Dinamikus fényszórás-mérés,

atomi erő mikroszkópia

Dr. Budai Lívia

Sem m elweis Egyet em Gyógyszerésztudományi Kar

http://semmelweis.hu/ Gyógyszerészeti Intézet 2021/22 Nanotechnológia
 Dinamikus fényszórás-mérés

Dynamic Light Scattering: DLS

vagy
Foton korrelációs spektroszkópia
Photon Correlation Spectroscopy

https://wiki.anton-paar.com/hu-hu/a-dinamikus-fenyszoras-alapelvei/
 Brown-mozgás

DLS: A részecskék Brown-mozgását korreláltatja a részecskemérettel.

Nagy részecskék: lassú Brown-mozgás

Kicsi részecskék: gyors Brown-mozgás

Pontos hőmérséklet ismeret szükséges a Brown-mozgás leírásához.

Hőmérséklet – viszkozitás összefüggése

Brown-mozgás sebessége: transzlációs diffúziós koefficiens; D (m2/s)

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Brownian_hierarchical.png
 A hidrodinamikai átmérő I.

A részecske mérete a transzlációs diffúziós koefficiens segítségével a

Stokes-Einstein egyenlettel számítható ki:

d (H): hidrodinamikai átmérő (m)

D = transzlációs diffúziós koefficiens (m2/s)
k = Boltzmann állandó (m²kg/Ks²)
T = abszolút hőmérséklet (K)
η = viszkozitás (Pa·s)

(hidrodinamikai: a részecske folyadékban mért diffúziójára utal)

 A hidrodinamikai átmérő II.

A kapott hidrodinamikai átmérő egy nem szferikus részecske

esetében egy olyan szferikus részecske átmérőjét adja meg, melynek
diffúziós koefficiense a mért részecske diffúziós koefficiensével
egyezik meg.
http://www-f1.ijs.si/~rudi/sola/Dynamic_light_scattering_and_application_to_proteins_in_solutions.pdf
 A diffúzió sebességét befolyásoló tényezők I.

A közeg ionerőssége: a részecskék elektromos kettősrétegének

vastagságát változtatja meg

Alacsony konduktivitás:
kiterjedt elektromos kettősréteget hoz létre,
lassítja a diffúziós sebességet és
nagyobb látszólagos hidrodinamikai átmérő méréséhez vezet

Magas konduktivitás:
csökkenti az elektromos kettősréteg vastagságát és
a mért hidrodinamikai átmérőt is

Mérésekhez alkalmazott standard:

polisztirén latex részecskék 10 mM NaCl-ban hígítva
 A diffúzió sebességét befolyásoló tényezők II.

A részecske felülete:
A részecske felületéhez kötődő polimer helyzete (részecskétől
kinyúlik a közeg felé vagy részecske felületéhez laposan tapad)

A részecske alakja:
Pl. Kis mértékű változás egy oszlop formájú részecske
hosszúságában jelentősebb mértékű diffúziós változást eredményez,
mint annak az átmérőjében bekövetkező változás.

Makromolekulák és proteinek konformációja a diszperziós

közegtől függ.
DLS: konformációs változások mérése
 Rayleigh-szórás

A szórt fény I intenzitása a következő összefüggéssel írható fel, ha

a beeső fény λ hullámhosszúságú, I0 intenzitású fény nem
polarizált, és a gömb alakúnak feltételezett, d átmérőjű
részecskékből álló, átlátszó n törésmutatójú közegen a beeső
irányhoz képest γ szögben szóródik, és a szóró részecskétől való
távolság R:

https://hu.wikipedia.org/wiki/Rayleigh-sz%C3%B3r%C3%A1s
 Izotróp fényszórás

Ha a részecskék mérete kisebb, mint a besugárzó fény

hullámhosszúsága (legfeljebb d = λ/10 vagy megközelítőleg 60
nm He-Ne lézerfény esetén; vertikálisan polarizált fénynél),
akkor a szórt fény izotróp lesz.

https://www.researchgate.net/figure/Isotropic-scattering-and-anisotropic-scattering_fig2_278962164
 Izotróp fényszórás diffúziós koefficiense

n: diffúziós centrumok száma (részecskeszám)

d: részecske átmérő
m: refraktív index
λ: beeső fény hullámhosszúsága

A diffúziós koefficiens fordítottan arányos a beeső fény

hullámhosszúságának 4. hatványával, emiatt
a kis hullámhosszúságú fénnyel történő besugárzás nagyobb
diffúziós koefficienst eredményez.

https://physicsopenlab.org/2019/07/10/light-scattering/
 Rayleigh-szórás alapján

A szórt fény intenzitása arányos a részecske átmerőjének

hatodik hatványával.

Mi a különbség egy 5 nm-es és 50 nm-es részecske

fényszórásának intenzitása között?

Az 50 nm-es részecske fényszórásának intenzitása 106

értékkel nagyobb lesz, mint az 5 nm-es részecskéé.
 Kicsi és nagy részecskék fényszórása

A nagy részecskék beárnyékolhatják a kicsi részecskéket.

Probléma: 1000 nm-es és 10 nm-es részecskéket tartalmazó
szuszpenzió mérése
A teljes szórt fény intenzitáshoz a nagy részecskék járulnak
hozzá nagyobb mértékben.
 Mie-elmélet I.

német fizikus Gustav Mie:

A szemcsék felülete a rajta lévő ezért képesek egymással
elektronok miatt elektromágneses kölcsönhatva létrehozni

teret kelt és a Mie-szórás vagy -

fényelhajlás jelenségét.
a fény elektromágneses sugárzás

Egy anyag a fényt:

abszorbeálhatja,
reflektálhatja,
áteresztheti (transzparens anyagok, gyémánt)

https://www.microtrac.hu/hu/tudastar/mie-szoras-es-mie-elmelet/
 Mie-elmélet II.

Gömb alakú részecskénél a szórt fény mintázata független a beeső

fény irányától.
Szabálytalan részecskealak esetén meghatározó a beeső fény
iránya is.

https://www.microtrac.hu/hu/tudastar/mie-szoras-es-mie-elmelet/
 Mie-elmélet III.

Ha a részecske mérete ekvivalens a beeső fény

hullámhosszúságával:
a szórt fény szögének függvényében komplex minimum-
maximum szórt fény intenzitás mérhető

A szórt fény intenzitása

részecskemérethez
rendelhető.

Malvern DLS Technical Note, Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 Minutes

 Intenzitás fluktuációjának mérése

Dinamikus fényszórás-mérés:
a Brown-mozgás következtében létrejött diffúziós sebesség
mérése;
a szórt fény intenzitásának fluktuációját szükséges mérni.

Statikus rendszerben:
nincs fluktuáció

Világos pöttyök: szórt fény

interferenciájának eredménye
(fényintenzitás növekedés)
Sötét pöttyök: a szórt fény kioltja
egymást
Malvern DLS Technical Note, Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 Minutes
 Szórt fény interferencia

A: destruktív interferencia
B: konstruktív interferencia

Malvern DLS Technical Note, Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 Minutes

 Az interferencia

Az interferencia két, vagy több hullám találkozása, amikor a

hullámok erősíthetik, vagy gyengíthetik egymást, attól
függően, milyen fázisban találkoznak.

Tölgyesi Ferenc, Derka István, Módos Károly : Fogorvosi anyagtan fizikai alapjai 2012
 Intenzitás fluktuációjának mérése II.

Dinamikus rendszerben:
Brown-mozgás miatti folyamatos
változás a szórt fény intenzitásában,
fluktuáció;
... A szórt fény intenzitás mintázatának
. folyamatos követése szükséges.
.. A fluktuáció sebessége a részecske
.
méretétől függ.

. . Világos pöttyök: szórt fény

.. . interferenciájának eredménye
.. (fényintenzitás növekedés)
Sötét pöttyök: a szórt fény kioltja
. .
egymást
.. .
..
Malvern DLS Technical Note, Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 Minutes
 Intenzitás fluktuáció

Kicsi részecskék: intenzitás fluktuációja gyorsabb

Nagy részecskék: az intenzitás fluktuációja lassúbb

http://nanofase.eu/show/dynamic-light-scattering---dls_1286/
 Korrelátor: „jel összehasonlító”

Egy részecske intenzitás fluktuációjának mérése és időbeli

változásának követése.
t: idő δ: időintervallum (ált. nanoszekundum)
A korreláció helyessége az
idő előrehaladásával
csökken.
Kis részecskék: a korreláció
gyorsan csökken (gyors
Brown-mozgás);
Nagy részecskék: a
korreláció lassan csökken. t δt 2δt 3δt 4δt
Malvern DLS Technical Note, Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 Minutes
A korreláció csökkenésének sebessége
a részecskeméret függvényében I.

https://wiki.anton-paar.com/hu-hu/a-dinamikus-fenyszoras-alapelvei/
 A korreláció csökkenésének sebessége
a részecskeméret függvényében II.

Az a pont, amikor a korreláció

szignifikánsan csökkenni kezd
arányos a részecske méretével.

Méret meghatározása: algoritmusok alkalmazásával

https://www.researchgate.net/figure/Schematic-illustration-of-intensity-measurement-and-the-corresponding-autocorrelation_fig2_256467124
 Polidiszperzitás

Meredek korreláció csökkenés:

Monodiszperz minta

Elhúzódó, alacsony
meredekségű csökkenés:
Polidiszperz minta

https://www.biochempeg.com/article/61.html https://www.researchgate.net/figure/Schematic-illustration-of-intensity-measurement-and-the-corresponding-autocorrelation_fig2_256467124
A korrelációs koefficiens – idő függvény

http://www-f1.ijs.si/~rudi/sola/Dynamic_light_scattering_and_application_to_proteins_in_solutions.pdf
 Szemcseméret eloszlás

A grafikonokon ugyanaz a szuszpenzió mérési eredménye látható.

Szferikus részecskék számának aránya: 1:1
Részecskék átmérője: 5 nm és 50 nm

Gömb térfogata: I ~ d6

Részecskeszám Térfogat Intenzitás

https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Analytical_Chemistry/Physical_Methods_in_Chemistry_and_Nano
Átmérő (nm)
_Science_(Barron)/02%3A_Physical_and_Thermal_Analysis/2.04%3A_Dynamic_Light_Scattering
 Készülék felépítése

1. Lézerfény forrás
2. Mintatartó küvetta
3. Detektor
4. Attenuátor
5. Korrelátor
6. Számítógép

Malvern DLS Technical Note, Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 Minutes

 Attenuátor szerepe

A szórt fény intenzitásának meghatározott keretek között kell

lennie a sikeres detektáláshoz.
Túl nagy intenzitású szórt fény esetén a detektor telítődik,
ezért a lézerfény intenzitásának csökkentése szükséges
attenuátor alkalmazásával.
Amennyiben kicsi részecskeméretű és kis koncentrációjú minta
meghatározása szükséges, aminek szórt fény intenzitása
alacsony, akkor az attenuátor több fényt enged át a lézerfényből
a mintára.

Malvern DLS Technical Note, Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 Minutes

 Nem invazív „backscatter” detektor I.

A detektor és a minta nincs

közvetlen kapcsolatban:
nem invazív technika

Backscatter:
a visszafelé (fényforrás
irányába) szórt fény
intenzitásának mérése

Malvern DLS Technical Note, Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 Minutes

 Nem invazív „backscatter” detektor II.

Előnyei:
a lézerfény nem tesz meg nagy utat a mintában – csökken a
multiplikációs fényszórás (a fény egyik részecskéről a másikra szóródik);
magasabb koncentrációjú minták is mérhetőek
Szennyező részecskék ált. nagyobb méretűek összehasonlítva a
mintában lévő nanoméretű részecskékkel és ált. nem visszafelé, hanem
előre történik a fényszórásuk. Így a porszennyeződésekből fakadó
háttérzaj kiküszöbölhető.

Malvern DLS Technical Note, Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 Minutes

 A fókuszáló lencse változtatható mérési pozíciója

Kis részecseméret és/vagy alacsony koncentrációjú minta:

Előnyös, ha a szórt fény intenzitását és ezzel a szórt fény által a
mintában megtett utat maximalizáljuk
Nagy részecskeméret és/vagy magas koncentrációjú minta:
A szórt fény mintában megtett útját minimalizálni szükséges

Malvern DLS Technical Note, Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 Minutes

 Protein aggregátumok jelenlétének nyomon követése

Protein aggregátumok megjelenése:

csökkent hatékonyságot,
immunológiai reakciók kiváltását eredményezheti,
megváltozott toxicitást.

DLS: a szórt fény intenzitása a molekula sugarának hatodik

hatványával arányos.

Protein aggregátumok
kis mennyiségének
kimutatására alkalmas.

http://www-f1.ijs.si/~rudi/sola/Dynamic_light_scattering_and_application_to_proteins_in_solutions.pdf
 Proteinek termostabilitásának mérése

Melegítés hatására a proteinek denaturálódnak, ami masszív

aggregátumképzést eredményez.
A hőmérséklet és a méret nyomon követésével proteinek
olvadáspontja meghatározható. Az olvadáspont fölött jelentős
mértékű aggregátumképzés és ezáltal méretbeli növekedés
figyelhető meg, ami a szórt fény intenzitásának növekedését idézi
elő.

http://www-f1.ijs.si/~rudi/sola/Dynamic_light_scattering_and_application_to_proteins_in_solutions.pdf
Atomi erő mikroszkópia
 Mikroszkóp

Mikroszkóp: a görög mikron (μικρόν, kicsiny) és szkopein

(σκοπείν, nézni) szavakból
Pásztázószondás mikroszkópok:
a tárgy leképezése nem különböző sugárzások segítségével
történik, hanem egy nagyon hegyes, tűszerű szondával tapogatjuk
le a vizsgálni kívánt felületet.
Az atomi erő mikroszkóp (atomic force microscope, AFM):
az atomok szintjén jelentkező kölcsönhatásokat (atomi erőket)
képes detektálni
Az első AFM-et Binnig, Quate és Gerber építették 1986-ban.
Tölgyesi Ferenc, Derka István, Módos Károly : Fogorvosi anyagtan fizikai alapjai 2012
 Atomi erők detektálása

Atomok közötti elektrosztatikus kölcsönhatások:

pozitív töltésű mag, negatív elektronfelhő
Nagyobb távolságoknál a vonzó kölcsönhatások
érvényesülnek (atommag és másik atom elektronfelhője)
Az atomok közötti távolságot jelentősen csökkentve a taszítás
domináns.

A pásztázószondás mikroszkóp tűszerű szondája

Tölgyesi Ferenc, Derka István, Módos Károly : Fogorvosi anyagtan fizikai alapjai 2012 https://www.ducksters.com/science/the_atom.php
 Tűszonda-rugólapka rendszer

A tűhegynek és a mintafelületnek az egymáshoz legközelebb

kerülő atomjai között távolságfüggő, atomi szintű, vonzó és
taszító kölcsönhatások lépnek fel.

Dr. Bozó Tamás: Kohleát nanorészecskék biofizikai jellemzése, doktori értekezés, Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola, 2018
 Tűszonda-rugólapka rendszer II.

A tűre ható vonzás, illetve taszítás a laprugó

elhajlását okozza. A rugólapka felülete
fényvisszaverő fémréteggel van bevonva.
A lapka végére keskeny lézerfény-nyaláb
fókuszálása szükséges. A visszaverődő
fénynyaláb egy négyosztatú pozícióérzékelő
diódára esik, amelynek kvadránsain a
fényintenzitással arányos fotoáram keletkezik.
A diódáról feszültségjelek vezethetőek el,
melyek elemzésével a lézersugár pozíciója és a
rugólapka elhajlása (Δl) meghatározható.
Dr. Bozó Tamás: Kohleát nanorészecskék biofizikai jellemzése, doktori értekezés, Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola, 2018
 Hooke-törvény

A tűhegyre ható erő (F) a Hooke-törvényből számítható ki:

F = k· Δl
k: a rugólapka rugóállandója
Δl: a rugólapka elhajlásának mértéke

Rugólapka hosszúsága: ált. néhány 10 µm

A tű alakja: tetraéderes, kónuszos, hengeres stb.

Dr. Bozó Tamás: Kohleát nanorészecskék biofizikai jellemzése, doktori értekezés, Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola, 2018
 Kontaktmód (konstanserő-mód)

A rugólapka elhajlásának mértéke: konstans értékű

Ahhoz, hogy a rugólapka elhajlása akkor se változzon, ha a pásztázás
közben a tű egy felületi mélyedéshez vagy emelkedéshez érkezik, a
rugólapka z-pozícióját (magassági információ) kell korrigálni.
A mérés során a tű végigkarcolja a felszínt.
Hátránya: képlékeny minták deformációja

Dr. Bozó Tamás: Kohleát nanorészecskék biofizikai jellemzése, doktori értekezés, Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola, 2018
 Non-kontakt (tapping vagy tapogató mód)

Non-kontakt módban a rugólapkát adott frekvenciaértéken

rezegtetjük. Ha a rezgő rugólapka-tű rendszert a felszínhez
közelítjük, a tűhegyre ható vonzó vagy taszító kölcsönhatás miatt
a rezgési amplitúdó változik. A feedback feladata ebben az
esetben az, hogy a rezgési amplitúdót egy előre meghatározott
értéken tartsa.

Dr. Bozó Tamás: Kohleát nanorészecskék biofizikai jellemzése, doktori értekezés, Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola, 2018
 Vékonyabb tű élesebb képfelbontást nyújt

szélesebb tű,
kevésbé éles
képet
eredményez

vékony tű,
élesebb képet
eredményez

https://journals.asm.org/doi/pdf/10.1128/MMBR.00041-10
 Tárgyasztal mozgatása

A pásztázószondás mikroszkópok felbontását a szonda

hegyessége és a pásztázás finomsága szabja meg.
Tárgyasztal mozgatása: piezoelektromos effektus
A tárgyasztalt piezoelektromos kristályok mozgatják, amelyek a
rájuk kapcsolt elektromos feszültség hatására változtatják
méretüket a feszültség nagyságával arányosan.
Néhány voltos feszültség már elegendő század nanométeres
lépésekhez.

Tölgyesi Ferenc, Derka István, Módos Károly : Fogorvosi anyagtan fizikai alapjai 2012
 Piezoelektromosság (piezoelektromos effektus)

Egyes kristályokban elektromos feszültség generálódik

összenyomás hatására. Csak bizonyos kristályok (pl. kvarc, bárium-
titanát) mutatják ezt a jelenséget és csak akkor, ha megfelelő irányból
nyomjuk össze őket.
A kristályra gyakorolt nyomás hatására deformáció és a kristály
belsejében töltésszétválasztás jön létre, aminek az eredménye az
ellentétes felületeken megjelenő negatív, ill. pozitív töltések. A két
felület között elektromos feszültség (U) mérhető, amelynek nagysága a
deformáció mértékétől függ.

Tölgyesi Ferenc, Derka István, Módos Károly : Fogorvosi anyagtan fizikai alapjai 2012
 Inverz piezoelektromosság

Ha elektromos feszültséget kapcsolunk egy kvarc kristályra, az

deformálódik — ez az inverz (vagy reciprok) piezoelektromos
hatás.
Pl. 10 V feszültség hatására a kristály 0,01 nm-nyit deformálódik

Tölgyesi Ferenc, Derka István, Módos Károly : Fogorvosi anyagtan fizikai alapjai 2012
 Az atomi erő mikroszkóp (AFM) felépítése

Tölgyesi Ferenc, Derka István, Módos Károly : Fogorvosi anyagtan fizikai alapjai 2012
 Képi megjelenítés I.

A magasság-kontraszt kép az (x, y) felületi koordinátákhoz

tartozó magasság információt jeleníti meg színskálázás
segítségével.

Nanocsővel összekötött B-limfociták

Dr. Bozó Tamás: Kohleát nanorészecskék biofizikai jellemzése, doktori értekezés, Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola, 2018
 Képi megjelenítés II.

Elhajlás-kontraszt, illetve amplitúdó-kontraszt kép a kontakt-,

illetve a non-kontakt módú mérés esetén:
Az előre meghatározott elhajlástól és a rezgési amplitúdótól való
eltérések felületi eloszlását ábrázolja színskálázással.

Nanocsővel összekötött B-limfociták

Dr. Bozó Tamás: Kohleát nanorészecskék biofizikai jellemzése, doktori értekezés, Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola, 2018
 Képi megjelenítés III.

A non-kontakt képalkotás esetén egy harmadik képtípust, a fázis-

kontraszt képet is használják.
Ez a rugólapkát gerjesztő rezgés és a rugólapka kényszerrezgése
közötti fáziskülönbséget rendeli hozzá minden (x, y) pozícióhoz.

Nanocsővel összekötött B-limfociták

Dr. Bozó Tamás: Kohleát nanorészecskék biofizikai jellemzése, doktori értekezés, Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola, 2018
 AFM előnyei

A minták fixálási vagy festési eljárást nem igényelnek

A módszer mentesül a mintaelőkészítés termékeitől
A pásztázás mind gáz, mind folyadék közegben végezhető
(biológiai minták pufferben vizsgálhatóak)
Élő sejtek, natív szerkezetű biomolekulák vizsgálhatóak
A képalkotás közben a közeg összetétele és hőmérséklete
változtatható

Dr. Bozó Tamás: Kohleát nanorészecskék biofizikai jellemzése, doktori értekezés, Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola, 2018
 AFM hátrányai

•A pásztázás lassú folyamat (egy kép elkészítése méretétől

függően néhány másodpertől akár több tíz percig is tarthat)
•Topográfiai kép készül (a felszínről hordoz információt)
•Ha egyes molekulák felülethez történő kötődése nem elég stabil,
akkor pásztázás közben lesodorható a felszínről.
(Minél laposabb a minta, annál könnyebb róla képet készíteni)

Dr. Bozó Tamás: Kohleát nanorészecskék biofizikai jellemzése, doktori értekezés, Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola, 2018
 Erőspektroszkópia

Az AFM – a képalkotáson túl – lehetővé teszi a minta néhány

mechanikai tulajdonságának vizsgálatát is.
A tű segítségével mechanikai manipulációnak vethetjük alá a
minta felületének bármely pontját, és eközben detektálhatjuk a
rugólapkára ható erőket.
Az erőspektroszkópia során a rugólapka tűjét adott sebességgel a
felület egy adott pontjába nyomjuk, majd, esetleg némi várakozás
után, visszahúzzuk.
Erőgörbe detektálható.

Dr. Bozó Tamás: Kohleát nanorészecskék biofizikai jellemzése, doktori értekezés, Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola, 2018
http://biomechanicalregulation-lab.org/afm
 Lactobacillus törzsek AFM felvételei

https://www.researchgate.net/figure/Representative-atomic-force-microscopy-AFM-amplitude-images-of-Lactobacilli-and-their_fig1_330706866
 AFM felvételek

A:
Moloney rágcsáló
leukémia vírus

B:
Vakcínia vírus

C:
Bakteriofág

D:
Mimivírus

https://journals.asm.org/doi/pdf/10.1128/MMBR.00041-10
Köszönöm szépen a figyelmet!