Elektroforeza,

Imunoelektroforeza, Western blot

Dr. Mirela Mačkić-Đurović

Viši naučni saradnik
Elektroforeza

grč. ηλεκτρο - elektro = struja + φορέω – foreza

= nositi
• Kretanje čestica pod direktnim uticajem
električne struje i potrebno je:
1. Naelektrisane čestice
2. Medium sposoban da provodi struju
Elektroforeza može biti:
1. Slobodna (u rastvoru)
2. Zonska (na čvrstoj podlozi)

Ispitivani uzorak se nanosi u obliku tačke ili vrpce najčešće na homogeni

i inertni čvrsti ili želatinozni medij (gel ili papir).
Po završteku elektroforeze trake se detektuju bojama za proteine, a intenzitet
boje se meri u denzitometru

Proteini normalnog seruma se elektroforezom razdvajaju u 5 glavnih

zona/traka:
Albumin
α1-globulin (α1 antitripsin)
α2-globulin (haptoglobin i α2 mikroglobulin)
β-globulin (transferin i komponente komplementa)
γ-globulin (imunoglobulini) .
Brzina kretanja čestica

– Neto naboju
– Masi
– Obliku molekula
– Jačini struje
– Svojstvima medija

Gelovi koji se koriste:

poliakrilamid i agaroza,
 Poliakrilamidni gel (PAGE)

• Denaturirajućim uslovima
• Nedenaturirajućim uslovima

-Denaturacija se postiže dodatkom anionskog detergenta SDS-a (natrij-

dodecilsulfat).

- Obradom SDS-om svi proteini postaju negativno nabijeni

-Razdvajenje u električnom polju ostvaruje samo na temelju razlike u

njihovoj veličini.

Ova metoda omogućava:

-identifikaciju proteinskih frakcija u biološkim tekućinama s niskim
koncentracijama proteina (likvor, urin, suze),
-koristiti u istraživačke svrhe (istraživanja proteinskog sastava homogenata
tkiva i stanica, medija staničnih kultura)
Nedenaturirajući gel elektroforeza koristi se za:
- detekciju aktivnosti proteina u gelu,
- -analizu proteinskih kompleksa,
- ispitivanja interakcije među proteinima.
 Elektroforeza na agaroznom gelu

• Visoko pročišćeni prirodni polisaharid koji se dobiva iz agara

• Molekule koje se separiraju elektroforetski najčešće u svojoj

strukturi sadrže anionske ili kationske grupe, pa su prema tome
dipolarni joni.
 Elektroforeza na agaroznom gelu
Protokol
Elektroforeza na agaroznom gelu
 Uzroci greške kod Elektroforeze

• Primjena struje u pogrešnom smjeru.

• Pogrešan pH pufera
• Nepravilno korištenje vremena
• Nepravilna primjena struje.
• Koncentracije reaktanata moraju biti odgovarajuće.
 Imunoelektroforeza

Kombinaciju elektroforeze serumskih proteina sa imunoprecipitacijskom

detekcijom.

Elektroforeza proteina obezbjeđuje separaciju serumskih proteina, i omogućava

detekciju i kvantifikaciju pojedinih klasa proteina

Imunoprecipitacijom se detektuju pojedine imunoglobulinske klase i drugi

specifični proteini u serumu
U prvoj fazi se u agaru naprave rupice
dijametra do 2 mm u koje se stavlja serum
ispitivanih osoba.
- propusti struja u određenom vremenskom
intervalu i vrši razdvajanje seruma na
komponente.

U drugoj fazi se stavlja antiserum

odgovarajuće specifičnosti u napravljeni
uzdužni kanal širine do 2 mm.
Anti serum poslje određenog vremena
difunduje i u područjima ekvivalencije stvara
precipitate.
Komponente seruma difunduju radijalno a
antiserum u jednom smjeru, precipitati imaju
lučni izgled.
IEFsa je kvalitativna metoda i najčešće se primenjuje u dijagnozi:
monoklonskih gamopatija,
detekciju strukturnih abnormalnosti i poremećaja u koncentraciji
proteina.

Promjene u elektroforetskoj
mobilnosti "normalna/izmjenjena"
promjene u primarnoj strukturi ili
fragmentacija proteina, pri čemu
fragmenti imaju izmjenjenu brzinu
u odnosu na nativni protein

Promjene u distanci preciptiranih

lukova
Smanjeno rastojanje od kanala:
povećana konc. ili prisustvo
proteina manje (ubrzana difuzija)
Povećano rastojanje od kanala:
smanjena konc. ili prisustvo
agregata (usporena difuzija)
 Promjene u obliku i izgledu luka
Monoklonski imunoglobulini u monoklonskim
gamapatijama
Vrste: raketna, dvodimenzionalna, protusmjerna, imunoblot tehnika

Raketna Kvantitativna metoda-proporcionalna dužini

percipitacijske linije

Antitjela u gelu-percipitacija u području koncentracijske

ekvivalencije
 Dvosmjerna imunoelektroforeza

• za separaciju koriste medijumi sa kontinuiranim gradijentom pH,

• proteini će migrirati do vrijednosti pH koja odgovara njihovoj izoelektričnoj

tački kada gube naboj,

• postaju neutralni i prestaju da se kreću.

U dvodimenzionalnoj elektroforezi proteini se;

-u prvoj dimenziji separišu izoelektrofokusiranjem,

- u drugoj dimenziji koja je upravna na pravac separacije u prvoj

dimenziji, podvrgavaju se SDS-PAGE-u.

Reakcija antigen-antitjelo stvaraju imunoprecipitati.

Omogućava povećanje
rezolucije razdvajanja
proteina i do 10 000
proteina u jednom gelu.
 Western blot

• identifikaciju i određivanje prisutnosti malih količina

određenog proteina
• odnosa količine proteina koji se nalaze u kompleksnoj
proteinskoj smjesi,
• koristi se za potvrđivanje pozitivnih rezultata bilo gel-
elektroforezom ili ELISA testom.
Denaturacija proteina
Elektroforeza sa poliakrilamidnim gelom
Transfer proteina na nitroceluloznu membranu ili sintetsku membranu
Inkubacija proteina sa specifičnim antitjelima (prepoznati ciljani protein)
Sekundarno antitjelo (prethodno vezan enzim)
Omogućava vidljivost signala i određuje način detekcije traženog proteina
na membrani.

Postoji reakcija
antigen-antitjelo -
pozitivan rezultat,
na membrani vidi
jedna tamna trakica
Western blot test općenito se
koristi za potvrđivanje pozitivnih
rezultata ispitivanja virusa
humane imunodeficijencije (HIV)
i lajmske bolesti, kao i potvrdni
test za infekciju hepatitisom B i
HSV-2 (herpes tip 2) infekcijom.
 POLIMERAZNA LANČANA REAKCIJA (eng. Polymerase Chain
Reaction:PCR)

PCR brza je i jeftina tehnika koja se koristi za „kopiranje“ - malih

segmenata DNK.

PCR reakcija se sastoji od serije ciklusa. Broj ciklusa koji se moraju

izvršiti zavisi od količine inicijalne DNK mase od koje počinjemo. Obično
se PCR uspešno obavlja između 20-45 ciklusa.
Denaturacija: uzorak se zagrijavado 94-96°C, tako da se DNK denatura.
Dvolančana DNK se razdvaja na dva dijela jednolančane DNK.

-Hibridizacija: kada se lanci DNK molekula razdvoje, temperatura se snizi

na 45-60°, kako bi se početnice samostalno vezale na oba razdvojena
lanca.
-Elongacija: temperatura se povećava na 720C, optimalna temperatura za
djelovanje termostabilne Taq-polimeraze. Pritom će polimeraza ugrađivati nove
komplementarne nukleotide sve dok ne stigne do druge početnice.

Ciklus denaturiranja i sintetizacije nove DNK ponavlja se čak 30 ili 40 puta, što
dovodi do više od milijardu tačnih kopija izvornog DNK segmenta.

Cjelokupni proces PCR-a automatiziran je i može se okončati u samo nekoliko sati.

Njime upravlja mašina termocikler, koja je programirana da mijenja temperaturu
reakcije svakih nekoliko minuta/sekundi, kako bi se omogućila denaturacija i sinteza
DNK.