Professional Documents
Culture Documents
Báo Cáo Cerebroside
Báo Cáo Cerebroside
Báo Cáo Cerebroside
1
BRUCE D. WHITAKER
USDA, Agricultural Research Service, Horticultural Crops Quality Laboratory,
Beltsville Agricultural Research Center-West, Beltsville, MD 20705-2350, U.S.A.
(Received in revised form 4 December 1995)
Tóm tắt: Các Cerebroside (CBs) được phân lập từ các lipid ở mô vỏ của quả
ớt chuông và quả cà chua còn xanh và chín đỏ bằng phương pháp HPLC (sắc
ký lỏng hiệu năng cao) thành sáu thành phần trở lên. Biểu đồ HPLC ở hai loại
quả là khá giống nhau và ít thay đổi khi chín. CB 1 là đỉnh chính; CB 2 chỉ
được tìm thấy trong quả ớt chuông; CB 4, 5 và 6 có nhiều trong ớt chuông
hơn là trong cà chua. Tổng các CBs và HPLC/CB đã được phân tách để phân
tích các acid béo (FAs), sphingoid (SPs) và đường có trong CBs. Các CBs của
cà chua và ớt chuông có hơn 95% là acid béo (2-hydroxyl) bão hòa. CB 1 và
2, 2-hydroxyl 16: 0 chiếm khoảng 98% trong tổng số các acid béo, trong khi
2-hydroxyl 22:0, 23:0 và 24:0 chiếm ưu thế trong CB 4, 5 và 6. SPs được biến
đổi sang dạng dẫn xuất peracetate của chúng để phân tích bằng HPLC, GLC
và GC-MS. Các SPs của CB 1 và CB 2 được xác định là đồng phân của 4,8
-sphingadienine và 8 -sphingenine. SPs của CB 4, 5 và 6 được xác định là
đồng phân của 4-hydroxy-8-sphingenine. Glucose là đường duy nhất có trong
các cerebroside của ớt chuông và cà chua. CBs chính trong cả hai loại quả
trên được xác định là 1- O -β -glucosyl- N - (2'-hydroxypalmitoyl) -4 -trans -8
-cis -phingadienine.
2
PHẦN 1. GIỚI THIỆU
hexose, một chuỗi aminoalcohol dài (sphingoid; SP) và một chuỗi acid béo (FA)
được nối với sphingoid bằng liên kết amide. Galacto- cerebrosides lần đầu tiên
được phân lập từ mô võ não vào cuối những năm 1800. Ở những động vật có vú,
CBs bao gồm acid béo bão hòa (n-alkyl và 2-hydroxy-FAs) với sphingosine (4-
gluco-cerebrosides (glucoCBs) được tìm thấy rất ít (<1%) trong các lipid được
phát hiện ở mô thực vật. Có lẽ do chúng chiếm một phần rất nhỏ trong tổng số các
lipid có ở mô thực vật nên glucoCBs ít được chú ý trước khi được biết đến (sau sự
phát triển của phương pháp phân vùng màng 2 pha) với vai trò là chất chủ yếu có
trong thành phần của màng tế bào. Một số báo cáo cũng cho thấy glucoCBs có ảnh
hưởng đến các tổn thương ở mô thực vật ở nhiệt độ thấp hay khi thực vật đang
Việc phân tích các đặc điểm vật lý và hóa học đã được thực hiện từ các
CBs được phân lập từ hạt hoặc lá của một số loài cây một lá mầm
tương, đậu mung và rau bina. CBs từ tất cả các nguồn thực vật cho đến nay đã
được xác định gồm một glucose duy nhất là đường hexose liên kết với nhóm 1-
hydroxyl của sphingoid bằng liên kết -1. CBs của thực vật thường chủ yếu gồm
3
acid béo bão hòa hoặc không bão hòa đơn (chỉ có một liên kết đôi ở vị trí từ Cl4
đến C26). Các SPs chính thường là dihydroxyl base sphinganine, 8-sphingenine và
và 4-hydroxy-8-sphingenine. Đây là những thông tin cụ thể nhất về cấu trúc CBs
của thực vật đã được phân lập và báo cáo ở lá và hạt của cây ngũ cốc. Sự ảnh
hưởng của glucoCBs đến những tổn thương ở mô thực vật ở nhiệt độ thấp hay khi
thực vật đang trong tình trạng thiếu nước dựa trên các chứng minh cho rằng
glycosphingolipid có nhiệt chuyển pha cao (Tm) hơn so với nhiệt độ môi trường
xung quanh (35 – 56 °C) và cũng làm tăng nhiệt chuyển pha của màng
phospholipid.
Trong các loại rau và trái cây, CBs đã được phân lập từ củ khoai mỡ trắng,
khoai lang, khoai tây và táo. CBs từ khoai tây và táo được chứng minh rằng chỉ
chứa glucose, acid béo và các sphingoid chưa được xác định rõ. Trong nghiên cứu
này, CBs đã được phân lập từ mô vỏ bên ngoài của hai loại quả khác nhau là ớt
chuông và cà chua ở hai giai đoạn phát triển khác nhau của quả là : chưa chín (còn
xanh) và chín đỏ, phân tích định tính CBs bằng phương pháp sắc kí pha đảo
4
PHẦN 2. KẾT QUẢ
Bảng 1. Cerebroside (CB) có trong mô vỏ của quả ớt chuông và quả cà chua khi quả còn
xanh (MG) và chín đỏ (RR). Các giá trị cho biết phần trăm diện tích của tổng số đỉnh CB
ở 205nm và đại diện cho giá trị trung bình của ba phép đo xác định (± sai số).
5
Hình 1. Đồ thị HPLC của cerebrosides được phân lập từ mô của vỏ quả ớt chuông xanh
trưởng thành. Sáu đỉnh CB cực đại (đánh số từ 1-6) được xác định bằng quang phổ UV ở
205 nm trong 40 phút.
Đồ thị HPLC của CBs được phân lập từ mô vỏ của quả ớt chuông xanh
trưởng thành được biểu diễn trong Hình 1. Thành phần chính (CB 1) được rửa giải
sau 22 phút và khoảng 1 phút sau xuất hiện đỉnh thứ 2 (CB 2). Ba đỉnh cực đại khá
lớn còn lại (CB 4,5,6) được rửa giải trong khoảng từ 31 đến 39 phút. Các đỉnh phụ
trước CB 1 là tạp chất steryl glycoside. Tỷ lệ của các CBs chính thay đổi ở trái chín
(Bảng 1): giảm CB 1 và CB 2 , tăng nhẹ CB 3-5. Một số CBs nhỏ rửa giải từ 25
đến 31 phút (Hình 1), nhưng chúng không có sự tách biệt lớn về định lượng hay
đặc trưng.
6
2.2 Trên quả cà chua khi còn xanh
Hình 2. Đồ thị HPLC của cerebroside được phân lập từ mô của vỏ quả cà chua xanh
trưởng thành. Năm đỉnh CB được xác định bằng quang phổ UV ở 205 nm trong 40 phút.
Các đỉnh 1,3,4,6 có vị trí giống với quả ớt chuông xanh.
Sơ đồ HPLC của CBs từ quả cà chua xanh được thể hiện trong Hình 2.
Ngoại trừ đỉnh CB 2 không xuất hiện thì các đỉnh CB chính trong cà chua cũng
giống như ớt chuông. Đỉnh CB 1 chiếm ưu thế trong cà chua và đỉnh CB 6 đứng
thứ hai về mặc số lượng. Thay đổi về tỷ lệ của các CBs ở quả cà chua chín rõ rệt
hơn ở ớt chuông (Bảng 1). Lượng CB 1 giảm được cân bằng với sự gia tăng ở CB
3, 5 và 6. Sơ đồ HPLC trong hình 2 cho thấy sự phân tách của đỉnh CB 1 , cho biết
sự hiện diện của hai thành phần. Các đỉnh CBs chính khác cũng thường xuất hiện
7
2.3 Định lượng CBs và định tính các thành phần của CBs
Bảng 2: Thành phần các acid béo có trong CBs phân lập từ mô vỏ của quả ớt chuông và
cà chua ở thời điểm quả chưa chín (MG) và quả chín (RR). Các acid béo đều là 2-
hydroxyl-FAs và được phân tích dưới dạng methyl ester bằng FDI-GC. Giá trị được biểu
diễn bằng % khối lượng của tổng lượng methyl ester và đại diện cho giá trị trung bình
của ba phép xác định (± sai số)
Định lượng tổng số CBs (trên mỗi g.fr. wt ) của mô vỏ bằng cách xác định
lượng glucose và lượng acid béo 2-hydroxy-FAs (sử dụng 2- hydroxyl 18: 0 metyl
este làm chất nội chuẩn) sau phản ứng HCl methanolysis của mẫu CB. Nồng độ
CBs trong vỏ ớt chuông cao gấp bốn lần so với vỏ cà chua. Khi chín từ xanh lục
sang đỏ, CBs giảm từ 45 xuống 36 nmol.g-1.fr.wt trọng lượng trong ớt chuông và từ
10,1 đến 9,8 nmol.g-1.fr.wt trong cà chua (giá trị trung bình của ba lần xác định).
Các acid béo (2-hydroxy-FAs) của các CBs ở quả chưa chín và qủa chín cùng các
phân đoạn CBs tinh chế bằng phương pháp HPLC được thể hiện trong Bảng 2. Sáu
FAs được phát hiện bao gồm 2-hydroxyl 16: 0 (16: 0h) và cả các FAs có chuỗi
carbon chẳn và lẽ khác nhau, từ 2-hydroxyl 22: 0 đến 26: 0 (tức là 22: 0h, 23: 0h,
24: 0h, 25: 0h và 26: 0h). Đối với cả ớt chuông và cà chua, 16: 0h là FAs chiếm ưu
8
thế, bất kể giai đoạn còn xanh hay đã chín. Cả 22: 0h và 24: 0h đều là những FAs
chính trong CBs của ớt chuông, trong khi 24: 0h là FAs chính duy nhất của CBs ở
cà chua. Các FAs của CBs 1 và 2 từ ớt chuông, cũng như CBs 1 từ cà chua, hầu
như chỉ có 16: 0h (t ≥ 96%). FAs của CB 4 và 5 từ ớt chuông chủ yếu là 22: 0h và
23: 0h theo tỷ lệ 2: 1, trong khi FAs của CB 6 từ ớt chuông gần như hoàn toàn là
24: 0h.
chế bằng HPLC và được phân tích bằng mao quản FID-GC. Thứ tự thời gian lưu
(9,0 phút) <4-hydroxysphinganine (9,8 phút) < sphinganine (10,7 phút). Do đó, các
của chúng; tất cả đều được rửa giải sớm hơn các SP axetate tiêu chuẩn. Như vậy
với HPLC, việc lưu giữ GC của SP axetat từ các CBs của hai loại quả không phù
hợp với bất kỳ tiêu chuẩn nào trong ba tiêu chuẩn. Trong số các tiêu chuẩn, thêm
liên kết đôi 4-trans vào sphinganine làm giảm thời gian lưu giữ GC một chút, trong
khi về cơ bản việc bổ sung 4-hydroxyl làm tăng thời gian lưu. D, L-sphinganine
tiêu chuẩn, là hỗn hợp tiêu triền của đồng phân erythro- và đồng phân threo-, cho
9
hai đỉnh GC theo tỷ lệ 1: 2, trong khi tất cả D-erythro-4-trans-sphingenine và 4-
hydro- xysphinganine tiêu chuẩn chỉ cho một đỉnh GC. Thứ tự thời gian lưu giữ
phút).
và ớt chuông CB 4 + 5 + 6, cũng được phân tích bằng phương pháp khối phổ GC
amoniac ion hóa hóa học. Đối với mỗi SP axetate mẫu, ba ion chính là [M+NH4]+,
[M + H]+, và [M- CO2CH3]+. Như mong đợi, ba ion này đều thấp hơn 2 mu trong
quang phổ của 4-trans-sphingenine triacetate (m/ɀ = 443, 426 và 366), so với
sphinganin triacetat (m/ɀ= 445, 428 và 368) phản ánh sự mất đi hai proton tạo
thành liên kết đôi. Trong phạm vi của 4-hydroxysphinganine tetraacetate, ba ion
chính (m/ɀ = 503, 486 và 426) đều cao hơn 58 mu những chất trong phổ của
sphinganine triacetate (thay thế một proton bằng một gốc axetate). Cả hai các đồng
phân của SP axetate từ cà chua CB 1 có quang phổ gần như giống hệt nhau và ba
ion chính (m/ɀ =441,424 và 364) đều thấp hơn 4 mu so với sphinganinetriacetate,
cho biết sự loại đi bốn proton tạo thành hai liên kết đôi. Hai SP đồng phân axetate
từ ớt chuông CB 2 cũng có quang phổ tương tự và các ion chính (m/ɀ = 43, 426 và
366) phù hợp với 4-trans-sphingenine. Cuối cùng đồng phân của SP axetate từ ớt
10
chuông CB 4 + 5 +6 lại có quang phổ gần giống nhau và mỗi quang phổ các ion
chính (m/ɀ =501, 484 và 424) thấp hơn 2 mu với những chất trong quang phổ của
4-hydro -xysphinganine, điều này thể hiện rõ sự khác biệt của một liên kết đôi. Từ
(Capsicum Minimum L. v. Gator Bell) được trồng trong các thửa ruộng khảo
nghiệm giống cây trồng tại Beltsville, sử dụng lớp phủ nhựa đen và tưới nhỏ giọt.
Trái cây được thu hoạch bằng tay ở các giai đoạn phát triển chín đỏ và xanh (nhận
biết bằng mắt) và được chế biến trong vòng vài giờ sau khi thu hoạch. Các mảnh
mô bên ngoài được giải phóng khỏi hạt và vật chất định vị, được đông lạnh trong
nito lỏng và được bảo quản trong túi nhựa ở -80 °C cho đến khi được sử dụng. Các
mẫu mô (10g fr. Wt), mỗi mẫu được lấy từ một quả, được đông khô (bảo quản khô
Chiết xuất lipid và phân lập các chất cerebrosides. Các mẫu mô khô được
nghiền thành bột và chiết với 25 ml CHCl3 – MeOH (2:1), sử dụng 2 x 30 giây
kích nổ của thiết bị đồng nhất Polytron. Dịch chiết được lọc qua một phễu thủy
11
tinh, tráng giấy lọc bằng 5 m1 CHC13, dịch chiết được rửa bằng phương pháp
Folch. CHCl3 đã rửa được làm bay hơi dưới dòng N2. Tổng lipid ở màng ngoài
được hòa tan lại là 2 ml và được bảo quản trong N2 ở -80°C cho đến khi được phân
đoạn nhỏ. Tổng lipid được tách thành các chất béo trung tính, gIycolipidvà
phospholipid bởi axit salicylic. Sau khi rửa giải chất béo trung tính với CHC13 -
Me2C (20:1) hai glycolipid (GL1 và GL2) được rửa giải tuần tự bằng CHC13 -
Me2CO (1: 1) và Me2CO - MeOH (20:1). CBs chỉ được tìm thấy trong GL2, được
hòa tan trong MeOH - CHC13 (9:1) chứa KOH 0,6 M và lắc trong 4 giờ để loại bỏ
các tạp chất glyxerolipids. Chất béo không xà phòng hóa có nguồn gốc từ GL2
được TLC phân tách trên silica gel 60 (EM Science, Darmstadt) bằng cách sử dụng
CHC13 -Me2CO - MeOH – HOAc - H2O (10:4:2:2:1). CB chạy trên bản mỏng rộng
1 cm từ Rf 0,59 đến 0,64 và được rửa giải khỏi chất hấp phụ bằng CHC13 - MeOH
(2:1) sau đó rửa bằng phương pháp Folch. TLC-tinh khiết bao gồm 96 - 99% CB
HPLC tách và phân tích các cerebrosides. Cột HPLC được sử dụng để phân
tích CB là C6 (hexyl) pha ngược trong 5 μm Spherisorb, 150 x 4,6 mm i.d. từ Phase
Sepages, Inc. (Norwalk, CT). Phần riêng của CB được thực hiện bằng cách sử
dụng một gradient tuyến tính của MeCN - H2O bắt đầu từ 11: 9, tăng lên 17: 3
trong 35 phút, sau đó trở lại 11: 9 từ 35 đến 40 phút. Lưu lượng được duy trì trong
12
suốt 0,9 ml/phút. Nhâ ̣n biết ở bước sóng 205 nm. Mẫu CB được hòa tan trong
Phân tích các các acid béo, sphingoid và hexose. Mẫu CB bị phân hủy bằng
cách hồi lưu trong 18 giờ ở 75 ° C trong 2N HCL/MeOH. Sau khi thêm H2O, acid
EtOAc. Hỗn hợp MeOH- H2O -CL được làm bay hơi bằng dòng N2 và phần còn lại
được hồi lưu trong 2N HCI để tạo ra một hexose tự do. Hexose được chuyển thành
alditol axetat và được phân tích bởi FID - GC như đã mô tả trước. Phân tích 2-
hydroxy- FAME được FID-GC thực hiện trên 0,25 mm i.d. x 15 m SP 2330 cột
mao quản silica nung chảy (Supelco). Lò cột được lập trình để tăng từ 160 ° C đến
220 °C (3°C/phút); nhiệt độ kim phun và đầu báo tương ứng là 225 °C và 250 °C,
Matreya, Inc. SPs ban đầu được TLC lọc bằng cách sử dụng cùng một hệ thống
như dành cho CBs. Các dải SPs được xác định bằng cách nhuộm ninhydrin. Sau
khi peracetyl hóa bằng cách hồi lưu trong Ac2O- pyridine (1: 1) SPs được tinh chế
và phân lập bằng HPLC pha ngược cột C6 như mô tả ở trên. Các axetat SP được
tinh chế bằng HPLC sau đó được phân tích và xác định bằng FID-GC và GC-MS.
FID-GC được thực hiện đẳng nhiệt ở 240 °C trên 0,25 mm i.d. X 30 m SPB-1 cột
13
PHẦN 4. KẾT LUẬN
Quá trình lão hóa mô tự nhiên, mất nước và tổn thương do bảo quản lạnh là
những vấn đề làm giảm chất lượng và rút ngắn thời hạn sử dụng của cà chua và ớt
chuông. Một khía cạnh quan trọng của vấn đề này là sự mất tính toàn vẹn của hai
màng tế bào: một màng kiểm soát dòng chảy của nước và chất dinh dưỡng vào và
ra khỏi tế bào thực vật và một màng ngăn cách các chất thải và enzym có hại khỏi
phần còn lại của tế bào. Gần đây, người ta đã chỉ ra rằng một nhóm chất béo được
gọi là cerebrosides (CBs) thường là thành phần cấu trúc chính của hai màng này,
và do các đặc tính độc đáo của chúng, CBs được cho là có liên quan đến tổn
thương các mô thực vật do tiếp xúc với nhiệt độ thấp hoặc quá ít nước. Nghiên cứu
này được thực hiện để xác định số lượng và loại CBs có trong mô cà chua và ớt
chuông, và liệu những thay đổi về loại và số lượng CBs có xảy ra với quá trình
chín của những quả này hay không. Thông tin này sẽ giúp các nhà khoa học thực
vật khác xác định tầm quan trọng của CBs trong việc duy trì tính toàn vẹn của
màng trong suốt thời gian sau thu hoạch của trái cây tươi và rau quả. Cuối cùng,
nghiên cứu này sẽ hữu ích trong việc xác định các cách để thay đổi di truyền mô
hình tổng hợp CBs trong rau củ quả và do đó làm giảm tổn thương do lạnh sau thu
14
TÀI LIỆU THAM KHẢO
15
19. Lurie, S. and Ben-Yehoshua, S. (1986) J. Am. Soc. Hort. Sci. 111, 886.
20. Bergevin, M., L'Heureux, G. P., Thompson, J. E. and Willemot, C.
(1993) Physiol. Plant. 87, 522.
21. Whitaker, B. D. (1994) J. Am. Soc. Hort. Sci. 119, 994.
22. Whitaker, B.D. (1995) Physiol. Plant. 93, 683.
23. Lynch, D. V., Caffrey, M., Hogan, J. L. and
Steponkus, P. L. (1992) Biophys. J. 61, 1289.
24. Moreau, R. A., Powell, M. J., Osman, S. F., Whitaker, B. D., Fett, W.
F., Roth, L. R. and O'Brien, D. J. (1995) Analyt. Biochem. 224, 293.
16