ФАКУЛТЕТ ПО ХИМИЧНО И СИСТЕМНО ИНЖЕНЕРСТВО

КАТЕДРА „ БИОТЕХНОЛОГИЯ “

РЕФЕРАТ
ПО ФАРМАЦЕВТИЧНИ БИОТЕХНОЛОГИИ

Тема:
Ензимен синтез на амоксицилин от пеницилин G ацилаза в
присъствието на йонни течности

Изготвил: Нора Георгиева, Проверил:.....................

Фак. номер БТ / Проф. Д. Даналев /

2021
 ВЪВЕДЕНИЕ

Пеницилин G ацилазата (PGA, E.C.3.5.1.11), известна още като пеницилин

ацилтрансфераза, пеницилин амидаза или пеницилин амидохидролаза, е важен ензим за
фармацевтичната индустрия. Използва се за хидролизата на пеницилин G, произвеждайки
6-аминопенициланова киселина (6-AПК), ключова молекула в синтеза на полусинтетични
пеницилини. Освен това, PGA може също да катализира ензимния синтез на
полусинтетичен β-лактамни антибиотици, чрез кондензация на различни ацилни групи до
β-лактамно ядро (например 6-AКА). Бактерии, дрожди и гъбички произвеждат PGA, но
най-използваният в промишлените процеси е ензимът от Escherichia coli ATCC 11105.
Този ензим е хетеродимер. По-малката субединица, α, с 209 аминокиселини, има
молекулна маса 20 500 Da, а по-голямата, β, има 69 000 Da и 557 аминокиселини. Ролята на
α субединицата е да разпознава страничната верига на субстрата, докато крайният серин,
съществен за каталитичната активност, е в β субединицата. Остатъците от двете
субединици са част от активното място на ензима. Сред най-рутинно използваните
фармацевтични продукти в света, β-лактамните антибиотици заемат видно място.
Полусинтетичните цефалоспорини и пеницилини като цефалексин, цефадроксил,
цефазолин, ампицилин, амоксицилин, наред с много други, представляват приблизително
65% от непрекъснато нарастващото производство на антибиотици, което изпреварва 45
000 тона през 2000 г. Амоксицилин заема важно място на този пазар. Той има широк
спектър на действие, висока разтворимост, висока скорост на абсорбция и е стабилен при
киселинни условия, което позволява пероралното приложение на това лекарство, което е
устойчиво на стомашното рН. Настоящият промишлен процес, използван за
производството на тези антибиотици, е по-скоро драстичен химически път, включително
защита и премахване на защитата на реактивни групи. Изисква ниски температури (-30
°C), използване на токсични органохлоридни разтворители и генерира нерециклируеми
отпадъци. Понастоящем има тенденция за концентриране на производството на β-
лактамни антибиотици в няколко страни. Добивите, които се постигат от химичният
синтез са много високи, което допринася за ниските пазарни цени на тези лекарства. Това
разбира се е важна характеристика за общественото здраве, особено в неразвитите страни.

1
Но тенденцията към по-строго регулиране на околната среда отваря прозорец от
възможности за други, по-малко вредни технологии. Ензимният синтез на полусинтетични
β-лактамни антибиотици е предложен за първи път от Cole. Работейки при меки условия
на реакция и генерирайки безвредни соли като отпадък от процеса на пречистване,
ензимният път стана обект на интензивни изследвания като „по-чист“ процес . Ензимните
реакции са „екологични“ стратегии. Ензимите са биоразградими и следователно по-малко
замърсяващи от химическите катализатори. Въпреки това, ензимният синтез на β лактамни
антибиотици все още не е икономически конкурентен с фино настроения конвенционален
химичен процес. Всъщност, въпреки напредъка в тази област, който позволи известен
оптимизъм по отношение на икономическата осъществимост на ензимния процес, към най-
доброто доколкото е известно, в целия свят няма индустрия, използваща ензимния синтез
на амоксицилин в производствения си процес.

За да се намалят разходите за ензимния синтез, трябва да се обърне внимание на две

точки: повишаване на добива и селективността на процеса; и намаляване на цената на
биокатализатора чрез повторното му използване. Разтворимите ензими обикновено
показват по-ниска стабилност от химическите катализатори и често не могат да бъдат
възстановени. Този факт затруднява прилагането им в промишлената практика. Този
проблем може да бъде преодолян чрез техники за ензимно имобилизиране, които
подобряват термичната и оперативна стабилност, правят катализатора лесен за работа и
предотвратяват ензимната агрегация. Освен това, възможността за възстановяване и
повторно използване на ензими, имобилизирани върху твърди опори, намалява
оперативните разходи в индустрията. Полусинтетичните антибиотици могат да бъдат
произведени с помощта на ензими чрез два подхода: термодинамично контролиран синтез
(ТКС), който е обратната реакция на антибиотичната хидролиза; или кинетично
контролиран синтез (KКС), който изисква активиране на субстрата. В ТКС добивът е
ограничен от термодинамичната равновесна константа на реакцията, докато за KКС
конкуренцията между различните каталитични активности (трансфераза, естераза и
амидаза) на PGA определя добива и селективността на цялостния процес. Основен
проблем с TКС е, че синтезът на амоксицилин е напълно изместен към хидролизата на
антибиотика във водна среда, при условията, при които ензимът е активен. Освен това, за

2
да се осъществи ензимният синтез на амоксицилин, аминогрупата на 6-AПК и
карбоксилната група р-хидроксифенилглицин трябва да е неутрална. Въпреки това,

няма диапазон на pH, където и двата субстрата са предимно в нейонизирано състояние,

както се изисква за ензимното действие. В KКС на β-лактамни антибиотици, активирано
производно на донорът на ацила, естер или амид, реагира с β-лактамното ядро (6-AПК) и
произвежда антибиотика, като по този начин се заобикаля нуждата от неутрална
карбоксилна група в предшественика на страничната верига, както се изисква в TКС. При
тази реакция PGA действа като трансфераза. Този ензим обаче също е хидролаза, така че 6-
AПК и водните молекули се конкурират в нуклеофилната атака към ацил-ензимния
междинен продукт. В резултат на това селективността се превръща в проблем. Фиг. 1
илюстрира реакциите, участващи в KКС на амоксицилин, където р-хидроксифенилглицин
метиловия естер (PHPGME) е използван.

Фигура 1. KКС на амоксицилин, катализиран от PGA. В реакциите PGA действа като трансфераза
(за синтез) и като хидролаза, насърчавайки две нежелани странични реакции (хидролиза 1 на
производното на ацил донор и хидролиза 2 на антибиотика).

В тези последователно-паралелни реакции PHPGME реагира с 6-AПК за образуване на

амоксицилин и метанол, докато се хидролиза произвежда р-хидроксифенилглицин (PHPG)
и метанол. В хидролизата на амоксицилин генерира 6-AПК и PHPG. Би трябвало трябва да

3
се подчертае, че р-хидроксифенилглицин етилов естер (PHPGEE) може също да се
използва, като още повече намалява въздействието на процеса върху околната среда. По
този начин хидролитичните реакции са основният недостатък, възпрепятстващ
индустриалното внедряване на ензимния синтез на полусинтетични пеницилини.
Следователно максимизирането на селективността (синтез/хидролиза, съотношение S/H)
към антибиотика е ключов въпрос за икономиката на ензимния процес. Тези нежелани
странични реакции могат да бъдат частично избегнати чрез намаляване на водната
активност (aw) в реакционната среда. Един от начините за намаляване на хидролитичните
реакции е използването на органични съразтворители. През последните години много
усилия били насочени към изследване на ензимния синтез на полусинтетични пеницилини
в присъствието на органични съразтворители, или за TКС, или за стратегията KКС.
Въпреки това, че са докладвани някои добри резултати по отношение на добива и
селективността органичните разтворители имат недостатъка, че са летливи, запалими,
токсични и вредни за околната среда. Йонните течности (IL) са се появили като
разтворители, които могат да заменят традиционните органични среди в различни
биотехнологични процеси. Преди едно десетилетие, доколкото ни е известно, IL започнаха
да се използват като реакционна среда при биотрансформации. ILs са органични соли,
които съществуват като течности под прагова температура (обикновено около 100 °C). ILs
се считат за обещаващ клас „зелени разтворители” главно поради тяхното незначително
парно налягане. Освен това те са незапалими и имат висока термична и химическа
стабилност. В допълнение, ILs са признати като „дизайнерски разтворители“, тъй като
техните физикохимични свойства като хидрофобност, вискозитет, плътност и
разтворимост могат да бъдат настроени чрез избиране на различни комбинации от катиони
и аниони, и на прикрепения заместител също. Типичните IL се основават на органични
катиони, сдвоени с различни аниони, които имат силно делокализиран отрицателен заряд.
Солите на базата на имидазолий (IM) са най-изследваните IL в биотехнологията. Освен
това, бис(трифлуорометилсулфонил)имид (NTf2), тетрафлуороборат (BF4) и
хексафлуорофосфат (PF6) са най-често използваните аниони. Фиг. 2 показва химичната
структура на тези йони.

4
 Фигура 2. Химическа структура на йонните течности, които обикновено се използват в
биотехнологичните процеси.

Накратко, ензимният синтез на β-лактамни антибиотици все още не е придобил

индустриална приложимост поради ниската селективност на реакцията, причинена от
хидролизата на субстрата и продукта. Следователно важни антибиотици (сред тях
амоксицилин) продължават да се произвеждат по химичен път, като се използват
органохлоридни разтворители. По този начин използването на „най-зеления разтворител”,
водата, не е алтернатива на практика. С тази мотивация, тази работа оценява
каталитичната активност на PGA за KКС на амоксицилин, използвайки различни IL,
всички базирани на диалкилимидазолиеви катиони. Реакцията в напълно водна среда
(използвайки фосфатен буфер) е избрана като стандарт за сравнение с реакциите,
проведени в нарастващи пропорции на ILs, за да се оцени влиянието на тези разтворители
върху показателите за ефективност на реакциите (6-AПК преобразуване и селективност).

5
 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ

Поведението на ензимите в неводни разтворители все още не е напълно изяснено.

Още от пионерските изследвания на ензимната катализа в органични разтворители се
поставя под въпрос дали напълно водната микросреда е от съществено значение за
поддържане на активната конформация на ензимите. Количеството вода, налично за
ензима в реакционната среда (ензимна хидратация), особено за взаимодействие с
активното място, е тясно свързано с термодинамичната водна активност в средата (aw). По
този начин били извършени измервания на aw. Таблица 1 показва стойностите на aw за
трите IL-водни среди, използвани в кинетичните анализи, за различни обемни състави на
всяка среда, измерени при 25 °C след уравновесяване за 24 часа.

Таблица 1. Водна активност (aw) за различни смеси йонна течност-вода (IL-вода), измерва се при
25 °C след уравновесяване за 24 часа, със стандартни отклонения на трикратни измервания

Струва си да се отбележи, че насипните „състави“ на сместа IL-вода са изразени тук като

обемни фракции. Според таблица 1 анионите имат голямо влияние върху
взаимодействието „IL-вода“ . За всички обемни фракции най-ниските стойности на aw са
открити за BMI·BF4, докато по-високите стойности са за BMI·NTf2. Стойностите на aw за
IL без добавяне на вода, 100% (v/v), са потвърдени от по-ранно проучване (0,17 и 0,30 за
BMI·BF4 и BMI·PF6, съответно). Както се очаква, намаляването на обемната фракция на
IL предполага по-високи стойности на aw. Известно е, че aw зависи от специфичните
взаимодействия между разтворителя и водата, т.е. aw е по-висок за разтворител, който
съдържа по-хидрофобна група. Накратко, тези взаимодействия са предпочитани в
хидрофилните разтворители, което води до по-ниски стойности на аw, смесването на IL с
вода варира значително и непредвидимо, тъй като BMI·BF4 е смесим с вода, но BMI·PF6 и
BMI·NTf2, които имат подобен полярност като BMI·BF4, са само частично се смесва с
6
вода. Наблюдава се, че разтворителите с подобни полярности могат да имат много
различни стойности на смесимост във вода. Таблица 2 представя стойностите на
полярността на багрилото на Reichardt (EN T) получени при 25 °C и водно съдържание на
ILs, уравновесени при 25 °C във вода.

Таблица 2. Стойности на полярността на багрилото на Reichardt (EN T) при 25 °C и вода

съдържание на йонните течности, уравновесени при 25 °C във вода, и двете докладвани в
литературата

Емпиричната скала за полярност ENT се основава на изместването на лентата на

абсорбция на пренос на заряд на солватохромна сонда в присъствието на разтворител.
Промените в позицията на лентата за поглъщане на заряда във видимия спектър се дължат
на водородната връзка между разтворителя и феноксидния кислороден атом, присъстващ в
багрилото на Reichardt. EN стойността на T след това се определя като функция на
позицията на лентата на абсорбция на пренос на заряд. ENT стойностите за ILs зависят от
силата на свързване на водорода между катиона, който съставя IL, и феноксидната група,
присъстваща в багрилото на Reichardt. Високите стойности на ENT показват, че ILs
проявяват силни сили на водородна връзка, а разтворителите, които демонстрират
способността за водородни връзки, представляват потенциала да повлияят на структурата
на ензима. Съгласно скалата за полярност на разтворителя, по-високите стойности на ENT
съответстват на по-високия полярност на разтворителя. Солватохромните параметри
осигуряват прост метод за определяне на полярността на разтворителя. Следователно
сравнението между данните, представени в таблици 1 и 2, показва, че редът на смесимост с
вода (хидрофилност), BMI·BF4 > BMI·PF6 > BMI·NTf2, следва полярността на тези ILs,
като по този начин обяснява стойностите на aw.

7
 Таблица 3. Експериментални вискозитети (η) на йонните течности, получени при 25 °C

Наблюдава се, че рангът на вискозитетите е BMI·PF6 > BMI·BF4 > BMI· NTf2. В
допълнение, по-високата симетрия на неорганичните аниони (PF6 или BF4) в сравнение с
органичния анион (NTf2) може да играе важна роля, т.е. геометрията и молната маса на
анионите имат силно влияние върху вискозитета на този клас от IL В процесите на
промишлено производство повечето ензими са имобилизирани, стабилизирани, за да
улеснят боравене и подобряване на тяхната стабилност на работа. Тези хетерогенни
частици на катализатора са обект на вътрешни и външни ограничения на масовия
транспорт, които са силно повлияни от вискозитета на реакционната среда. Важен аспект,
който трябва да се наблюдава при изследвания с иновативни разтворители, както е в
случая с използването на ILs за процеса на ензимен синтез на амоксицилин, е
експерименталната възпроизводимост, която може да бъде постигната. Следователно, за да
се илюстрира възпроизводимостта на реакциите, извършени в тази работа, Фиг. 3 показва
еволюцията на KCS на амоксицилин, катализиран от PGA, имобилизиран върху
Sepabeads® в напълно водна среда, докато Фиг. 4 показва някои реакции с ILs като
съразтворители (в различни концентрации на всеки един от IL).

Фигура 3. Синтез на амоксицилин при 25 °C и pH 6,5

с начални обемни концентрации: 50 mM PHPGME,
50 mM 6-APA и 0,2 g от 260 IU g-1 от PGA
препарат в напълно водна среда (100 mM фосфатен
буфер с pH 6.5). В графиките: (□) PHPGME, (▲) 6-
APA, (■) PHPG и (∇) амоксицилин. Ленти за грешки:
S.D., изчислено от три екземпляра.

8
 Фигура 4. Синтез на амоксицилин при 25 °C и pH 6,5 с начални обемни концентрации: 50 mM
PHPGME, 50 mM 6-APA и 0,2 g от 260 IU g-1 от PGA препарат в (а) 25% (v/v) BMI·BF4, (b) 50%
(v/v) BMI·NTf2 и (c) 75% (v/v) BMI·PF6. В графиката: (□) PHPGME, (▲) 6-APA, (■) PHPG и ( ∇)
амоксицилин. Ленти за грешки: S.D., изчислено от три екземпляра.

Тези графики показват, че стандартното отклонение (SD) от три екземпляра е малко и във
всички случаи по-ниско от 5%, което свидетелства за високата възпроизводимост на
експериментите. Освен това профилите на субстратите и продуктите следват очакваната
тенденция за тази система от последователно-паралелни реакции. Важно е да се отбележи,
че изчисленията на масовия баланс са направени за всички реакции, винаги с отклонения
под 5%. Стехиометрията на реакциите, показани на фиг. 1, осигурява две степени на
свобода за системата, така че конверсията на 6-AПК и селективността (синтез/хидролиза,

9
съотношение S/H) са индексите, избрани за оценка на ефективността на ензимния синтез
на амоксицилин.

Изборът на оптимален разтворител не може да се основава само относно неговите физико-

химични свойства: кинетичните тестове са от съществено значение за тази оценка.
Превръщането е друга важна променлива при оценката на ефективността на ензимния
процес. Фиг. 5 представя сравнение, по отношение на 6-AПК конверсия (%), на всички
експерименти, които са проведени в тази работа.

Фигура 5. Превръщане на 6-APA (%) след 180 минути реакция. Амоксицилин синтезира при 25 °C и
pH 6,5 с начални обемни концентрации: 50 mM PHPGME, 50 mM 6-APA и 0,2 g от 260 IU g-1 от
PGA препарат.

Графиката показва, че конверсията намалява рязко в реакциите с BMI·BF4 като

съразтворител в сравнение със стандартната реакция. Реакциите в BMI·PF6 също показват
намаляване на конверсията с повишаване на концентрацията на IL, но много по-слабо
изразено. Анализите с BMI·NTf2 показват увеличение на конверсията до 62,5% (v/v) IL, а
за по-високи обемни фракции има намаление на конверсията. Важно е да се спомене, че за
чисти ILs, 100% (v/v), не е имало забележими реакции. На фиг. 5 се отбелязва
„неочаквано“ плато в диапазона 12,5–62,5% (v/v) на по-хидрофобните ILs, BMI·PF6 и
BMI·NTf2. Сравнението между профилите на конверсия и стойностите на aw в таблица 1
обаче показва, че стойностите на aw не се променят значително в диапазона 12,5–62,5%

10
(v/v), т.е. ензимната хидратация в този регион е достатъчна за поддържане ензимната
активност почти непроменена за тези два ILs в този регион на състав. PGA, имобилизиран
върху Sepabeads®, биокатализаторът, използван в настоящото изследване, е силно
стабилен катализатор, способен да издържи на неблагоприятни реакционни условия.Тези
опори са здрави и подходящи за промишлени цели, с много висока повърхностна плътност
на епоксидните групи, което позволява интензивно взаимодействие ензим-поддръжка.
Освен това, ензимната активност на PGA се измерва преди и след всяка реакция и никога
не е наблюдавано дезактивиране.. За да се гарантира, че частиците на PGA,
имобилизирани върху Sepabeads®, не са структурно засегнати от присъствието на ILs в
реакционната среда, анализите на изображенията се извършват чрез техниката на
сканираща електронна микроскопия (SEM). За тази цел частиците на биокатализатора се
промиват еднакво и се сушат под вакуум за задно фиксиране и покритие със злато. Фиг. 6
показва микроснимките на катализатора преди да бъде използван в реакциите (фиг. 6а и б)
и след като е бил използван при синтеза на амоксицилин с IL като съразтворител (фиг. 6в и
г). Наблюдава се, че целостта на частиците е перфектно запазена.

Фигура 6. Микрофотографии на катализатора (PGA, имобилизиран върху Sepabeads®): (a) и (b)

SEM на частиците преди реакцията, (c) и (d) SEM след реакцията в присъствието на йонна
течност.

Вискозитетът на ILs също пречи на наблюдаваната активност на ензима, най-вече защото

са използвани имобилизирани ензими, т.е. процесът е подложен на съпротивления при
пренос на маса както във външния филм, така и в порите на частиците. Таблица 3 показва,

11
че рангът на вискозитетите е BMI·PF6 > BMI·BF4 > BMI·NTf2. Същият този клас на
вискозитети е докладван в литературата, но вискозитетите за изсушените ILs са по-високи
от стойностите, установени в това изследване, което показва, че наличието на вода има
важен ефект върху вискозитета на средата.44 Следователно, масата съпротивлението при
прехвърляне може да се потвърди за по-висока конверсия в BMI·NTf2, отколкото в
BMI·PF6. От друга страна, за до 62,5% (v/v) от BMI·NTf2 конверсията е по-висока,
отколкото в напълно водна среда. Това е пример за сложността на явленията, включени в
IL-ензимно взаимодействие. За разлика от другите два IL, има систематичен спад на
конверсията на 6-APA с увеличаване на обемната фракция на BMI·BF4 (виж Фиг. 6). В
този случай, вместо вискозитета на BMI·BF4, смесимостта във вода и полярността
допринасят по решаващ начин за тези резултати, тъй като последните пряко засягат aw.
Някои разтворители имат тенденция да се отстраняват вода от близост до ензима, което
води до недостатъчна хидратация и оттам до намаляване на ензимната активност. Степента
на това явление е по-голяма за хидрофилните разтворители, и поради тази причина
хидрофобните разтворители обикновено имат по-добро представяне в ензимните реакции.

Не е наблюдавана никаква активност за PGA в присъствието на различни концентрации на

BMI·BF4 (v/v) за реакцията на хидролиза на пеницилин G, докато резултатите бяха
обещаващи при BMI· PF6, като PGA показва по-голяма стабилност, отколкото във вода
при 10 °C. Интересно е, че при скорошни проучвания PGA не е в състояние да катализира
синтеза на β-лактамни антибиотици в присъствието на N-метилимидазол, който
обикновено се използва като предшественик на някои ILs. Получените резултати за
селективност и конверсия показват, че BMI·BF4 не изглежда подходящ разтворител за
провеждане на реакции на синтез на амоксицилин, тъй като няма значително повишаване
на селективността и много рязък спад при преобразуване настъпва по отношение на
водната система. Най-обещаващите разтворители бяха BMI·PF6 и BMI·NTf2, които
показват много значително увеличение на селективността, достигайки стойност с 400% по-
висока при 75% (v/v) BMI·PF6, отколкото в напълно водна среда, докато BMI· NTf2 показа
увеличение от повече от 350% за същото обемно съотношение. Въпреки това, BMI·NTf2
показва по-добри резултати по отношение на конверсията на 6-APA от BMI·PF6 в

12
диапазона 12,5–62,5% (v/v). Повишаването на селективността отразява намаляването на
нежеланите хидролитични реакции. Така ще се образува по-малко количество страничен
продукт, т.е. цената за възстановяване на PHPG и за последващ синтез на субстрата на
PHPGME ще бъде по-ниска. По същия начин, по-голямото преобразуване на β-лактамното
ядро (6-APA) представлява по-ниски разходи за рециклирането му. В този момент
сравнението между концентрациите 62,5 и 75% (v/v) на BMI·NTf2 показва намаление от
36% в конверсията и увеличение от 30% в селективността.

Изборът между 62,5 или 75% (vIL/vwater) ще зависи от анализа на разходите за този
ензимен процес. Реакциите, проведени в BMI·PF6, показват най-високи стойности на
селективност, но това увеличение е за сметка на конверсията. Едно вероятно обяснение за
намаляването на конверсията в реакции с BMI·PF6 може да бъде високият вискозитет на
този разтворител, който може да е намалил видимите скорости на реакцията. Вискозитетът
на BMI·PF6 може да бъде намален чрез повишаване на реакционната температура или чрез
добавяне на някакъв органичен разтворител, който не засяга стабилността на PGA, което е
извън целта на това изследване. Освен това, при определени условия, контактът на
BMI·PF6 с водна фаза може да доведе до хидролиза на PF6 аниона, генериращ HF. IL,
който показа най-добрите характеристики за използване в ензимния синтез на
амоксицилин, беше BMI·NTf2, който е най-малко вискозен и не е склонен да отстранява
водата от ензимната близост, тъй като е най-хидрофобният от тях, без обаче да е отговорен
за някаква забележима деформация на ензимната структура, запазвайки целостта на
активния сайт. Следователно е проведено изследване в диапазона от 62,5 до 75% (v/v)
BMI·NTf2, за да се определи границата на концентрация, която няма да намали
конверсията на 6-AПК и все пак да запази селективността на реакцията. Фигура 7 показва
еволюцията на KКС на амоксицилин със 71% (vIL/vwater) BMI·NTf2, което показва
увеличение от 36% в конверсията в сравнение със стандартната реакция (фосфатен буфер),
0% (v/v) и увеличение на селективността с повече от 300%.

13
 Фигура 7. Синтез на амоксицилин при 25 °C и pH 6,5 с начални обемни концентрации: 50 mM
PHPGME, 50 mM 6-APA и 0,2 g от 260 IU g-1 от PGA препарат в 71% (v/v) BMI·NTf2 . В
графиката: (□) PHPGME, (▲) 6-APA, (■) PHPG и (∇) амоксицилин.

Важен момент, който трябва да се оцени след синтеза на лекарство, е възможността за

изолиране на целевата молекула, амоксицилин, от реакционната смес. Фиг. 8 представя
типична хроматограма на проба, която е изтеглена по време на реакция на ензимен синтез
на амоксицилин, използвайки BMI·NTf2 като съразтворител.

Фигура 8. Типична хроматограма на проба, извадена по време на ензимния синтез на амоксицилин,

включително ленти от PHPG (2,9 минути), 6-APA (4,5 минути), амоксицилин (7,1 минути),
PHPGME (9,8 минути) и BMI·NTf2 (13–16 минути). Подвижната фаза се състои от 1,4 g от SDS,
0,6805 g KH2PO4, 650 mL вода със свръхвисока чистота и 350 mL ацетонитрил, при рН 3.0.
Анализите се извършват при 25 °C и откриване при 225 nm като λmax. Колона: Phenomenex Gemini
C18, 150 × 4,6 mm, 5 μm.

14
След ензимния синтез на амоксицилин в присъствието на 71% (vIL/vwater) BMI·NTf2,
резултатът е смес от кристали амоксицилин и PHPG, както може да се наблюдава на Фиг.9.

Фигура 9. Типична хроматограма на кристалите, образувани след ензимния синтез на

амоксицилин в присъствието на 71% (v/v) BMI·NTf2, включително ленти PHPG (2.9 min),
амоксицилин (7.1 min), и BMI·NTf2 (13–16 минути). Подвижната фаза се състои от 1,4 g SDS,
0,6805 g KH2PO4, 650 mL вода със свръхвисока чистота и 350 mL ацетонитрил, при рН 3.0.
Анализите се извършват при 25 °C и откриване при 225 nm като λmax. Колона: Phenomenex
Gemini C18, 150 × 4,6 mm, 5 μm.

Малко количество IL все още е задържан, вероятно прилепнал към повърхността на

кристала (която все още не е била измита в този момент). Пречистването на антибиотика
беше успешно, както е показано на Фиг. 10.

15
Фигура 10. Типична хроматограма, получена след етапа на пречистване (промиване, разтваряне и
рекристализация) на кристалите в резултат на ензимния синтез на амоксицилин в присъствието
на 71% (v/v) BMI·NTf2, с една ивица от амоксицилин (7,1 минути). Подвижната фаза се състои
от 1,4 g SDS, 0,6805 g KH2PO4, 650 mL вода със свръхвисока чистота и 350 mL ацетонитрил при
рН 3,0. Анализите бяха проведени при 25 °С и откриване при 225 nm като λmax. Колона:
Phenomenex Gemini C18, 150 × 4,6 mm, 5 μm.

Масспектър след етапа на пречистване потвърждава идентичността на синтезирания

амоксицилин (виж Фиг. 13).

Фигура 13-Мас-спектър на
амоксицилин, синтезиран в 71%
(v/v) от BMI·NTf2 и пречистен чрез
утаяване в неговата изоелектрична
точка, получен използвайки 9 V
конусно напрежение и 5 eV
енергия на сблъсък. Спектрални
данни: MS (ESI+ , троен
квадрупол) m/z: 366 [M + H]+, 349
[M + H − NH3]+, 208 [M + H
C6H9NO2S]+ , 160 [C6H9NO2S +
H]+ и 114 [C6H9NO2S − COOH]+.

Прекурсорният йон за амоксицилин е протонираният молекулен йон [M + H]+ при 366 m/z.
Едно от основните разцепвания за амоксицилин произвежда продуктов йон при 349 m/z,

16
поради загубата на амоняк [M + H − NH3] +. Типично разцепване сред β-лактамните
антибиотици е отварянето на β-лактамния пръстен, генерирайки продуктов йон при 160
m/z [C6H9NO2S + H]+ и допълнителна загуба на карбоксилната група от частта на
тиазолидиновия пръстен при 114 m /z [C6H9NO2S − COOH]+. Продуктовият йон при 208
m/z [M + H − C6H9NO2S]+ също е резултат от разцепването на антибиотичното ядро. Един
зелен индустриален процес, използващ IL, би довел само до разтвор на NaCl като
продухваща струя. Антибиотикът ще кристализира в реактора с периодично захранване,
заедно със страничния продукт PHPG, и след това IL (съдържащ малки количества
разтворени реагенти) ще бъде филтриран и рециклиран за друг цикъл на реактора, заедно с
нереагирал 6- AПК и PHPGME. След това кристалите на амоксицилин и PHPG се
промиват, за да се отстранят всякакви следи от IL. След това този поток се изпарява
(осигурява чиста вода като изтичане) и задържаният IL също се рециклира в реактора.
След това чистите кристали на амоксицилин ще бъдат разтворени с помощта на NaOH за
повишаване на рН, твърдият PHPG ще бъде събран и рециклиран в реактор за
естерификация, където ще реагира с метанол (или дори по-добре, етанол), за да осигури
естерен субстрат на страничната верига. Антибиотикът накрая ще бъде повторно
кристализиран, като се използва HCl за понижаване на pH, като по този начин се получава
NaCl разтвор като единствен остатък. Трябва да се отбележи, че не е наблюдавано
разграждане на IL след няколко рециклирания в лабораторен мащаб.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛА ЧАСТ

 Материали

Химикалите, амоксицилин, 6-аминопенициланова киселина (6-APA), р-

хидроксифенилглицин (PHPG), р-диметиламинобензалдехид (PDAB) и р-
хидроксифенилглицин метилов естер хидрохлорид (PHPGME), са от Sigma-Aldrich.
Пеницилин G ацилаза (PGA) от Escherichia coli била ковалентно имобилизирана върху
опора Sepabeads® (Mitsubishi Chemical Corporation) . Всички йонни течности (IL), 1-бутил-
3-метилимидазолиев хексафлуорофосфат (BMI· PF6), 1-бутил-3-метилимидазолиев

17
тетрафлуороборат (BMI·BF4) и 1-бутил-3-метилимидазолиев бис
(трифлуорометилсулфонил) имид (BMI·NTf2), се приготвят, както е описано по-горе.

 Ензимна активност

Ензимната активност на PGA, имобилизирана върху Sepabeads®, се измерва чрез

метода на p-диметиламинобензалдехид (PDAB), базиран на образуването на база на Шиф
след реакцията на 6-APA с PDAB. 6-APA, получен при ензимната хидролиза на пеницилин
G (Pen G) реагира с PDAB, генерирайки оцветено съединение, което абсорбира светлина
във видимата област и може да бъде наблюдавано в спектрофотометър при дължина на
вълната от 415 nm. Във всички експерименти се използва партиден реактор с кожух и
механично разбъркване. Температурата и рН на реакционната среда се поддържат
постоянни по време на анализите за ензимна хидролиза. В работните условия бяха както
следва: разтвор на Pen G 5% (w/v) в 100 mM фосфатен буфер рН 8.0 и 37 °С. Една
международна единица ензим (IU) била определена като количество ензим, който
хидролизира 1 μmol Pen G на минута при 37 °C и рН 8.0.

 Синтез на амоксицилин

Ензимните реакции за синтеза на амоксицилин се провеждат под кинетичен

контрол. В тези експерименти реакцията между PHPGME и 6-APA се катализира от PGA,
имобилизиран върху Sepabeads®. Във всички анализи се използва партиден реактор с
кожух и постоянно механично разбъркване. Температурата на реакционната среда се
поддържа постоянна по време на ензимния синтез чрез термостатична баня, докато рН се
следи непрекъснато с рН метър. Експерименталните условия са идентични както за
реакциите, проведени в напълно водна среда, така и за реакциите с всяка йонна течност
като съразтворител. Първоначалните концентрации на субстрата са 50 mM както за
PHPGME, така и за 6-APA. В допълнение, съотношението ензим към субстрат (E/S) е 52 IU
mmol-1 субстрат и общият реакционен обем е 20 mL; по този начин, количеството на
катализатора, използван във всички експерименти, е 0,2 g. Всеки синтез се провежда при
25 ° С. Стандартът за сравнение е реакцията в напълно водна среда (100 mM фосфатен
буфер рН 6.5), без присъствието на каквато и да е йонна течност. IL, използвани като

18
съразтворители, са BMI·NTf2, BMI·PF6 и BMI·BF4 при (vIL/vwater). По време на хода на
реакциите, аликвоти се изтеглят и се разреждат в мобилната фаза за HPLC анализ.

 Пречистване на амоксицилин

В края на ензимния синтез на амоксицилин в присъствието на 71% (vIL/vвода)

BMI·NTf2, получените кристали на амоксицилин и PHPG се отстраняват от реакционната
среда чрез филтриране и се промиват с наситен разтвор на амоксицилин, с цел плъзгане на
всяка следа от IL, която може да бъде прилепнала. След това кристалите се разтварят при
рН 8,5 и 25 °С. След пълно разтваряне, амоксицилинът се прекристализира в неговата
изоелектрична точка, 4,9 при 4 °C. Всички етапи на пречистването се наблюдават чрез
HPLC анализи.

 Характеристика на амоксицилин

Амоксицилинът се характеризира с помощта на мас спектрометър (Waters Xevo TQ,

Масачузетс, САЩ). Директната инфузия на амоксицилин, разтворен в метанол/вода (1 : 1),
при 2 μg mL-1, се извършва със спринцовка помпа. Йонизацията се извършва от източник
на електроспрей в положителен режим (ESI+). Използван е троен квадруполен масов
анализатор. Масовият спектър (MS) е получен при използване на 9 V конусно напрежение
и 5 eV енергия на сблъсък.

 Аналитичен метод

Концентрациите се определят чрез високоефективна течна хроматография (HPLC) в

Shimadzu LC-6AD с SPD-10Avp UV-Vis детектор и Phenomenex Gemini C18 колона (150 ×
4.6 mm, размер на частиците 5 μm). Хроматографското разделяне се провежда при
изократно елуиране с подвижна фаза, съставена от 35% ацетонитрил, 4,85 mM натриев
додецил сулфат (SDS), 5 mM калиев фосфат едноосновен безводен (KH2PO4) и корекция
до pH 3,0 с помощта на фосфорна киселина (H3PO4). Елюентът се филтрира през 0,45 μm
мембрана и се дегазира с ултразвук преди употреба. Анализите бяха при 25 ° C и
откриване при 225 nm с обем на инжектиране от 10 μL и скорост на потока от 1 mL min-1.
Всички проби се разтварят в подвижната фаза. Всички разтворители са от HPLC клас.
Компонентите на реакционната среда се елуират в следния ред: PHPG, 6-APA,

19
амоксицилин, PHPGME и IL. Индекси на ефективност за кинетично контролиран синтез на
амоксицилин Изпълнението на ензимния синтез на амоксицилин под пътят на KCS беше
оценен с помощта на индекси на обща селективност (уравнение (1), S, съотношение
синтез/хидролиза) и 6-APA конверсия (уравнение (2), X6-APA) след 180 минути реакция,
както следва:

 Водна дейност

Водната активност (aw) се измерва с помощта на хигрометър AquaLab Series 4 TEV

от Decagon Devices. Измерванията се извършват в запечатан сензор за точка на оросяване
при 25 °C, докато се получат постоянни показания. Всички проби бяха предварително
уравновесени за 24 часа. Хигрометърът се калибрира непрекъснато със стандартни
разтвори (Decagon Devices).

 Вискозитет

Измерванията на вискозитетите (η) на всички йонни течности били извършено в

програмируем реометър Brookfield DV-III при 25 °C. Реометърът преди това е калибриран
със стандартно масло (Brookfield).

 Сканираща електронна микроскопия

Микрофотографии на катализатора (PGA имобилизиран върху Sepabeads®) бяха

получени чрез техниката на сканираща електронна микроскопия (SEM) в микроскоп FEI
Company Inspect S50, оборудван с EBSD детектор. Всички проби бяха фиксирани в
алуминиеви ленти с помощта на въглеродна лента. Покритието на пробите е направено със
злато в система BAL-TEC SCD 005 Sputter Coater. Подготвените проби се държат в
ексикатор до момента на анализа.

20
 ЗАКЛЮЧЕНИЯ

Беше оценено приложението на йонни течности (ILs) на базата на алкил-заместен

имидазолий за ензимния синтез на амоксицилин. Резултатите ясно показват, че природата
на аниона оказва голямо влияние върху взаимодействието на IL с водните молекули. Най-
ниските стойности на водната активност (aw) са открити за смеси от вода и BMI·BF4,
докато най-високите стойности са наблюдавани за BMI·NTf2, следвани от BMI·PF6. Това
термодинамично свойство пряко повлиява селективността на реакциите, които са
значително по-високи в присъствието на ILs, достигайки увеличения до 400%.
Вискозитетът на тези разтворители също влияе върху превръщането на 6-APA. Общият
ефект е, че конверсията в присъствието на BMI·PF6 е по-ниска, отколкото в напълно водна
среда (със 100 mM фосфатен буфер pH 6,5, стандартната среда за сравнение), но за
BMI·NTf2 те са по-високи, отколкото в стандартната средно, приблизително 36%.
Използваният биокатализатор, PGA имобилизиран върху подложка Sepabeads®, не се
дезактивира по време на реакцията и структурата му остава незасегната, позволявайки
повторно използване на ензима и по този начин намалявайки цената на синтетичния
процес. Изолирането на целевата молекула амоксицилин от реакционната смес се оказа
осъществимо с помощта на проста процедура за пречистване, която генерира безвредна
сол NaCl. Тези резултати откриха обещаващи възможности за следване в опит да се
направи ензимният синтез на полусинтетични пеницилини индустриално осъществим.
Въпреки това очевидно са необходими по-нататъшни изследвания, за да се изследват
последиците от процеса от използването на IL.

21
 ИЗТОЧНИК

1. PEREIRA, Sandra Cerqueira, et al. Enzymatic synthesis of amoxicillin by penicillin G acylase

in the presence of ionic liquids. Green chemistry, 2012, 14.11: 3146-3156. ;

22