Uvod

Razlikujemo postupke izravne i neizravne laboratorijske dijagnostike. Postupcima

izravne dijagnostike pripadaju izravno otkrivanje virusa ili virusnih dijelova
(uključujući nukleinske kiseline) te izolacija virusa iz tkiva, sekreta i eksudata
bolesnika. Postupci neizravne dijagnostike odnose se na detekciju specifičnih
protutijela u serumu bolesnika. Odabir metode laboratorijske dijagnostike ovisi o
uzročniku i stadiju bolesti. U vrijeme inkubacije uzročnik se rijetko detektira. U
vrijeme pojave kliničkih simptoma moguća je detekcija uzročnika, no rijetko
protutijela. Konačno, u fazi oporavka rijetko se može detektirati uzročnik, no moguća
je detekcija protutijela.

Izolacija (uzgoj) virusa u prošlosti predstavljala je „zlatni standard“. S obzirom da je

uzgoj dugotrajan i zahtjevan, danas je većinom zamijenjen metodama molekularne
dijagnostike. Metode detekcije antigena za neke virusne infekcije (npr. infekcije
dišnog sustava) zamijenjene su osjetljivijim metodama molekularne dijagnostike.
Danas su najčešće korištene serološke metode imunoenzimski i imunofluorescentni
testovi.

Uzorci

Najpovoljnije vrijeme za uzimanje uzoraka odnosi se na prva tri dana trajanja bolesti
(ne poslije sedam dana). Razlikujemo tekuće (mokraća, likvor, ispirak) i krute (tkivo,
obrisak) uzorke. Tekuće uzorke za razliku od krutih nije potrebno staviti u tekući
medij. Transportni medij svojim sadržajem (aminokiseline, šećer, vitamini i soli) i
vlažnošću usporava smrt virusa i stanica u uzorku i sprječava njihovo sušenje.
Većina uzoraka može se pohraniti na nekoliko dana na 4 do 8 stupnjeva C.
Zamrzavanjem uzoraka na -70 stupnjeva C dugotrajnije je očuvana infektivnost
virusa.

Mnoge viruse moguće je detektirati imunofluorescentnim ili imunoenzimskim

bojenjem određenog uzorka. Pripravci tih uzoraka obično sadržavaju stanice
bolesnika na predmetnom stakalcu koje potječu od tkiva dobivenih biopsijom ili iz
razmaza stanica obrisaka i ispiraka. Pripravak stanica za bojenje može se pripremiti
i iz inokulirane stanične kulture, mokraćnog sedimenta, amnijske i peritonealne
tekućine. Uzorke za izolaciju virusa možemo podijeliti u dvije skupine. Prvu skupinu
čine primarno sterilni uzorci koji uglavnom nisu kontaminirani drugim
mikroorganizmima. Druga skupina uzoraka su uzorci većinom kontaminirani drugim
(nevirusnim) patogenima. Kontaminirane uzorke prije inokulacije potrebno je tretirati
antimikrobnim sredstvima.

Izravno otkrivanje virusa

Virusi se mogu otkrivati na dva načina tj. dvije metode - izravno i neizravno
otkrivanje. Izravna dijagnostika se odrađuje s uzorcima koji se uzimaju s mjesta gdje
se virus umnožava ili izlučuje.

● Uzorak urina: uzima se 10-20 ml srednjeg mlaza urina u plastičnu posudicu

● Uzorak likvora: aseptičkom punkcijom uzima se 3-5 ml likvora u epruvetu
● Uzorak nazofaringealnog sekreta: pomoću aspiratora uzima se 1-3ml sekreta
u mukozni ekstraktor
● Uzorak stolice: uzima se 3-4 grama ( uzorak veličine lješnjaka) stolice u
plastičnu posudicu sa žličicom na čepu
● Brisevi kože i sluznica: bris uroniti u epruvetu sa transportnim medijem
(Hanks)
● Uzorak krvi (ako se dokazuje virus ili antigen u stanicama krvi, uzorku se
mora dodati antikoagulans)
● Bioptički materijal
● Slina
● Kornealni otisak

Serološka dijagnostika

Serološka dijagnostika pripada metodama neizravne virološke dijagnostike. Koristi

se za dokaz protutijela na virusne antigene u serumu bolesnika. Serološki testovi se
najčešće primjenjuju u dijagnostici akutnih infekcija ili za utvrđivanje imunosnog
statusa osobe prema određenom virusu. Serološka dijagnostika je značajna za
viruse koji se teško kultiviraju ili je metoda izolacije dugotrajna i komplicirana. Neki
serološki testovi nisu ograničeni na krvni serum pa se mogu provesti i na drugim
tjelesnim tekućinama, kao što su sperma i slina.
Zbog specifičnosti serološke dijagnostike preporuča se testirati parne uzorke
seruma. Prvi serum treba uzorkovati par dana nakon pojave simptoma bolesti, a
drugi dva do tri tjedna nakon prvog.
Prisutnost protutijela protiv virusa u krvi osobe ukazuje na to da je ona bila izložena
tom virusu. Većina seroloških testova mjeri jednu od dvije vrste protutitijela:
imunoglobulin M (IgM) i imunoglobulin G (IgG). IgM se proizvodi u velikim količinama
nedugo nakon što je osoba izložena patogenu, a proizvodnja nakon toga brzo
opada. IgG se također proizvodi pri prvom izlaganju, ali ne tako brzo kao IgM.
Prilikom naknadne izloženosti proizvedena protutitijela su prvenstveno IgG i oni
ostaju u opticaju dulje vrijeme. To utječe na interpretaciju seroloških rezultata:
pozitivan rezultat na IgM sugerira da je osoba trenutno ili nedavno zaražena, dok
pozitivan rezultat za IgG i negativan za IgM sugeriraju da je osoba možda bila
zaražena ili imunizirana u prošlosti.
Serološke reakcije se mogu podijeliti u četiri grupe: 1. testovi koji detektiraju
protutijela koja blokiraju biološke aktivnosti virusa (test neutralizacije i test inhibicije
hemaglutinacije), 2. testovi koji se temelje na biološkim funkcijama protutijela u
kompleksu sa antigenom (aglutinacija, test fiksacije komplementa), 3. testovi koji se
temelje na primjeni obilježenih protutijela (ELISA, imunofluorescencija) i 4. testovi
pomoću kojih se određuje serološki profil protutijela na pojedinačne virusne antigene
(Western blot)
Test neutralizacije- Virus-specifična protutijela, ukoliko su prisutna u serumu,
neutraliziraju virus, tako da on ne može rasti u kulturi.
Test inhibicije hemaglutinacije- Ovim testom detektiraju se protutijela specifična za
viruse (rubela, influenza) koji posjeduju hemaglutinin antigen.
Test aglutinacije- antigen ili protutijelo se adsorbira na inertne čestice (lateks) i
pozitivna reakcija se vidi kao aglutinacija čestica.
Test fiksacije komplementa- zasniva se na činjenici da kompleks protutijelo-antigen
veže („fiksira”) komplement, tako da slobodan komplement nije dostupan za liziranje
senzibiliziranih eritrocita koji se dodaju kao indikator reakcije.
Imunofluorescencija (direktna ili indirektna)- Ovi testovi se zasnivaju na istim
principima kao i ELISA i također mogu detektirati anti-virusna protutijela ili virusni
antigen u uzorku. Umjesto enzim-supstrat detektorskog sustava, u ovim testovima,
za detekciju kompleksa antigen-protutijelo koristi se protutijelo obilježeno
fluorescentnom bojom.
Western blot i srodni rekombinantni imunovezujući eseji omogućavaju određivanje
serološkog profila, odnosno detekciju protutijela na pojedinačne virusne antigene.
Western blot je visoko specifična tehnika jer omogućava detekciju protutijela
specifičnih za različite virusne proteine.
ELISA testovi su najčešće korišteni serološki testovi u rutinskim dijagnostičkim
laboratorijima. U najjednostavnijem obliku antigeni iz uzorka koji se testira
pričvršćeni su na površinu. Zatim se na površinu nanosi odgovarajuće protutijelo,
kako bi moglo vezati antigen. Ovo protutijelo veže se za enzim, a zatim se uklanjaju
sva nevezana protutijela. U završnom koraku dodaje se supstanca koja sadrži enzim
supstrat. Ako je došlo do vezanja, naknadna reakcija proizvodi prepoznatljiv signal,
najčešće promjenom boje. Prednosti ELISA tehnika: brzina izvođenja (većina testova
traje 2-3h), automatizirane su i objektivne su jer se reakcija očitava
spektrofotometrijski.

STANIČNE KULTURE - UZGOJ I PRIPREMA

Biološki sustav in vitro (stanice stavljene u lab.hranjivu podlogu zadržavaju

sposobnost umnožavanja)

1.Nosač stanica - plosnate boce ili epruvete od pyrexa, plastike ili plastične
mikrotitarske pločice s bazenima različita volumena

2. Hranjive podloge za umnožavanje i održavanje stanica a) Podloga za

umnožavanje stanica, (npr. Eagleov medij - sadržava puferski sustav, aminokiseline,
vitamine, šećere, životinjski serum, antibiotike i indikator pH sredine) b) Podloga za
održavanje stanica sadrži minimalne količine tvari potrebnih za život stanica u
stacionarnoj fazi

3. Stanice: primarne stanice, kontinuirane stanične linije i diploidne stanice

VRSTE STANIČNIH KULTURA

Primarne stanične kulture pripremaju se iz različitih tkiva ljudi i životinja (bubreg

majmuna, svinje, kunića, amnion itd.) embrionalnog ili odraslog organizma.
Fibroblasti ili epitelne stanice zbog kontaktne inhibicije rastu u jednom sloju, a krvne
stanice (limfociti) u obliku grozdastih nakupina u otopini podloge obogaćene goveđim
serumom ili čimbenicima rasta. Životni vijek jednoslojne kulture stanica npr.
majmunskog bubrega približno je 15 do 20 dana.
Kontinuirane stanične kulture mogu se rabiti tijekom mnogo godina. Staničnu liniju
smatramo kontinuiranom onda kada je broj supkultivacija neograničen. Te stanične
linije imaju kromosomske nepravilnosti koje se očituju ili u broju ili u građi
kromosoma.

Diploidne stanice imaju očuvani kariotip prirodnih stanica od kojih su dobivene.

Diploidne stanice posjeduju svojstvo kontaktne inhibicije, a supkultivirati ih se može
samo ograničen broj pasaža (30 do 50 uzastopnih supkultivacija).

OPLOĐENA KOKOŠJA JAJA

Oplođena kokošja jaja koriste se za izradu dijagnostičkih virusnih antigena,

određenih virusnih cjepiva i u istraživanjima. Prilikom uzgoja virusa u oplođenim
kokošjim jajima potrebno je voditi računa o tkivnom tropizmu virusa koji određuje
gdje će se virus unijeti u jaje, odnosno koja su mjesta odgovarajuća za rast virusa.
Unutar embrija, ciljana mjesta uključuju amnionsku šupljinu, korioalantoidnu
membranu ili žumanjčanu vreću. Neki se virusi bolje umnožavaju u stanicama
korioalantoidne opne kao na primjer virus velikih boginja, herpesa simpleksa i drugi.
Ostali se virusi uzgajaju u stanicama amnijske vrećice i alantoidne šupljine (virus
influence, virus parotitisa…). Virusna infekcija može oštetiti tkivne membrane,
stvarajući lezije, poremetiti razvoj embrija ili uzrokovati smrt embrija. Prisutnost
virusa otkriva se na temelju patoloških promjena na korioalantoidnoj opni ili embriju,
reakcijom hemaglutinacije i dokazivanjem virusnih antigena primjenom seruma sa
specifičnim protutijelima. Prednosti inokulacije u oplođeno kokošje jaje su cijena i
lako održavanje, manje radne snage, dostupnost, velik izbor tkiva i tekućina,
sterilnost i česta primjena ove metode za uzgoj virusa za proizvodnju cjepiva. Jedina
mana uzgoja u oplođenom kokošjem jajetu jest razlika u mjestu inokulacije koje ovisi
o vrsti virusa.

POKUSNE ŽIVOTINJE

Danas se pokusne životinje iznimno upotrebljavaju u kliničkoj dijagnostici uzročnika

virusnih bolesti. Pokusne životinje, uglavnom glodavci (miš, zamorče, hrčak) i
čimpanze, uporabljuju se u radu s virusima koji se umnažaju samo u životinjama
(Coxsackie virusi podskupine A), s virusima koji se najbrže umnažaju u pokusnim
životinjama (virus bjesnoće, limfocitnoga koriomeningitisa, hepatitisa B, zatim u
istraživanjima patogeneze virusnih infekcija, djelotvornosti antivirusnih lijekova i
cjepiva. Rad s pokusnim životinjama krije i opasnosti, prividno zdrave životinje mogu
biti izvor za ljude vrlo opasnih virusa. Latentne, neopažene (inaparentne) virusne
infekci je, osobito u glodavaca i majmuna, mogu znatno ometati istraživanja, utjecati
na tijek pokusa i uzrokovati pogrešna tumačenja rezultata.
Citopatični učinci virusa u staničnoj kulturi
Citopatogeni učinak (CPE) odnosi se na strukturalne promjene stanica
uzrokovane virusnom invazijom. Zbog nanometarske veličine virusa, danas se koristi
metoda detekcije virusa preko njihovih citopatogenih učinaka. Naime, virusi se jedino
mogu vidjeti preko elektronskih mikroskopa ali, zbog razaranja stanice domaćina
koje virus inficira, možemo otkriti o kojoj vrsti virusa se radi uočavajući promjene
nastale na staničnoj kulturi.
Osnovni primjer citopatogenog učinka je virus-inducirana stanična smrt. Virusi ubijaju
ciljne stanice lizom ili apoptozom te se ti procesi mogu jasno vidjeti na svjetlosnom
mikroskopu.
Još jedan primjer CPE je formiranje sincicija, kada se stanice stapaju jedna s
drugom zbog signalizacije virusnim proteinima. Respiratorni sincijcijski virus (RSV) je
primjer takvog tipa CPE.
Virusno inficirana stanica također mijenja svoju morfologiju, metaboličku aktivnost i
staničnu funkciju. Poznati primjer takvog virusa je Zika virus koji uzrokuje
mikrocefaliju tijekom fetalnog razvoja tako što promovira staničnu hipertrofiju,
adherenciju, disregulaciju stan. ciklusa i staničnu smrt.

UZIMANJE KLINIČKOG MATERIJALA ZA VIROLOŠKE PRETRAGE

Pravilo kod uzimanja kliničkog materija za virološke pretrage glasi:,,Kada se šalju

uzorci kliničkog materijala za mikrobiološke pretrage, treba uvijek imati na umu da će
rezultati biti onoliko dobri koliko su dobri i poslani uzorci.’’ Potrebno je slijediti
protokol o pravilnom odabiru, uzimanju i sigurnom rukovanju uzorka kliničkog
materijala pri slanju u laboratorij. Za pouzdane rezultate mikrobioloških pretraga je
od najveće važnosti odabrati odgovarajući uzorak kliničkog materijala, pravilno ga
uzeti (u pravo vrijeme, s odgovarajućeg mjesta i u dovoljnoj količini), kao i dostaviti ili
eventualno čuvati. Nikada se ne bi trebalo štedjeti na količini uzorka. Suradnja
liječnika i drugog medicinskog osoblja koje se brine o bolesniku i mikrobiološkog
laboratorija je neophodna da bi se dobili rezultati koji će se moći primijeniti na
dobrobit bolesnika.

Opća pravila za uzimanja uzorka kliničkog materijala glase:

■ Uzorak mora potjecati s mjesta infekcije da bi se otkrio etiološki uzročnik.
■ Uzorak treba uzeti u pravilu prije početka antimikrobne terapije, a ako to nije
moguće, potrebno je navesti terapiju koja je primijenjena.
■ Uzorak treba pohraniti u sterilnu posudicu čiji zatvarač dobro prijanja.
■ Treba izbjegavati kontaminaciju uzorka fiziološkom florom.
■ Posudica s uzorkom mora biti pravilno označena, tj. obavezno treba staviti
naljepnicu s imenom i prezimenom bolesnika.
 ■ Na uputnici uz opće identifikacijske podatke bolesnika obvezno treba navesti
vrstu uzorka, datum i vrijeme uzimanja, dijagnozu i/ili vodeće simptome,
laboratorijske i epidemiološke podatke.
■ Na uputnici treba navesti pretragu koja se traži, a ako nije navedena,
laboratorij će sam odrediti pretragu uzimajući u obzir uputnu dijagnozu, dob,
spol i ostale relevantne podatke s kojima raspolaže.
■ Uzorci se mogu uzimati u prijemnoj ambulanti Službe za mikrobiologiju HZJZ-
a ili u drugoj medicinskoj ustanovi i dostavljeni osobno što prije (u pravilu u
roku od 2 – 3 sata ) nakon uzimanja.
■ Neki uzorci se mogu poslati poštom (stolica na ciste i helminte, serum, trajni
preparati). U tom slučaju treba obratiti pozornost na ambalažu za slanje
infektivnih uzoraka kliničkog materijala odnosno uzorci moraju uvijek biti
dobro zatvoreni u čvrst paket (nikako ne u kovertu) kako bi se izbjeglo
lomljenje ambalaže u transportu i istjecanje uzorka zbog opasnosti od
infekcije!
■ Neki se uzorci moraju pohraniti u posebna transportna hranilišta koja se mogu
nabaviti u laboratorijima Službe za mikrobiologiju HZJZ-a.

Upute za uzimanje i slanje uzoraka

Uzorak stolice za virološku pretragu treba uzeti u prva tri dana od početka simptoma
(najbolje 2 unutar 24 sata). Potrebno je 2-3 ml uzorka tekuće stolice ili 1-2 g čvrste
stolice u sterilnoj posudici. Uzorak se odmah dostavlja u prijemnu ambulantu, a ako
to nije moguće potrebno ga je pohraniti na 4 °C na najduže 48 sati. Dostavlja se u
putnom hladnjaku ili termos boci. Ako u roku od 48 sati nije moguće dostaviti uzorak,
potrebno je posavjetovati se s liječnikom mikrobiologom. Uzorak na dulje vrijeme
može biti pohranjen na -18 °C ili niže. Zamrznuti uzorak dostavlja se u prijemnu
ambulantu u ledu u termos boci. Rezultati virološke pretrage uzorka stolice dostupni
su za 2-14 dana.

Duboki obrisak ždrijela (stražnje stijenke farinksa) treba uzeti rotirajućim pokretima,
uz pritisak, izbjegavajući jezik, tonzile i sluznicu usne šupljine. Obrisak se uzima u
prva tri dana bolesti. Obrisak treba uroniti u transportnu podlogu (Hanks), pohraniti
na +4 °C i dostaviti u prijemnu ambulantu najkasnije u roku od 24 sata. Suhi obrisak i
obrisak pohranjen na -18 ºC nije pogodan za virološke pretrage. Rezultati virološke
pretrage dostupni su za 24 sata

Uzorak nazofaringealnog sekreta se u manje djece uzima mukoznim ekstraktorom,

vakuum pumpom i sondom uz eventualnu prethodnu aplikaciju 1 mL sterilne
fiziološke otopine. Uzorak u dobro zatvorenom ekstraktoru treba odmah poslati u
laboratorij ili ga pohranjenog na +4 ºC dostaviti u prijemnu ambulantu najkasnije 24
sata nakon uzimanja. Za virološku pretragu je najkvalitetniji uzorak gornjeg dišnog
sustava. Rezultati virološke pretrage dostupni su za 24 sata.

Kod obriska spojnice oka, ako nema dovoljno eksudata (spojnica je suha), obrisak
(drveni štapić s vatom) treba umočiti u transportni medij ili sterilnu fiziološku otopinu.
Treba dobro obrisati spojnicu donje vjeđe i forniksa od vanjskog prema unutarnjem
kutu oka. Ako treba uzeti obrisak spojnice oba oka, za svako oko treba koristiti
poseban bris i dostaviti u prijemnu ambulantu odvojeno, svakog u svojem sterilnom
kontejneru. Obriske treba dostaviti u prijemnu ambulantu što prije, najbolje u roku od
dva sata. Ako to nije moguće, obriske u transportnoj podlozi treba dostaviti tijekom
24 sata. Za dokaz trahoma preporučujemo uzimanje obrisaka spojnice oka u
prijemnoj ambulanti Službe za mikrobiogiju ili prema dogovoru s liječnikom
mikrobiologom. Rezultati virološke pretrage dostupni su za 24 sata.

Bioptički uzorak tkiva treba staviti u sterilnu fiziološku otopinu i odmah dostaviti u
prijemnu ambulantu. Rezultati izravne dijagnostike (mikroskopije) dostupni su za 24
sata. Rezultati izolacije i identifikacije uzročnika dostupni su za 2 – 21 dan.

Za uzorak seruma ili krvi potrebno je uzeti 3 – 5 mL krvi (10 mL ukoliko se traži više
pretraga) natašte i bez antikoagulansa. U laboratorij može biti dostavljen uzorak krvi
ili seruma. Uzorak seruma može biti pohranjen nekoliko tjedana na +4-8 °C, a na –
18 °C i mnogo duže. Uzorak krvi ne smije biti zamrznut jer nastupa hemoliza te je
takav uzorak neupotrebljiv za serološko testiranje. Hilozan, hemoliziran ili zagađen
uzorak seruma nije pogodan za serološke pretrage. Radi utvrđivanja dinamike
protutijela treba uzeti parni serum u roku od 2 – 3 tjedna. Rezultat seroloških
pretraga dostupni su za 2 – 15 dana.

Uzorak likvora treba uzeti u bolničkoj ustanovi. Za virološku pretragu uzorka likvora
potreban je najmanje 1 mL likvora. Uzorak treba dostaviti u laboratorij u roku od 2
sata. Uzorak likvora može biti pohranjen na +4 ºC najduže tijekom 48 sati. A na -70
°C neograničeno dugo. Rezultati virološke pretrage dostupni su za 2 – 14 dana.

Kod uzimanja uzorka mokraće potrebno je uzeti prvi mlaz prve jutarnje mokraće.Prije
uzimanja uzorka mokraće potrebno je oprati vanjsko spolovilo toplom vodom i
sapunom, te osušiti papirnatom maramicom. Uzorak mokraće treba dostaviti u
laboratorij u roku od dva sata. Ako to nije moguće, uzorak treba pohraniti na +4 °C i
dostaviti u laboratorij najkasnije u roku od 24 sata od uzimanja uzorka. Rezultati
virološke pretrage dostupni su za 3 – 14 dana.

BRZI TESTOVI

Latex testovi

Latex test naziva se još i test aglutinacije. Predstavlja metodu detekcije antigena u
biološkim uzorcima koja se temelji na imunološkoj reakciji stvaranja kompleksa
antigen-protutijelo što vidimo kao aglutaciju. Radi olakšanja vizualizacije aglutinacije
koriste se čestice lateksa. Čestice su obložene specifičnim protutijelom protiv
antigena koji se želi dokazati u uzorku. Da bi došlo do aglutinacije antigen se mora
vezati na više čestica što onda vodi do aglutinacije čestica tako da aglutinacija ovisi
o poprečnom povezivanju polivalentnih antigena. Na podlogu se prvo dodaje otopina
obloženih lateks-čestica, zatim par kapi uzorka koji se testira i uvijek imamo
pozitivnu i negativnu kontrolu. U polju u kojemu se nalazi traženi antigen dolazi do
aglutinacije.

Imunokromatogeni testovi

Predstavljaju kombinaciju kromatografije i imunokemijske reakcije. Sastoje se od

jednokratnih kaseta koje dovode do karakterističnog obojenja koje je završni produkt
i koje označava pozitivan/negativan test na određeni antigen. Koriste se dvije vrste
protutijela. Jedno je na kromatografskom papiru, a drugo je na jastučiću na koji se
stavlja uzorak te je označeno koloidnim zlatom. Nakon postavljanja uzorka, antigen
iz uzorka stvara kompleks s protutijelom koje je označeno zlatom. Kompleks se
pomiče, dolazi u kontakt s protutijelom na membrani i s njime stvara imunokompleks.
To dovodi do pojave ljubičasto-crvene linije u test-području. Uzorak se brzo pomiče
po membrani i test se može očitati u roku od 15 minuta. Protutijela koja nisu stvorila
kompleks sa antigenom nastavljaju migrirati po membrani prema kontrolnoj zoni i
stvaraju kontrolnu liniju što je znak da je test pravilno izveden. Ovi testovi su lako
dostupni, brzi no manje osjetljivi.

VRSTE CJEPIVA

Cjepivo su uzročnici bolesti ili njihovi produkti, pripremljeni na način da potaknu

imunitet, a ne izazovu bolest. Cijepljenje postupak promišljene stimulacije
imunološkog sustava u svrhu zaštite od bolesti. Imamo nekoliko vrsta cjepiva.
Cjepiva sa inaktiviranim virusom sadrže cijele viruse ili njihove sastavne dijelove koji
se ne mogu replicirati i koji sami ne izazivaju bolest, ali potiču imunosni odgovor.
Virus u tim cjepivima je inaktiviran kemikalijama poput ß- propriolaktona, etilen
oksida ili formaldehida, zračenjem ili toplinskom obradom. Neki primjeri cjepiva:
Salkovo cjepivo, cjepiva za gripu, hepatitis A i bjesnoću. Prednosti ovih cjepiva su da
su sigurna za upotrebu jer je virus „mrtav“ i ne može se replicirati u organizmu.
Nedostatak im je taj da je imunost je kratkotrajna i slaba.
Cjepiva s oslabljenim virusom su cjepiva kod kojih je virus sposoban replicirati se u
domaćinu i izazvati infekciju, ali sa nezamjetnim ili blagim simptomima. Virus se
atenuira najčešće pasažiranjem kroz drugog domaćina ili kulturu stanica. Na taj
način postupno se akumuliraju mutacije koje virus čine manje sposobnim izazvati
bolest. Vrlo rijetko mutiraju u soj koji izaziva bolest i kod zdravih ljudi, potrebno ih je
držati u hladnjaku da bi ostala aktivna.
Cjepiva od proteinskih podjedinica su cjepiva načinjena od virusnih dijelova
(glikoproteini i proteini ovojnice ili kapside). prednosti su im da su stabilna i lako se
transportiraju,a mane da je proizvodnja skupa.
Živa rekombinantna cjepiva su cjepiva dobivena tehnologijom rekombinantne DNA
koja omogućuje kloniranje prikladnih virusnih gena,koji kodiraju za antigen,u
nepatogene viruse kao vektore.Tim virusom su napravljena pokusna cjepiva s
genima virusa bjesnoće, hepatitisa B, gripe. Potiču jak i dugotrajan imunosni
odgovor, ali problem je mogućnost stvaranja protutijela protiv samog vektora.
Cjepiva s virusima sličnim česticama su cjepiva čije su strukture složene od virusnih
proteina, ali ne sadrže nukleinsku kiselinu. Često induciraju adekvatan imunosni
odgovor (HPV).
DNA Cjepiva sadrže plazmidne DNA vektore koji kodiraju za antigen/antigene od
interesa i prilikom cijepljenja direktno se unose u stanicu.
Cjepiva od sintetičkih polipeptida predstavljaju fragmente sekvenci proteina
antigena, koji su sintetizirani iz aminokiselina i organizirani su u jednu molekulu ili
supramolekularni kompleks koji potiču imunosni odgovor.

Proizvodnja cjepiva

U samom procesu proizvodnje cjepiva koristimo se tvarima koje u konačnici ne

nalazimo u samom cjepivu. Unatoč tome, izrada cjepiva ne bi bila moguća. Prilikom
proizvodnje se, na taj način, koristimo antibioticima, koji nam jamče sterilnost
podloge, odnosno sprječavaju rast neželjenih organizama. U tu svrhu se mogu,
primjerice, koristiti aminoglikozidi: neomicin, streptomicin, kanamicin… Zatim
koristimo proteine jajeta ili kvasca, posebice kod virusa gripe jer njegova kultura
raste u jajima ili stanicama kvasca. Formaldehid neutralizira toksine virusa i
bakterija. Konačno koristimo i regulatore kiselosti za održavanje optimalnog pH.
Kada smo završili proces proizvodnje, konačno cjepivo sastoji se od virusnog
antigena i pomoćnih tvari: adjuvansa, konzervansa i stabilizatora. Ove pomoćne tvari
pojačavaju imunogeničnost cjepiva, kao i imunosni odgovor na isto te povećavaju
stabilnost i rok trajanja. Adjuvansi su tvari koje pojačavaju imunogeničnost cjepiva. U
tu svrhu koriste se aluminijeve soli. Dokazi upućuju da adjuvansi svoj učinak
ostvaruju kroz nekolicinu mehanizama: 1) omogućavaju kontinuirano otpuštanje
antigena 2) Izazivaju povećanje koncentracije citokina i kemokina 3) time pojačavaju
regrutiranje upalnih stanica 4) amplificiraju unos antigena u stanice i prezentiranje
istog 5) potiču maturaciju antigen prezentirajućih stanica.
Konzervansi se koriste u svrhu zaštite cjepiva od penetracije stranih
mikroorganizama te tako sprječavaju zarazu cijepljene osobe. Neki od istaknutijih
konzervansa su fenol i tiomersal. Tiomersal je spoj koji sadrži živu i osim što je
konzervans, također je i jedan od glavnih argumenata anti-vakserskih zajednica
unatoč dosljednom znanstvenom koncenzusu koji jamči sigurnost dotičnog spoja. U
Hrvatskoj tiomersal koriste 4 od 39 cjepiva ( 2 za tetanus i 2 za difteriju). Stabilizatori
se dodaju u svrhu zaštite cjepiva. U tu se svrhu koriste šećeri, aminokiseline i
proteini. Valja obratiti pozornost da su stabilizatori alergogeni i mogu izazvati
simptome rinoreje, osipa, laringo trahealnog edema i hipotenzije. Stabilizatori su
uvelike rašireni i u Hrvatskoj se koriste primjerice u cjepivima protiv rubele, difterije,
tetanusa… Od ostalih pomoćnih tvari koristimo i površinski aktivne tvari, poput
polisorbata 80, koji održavaju cjepivo koloidnom suspenzijom te time sprječavaju
nakupljanje čestica i grušanje krvi. Konačno koristimo i korigense okusa, poput
saharoze.
Rute administracije cjepiva su peroralno: rotavirus, adenovirus, tifus i kolera virus su
jedina cjepiva u SAD koja se daju peroralno. Parenteralno se daju cjepiva za polio,
H. Influenzae tip B, Hepatitis B virus. Intramuskularno: difterija, hripavac, tetanus...
Intradermalno: tuberkuloza, eventualno kolera. Virusna su cjepiva sastavni dio
obveznog programa cijepljenja u Hrvatskoj. Obvezno cijepljenje protiv sljedećih
bolesti: difterije, tetanusa, hripavca, dječje paralize, ospica, zaušnjaka, rubele,
tuberkuloze, hepatitisa B, bolesti izazvanih s H. influenzae tip B i pneumokokne
bolesti.

PROTUVIRUSNI LIJEKOVI

Antivirusni lijekovi su supstance koje se koriste u liječenju virusnih infekcija.

Antivirusni se lijekovi koriste kako u liječenju, tako i u simptomatskoj kontroli infekcija
koje su uzrokovane različitim virusima kao što su HIV, herpes virus, virus influenzae i
virus hepatitisa. Ovi lijekovi mogu djelovati u različitim stadijima virusne infekcije.
Tako neki antivirusni lijekovi djeluju u stadiju adhezije virusa, neki preveniraju
uncoating virusa, neki inhibiraju virusnu DNA polimerazu, dok će neki sprečavati
otpuštanje zrelih virusnih čestica. Posebnu skupinu čine lijekovi koji se koriste za
liječenje HIV - a, a o njima je više raspravljeno u daljnjem tekstu. Neki od
najpoznatijih virusa su već spomenuti, stoga ćemo njihovo liječenje i opisati. Herpes
virusi se liječe uz pomoć aciklovira, famciklovira i valaciklovira. To su analozi
nukeozida koji onemogućavaju elongaciju lanca i sprečavaju virusnu replikaciju.
Virus influenzae A se liječi uz pomoć amantadina, rimantadina i zanamivira.
Amantadin i rimantadin interferiraju s otpuštanjem virusne nukleinske kiseline u
stanicu putem interakcije s transmembranskom domenom M2 proteina virusa, dok
zanamivir blokira neuraminidazu koja je zaslužna za otpuštanje zrelih čestica virusa
influenzae putem kidanja ostataka sijalinske kiseline. Za liječenje virusa hepatitisa C
koriste se NS3/4A i NS5A inhibitori i interferon alfa. Važan je i mehanizam djelovanja
interferona alfa s obzirom na njegovu široku upotrebu. Vežući se na interferonske
receptore, započinje se JAK/STAT put u stanici i time se stanica priprema za
protuvirusni odgovor. U liječenju HIV-a se koriste inhibitori fuzije (antagonisti CCR5
receptora kao što je maravirok), NNRTI (efavirenz), NRTI (zidovudin, stavudin) te
inhibitori proteaza (indinavir, ritonavir, lopinavir i dr.).
HAART- Visoko aktivna antiretrovirusna terapija

Postoji nekoliko klasa antiretrovirusnih sredstava koja djeluju na različite faze

životnog ciklusa HIV . Upotreba više lijekova koji djeluju na različite virusne ciljeve
poznata je pod nazivom visoko aktivna antiretrovirusna terapija (HAART). HAART
smanjuje ukupni teret HIV-a pacijenta, održava funkciju imunološkog sustava i
sprječava oportunističke infekcije koje često dovode do smrti. Postoji šest klasa
lijekova, koje se obično koriste u kombinaciji za liječenje HIV infekcije.
Antiretrovirusni (ARV) lijekovi široko su klasificirani prema fazi životnog ciklusa
retrovirus koju lijek inhibira. Tipične kombinacije uključuju dva nukleozidna inhibitora
reverzne transkriptaze (NRTI) kao "okosnicu" zajedno s jednim ne-nukleozidnim
inhibitorom reverzne transkriptaze (NNRTI), inhibitorom proteaze (PI) ili inhibitorima
integraze (poznatim i kao inhibitori prijenosa nuklearnih lanaca ili INSTI) kao baza.
Antiretrovirusna terapija (ART) preporučuje se svim osobama zaraženih HIV-om
kako bi se smanjio rizik od progresije bolesti. Pacijenti koji započinju ART-u trebaju
biti vojni i sposobni predati se liječenju i razumjeti koristi i rizične terapije i važnost
pridržavanja. Pacijenti mogu odlučiti odgoditi terapiju, a pružatelji usluga, od
slučajeva do slučaja, mogu odlučiti odgoditi terapiju na temelju kliničkih i/ili
psihosocijalnih čimbenika.Najnovije sheme HAART sastoje se od tri lijeka: 2 NRTI
("okosnica") + a PI/NNRTI / INSTI ("baza"). Početni režimi koriste lijekove prve linije
s visokom učinkovitošću i malim profilom nuspojava.