ELDE EDİLEN SAF MADDELERİN YAPI TAYİNİ

Elde edilen saf maddelerin yapı tayini son 50 yıl içinde geliştirilen ve kısaca Spektroskopik
Teknikler diye adlandırılan fiziksel tekniklerle gerçekleştirilmektedir. Bu metodlar kısaca aşağıda
özetlenmiştir.
Ultra-Viyole Spektrofotometrisi (Mor Ötesi Spek.): Ultra viyole bölgesi dalga boyu 10-400 nm
olan ışıma sahasıdır. Bütün organik bileşiklerin UV bölgesinde absorbsiyonu vardır, bu absorbsiyon
spektrumu molekülün özellikle konjugasyon derecesi ve aromatikliği hakkında bilgi verir.
İnfrared Spektrofotometrisi (Kırmızı Ötesi Spek.): İnfrared sahası dalga boyu 0.8-500 mm
(dalga sayısı 12500-20 cm-1) olan bölgedir. Infrared spektrumu organik bileşiklerin yapısındaki
fonksiyonlu gruplar hakkında bilgi verir.
NMR (Nükleer Manyetik Rezonans) Spektroskopisi: Moleküllerdeki atomların elektromagnetik
ışımanın belli bir bölgesini absorblamalarının gözlenmesine dayanır. Bütün organik bileşiklerin
analizinde 1H-NMR ve 13C-NMR spektroskopileri kullanılır.  Bu spektrumlar H ve C atomlarının
sayısı ve konumları ile ilgili bilgileri verir.
Kütle Spektrometrisi: Bileşiğin molekül ağırlığı ve yapısı ile ilgili bilgi veren bir yöntemdir.

16