Lời nói đầu

Trong cơ thể sống, hầu như không có một quá trình hóa học nào lại không
có liên quan mật thiết đến các quá trình sinh học do các enzyme xúc tác. Có thể
nói rằng sự sống gắn liền với enzyme.
Ngoài một nhóm nhỏ phân tử RNA có hoạt tính xúc tác, các enzyme đều
có bản chất protein; chúng bảo đảm cho các quá trình chuyển hóa các chất trong
cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, cân đối, theo những chiều hướng
xác định.
Enzyme học (Enzymology) là một môn học có vị trí then chốt trong hóa
sinh đang phát triển mạnh mẽ và xâm nhập vào rất nhiều ngành khoa học, đặc
biệt thu hút sự chú ý của các nhà sinh học và sinh y học vì những hiểu biết cơ
bản về enzyme có liên quan mật thiết đến sinh học phân tử và y học phân tử và
là những kiến thức cơ bản rất quan trọng của sinh học và sinh y học.
Mục lục
Hình ảnh
Bảng
Tài liệu tham khảo

Chương 1: Enzyme
1.1 Định nghĩa enzyme
Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự
trao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của một
chất là tập hợp các quy luật của rất nhiều các phản ứng hóa học khác nhau. Các
phản ứng hóa học phức tạp này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn
nhau. Enzyme là các hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó.
Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo
cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng
trong cơ thể sống.
Enzym là chất xúc tác sinh học, được tạo ra trong tế bào sinh vật, có bản
chất protein, hòa tan trong nước và trong dung dịch muối loãng.
Chúng có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do những
tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất
xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hóa
học.
1.2 Lược sử nghiên cứu enzyme
Do enzyme học được coi như cột sống của hóa sinh học nên phần lớn các
nghiên cứu hóa sinh từ trước đến nay đều liên quan nhiều đến enzyme.
Về sự phát triển của học thuyết enzyme, có thể chia thành 4 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: trước thế kỷ thứ XVII
- Giai đoạn 2: từ thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XIX
- Giai đoạn 3: từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX
- Giai đoạn 4: từ những năm 30 của thế kỷ XX đến nay.
Giai đoạn 1
Trước thế kỷ XVII người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong
đời sống song chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của
vi sinh vật. Đó là các quá trình lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước
chấm... Ở thời kỳ này người ta chưa hiểu về bản chất enzyme và các quá trình
lên men. Người ta đã tìm thấy các tài liệu viết từ xưa về vấn đề này ở Babylon,
Hy Lạp Trung Quốc, Ấn Độ,…
Giai đoạn 2
Ở giai đoạn này các nhà bác học đã tiến hành tìm hiểu bản chất của các
quá trình lên men. Thời kỳ này đã khái quát hiện tượng lên men như là hiện
tượng phổ biến trong sự sống và enzyme là yếu tố gây nên sự chuyển hóa các
chất trong quá trình lên men.
Vào những năm 1600 của thế kỷ XVII, Van Helmont là người đầu tiên cố
gắng đi sâu tìm hiểu bản chất của quá trình lên men. Van Helmont đã nhận thấy
thực chất của sự tiêu hóa là sự chuyển hóa hóa học của thức ăn và giải thích cơ
chế của nó với sự so sánh nó với quá trình lên men rượu. Danh từ ferment (từ
chữ Latinh fermentatio - sự lên men) được Van Helmont dùng để chỉ tác nhân
gây ra sự chuyển biến các chất trong quá trình lên men rượu.
Vào nửa cuối thế kỷ thứ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp là Réaumur
cũng đã nghiên cứu bản chất của sự tiêu hóa. Nhà tự nhiên học này đã cho chim
quạ đen nuốt những miếng thịt đặt sẵn trong ống kim loại có thành đã được đục
sẵn và buộc vào dây thép. Sau vài giờ đã không thấy gì ở trong ống. Hiện tượng
này đã thúc đẩy sự nghiên cứu thành phần dịch tiêu hóa để tìm hiểu khả năng
tiêu hóa của dịch dạ dày. Sau thí nghiệm này một thời gian, vào năm 1783, nhà
bác học người Ý là Spalanzani đã lặp lại thí nghiệm bằng cách lấy dịch dạ dày
trộn với thịt mới và thấy có hiện tượng hòa tan xảy ra.
Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quá
trình lên men. Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước
chiết của mầm đại mạch có khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt
độ thường. Đây là công trình đầu tiên thu được chế phẩm amylase ở dạng dung
dịch và lịch sử enzyme học thực sự được xem như bắt đầu từ đây.
Mười chín năm sau (năm 1833), hai nhà khoa học người Pháp là Payen và
Pessoz đã chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có thể
tách được ở dạng bột. Thí nghiệm được tiến hành bằng cách cho etanol vào dịch
chiết của lúa đại mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa. Kết tủa được hình
thành này có khả năng chuyển hóa tinh bột và nếu đun kết tủa này sẽ mất tác
dụng chuyển hóa. Danh từ diastase (từ chữ Latinh diastasis - phân cắt) là do
Payen và Persoz dùng để gọi enzyme amylase lúc bấy giờ.
Tiếp đó người ta cũng đã tìm ra và tách được nhiều enzyme khác như
enzyme phân giải protein của dịch tiêu hóa trong dạ dày như Pepsin (Emberle và
Shwan) - những nhà khoa học người Đức, năm 1836)...
Sau đó, lý thuyết xúc tác đã ra đời. Năm 1835, nhà khoa học Berzelius có
quan điểm cho rằng tăng tốc độ phản ứng là hiện tượng xúc tác. Đây là một quan
điểm đúng. Song thật đáng tiếc là nhà khoa học này đã coi các chất xúc tác này
hoạt động được là do " lực sống" không theo sự điều khiển của con người. Đây
là quan điểm duy tâm, siêu hình đã làm trì trệ sự phát triển của khoa học nhất là
ảnh hưởng sâu sắc đến sưh phát triển của ngành enzyme học.
Giai đoạn 3
Giai đoạn từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX. Ở giai đoạn
này một số lượng rất lớn các enzyme ở dạng hòa tan đã được tách chiết.
Trong thời kỳ này, có hai trường phái đấu tranh với nhau: đó là trường
phái Pasteur - nhà bác học vĩ đại người Pháp và trường phái Liebig - nhà bác
học nổi tiếng người Đức.
Giai đoạn 4

Bản chất hóa học của enzyme chỉ được xác định đúng đắn từ sau khi kết
tinh được enzyme. Năm 1926 nhà hóa sinh Mỹ trẻ tuổi Sumner (39 tuổi) đã
thành công trong việc chứng minh protein được kết tinh từ hạt đậu tương là chất
giống enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân urê. Đây cũng chính là enzyme
đầu tiên được kết tinh. Bốn năm sau (1930) ở Mỹ Northrop đã tách được pepsin
ở dạng tinh thể, và vào năm 1931 Northrop và Kunitz cũng đã tách được trypsin
ở dạng tinh thể.
Trong thời kỳ này J.B.S Hardane đã viết quyển "Enzymes". Mặc dù lúc
đó bản chất phân tử của Enzyme hầu như vẫn còn là bí mật, nhưng tác giả đã
đưa ra dự đoán tuyệt vời về vai trò của các tương tác và liên kết yếu giữa
enzyme và cơ chất trong cơ chế hoạt động của enzyme. Điều này vẫn giữ
nguyên tính thời sự trong thời đại của chúng ta.
Các công trình của Sumner và Northrop đã mở ra một chương mới trong
lịch sử phát triển của enzyme học hiện đại. Những kết quả đạt được đã cho phép
xác định được một cách dứt khoát bản chất hóa học của enzyme là protein. Phải
nói rằng bản chất hóa học của phần lớn enzyme là protein và định nghĩa có tính
chất kinh điển về Enzyme phải xem lại từ sau phát hiện của T.R. Cech năm
1981. Cech đã phát hiện một RNA có hoạt tính xúc tác như enzyme và gọi là
ribozyme (xuất phát từ các tên ribose và enzyme). Ribozyme xúc tác cho quá
trình chuyển hóa tiền chất. RNA thông tin (pre - m RNA) thành m-RNA. Do đó
enzyme không nhất thiết phải là protein! Đây là một phát minh có ý nghĩa rất
lớn. Tác giả của phát minh này được giải Nobel năm 1989. Cho đến nay khoảng
100 ribozyme đã được biết. Có thể nói rằng, những công trình đã nói ở trên đã
mở màn cho giai đoạn thứ tư của lịch sử phát triển enzyme học kéo dài cho đến
hiện nay.
Từ giữa thế kỷ thứ XX, nhất là thời gian gần đây enzyme học phát triển
rất mạnh. Nhờ ứng dụng các phương pháp mới, hiện đại như: điện di, sắc ký,
quang phổ, đồng vị phóng xạ... đã cho phép nghiên cứu cấu trúc cũng như cơ
chế tác dụng của nhiều enzyme, cơ chế của quá trình sinh tổng hợp enzyme và
sự điều hòa hoạt động của enzyme trong tế bào.
Người ta đã xác định được cấu tạo của coenzyme. Đã xác định được mối
liên hệ của enzyme và các vitamin (nhiều vitamin là thành phần cấu tạo của
coenzyme và phần lớn các vitamin tan trong nước là thành phần cấu tạo của các
coenzyme).
Người ta cũng đã xác định được các enzyme xúc tác cho các quá trình
trao đổi chất như: hệ thống enzyme đường phân, Embden - Meyerhof - Parnas
năm 1933, hệ thống enzyme của chu trình Kreps - Szent Gyorgy năm 1937 (chu
trình citric acid), chu trình ornithrin trong trao đổi chất của protein năm 1932
(Krebs - Henseleit). Nhờ những phương pháp mới trong việc tách và làm sạch
enzyme, người ta đã xác định được vai trò rất quan trọng của kim loại trong sự
xúc tác của enzyme và tác dụng hoạt hóa của chúng. Đã xác định được sự phân
bố của các enzyme trong tế bào. Đã nghiên cứu cơ chế tác dụng cũng như cấu
tạo các protein enzyme. Bằng phương pháp Rhengen, người ta đã nghiên cứu
cấu trúc của của phân tử enzyme, như cấu trúc của ribonuclease (1960, Stein).
Trong vòng hơn 40 năm trở lại đây đã nghiên cứu các enzyme sinh tổng
hợp như nucleotide phosphorylase (Greenberg Marago, 1955), DNA -
polymesase ( Kornberg,1956), RNA - polymesase (Spieglman, Hurwist, 1958 -
1961) và các nghiên cứu về điều hòa sinh tổng hợp protein - enzyme của Jacob,
Monod (1961).
Từ năm 1961 đã phát hiện ra isoenzyme trong cơ thể là enzyme xúc tác có
thể tồn tại dưới nhiều dạng khác nhau, xúc tác trong cùng một cơ thể, cho một
phản ứng, có sai khác một số tính chất như độ di động điện di.
 Năm 1969 người ta đã tổng hợp được enzyme đầu tiên là ribonuclease
(Denkewalter và Hirschmann, Gutte và Merrifield). Đây là enzyme gồm 124
amino acid, bền với nhiệt, có thể đun nóng lên 800C với thời gian ngắn.
Có thể tổng hợp enzyme bằng hai phương pháp khác nhau:
- Tổng hợp từng peptid riêng biệt rồi sau đó nối lại với nhau.
- Dùng chất giá (polymer): cắm lên trên này một gốc amino acid, sau đó
cắm tiếp 123 gốc amino acid khác. Việc tổng hợp này đã thành công trong 3
tuần bao gồm 11931 giai đoạn, 369 phản ứng. Đã nêu lên được một phương
pháp mới về tổng hợp enzyme. Ở đây người ta đã dùng phương pháp tự động
hóa, khi được 124 gốc amino acid thì chuỗi polypepid tự tách ra. Điều này cho
thấy mỗi khi chuỗi polypeptid đã được lựa chọn theo một trật tự đúng đắn thì có
thể tự uốn cong trong không gian. Đấy chính là khả năng tự tổ chức.
Những thành tựu nghiên cứu cơ bản về enzyme là cơ sở để phát triển các
nghiên cứu ứng dụng enzyme trong thực tế.
Trong mấy chục năm cuối của thế kỷ XX và đầu thé kỷ XXI, người ta đã
chú ý nghiên cứu việc ứng dụng enzyme. Người ta đã tận dụng các nguyên liệu
giàu enzyme để tách enzyme, dùng chế phẩm enzyme này để chế biến các
nguyên liệu khác nhau hoặc sử dụng vào mục đích khác nhau. Ở nhiều nước đã
hình thành ngành công nghệ enzyme, hàng năm đã sản xuất hàng trăm tấn chế
phẩm enzyme để phục vụ cho các ngành sản xuất khác nhau và cho y học.

Chương 2: Cấu trúc phân tử của Enzyme

2.1 Bản chất hóa học của enzyme
Từ gần một thế kỷ trước đây, các nhà khoa học đã đổ xô vào việc xác
định bản chất hóa học của enzyme. Cho đến nay, có thể nói rằng, ngoài nhóm
nhỏ phân tử RNA có hoạt tính xúc tác, tuyệt đại đa số enzyme có bản chất là
protein và sự thể hiện hoạt tính xúc tác phụ thuộc vào cấu trúc bậc 1, 2, 3 và 4
của phân tử protein và trạng thái tự nhiên của chúng. Thực tế là bản chất hóa
học của enzyme chỉ được xác định đúng đắn từ sau khi kết tinh được enzyme.
enzyme đầu tiên nhận được ở dạng tinh thể là urease của đậu tương (Sumner,
1926), tiếp theo là pepsin và trypsin (Northrop và Kunitz, 1930, 1931). Sau đó
những tác giả khác cũng đã kết tinh được một số enzyme khác và có đủ bằng
chứng xác nhận các tinh thể protein nhận được chính là các enzyme.
Kết quả nghiên cứu tính chất hóa lý của enzyme đã cho thấy enzyme có
tất cả các thuộc tính hóa học của các chất protein về hình dạng phân tử: đa số
enzyme có dạng hình cầu (dạng hạt). Tỷ lệ giữa trục dài và trục ngắn của phân
tử vào khoảng 1 - 2 hoặc 4 - 6.
Về khối lượng phân tử: các enzyme có khối lượng phân tử lớn, thay đổi
rất rộng từ 12000 dalton đến 1.000.000 dalton hoặc lớn hơn. Ví dụ ribonuclease
có khối lượng phân tử là 12700, glutamat dehydrogenase có khối lượng phân tử
là 1.000.000. Đa số enzyme có khối lượng phân tử từ 20.000 đến 90.000 hoặc
vài trăm nghìn.
Do kích thước phân tử lớn, các enzyme không đi qua được màng bán
thấm. Enzyme tan trong nước, khi tan tạo thành dung dịch keo; chúng cũng tan
trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ có cực khác.
Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao.
Enzyme bị biến tính thì mất khả năng xúc tác. Mức độ giảm hoạt tính của
enzyme tương ứng với mức độ biến tính của protein trong chế phẩm. Kiềm, acid
mạnh, kim loại nặng cũng làm cho enzyme biến tính. Cũng như protein, enzyme
cũng có tính chất lưỡng tính.
2.2 Thành phần cấu tạo của enzyme

Cũng như protein, enzyme có thể là protein đơn giản hoặc protein phức
tạp. Trên cơ sở đó, người ta thường phân enzyme thành hai nhóm: enzyme một
thành phần (enzyme một cấu tử) và enzyme hai thành phần (enzyme hai cấu tử).
Trường hợp enzyme là một protein đơn giản gọi là enzyme một thành phần.
Trường hợp enzyme là một protein phức tạp nghĩa là ngoài protein đơn giản còn
có một nhóm ngoại nào đó không phải protein gọi là enzyme hai thành phần.
Phần protein của enzyme hai thành phần được gọi là apoprotein hay
apoenzyme, còn phần không phải protein gọi là nhóm ngoại hoặc coenzyme.
Phần không phải protein thường là những chất hữu cơ đặc hiệu có thể gắn chặt
vào phần protein hoặc có thể chỉ liên kết lỏng lẻo và có thể tách khỏi phần
protein khi cho thẩm tích qua màng. Coenzyme là phần không phải protein của
enzyme trong trường hợp khi nó dễ tách khỏi phần apoenzyme khi cho thẩm tích
qua màng bán thấm và có thể tồn tại độc lập. Phần không phải protein của
enzyme được gọi là nhóm ngoại hay nhóm prosthetic, khi nó liên kết chặt chẽ
với phần protein của enzyme bằng liên kết đồng hóa trị. Một phức hợp hoàn
chỉnh gồm cả apoenzyme và coenzyme được gọi là holoenzyme. Một coenzyme
khi kết hợp với các apoenzyme tạo thành các holoenzyme khác nhau xúc tác cho
quá trình chuyển hóa các chất khác nhau nhưng giống nhau về kiểu phản ứng.
Coenzyme trực tiếp tham gia phản ứng xúc tác, giữ vai trò quyết định kiểu phản
ứng mà enzyme xúc tác và làm tăng độ bền của apoenzyme đối với các yếu tố
gây biến tính. Còn apoenzyme có tác dụng nâng cao hoạt tính xúc tác của
coenzyme và quyết định tính đặc hiệu của enzyme. Các coenzyme thường là các
dẫn xuất của các vitamin hòa tan trong nước. Cần chú ý là sự phân biệt
coenzyme và nhóm ngoại chỉ là tương đối, vì khó có thể có một tiêu chuẩn thật
rành mạch để phân biệt “liên kết chặt chẽ” và “liên kết không chặt chẽ”, nhất là
trong những năm gần đây, người ta đã chứng minh rằng, nhiều coenzyme cũng
kết hợp vào apoenzyme của chúng bằng liên kết đồng hóa trị. Do đó, ngày nay
người ta ít chú ý đến sự phân biệt coenzyme và nhóm ngoại. Ngoài ra, trong
thành phần cấu tạo, rất nhiều enzyme có chứa kim loại. Thuộc loại enzyme hai
thành phần gồm có hầu hết các enzyme của các lớp 1, 2, 4, 5, 6. Các enzyme
thủy phân (lớp 3) thường là enzyme một thành phần có chứa ion kim loại hoặc
đòi hỏi ion kim loại làm cofactor (đồng yếu tố).

2.3 Trung tâm hoạt động của enzyme

Enzyme là protein đặc biệt. Ngoài cấu trúc giống protein, enzyme còn có
cấu trúc rất đặc biệt liên quan đến hoạt động enzyme. Không phải toàn bộ các
phần của enzyme đều tham gia vào hoạt động xúc tác mà chỉ một bộ phận rất
đặc biệt mang tính đặc hiệu trong phân tử protein mới tham gia xúc tác phản
ứng. Bộ phận này gọi là trung tâm hoạt động của enzyme.
Trong quá trình xúc tác của enzym chỉ có một phần tham gia trực tiếp vào
phản ứng để kết hợp với cơ chất gọi là "trung tâm hoạt động".Cấu tạo đặc biệt
của trung tâm hoạt động quyết định tính đặc hiệu và hoạt tính xúc tác của
enzym.
Trung tâm hoạt động của enzyme gồm:

- Những nhóm hóa học, những liên kết peptide tiếp xúc trực tiếp với cơ
chất
- Những nhóm hóa học, những liên kết peptide không tiếp xúc trực tiếp
với cơ chất nhưng có chức năng trực tiếp trong quá trình tiếp xúc
- Trung tâm hoạt động của enzyme thường chứa các amino acid có
nhóm chức hoạt động mạnh như amino acid serine, histidine, cysteine,
arginine, glutamic acid, aspartic acid, tryptophan. Các nhóm hóa học
này thực hiện hoạt động gắn với cơ chất để tạo thành phức chất
enzyme-cơ chất.
- Các nhóm chức của trung tâm hoạt động của enzyme:
+ Nhóm NH2 của lysine
+ Nhóm –SH của cysteine
+ Nhóm γ-carboxyl của glutamic acid
Ngoài các nhóm chức hóa học, trung tâm hoạt động enzyme còn có các
ion kim loại như Fe2+, Zn2+, Mg2+, Mn2+ và các nhóm chức của co-enzyme.
Trong "enzym 1 cấu tử", các acid amin thường phân bố trên những phần
khác nhau của mạch polypeptid nhưng nằm kề nhau trong không gian tạo thành
trung tâm hoạt động. Sự kết hợp của các nhóm chức của các acid amin, thường
gặp là -SH của cysteine, -OH của serine, vòng imidazol của histidine, w-COOH
của aspartie và acid glutamic, -COOH của các acid amin cuối mạch...
Trong "enzym hai cấu tử" ngoài mạch polypeptid mà các nhóm chức kết
hợp để tạo trung tâm hoạt động, còn có các nhóm chức coenzym và các nhóm
ngoại khác kết hợp tạo thành trung tâm hoạt động.
 Ở enzym chứa kim loại, các ion kim loại cũng tham gia vào việc tạo trung
tâm hoạt động.
Trong các nhóm chức tham gia tạo trung tâm hoạt động cần phân biệt hai
nhóm: "tâm xúc tác" (tham gia trực tiếp vào hoạt động xúc tác của enzym) và
"nền tiếp xúc" (giúp enzym kết hợp đặc hiệu với cơ chất).
Mỗi một enzyme thường có 1 trung tâm hoạt động. Nhưng có những
enzyme có 2 trung tâm hoạt động (alcohol hydrogenase của gan), và 4 trung tâm
hoạt động (alcohol dehydrogenase của nấm men).
Hoạt động xúc tác của enzyme có liên quan đến cơ chất với những điểm
quan trọng sau:
- Chỉ những cơ chất có cấu trúc phân tử thich hợp với trung tâm hoạt động
của enzyme mới có thể kết hợp được với trung tâm hoạt động của enzyme
để tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất (tính đặc hiệu).
- Các enzyme thường tạo ra trung tâm hoạt động có cấu trúc không gian
nhất định
- Trung tâm hoạt động của enzyme chỉ được tạo thành khi có sự tác động
cảm ứng với cơ chất, làm cho các amino acid, các nhóm chức của trung
tâm hoạt động di chuyển, định hướng một cách thích hợp, chính xác để
gắn cơ chất vào trung tâm hoạt động và thực hiện quá trình xúc tác
Cơ chế hoạt động

Giai đoạn thứ nhất: Enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những yếu tố liên kết,
nhờ đó sẽ tạo ra hệ enzym - cơ chất. Phức hệ này thường không bền. Phản ứng
tạo ra hệ enzyme - cơ chất thường xảy ra rất nhanh và hỏi ít năng lượng.
Giai đoạn thứ hai: khi cơ chất tạo phức với enzyme sẽ bị thay đổi cả cấu hình
không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết. Kết quả là các liên kết bị
phá vỡ và tạo ra sản phẩm.
Giai đoạn thứ ba: Đây là cuối cùng của giai đoạn, sản phẩm quá trình phản ứng
được tạo thành và tách ra khỏi enzyme.
Cơ chế tác động tổng quát của enzyme:

Trong đó:E- Enzym (enzym) S- Cơ chất (Substrate) P- Sản phẩm (Products)

Chương 3: Tính đặc hiệu của enzyme

3.1 Khái niệm chung
Do cấu trúc lý hóa đặc biệt của phân tử enzyme và đặc biệt là của trung tâm hoạt
động mà enzyme có tính đặc hiệu rất cao so với những chất xúc tác thông
thường khác. Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay
một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Đặc tính tác dụng lựa
chọn cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hóa của enzyme. Tính đặc
hiệu là một trong những đặc tính cơ bản quan trọng nhất của enzyme.

3.2 Các hình thức đặc hiệu

Có thể phân biệt hai kiểu đặc hiệu: đặc hiệu kiểu phản ứng và đặc hiệu cơ chất.

3.2.1 Đặc hiệu kiểu phản ứng

Phần nhiều mỗi enzyme đều có tính đặc hiệu với một loại phản ứng nhất định.
Những chất có khả năng xảy ra nhiều loại phản ứng hóa học thì mỗi loại phản
ứng ấy phải do một enzyme đặc hiệu xúc tác. Ví dụ, amino acid có khả năng xảy
ra phản ứng khử carboxyl, phản ứng khử amin bằng cách oxy hóa và phản ứng
vận chuyển nhóm amin, vì vậy mỗi phản ứng ấy cần có một enzyme đặc hiệu
tương ứng xúc tác theo thứ tự là decarboxylase, aminoacid oxydase và
aminotransferase.

3.2.2 Đặc hiệu cơ chất

Mỗi enzyme chỉ xúc tác cho sự chuyển hóa một hoặc một số chất nhất định.
Mức độ đặc hiệu cơ chất của các enzyme khác nhau không giống nhau, người ta
thường phân biệt thành các mức như sau:

3.2.2.1 Đặc hiệu tuyệt đối

Một số enzyme hầu như chỉ xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một cơ chất xác
định và chỉ xúc tác cho phản ứng ấy mà thôi.
Ví dụ: Urease, arginase, glucoseoxydase v.v... Đối với các enzyme này, ngoài
các cơ chất đặc hiệu của chúng là ure, arginine, β - D - Glucose (theo thứ tự
tương ứng) chúng cũng có thể phân giải một vài chất khác nhưng với vận tốc
thấp hơn nhiều. Chẳng hạn như urease, ngoài ure nó còn có thể phân giải
hydroxyure nhưng với tốc độ thấp hơn 120 lần. Như vậy urease có thể xúc tác
cho hai phản ứng sau:

Đối với trường hợp glucose oxydase: enzyme này có trong các loại nấm mốc, có
khả năng oxy hóa đặc hiệu β-D-glucose thành gluconic acid

Enzyme này có khả năng phân giải 10 cơ chất song với khả năng nhỏ hơn nhiều.
Ví dụ: nếu coi tốc độ oxy hóa tương đối acid β-D-glucose là 100% thì
α.D.glucose chỉ bằng 0,64 % (ngoài ra maltose 0,19%, D.galactose 0,14%).
Hình như trong trường hợp đặc hiệu tuyệt đối, cấu trúc trung tâm hoạt động của
enzyme tương ứng rất chặt chẽ với cấu trúc của cơ chất đến mức chỉ một sai
khác nhỏ về cấu trúc của cơ chất cũng đủ làm cho enzyme không xúc tác được.
Những enzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối thường được dùng để định lượng
chính xác cơ chất của nó.
3.2.2.2 Đặc hiệu nhóm tuyệt đối
Các enzyme này chỉ tác dụng lên những chất có cùng một kiểu cấu trúc phân tử,
một kiểu liên kết và có những yêu cầu xác định đối với nhóm nguyên tử ở phần
liên kết chịu tác dụng. Ví dụ: maltase thuộc nhóm α α- glucosidase chỉ xúc tác
cho phản ứng thủy phân liên kết glucoside được tạo thành từ nhóm OH
glucoside của α α- glucose với nhóm OH của một monose khác.
3.2.2.3 Đặc hiệu nhóm tương đối
Mức độ đặc hiệu của các enzyme thuộc nhóm này kém hơn nhóm trên. Enzyme
có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định trong phân tử cơ
chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành mối liên
kết đó. Ví dụ lipase có khả năng thủy phân được tất cả các mối liên kết este.
Aminopeptidase có thể xúc tác thủy phân nhiều peptid
3.2.2.4 Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể)
Hầu như tất cả các enzyme đều có tính đặc hiệu không gian rất chặt chẽ, nghĩa là
enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân không gian của cơ chất.
Enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất.
Ví dụ phản ứng khử nước của malic acid để tạo thành fumaric acid dưới tác
dụng của fumarathydratase chỉ xảy ra đối với L - malic acid mà không tác dụng
lên D - malic acid:

Enzyme cũng thể hiện tính đặc hiệu lên một dạng đồng phân hình học cis hoặc
trans. Ví dụ: enzyme fumarathydratase chỉ tác dụng lên dạng trans của fumaric
acid mà không tác dụng lên dạng cis để tạo thành L – malic acid:

Trong tự nhiên cũng có các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hổ
giữa các cặp đồng phân không gian tương ứng. Ví dụ, lactatracemase của vi
khuẩn xúc tác cho phản ứng chuyển hóa lẫn nhau giữa D và L – lactic acid, aldo
- 1 - epimerase xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa α α- D - glucose thành β -
D - Glucose, maleinat cis - trans isomerase của vi khuẩn xúc tác cho phản ứng
đồng phân hóa giữa maleic acid (dạng cis) và fumaric acid (dạng trans)v.v... Các
enzyme này có vai trò quan trọng khi sản xuất các chất dinh dưỡng bằng phương
pháp hóa học, vì chúng có thể chuyển các chất từ dạng cơ thể không thể sử dụng
được thành dạng có thể hấp thụ.
Enzyme còn có khả năng phân biệt được 2 gốc đối xứng trong phân tử giống
nhau hoàn toàn về mặt hóa học. Ví dụ, hai nhóm - CH2OH trong phân tử
glycerin, glycerophosphatkinase xúc tác cho phản ứng chuyển vị gốc phosphate
từ ATP đến C3 của glycerin (chứ không phải C1).

Chương 4: Hoạt tính xúc tác của Enzyme

4.1 Cơ chế của phản ứng có xúc tác nói chung
Vận tốc phản ứng hóa học được xác định bởi giá trị năng lượng hoạt hóa tức là
mức năng lượng các chất tham gia phản ứng phải đạt được để cắt đứt liên kết
cần thiết và hình thành các liên kết mới. Năng lượng hoạt hóa càng lớn thì vận
tốc phản ứng càng chậm và ngược lại. Do làm giảm năng lượng hoạt hóa phản
ứng, các chất xúc tác có tác dụng thúc đẩy vận tốc phản ứng hóa học.
Ví dụ, bột platin là một chất xúc tác hóa học được sử dụng rộng rãi. Vì các chất
tham gia phản ứng trên bề mặt platin đều được chuyển sang trạng thái có khả
năng phản ứng cao hơn. Do vậy năng lượng hoạt hóa sẽ nhỏ hơn và tốc độ phản
ứng sẽ cao hơn.
Như vậy, trong các phản ứng có xúc tác, chất xúc tác làm giảm năng lượng hoạt
hóa của phản ứng hóa học, có nghĩa là nó chỉ tham gia vào các phản ứng trung
gian mà không đóng vai trò là chất tham gia phản ứng. Sau phản ứng, chất xúc
tác lại phục hồi về trạng thái ban đầu để tiếp tục xúc tác.

4.2 Cơ chế của xúc tác enzyme

Hầu như tất cả các biến đổi hóa sinh trong tế bào và cơ thể sống đều được xúc
tác bởi enzyme ở pH trung tính, nhiệt độ và áp suất bình thường trong khi đa số
các chất xúc tác hóa học khác lại chỉ xúc tác ở nhiệt độ và áp suất cao.
Chính nhờ việc tạo được môi trường đặc hiệu (bởi trung tâm hoạt động của
enzyme liên kết với cơ chất) có lợi nhất về mật năng lượng để thực hiện phản
ứng mà enzyme có được những khả năng đặc biệt đã nêu trên.
Trong phản ứng có sự xúc tác của enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung
gian enzyme - cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa. Khi cơ chất kết hợp vào
enzyme, do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến
dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động
năng cũng như thế năng, kết quả là làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động
hơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng.
Năng lượng hoạt hóa khi có xúc tác enzyme không những nhỏ hơn rất nhiều so
với trường hợp không có xúc tác mà cũng nhỏ hơn so với cả trường hợp có chất
xúc tác thông thường.
Ví dụ trong phản ứng phân hủy H2O2 thành H2O và O2 nếu không có chất xúc
tác thì năng lượng hoạt hóa là 18 Kcal/mol, nếu có chất xúc tác là platin thì năng
lượng hoạt hóa là 11,7 Kcal/mol, còn nếu có enzyme catalase xúc tác thì năng
lượng hoạt hóa chỉ còn 5,5 Kcal/mol. Nhiều dẫn liệu thực nghiệm đã cho thấy
quá trình tạo thành phức hợp enzyme cơ chất và sự biến đổi phức hợp này thành
sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau.
E + S -> ES -> P + E
Trong đó E là enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme - cơ
chất, P là sản phẩm (Product)
- Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo
thành phức hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất
nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp;
- Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá
vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng.
- Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra
dưới dạng tự do.
Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là:
tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tương tác Van der Waals. Mỗi loại liên
kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có
nước.
Với phương pháp nghiên cứu bằng tia X và phương pháp hóa học người ta đã
làm sáng tỏ cách thức gắn cơ chất và cơ chế hoạt động của một số enzyme như
lysozyme, chymotrypsin, carboxypeptidase A v.v... Sau đây sẽ giới thiệu chi tiết
hơn cơ chế phản ứng của carboxypeptidase A.
Carboxypeptidase A (EC 3.4.17.1) thuộc nhóm peptidhydrolase, xúc tác cho sự
thủy phân liên kết peptid, phản ứng xảy ra với vận tốc lớn nếu amino acid đầu C
là amino acid thơm. Enzyme này cũng thủy phân liên kết este.
Carboxypeptidase A có khối lượng phân tử 34,3. KDa chứa 1 mol Zn/1 mol E.
Zn tham gia trong hoạt động xúc tác của enzyme. Khi thay thế Zn bằng các kim
loại hóa trị hai khác làm thay đổi hoạt độ và có thể cả tính đặc hiệu của enzyme.
Trong phân tử enzyme, Zn ở gần bề mặt phân tử, tương tác với gốc His - 69, His
- 196 và Glu - 72.
Các gốc amino acid có vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động của enzyme là:
Arg - 145, Tyr - 248 và Glu - 270.
Cơ chế phản ứng xúc tác của Carboxypeptidase A được xác định trên cơ sở kết
quả nghiên cứu phản ứng của nó với dipeptid glycyltyrosine. Quá trình phân giải
liên kết peptid có thể được phân thành các bước sau:
- Tạo thành phức ES: Khi tiếp xúc với cơ chất, các nhóm trong trung tâm hoạt
động của enzyme thay đổi vị trí trong không gian. Nhóm guanidin của Arg - 145
cũng như nhóm carboxyl của Glu - 270 dịch chuyển 2Å, nhóm hydroxyl của Tyr
- 248 dịch chuyển 12Å từ chỗ gần trên bề mặt phân tử chuyền vào trong đến
vùng gần với liên kết peptid của cơ chất.
Tương tác giữa các nhóm chức của trung tâm hoạt động với glycyltyrosine như
sau:
 HÌNH: Sơ đồ biểu diễn tương tác giữa glycyltyrosine với các nhóm
chức năng trong trung tâm hoạt động của carboxypeptidase A (cơ chất viết
nét đậm)
- Nhóm carboxyl tự do của cơ chất kết hợp với nhóm tích điện dương của Arg -
145 của enzyme qua liên kết ion.
- Nhóm NH trong liên kết peptide của cơ chất tạo thành liên kết hydrogen với
nhóm - OH của Tyr - 248.
- Oxy trong nhóm - CO - của liên kết peptide tương tác với Zn, còn carbon trong
nhóm - CO - này tương tác với nhóm carboxyl của Glu - 270 qua phân tử nước.
- Cắt đứt liên kết giải phóng sản phẩm. Nguyên tử Zn phân cực liên kết - CO,
tăng tính ái điện tử của nguyên tử carbon, do đó làm tăng tương tác của nó với
nước hoặc với nhóm ái nhân của phân tử protein enzyme.
Gốc Glu - 270 hoạt hóa phân tử nước, nhóm - OH được tạo thành tấn công trực
tiếp vào nguyên tử cacbon của - CO - (trong liên kết peptide của cơ chất), liên
kết peptid bị kéo căng ra và bị đứt. Gốc Tyr - 248 nhường hydrogen cho nhóm
NH trong liên kết peptiê cho cơ chất, giải phóng sản phẩm đầu tiên là tyrosine
của cơ chất và acyl – enzyme.
 Hình Cơ chế phản ứng xúc tác của carboxypeptidase A
Sau khi liên kết peptide bị cắt đứt, trạng thái ion hóa của các nhóm acid và base
bị biến đổi tương ứng với pH môi trường, Tyr - 248 kết hợp với proton, trở về
trạng thái ban đầu.

Chương 5: Kĩ thuật protein

năng của đa phần các protein/enzyme phụ thuộc không chỉ cấu trúc bậc một, mà là cấu
trúc không gian của phân tử protein, quá trình thiết kế thường được tiến hành, mô
phỏng với sự trợ giúp của máy tính với các công cụ tin sinh chuyên biệt. Hiện nay, cấu
trúc và chức năng của một protein tổng hợp (hóa học) hay tái tổ hợp (sinh tổng hợp)
đều có thể được thiết kế thông qua các công cụ tin sinh trên máy tính hoặc sản xuất
thông qua quá trình phát triển/tiến hóa định hướng không chỉ ở quy mô phòng thí
nghiệm, mà còn ở mức công nghiệp.

Kỹ thuật protein là công cụ quan trọng được sử dụng để tăng cường hoạt tính enzyme
và tính chọn lọc cơ chất, sự bền nhiệt. Nó đã tạo ra một cuộc cách mạng trong phát
triển các enzyme có sẵn trên thị trường thành các chất xúc tác công nghiệp tốt hơn. Kỹ
thuật này liên quan đến việc thiết kế và xây dựng các protein với các chức năng mong
muốn. Hiện có hai phương pháp khác nhau được sử dụng, bao gồm phương pháp ngẫu
nhiên được gọi là tiến hóa có định hướng và một phương pháp được gọi là thiết kế duy
lý (rational design). Các sản phẩm protein được tạo ra từ kỹ thuật protein có thể được
cải biến bằng việc thay đổi một hay nhiều amino axit hoặc thay đổi con đường cuộn
gập các chuỗi amino axit và lắp ghép với nhau để tạo ra các protein sẽ cung cấp các
enzyme bền vững và có lợi . Có nhiều công cụ được sử dụng trong cải biến enzyme
tùy thuộc vào mục tiêu cụ thể (bảng 1).
Bảng 1. Các công cụ sử dụng trong kỹ thuật protein.
Mục tiêu Phương pháp
Cấu trúc protein Kết tinh, tinh thể học tia X, cộng hưởng từ hạt nhân
Mô hình hóa và mô
Mô phỏng tính toán
phỏng
Plasmids, các hệ thống biểu hiện, các đột biến hướng đích,
Gen
PCR DNA shuffling, đột biến ngẫu nhiên

Kỹ thuật protein đã trở thành một phương pháp được ưa chuộng để cải thiện các hoạt
động của enzym, tăng cường tính ổn định của enzym và mở rộng phổ sản phẩm trong
sinh tổng hợp các sản phẩm tự nhiên. Đánh giá này tóm tắt những tiến bộ gần đây và
các chiến lược điển hình trong kỹ thuật protein, đồng thời nêu bật vai trò tối quan
trọng của kỹ thuật protein trong việc cải thiện và đa dạng hóa quá trình sinh tổng hợp
các sản phẩm tự nhiên. Triển vọng trong tương lai và hướng nghiên cứu cũng được
thảo luận.
Một trong những nút thắt chính trong quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm tự nhiên là
hoạt động của enzym bị hạn chế. Việc tích hợp các enzym khác nhau vào khung vi
sinh có thể làm giảm các hoạt động xúc tác hoặc thậm chí làm mất chức năng. Tăng
cường hoạt động của enzyme để đẩy nhanh quá trình sản xuất là một mục tiêu chính
trong lĩnh vực này. Cải thiện hoạt động xúc tác của các enzym đối với các chất nền cụ
thể thông qua gây đột biến ngẫu nhiên là một chiến lược điển hình được sử dụng trong
kỹ thuật protein.
Một tyrosine hydroxylase có hoạt tính trên nấm men đã được xác định và gây đột biến
ngẫu nhiên bằng PCR dễ bị lỗi để cải thiện hoạt tính xúc tác của nó lên 4,3 lần. Sự
đồng biểu hiện sâu hơn của decarboxylase L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)
và tyrosine hydroxylase được thiết kế đã cho phép chứng minh sản xuất de
novo dopamine ở nấm men.
Tương tự, hoạt tính xúc tác của isopentenyl diphosphat isomerase (IDI) từ nấm men
Saccharomyces cerevisiae ( Sc ) đã được tăng cường gấp 2,53 lần thông qua gây đột
biến ngẫu nhiên dựa trên PCR. IDI với hoạt tính tăng cường dẫn đến hiệu giá lycopene
(1,24 g / L) tăng gấp 2,1 lần so với loại hoang dã . 
Các kỹ thuật phân tách protein 
Đây là công cụ truyền thống nhưng được ứng dụng rộng rãi và có nhiều vai trò quan
trọng trong nghiên cứu protein. Thứ nhất chúng làm cho các mẫu phức tạp trở nên đơn
giản hơn bằng cách phân tách hỗn hợp mẫu thành các protein riêng lẻ hoặc các nhóm
nhỏ. Thứ hai, chúng cho phép phân biệt sự khác nhau về mức độ biểu hiện của protein,
và so sánh giữa các mẫu. Có 5 kỹ thuật chính để phân tách protein đó là điện di 1 chiều
SDS-PAGE, điện di 2-DE, điện di đẳng điện IEF, sắc ký lỏng nano hiệu năng cao
HPLC, ngoài ra còn nhiều phương pháp phân tách khác nhau tùy thuộc vào mục đích
và nhu cầu sử dụng.
Điện di SDS-PAGE
SDS-PAGE được thực hiện theo LaemLi [71]. Trong phương pháp này, các phân tử
protein được phân tách theo trọng lượng dưới tác dụng của điện trường không đổi.
Protein được phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau. Dưới tác
dụng của dòng điện một chiều, các protein có kích thước khác nhau sẽ di chuyển về
điện cực trái dấu. Các phân tử protein gắn với SDS nên chúng sẽ tích điện âm, do đó
sự khác biệt về điện tích được loại trừ.

 
 
Khi protein được chạy trong điện trường không đổi, phức hệ protein-SDS sẽ di chuyển
xuyên qua các lỗ gel polyacrylamid với vận tốc phục thuộc vào hình dáng, kích thước
phân tử. Khi đó protein sẽ được phân tách thành các băng, vạch khác nhau. Gel thường
được sử dụng với nồng độ từ 5%-15% và có thể được chạy theo chiều nằm ngang hoặc
chiều thẳng đứng (Hình 5) [40].
Điện di 2-DE
Ngày này, kỹ thuật điện di 2 chiều (two-dimensional electrophoresis, 2DE) ngày càng
trở thành một công cụ được ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách các phức hợp protein
trong tế bào, mô và các dịch cơ thể [46]. Phương pháp điện di hai chiều, thủy phân
protein trong gel, sau đó nhận dạng bằng khối phổ đang là một phương pháp truyền
thống hay được sử dụng nhất. Tùy thuộc vào kích thước lỗ gel và giải gradient pH sử
dụng, điện di 2-DE có thể phân tách hàng ngàn protein (5000 protein, và có thể phát
hiện vệt protein với lượng <1ng) có mặt trong mẫu cùng một lúc, đồng thời so sánh
mức độ biểu hiện khác nhau của các mẫu phân tích. Đây là phương pháp cổ điển
nhưng vẫn được áp dụng rộng rãi và thường gắn liền với proteomics vì nó có khả năng
phân tách cao, hiển thị hình ảnh so sánh tương quan, đem lại bức tranh toàn cảnh về
mức độ biểu hiện khác nhau của các protein.
 
  
 
 

  
 Kỹ thuật điện di 2-DE thực ra là sự kết hợp của hai nguyên lý phân tách khác nhau.
Theo chiều thứ nhất, các phân tử protein được phân tách dựa theo điểm đẳng điện pI
bởi nguyên lý hội tụ theo điểm đẳng điện IEF (Isoelectric focusing) trên một thanh
strip có giải gradient pH xác định (ví dụ dải pH 3-10). Chiều thứ hai, các phân tử
protein được phân tách trên điện di trên gel polyacrylamid (như điện di SDS-PAGE)
(hình 6). Do đó, thực chất 2-DE là phương pháp phân tách protein theo 2 chiều, (i)
chiều thứ nhất theo điện tích và (ii) chiều thứ hai theo trọng lượng phân tử.
Sự khác biệt về điểm đẳng điện pI (Isoelectric ponit) của các protein chính là cơ sở của
IEF. pI là giá trị pH tại đó điện tích bề mặt tổng số của protein bằng 0 (protein không
di chuyển trong điện trường). Mỗi protein có một giá trị pI xác định. Thanh gel IPG
(immobilized pH gradient) tạo ra một giải gradient pH cố định, liên tục và tăng dần với
chiều dài khác nhau (7 cm, 11 cm, 18 cm, 24 cm) đã hạn chế sự di chuyển, trôi dạt của
các hóa chất (vì chúng được gắn trên gel polyacrylamid) làm cho quá trình phân tách
ổn định hơn [84]. Ngoài điện di 2DE các kỹ thuật khác như điện di mao quản, điện di
trường xung cũng thường được sử dụng để phân tách protein

Sắc ký lỏng nano đa chiều (2DnanoLC)

Mặc dù 2-DE được sử dụng rộng rãi như một phương pháp truyền thống để phân tách
protein nhưng hạn chế của nó là độ nhạy thấp, không tự động, mất thời gian, tốn kém,
tiến hành nhiều lần tạo ra sai số. Do đó phương pháp này gặp nhiều khó khăn trong
quá trình phân tích các protein có hàm lượng thấp hoặc các protein có tính kỵ nước cao
(như protein màng). Để vượt qua những hạn chế này sắc ký lỏng nano đa chiều
(multidimensional nano liquid chromatography - MDnanoLC) được pháp triển như là
một phương pháp thay thế hiệu quả (hình 8) [87].
 
  

Bằng sự kết hợp của các kỹ thuật phân tách các cột liên tiếp nhau dựa vào sự kết hợp
của phương pháp sắc ký trao đổi ion (SCX), sắc ký ái lực và phương pháp sắc ký
ngược pha (RP) [121]. Điểm đáng lưu ý trong phương pháp này, đó là kích thước cột
rất bé (ID vài mm), và tốc độ dòng rất thấp (0,2 ml/phút).
Phương pháp sắc ký lỏng nano đa chiều kết nối trực tuyến với hệ khối khối QSTAR
XL sử dụng các chiến lược cột sắc ký nhiều chiều khác nhau với đường kính cột và tốc
độ dòng cực thấp đã và đang được sử dụng mạnh mẽ để phân tách và nhận diện các
mẫu phức tạp [7]. Điểm quan trọng của phương pháp này đó là có thể sử dụng lượng
mẫu nhỏ, tự động, chính xác và có khả năng phân tách tốt nhiều peptid cùng lúc chỉ
trong một lần chạy [120]. Ngoài sắc ký lỏng nano, các phương pháp khác như sắc ký
hiệu năng cao HPLC, sắc ký ái lực, sắc ký ngược pha cũng được sử dụng kết hợp để
phân tách protein. Sự kết hợp này được gọi là sắc ký liên tục (tandem LC).
 Khối phổ - Trung tâm của proteomics
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) ngày càng được lựa chọn để phân
tích các phức hợp protein, là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi nhất và không thể
thay thế trong các nghiên cứu hỗn hợp protein những năm gần đây [7, 9, 18, 30].
Proteomics dựa trên nguyên lý khối phổ đã trở thành một môn khoa học thực sự nhờ
có các dữ liệu về trình tự gen và genome cùng với các thành tựu vượt bậc trong nhiều
lĩnh vực [2]. Việc phát triển các thiết bị khối phổ có độ phân giải, độ nhạy, độ chính
xác và tự động ngày càng cao làm cho khối phổ trở thành trung tâm trong nghiên cứu
protein và lĩnh vực proteomics trở nên kỳ thú hơn. Các kỹ thuật này ngày càng không
thể thay thế nhằm giải thích những thông tin được mã hoá trong genome.
Nguyên lý của khối phổ
Khối phổ là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích điện khi
chúng di chuyển trong điện trường. Mẫu được ion hóa trở thành các phân tử tích điện
khác nhau và được phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z. Dữ liệu phổ khối được
tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các công cụ tin sinh học.
Hoạt động và cấu tạo chung của máy khối phổ
Ban đầu, mẫu (i) được ion hóa thành các ion ở các trạng thái tích điện khác nhau, (ii)
sau đó các ion mẫu sẽ được phân tách dựa trên sự khác biệt về giá trị m/z, (iii) ghi dữ
liệu phổ về khối của các ion đã phân tách với sự trợ giúp của các phần mềm tin sinh
học cho phép tìm kiếm trên các cơ sở dữ liệu và phân tích kết quả thu được. Máy khối
phổ không đo khối lượng (m) mà chúng đo giá trị m/z (mass/charge ratio).
Hệ thống khối phổ có nhiều loại và được ứng dụng rất đa dạng trong các lĩnh vực khác
nhau. Trong đó, có hai loại hệ thống hay được sử dụng chính trong proteomics là
MALDI-TOF và ESI-MS/MS [2, 10]. Hai hệ thống này khá khác nhau nhưng bổ sung
cho nhau với cùng một mục đích là nhận dạng protein. Máy khối phổ có 3 phộ phận
chính đó là (i) nguồn ion hóa mẫu, (ii) bộ phận phân tích khối, (iii) bộ phận ghi phổ
(detector). Tùy thuộc vào các loại nguồn và bộ phân tích khối mà máy khối phổ có cấu
hình và nguyên tắc hoạt động khác nhau. Hình 9 minh họa sơ đồ cấu tạo đơn giản của
hệ thống khối phổ.

Có 2 loại nguồn ion hóa mẫu hay được sử dụng đó là nguồn MALDI và ESI.
Kỹ thuật MALDI-TOF
MALDI là thuật ngữ chỉ phương pháp ion hóa mẫu hấp thụ dựa trên sự hỗ trợ của các
chất nền và năng lượng laser (Matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI).
Nguồn MALDI sử dụng các chất nền hỗ trợ để ion hóa mẫu dưới tác dụng của năng
lượng laser lớn.
 
 

  
Ban đầu, mẫu được xử lý, làm tinh sạch bằng nhiều phương pháp khác nhau. Sau đó
mẫu phân tích được trộn với các chất nền (các axit yếu như sinapinic) chứa các phân
tử hữu cơ nhỏ có khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng ở những bước sóng nhất định.
Hỗn hợp mẫu và chất nền được đưa lên khay và bay hơi tạo thành các hạt tinh thể bám
với peptid. Dưới tác dụng của nguồn năng lượng laser cực lớn chiếu vào làm cho các
chất nền (axit yếu) hấp thụ năng lượng và bật ra các photon. Mẫu được hấp thụ photon
và năng lượng sẽ được đi vào hệ thống khối phổ TOF. Các ion dương thường được tạo
ra đối với mẫu dạng các peptid/protein. Mỗi peptid có xu hướng hấp thụ một photon
kết quả là ion peptid sẽ tích điện dương +1.
Phương pháp MALDI-TOF và MALDI-TOF MS thường được sử dụng cho các mẫu
protein đơn giản, và khá tinh sạch [10]. Ưu điểm là có thể giải trình tự axit amin mảnh
peptid và đo chính xác khối lượng, nhưng nó lại không thích hợp cho việc phân tích
hỗn hợp protein phức tạp.

Kỹ thuật ESI-MS/MS
ESI (ElectroSpray Ionization) là thuật ngữ chỉ phương pháp ion
hóa mẫu bằng phương pháp phun chùm ion trong dung dịch tạo
thành đám sương mù với các giọt nhỏ dễ bay hơi.
Cơ chế hoạt động của nguồn ESI khá đơn giản. Dưới áp lực dòng
liên tục, đường kính cột bé và hiệu điện thế cao (2500V), peptid sẽ
được phun tơi thành các giọt nhỏ đa điện tích ra khỏi đầu kim
phun. Kim phun sẽ tạo thành các giọt nhỏ, như đám sương mù
(đám mây khí ion), dễ bay hơi, các giọt này chứa peptid và các
thành phần dung môi khác. Quá trình bay hơi được thực hiện bởi
nhiệt độ hoặc màng chắn khí nitơ (curtain gas) làm cho mẫu dễ
bay hơi. Kết quả là chỉ còn peptid tích điện và bay vào bộ phận
phân tích khối của máy khối phổ liên tục MS/MS.
 
 

 
Ngược với MALDI, nguồn ESI ion hóa mẫu trong dịch lỏng. Khi đó peptid sẽ tồn tại ở
dạng ion bởi vì chúng chứa các nhóm chức, và điện tích của chúng phụ thuộc vào pH
của dung môi. Ở giá trị pH axit (pH 3,5 hoặc thấp hơn) protein/peptid sẽ mang điện
tích dương và được phân tách bằng sắc ký nano đa chiều tốt hơn [3]. Do đó, nguồn ESI
hay được kết nối trực tiếp với hệ sắc ký lỏng và thường phân tích các peptid ở chế độ
ion dương. Hệ ESI-MS/MS có ưu điểm là tự động, ion hóa cao, có khả năng kết nối
linh động với sắc ký và khối phổ, peptid thường ở trạng thái đa điện tích (+2, +3...).
Trạng thái tích đa điện tích làm cho giá trị m/z phù hợp với giải khối cho phép của các
bộ phận phân tích khối như quadrupole và ion-trap. Hệ nanoLC-MS/MS có thể phân
tách hỗn hợp protein phức tạp với hàng ngàn protein được nhận dạng.
 
  
Có ba loại bộ phận phân tách khối liên tục MS/MS (tandem mass analyzer) là triple
quadrupole (hình 12), ion-trap và quadrupole-time of flight.

Mặc dù các bộ phận phân tích khối này hoạt động khác nhau nhưng chúng có chung
một chức năng là phân tách khối các ion trong điện trường. Hỗn hợp ion được hình
thành từ nguồn ESI sẽ được đi qua bộ phận phân tách khối liên tục để phân tách, lựa
chọn và vào buồng phân mảnh CID (collision-induced dissociation).
 
 Ion peptid sẽ bị phân mảnh thành các đoạn nhỏ hơn được đo và ghi phổ tại detector.
Quá trình phân mảnh liên tục được gọi là quá trình thực hiện MS/MS.
Các phần mềm tin sinh học
Công cụ proteomics quan trọng thứ ba là các phần mềm tin sinh học. Các phần mềm
này có thể so sánh, tìm kiếm và hỗ trợ kết quả thu được trên các cơ sở dữ liệu. Các
phần mềm ngày nay phát triển rất mạnh, đây là lĩnh vực tin sinh học mới mẻ và hấp
dẫn. Những dữ liệu thực nghiệm thu được thực sự cần phân tích bổ sung bằng các
phép thử và thuật toán trên máy tính [55]. Do đó từ sự phát triển các phần mềm phân
tích, so sánh hình ảnh gel 2 chiều như PD Quest, Quantity one (Bio-Rad),  Progenesis
(Nonlinear Dynamics) đến các dữ liệu phân tích về khối phổ, và nhiều công cụ đã
được bán cùng với các thiết bị tương ứng như MASCOT (Matrix Science) hay
SEQUEST (Thermo Finnigan). Các phần mềm này được dùng để so sánh phổ MS/MS
thực nghiệm thu được với phổ lý thuyết từ trình tự các protein trên cơ sở dữ liệu
(Swiss-Prot, EST sequence data, Genomics sequence data).

Chương 6: Kĩ thuật sinh học phân tử

- Biến đổi sinh học với sự trợ giúp của các enzyme có thể cải thiện đáng kể tốc
độ và tính đặc hiệu của các phản ứng trong hóa học hữu cơ.

- Tuy nhiên việc sử dụng các dung môi hữu cơ và các điều kiện khắc nghiệt trong
các ứng dụng công nghệ sinh học thường tương quan với việc khử hoạt tính của
enzyme hoặc giảm mạnh hoạt tính xúc tác.

- Cùng các phương pháp hóa lý để ổn định enzyme, chẳng hạn như: phương pháp
phụ gia, biến đổi hóa học và cố định enzyme, các phương pháp kĩ thuật enzyme
dựa trên tái tổ hợp DNA có thể được sử dụng để nâng cao hiệu suất của chất
xúc tác sinh học.

- Bằng cách sử dụng các công cụ tiên tiến của sinh học phân tử, tức là giải trình
tự thế hệ tiếp theo, gây đột biến theo hướng vị trí, protein dung hợp, hiển thị bề
mặt,… Giờ đây, các nhà nghiên cứu có thể tạo ra các enzyme để cải thiện hoạt
động, độ ổn định và tính đặc hiệu của cơ chất để đáp ứng nhu cầu công nghiệp.

 Lĩnh vực công nghệ sinh học cố gắng khai thác các enzyme phân lập và nuôi
cấy toàn bộ tế bào làm chất xúc tác sinh học có khả năng tăng tốc và tinh chế
các biến đổi hóa học phức tạp của các hợp chất hữu cơ để sử dụng trong công
nghiệp và tổng hợp.

Sinh học phân tử cải thiện hoạt động của enzyme

Nguyên liệu
 - Enzyme được tổng hợp bởi nhiều nguồn khác nhau:

o Vi sinh vật

o Động vật

o Thực vật

Nhưng trong tất cả enzyme vi sinh vật được quan tâm và sử dụng nhiều hơn
trong bối cảnh hiện nay vì vi sinh vật có khả năng sinh sôi nảy nở với tốc độ
cao và tạo ra nhiều hợp chất hoạt động.

 Các enzyme vi sinh vật đã được khám phá cho các ứng dụng công nghiệp và
thương mại ở mức độ lớn hơn, đặc biệt là trong các nhà máy chế biến sinh học,
dược phẩm, dệt may, thực phẩm và đồ uống, bánh kẹo, mỹ phẩm, sản xuất hóa
chất, sản xuất nhiên liệu sinh học.

- Các chất xúc tác sinh học:

o Lipase vi sinh vật được sử dụng để tổng hợp chất tạo màng sinh học hiệu quả về
chi phí.

o Dầu diesel sinh học, dược phẩm và hóa chất nông nghiệp từ các nguồn tự nhiên
có thể tái tạo.

o B-glycosidase được sử dụng trong quá trình đường hóa sinh khối thực vật công
nghiệp.

o Các sản phẩm OXH do nấm tiềm năng cũng trở thành chất xúc tác sinh học.

Các kỹ thuật trong sinh học phân tử

 Nhân bản phân tử (molecular cloning)

o Một trong những kỹ thuật cơ bản nhất của sinh

học phân tử để nghiên cứu hàm lượng protein là
nhân bản phân tử.

o DNA mã hoá cho protein quan tâm được nhân

bản bằng cách sử dụng phản ứng nhân gene
(PCR), hoặc các enzyme hạn chế vào một
plasmid (vector biểu hiện).

o Vị trí đầu tiên thuộc vị trí đa nhân dòng là các

vùng promoter và vùng bắt đầu phiên mã điều
 chỉnh sự biểu hiện của gen nhân bản. Plasmid này có thể được đưa vào trong tế
bào vi khuẩn hoặc động vật. Việc đưa DNA vào các tế bào vi khuẩn có thể thực
hiện bằng cách chuyển đổi thông qua việc hấp thụ DNA trần, liên hợp qua tế
bào hoặc bằng cách truyền qua vector virus.

o DNA mã hoá cho một protein quan tâm hiện đang ở trong tế bào, và protein bây
giờ có thể được biểu hiện.

o Số lượng lớn protein sau đó có thể được chiết xuất từ tế bào vi khuẩn hoặc tế
bào eukaryote. Protein này có thể được kiểm tra hoạt tính enzyme trong nhiều
tình huống khác nhau.

 PCR (Polymerase Chain Reaction)

o PCR là một kỹ thuật cực kỳ linh hoạt để sao chép DNA.

o PCR cho phép một chuỗi DNA cụ thể được sao chép hoặc sửa đổi theo những
cách xác định trước.

o Kỹ thuật PCR có thể đưa các enzyme giới hạn tới các đầu của các phân tử
DNA, hoặc để biến đổi các bazơ đặc biệt của DNA, sau đó là một phương pháp
gọi là sự biến dị điểm( site-directed mutagenesis).

o PCR cũng có thể được sử dụng để xác định liệu một đoạn DNA cụ thể có trong
một thư viện cDNA.

 Điện di gel ( Gel electrophoresis)

o 2% Agarose Gel trong Borate Buffer đúc trong một khay Gel (mặt trước, góc
cạnh)

o Gel điện di là một trong những công cụ chính của sinh học phân tử. Nguyên tắc
cơ bản là DNA, RNA, và protein có thể được tách ra dựa trên trường điện và
kích cỡ của chúng.

o Trong quá trình điện di agarose gel, DNA và RNA có thể được tách ra trên cơ
sở kích thước bằng cách chạy DNA thông qua một gel agarose tích điện.

Kỹ thuật điện di ngang trên gel agarose

Điện di ngang trên gel agarose (Agarose gel electrophoresis) là kỹ thuật được sử dụng
chủ yếu để phân tách DNA trong mẫu dựa trên kích thước, kỹ thuật này cũng được sử
dụng để phân tách RNA hoặc protein.
Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật điện di ngang
Phân tử DNA được cấu tạo từ các nucleobase được nối với nhau bởi khung sườn
(backbone) từ đường dideoxybose và một nhóm phosphate. Theo cấu trúc này, mỗi
một nucleotide sẽ đều mang điện tích âm, điều này khiến DNA có điện tích âm tỷ lệ
thuận với khối lượng (mass-to-charge). Do DNA có điện tích âm, việc sử dụng điện
trường có thể khiến DNA di chuyển về phía điện cực dương.

Hình 1. Cấu tạo của phân tử DNA

 
Quy trình thực hiện (xem thêm trong video bên dưới)
1) Chuẩn bị gel agarose:
- Agarose là một loại polysaccharide tự nhiên được chiết từ tảo biển. Gel agarose sử
dụng trong điện di thường ở nồng độ 0.5 ~ 2%, tùy vào kích thước DNA cần phân
tách.
- Khi đổ gel agarose, một chiếc lược sẽ được cắm lên trên miếng gel và gỡ ra khi gel
đã đông đặc để tạo thành các giếng cho phép nạp mẫu vào.
2 Chạy điện di trên gel agarose:
- Miếng gel agarose được đặt trong bồn điện di, chứa dung dịch đệm (buffer) dẫn điện
và ổn định pH, thường là Tris-acetate-EDTA (TAE) hoặc Tris-Borate-EDTA (TBE).
- Mẫu DNA được pha với dung dịch nạp mẫu (loading dye) nhằm giữ mẫu chìm trong
giếng và cung cấp chỉ thị màu để nhận biết sự điện di.
3) Quan sát DNA sau khi điện di:
- Cần phải nhuộm gel để quan sát do DNA “vô hình” với mắt thường, phổ biến nhất là
nhuộm bằng hóa chất huỳnh quang, chẳng hạn như Ethidium Bromide (EtBr).. Tùy
vào loại hóa chất nhuộm huỳnh quang được sử dụng, có thể bổ sung chúng vào
agarose trước khi đổ gel hoặc sau khi chạy điện di để nhuộm
- Sau khi điện di và nhuộm gel xong, có thể thực hiện ghi nhận hình ảnh DNA thông
qua hệ thống đọc gel (gel document system) hay còn gọi là hệ thống chụp ảnh gel. Hệ
thống đọc gel gồm nguồn chiếu sáng (illumination source), bộ lọc (filter) để loại bỏ
ánh sáng nền và camera để ghi nhận hình ảnh, đôi khi còn tích hợp PC và trang bị màn
hình cảm ứng.
Một số ứng dụng của kỹ thuật điện di trên gel agarose
1) Trong tạo dòng (cloning): Điện di DNA là bước quan trọng trong quy trình tạo
dòng, giúp nhà nghiên cứu phân tích sản phẩm PCR hoặc DNA sau khi xử lý với
enzyme cắt giới hạn (RE). Ngoài ra, điện di cũng cho phép thu hồi đoạn DNA mong
muốn từ gel agarose.
2) Dấu ấn di truyền (genetic fingerprinting): là kỹ thuật kết hợp việc PCR và điện di
các trình tự lặp lại ngắn trên bộ gene. Những trình tự này sẽ có số lần lặp lại khác nhau
ở các cá thể khác nhau, dẫn đến sự khác biệt về kích thước sản phẩm PCR và có thể
nhận biết thông qua điện di.
3) Trong chẩn đoán (diagnostic): điện di DNA là bước không thể thiếu trong quy trình
xét nghiệm bệnh lý bằng PCR, từ bệnh di truyền cho đến các bệnh truyền nhiễm.

Ưu, nhược điểm

 Ưu điểm

+ Cải thiện tính đặc hiệu, hoạt tính xúc tác của enzyme.
+ Các công nghệ, thiết bị hiện đại.

Ứng dụng thực tế

 Ứng dụng trong y học

+ Nhằm nâng cao chất lượng chẩn đoán và điều trị, Bệnh viện Đa khoa (BVĐK) tỉnh
Khánh Hòa đã đưa vào hoạt động hệ thống máy xét nghiệm sinh học phân tử (PCR).
Đây là một kỹ thuật cao giúp chẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm khuẩn ở người.
Thực hiện kỹ thuật xét nghiệm sinh học phân tử tại BVĐK Khánh Hòa
+ So với các chẩn đoán lâm sàng và xét nghiệm thường quy, kỹ thuật xét nghiệm sinh
học phân tử cho kết quả nhanh hơn, chính xác hơn. Đây có thể nói là lựa chọn tốt nhất
để thực hiện nhiều mục đích trong chẩn đoán bệnh nhiễm khuẩn mà các phương pháp
khác không thực hiện được.
+ Những người bị nhiễm viêm gan siêu vị B mãn có nguy cơ bị ung thư gan cao gấp
200 lần so với người bình thường. Chính vì vậy, việc xét nghiệm định kỳ HBV-HCV
bằng kỹ thuật sinh học phân tử sẽ giúp BS phát hiện sớm và đưa ra phác đồ điều trị
thích hợp cho bệnh nhân.
+ Tương tự đối với bệnh lao, trước đây các xét nghiệm thường quy chỉ giúp phát hiện
bệnh nhân có bị nhiễm lao hay không, độ nhạy và độ đặc hiệu kém, việc nuôi cấy vi
trùng lao được coi là tiêu chuẩn vàng nhưng thời gian lâu (6-8 tuần), trong khi đó với
xét nghiệm sinh học phân tử, BS sẽ biết chính xác hàm lượng nhiễm (đây là điều rất
quan trọng), đột biến kháng thuốc của vi trùng lao, từ đó đưa ra phác đồ điều trị thích
hợp, có lợi cho bệnh nhân.
 Ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán, điều trị
+ Sản xuất các loại thuốc có bản chất protein
  Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

+ Phân tích di truyền các loại vi sinh vật sử dụng trong quá trình lên men, xác định các
gen mã hóa cho các tính trạng mong muốn nhằm tạo ra năng suất, chất lượng cho sản
phẩm lên men.
+ Tạo ra các vi sinh vật chuyển gen phục vụ cho các quy trình lên men. Ví dụ trong
sản xuất rượu, ngày nay người ta thường dùng các chủng vi sinh vật có khả năng tạo
rượu cao và cho hương vị tốt. Phần lớn các chủng đó được nghiên cứu, tuyển chọn, lai
tạo bằng công nghệ di truyền.
+ Đối với các sản phẩm lên men sữa như sữa chua, phomat, trước kia người ta thường
dùng những vi sinh vật tự nhiên có mặt trong sữa để lên men. Ngày nay, người ta đã
tạo ra các chủng mới với các tính chất xác định và đã điều khiển được quá trình lên
men theo hướng mong muốn.

 Ứng dụng trong nông nghiệp

+ Cải thiện giống cây trồng

+ Xây dựng kĩ thuật canh tác mới.