LFR1106 Verklegar æfingar Haust 2019

3. Útdráttur DNA úr plöntufrumum, magn- og

hreinleikaákvörðun með ljósgleypnimælingu
Í þessari æfingu er kynnt og prófuð einföld aðferð til útdráttar erfðaefnis
úr plöntuvefjasýni. Við útdráttinn verður að miklu leyti notast við efni og
áhöld sem finna má á venjulegum heimilum og afraksturinn á að vera
sýnilegur með berum augum. Jafnframt verður afurðin magnmæld með
hjálp ljósgleypnimælis og staðallínurits.

3.1 Lærdómsviðmið
Að æfingunni lokinni á nemandinn að geta:

• skýrt út einstaka þætti DNA einangrunar sem notuð er í

æfingunni
• notað ljósgleypnimæli og lýst grundvallaratriðum sem slíkar
mælingar byggja á
• búið til staðallínurit og reiknað styrk óþekkts efnis út frá því Mynd 5 Líkan af byggingu
• metið kosti og galla aðferðanna sem notaðar eru í æfingunni DNA sameindar

3.2 Lesefni til undirbúnings

Notið upplýsingar úr efnafræði til að rifja upp gerð og tilgang staðallínurita. Leitið heimilda um þau
atriði sem koma fram í spurningum í úrvinnslukafla og í lærdómsviðmiðum.

Kynnið ykkur lesefni á Canvas sem merkt er æfingunni og eftirfarandi í kennslubók:

Concept 5.5 (Nucleic acids store, transmit and help express hereditary information)

Kafla 16.3 (A chromosome consists of a DNA molecule packed together with proteins) og mynd
16.22 (Chromatin packing in a eukaryotic chromosome).

Efnið mun nýtast til að skrifa inngang í skýrslu og draga ályktanir.

3.3 Viðfangsefni æfingar

3.3.1 DNA einangrun með einföldum aðferðum
Erfðaefni eða DNA er til staðar í kjarna allra plöntu- og dýrafruma, hvert sem hlutverk frumunnar er í
lífverunni. Genamengi mannsins, sem er erfðaforskriftin í hverri einstakri frumu, inniheldur 24 DNA
sameindir sem hver og ein inniheldur frá 500.000 til 2,5 milljónir basapara. Svo stórar DNA sameindir
væru ca. 1.7 til 8.5 cm langar ef teygt væri úr þeim. Í mannslíkamanum eru líklega um 1000 milljarðar
fruma, þannig að ef allt DNA væri lagt beint enda við enda væri það u.þ.b. áttföld vegalengd frá jörðu
til sólar. Í manninum eru frumur tvílitna, þ.e. þær innihalda erfðaefnið í samstæðum litningapörum.
Í þeim jarðarberjaafbrigðum sem oftast eru notuð til ræktunar eru frumurnar hins vegar áttlitna og
hafa í raun átta sett af genamengi sínu, sem gerir þau hentug til að einangra DNA sem sést með

17
LFR1106 Verklegar æfingar Haust 2019

berum augum. Laukur er tvílitna, en öfugt við jarðarberin er genamengi þeirra mjög stórt (um 15
gígabasapör) og það er að sama skapi kostur hvað þetta varðar. Til að ná erfðaefninu (DNA) úr
frumunum þarf að sundra frumuveggnum og himnunum sem umlykja bæði frumu og kjarna, en hins
vegar þarf að forðast að DNA brotni líka niður. Frumuveggurinn sundrast að hluta þegar sýnið er
maukað, en þroskuð jarðarber framleiða einnig ensím sem hjálpa til við að brjóta niður frumuveggina
og himnurnar. Ensímin virkjast eða herða á virkni sinni við hækkaðan hita. Himnurnar, sem að
megninu til eru úr fituefnum þarf að brjóta niður með einhvers konar sápuefni. Svokölluð SDS
(sodium dodecyl sulphate þ.e. natríum dódekýl súlfat) sápa er hentug í þessu skyni, en svo vill til að
hún er algeng í sjampói og uppþvottalegi. SDS er oftast merkt á umbúðum sem Sodium Lauryl Sulfate
sem er samheiti, efnaformúla CH3(CH2)11OSO3Na. Oftar er þó notað Sodium Laureth Sulfate sem
hefur efnaformúluna CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOSO3Na, og er líka sápa með yfirborðsvirkni og nýtist í
þessum tilgangi. Jafnframt eru oft í sjampói lífrænar sýrur og EDTA (etylendíamíntetraediksýra), sem
hvort tveggja verndar DNA fyrir niðurbroti. Með því að hafa blönduna salta hlutleysast neikvæðar
hleðslur DNA og líkur minnka á því að þræðirnir losni hvor frá öðrum. Saltið örvar einnig útfellingu á
prótínum og kolvetnum. Ef notaður er kjötmeyrir, ananassafi eða kiwi í blönduna, er það vegna
þessa að það inniheldur prótínsundrandi ensím sem hjálpa til við að losna við prótín úr blöndunni.

3.3.2 Ljósgleypni
Ljósgleypni er algeng og handhæg aðferð til að magnmæla efni, en skilyrði er að efnið gleypi ljós.
Mörg efni geta það, en ekki öll við sömu bylgjulengd ljóssins (táknað með ). Þess vegna verður að
þekkja við hvaða ljósbylgjulengd efnið sýnir mesta gleypni. Flestir ljósgleypnimælar gefa kost á að
velja ljós af ákveðinni bylgjulengd til að nota í hverri mælingu. DNA gleypir ljós á útfjólubláa sviðinu,
mest við  = 260 nm. Það er því mögulegt að magngreina DNA með því að mæla ljósgleypni við 260
nm. Óhreinindi af völdum annarra efna sem gleypa ljós við 260 nm, til dæmis prótína eða fenólefna,
valda þó iðulega vandræðum við slíkar mælingar. Þegar verið er að kanna hvort prótínsýni sé mengað
af kjarnsýrum er algengt að mæla gleypni við bæði 260 og 280 nm og reikna A260/A280. Aðferðin er
ekki eins næm fyrir hið gagnstæða, þ.e. að nema prótínmengun í DNA sýnum, þar sem eðlisgleypni
DNA er mun hærri en eðlisgleypni prótína, en samt sem áður er hún gjarnan notuð. Mengun af
öðrum efnum, einkum hringlaga lífrænum efnum, svo sem fenóli og skyldum efnum geta einnig haft
áhrif á mælinguna.

3.3.3 Staðallínurit til að ákvarða styrk

Staðallínurit sem byggt er á sambandi styrks og ljósgleypni, er mikið notuð aðferð við að ákvarða
styrk ákveðinna efna í lausn. Þess vegna er mikið grundvallaratriði í efnafræði og lífefnafræði að
kunna að búa til og nota slík línurit. Sem dæmi má nefna Bradford aðferðina við magnmælingu
prótíns (aðferðin er notuð í 1. æfingu í Almennri efnafræði). Aðferðin notar hvarfefni sem myndar
blátt litarefni með prótínum og myndefnið gleypir ljós við 600 nm bylgjulengd. Ef nóg er til staðar af
hvarfefninu, eykst því ljósgleypnin eftir því sem meira prótín er til staðar í lausninni. Þetta á þó ekki
alltaf við (sjá síðar).

Í öllum tilfellum gildir að ljósgleypni við ákveðna bylgjulengd þarf að vera línulegt fall af styrk þess
efnis sem á að mæla, þ.e. fylgi Beer-Lambert lögmálinu.

A = ɛ∗ l∗ C Jafna Beer-Lamberts

18
LFR1106 Verklegar æfingar Haust 2019

Þar sem A er ljósgleypni; ɛ er mólar ljósgleypnistuðull við tiltekna bylgjulengd; l er vegalengd í cm sem
ljósið ferðast gegnum og C er mólstyrkur. Kúvettur í ljósgleypnimælum eru oftast 1 cm og ef svo er
sést að gleypnin er í línulegu sambandi við styrk.

Þegar staðallínurit er búið til, þarf því fyrst að búa til staðallausnir sem innihalda mismunandi styrk af
efninu – í þessu dæmi prótíni. Ekki er óalgengt að nota tífaldar þynningar, þ.e. búin er til
upphafslausn af prótíni sem síðan er þynnt tífalt nokkrum sinnum þannig að til séu lausnir með styrk
sem er 1/10, 1/100, 1/1000 o.s.frv. af styrk upphafslausnarinnar, en einnig má t.d. nota
helmingaþynningar. Þetta eru svokallaðar staðallausnir sem allar eru með þekktan prótínstyrk.
Hvarfefnum er síðan bætt út í lausnirnar og ljósgleypni þeirra mæld við 600 nm (eða 595 nm) og
ljósgleypnigildin sett upp í graf sem fall af styrk og besta lína fundin (Mynd 6). Þannig er búið að
draga upp samband prótínstyrks og ljósgleypni við 600 nm og eftir mælingu á sýnum sem
meðhöndluð eru á sama hátt og staðallausnirnar, er einfalt að reikna út prótínstyrk í slíkum sýnum.
Það má gera með því að lesa beint af línuritinu, en nákvæmara er að setja mælda gleypni inn í jöfnu
bestu línu og leysa fyrir x. Athugið að reiknaður styrkur verður í sömu einingum og styrkur
staðallausna, hvort sem það er mólstyrkur eða massi/rúmmál (t.d. mg/ml).

Mynd 6. Dæmi um staðallínurit. Ljósgleypni er á y-ás og mólstyrkur á x-ás. Punktarnir sýna mælda ljósgleypni
staðallausna (Standard 1-4) og línan er dregin í gegnum punktana. Styrkur óþekkts sýnis er lesinn út frá gleypni
þess eins og örvarnar sýna.

Eins og áður sagði þarf lögmál Beer‘s – Lamberts að gilda, en í Bradford prótínmælingu, gildir það til
dæmis ekki við háan prótínstyrk. Þess vegna þarf í fyrsta lagi að gæta að því að útbúa staðallausnir á

19
LFR1106 Verklegar æfingar Haust 2019

heppilegu styrkbili sem fellur inn á línulega sviðið og í öðru lagi getur þurft að þynna sýnin með
óþekkta styrknum til að fá mælingar sem falla inn á svið línuritsins.

Í þessari æfingu gilda sömu grundvallaratriði um staðallausnir og –línurit, þó viðfangsefnið sé

kjarnsýra en ekki prótín.

3.4 Framkvæmd
Efni og áhöld:
Hitabað, ísbað og ljósgleypnimælir með mælisvið í 260 nm – sameiginlegt fyrir alla

Hitamælir
Matvinnsluvél eða blandari
Mæliglös 500 ml og 50 ml
Bikarglös
Glerstafur eða spaði til að hræra
Etanol (spiritus fortis)
Matarsalt (NaCl)
Jarðarber
Ananassafi EÐA kjötmeyrir
Sjampó sem inniheldur láryl súlfat (SDS), sítrónusýru og EDTA
Síupappír (pappírsþurrka, kaffifilter) og trekt
Glært plastglas (lítið)
Sogrör úr plasti
Sandpappír
SSC dúalausn - blanda af natríum klóríði og natríum sítrati
Tilraunaglös með tappa
Pípetta og pasteur pípettur
Staðallausn af DNA

3.4.1 Undirbúningur
Gangið úr skugga um að þið hafið öll áhöld og efni við höndina.
Hitabað við 55°C og ísbað (vatn og ís) hefur verið útbúið. Setja má dálítið salt út í ísbaðið til að gera
það kaldara. Sprittbrúsi er geymdur í ísbaði.
Mælið 20 ml af SSC dúa og geymið í tilraunaglasi

3.4.2 DNA einangrun

1. Fyrsta skrefið geta hópar sameinast um, nóg er að tvær blöndur séu útbúnar en þeim síðan skipt
milli hópa:
Blandið saman ca 20 ml af sjampói, 5 g af salti og 500 ml af köldu vatni í bikarglas. Hrærið varlega þar
til allt saltið er uppleyst.

20
LFR1106 Verklegar æfingar Haust 2019

Setjið 5 - 10 jarðarber, sjampóblönduna og 1 tsk af kjötmeyri (eða ½ bolla af ananassafa) í blandara.

Tætið í örstutta stund. Ef blandað er of lengi er hætta á að DNA sameindirnar skemmist (tætist
niður). Hæfilegt er að gefa þrjá til fjóra stutta púlsa á miklum hraða. Einnig má búast við að blandan
freyði talsvert.
2. Hellið blöndunni í stálbikarglas (hver hópur nú hefur sinn bikar) og komið því fyrir í hitabaðinu.
Fylgist með hitastiginu í blöndunni og látið hana vera við 55°C í 15 mínútur. Hrærið rólega í henni
annað slagið.

Kælið nú blönduna í ísbaðinu niður í u.þ.b. 10°C og síið hana þá yfir í plastglasið þar til komin er ca 1 -
2 cm djúp botnfylli í það. Skammtið ykkur nokkra millilítra af köldu etanólinu í lítið bikarglas. Hellið
ísköldu etanólinu nú afar varlega niður með barmi glassins þannig að það leggist ofan á vökvann í
glasinu. Etanóllagið þarf að vera ca 1,5 - 2 cm.

Látið glasið standa í 3 - 4 mínútur, etanólið ætti nú að verða skýjað.

Raspið neðsta hlutann á sogrörinu (ca 1 cm) lítillega með sandpappír, þannig að yfirborð þess verði
gróft. Stingið rörinu ofan í lausnina þannig að endinn nái ofan í neðra lagið. Snúið rörinu um leið og
þið hrærið rólega í lausninni með því og reynið að vefja slímugum massanum (DNA) upp á það.
Reynið að ná sem mestu af DNA upp á rörið. Færið afurðina varlega yfir í dúalausnina í
tilraunaglasinu og endurleysið hana.

3.4.3 Mæling á magni og hreinleika DNA

Þynnið nú DNA-lausnina ykkar (sýni) í 5 glös með SSC samkvæmt eftirfarandi þynningarskema,
athugið að vera viss um að skilja töfluna. Þar sem styrkur DNA er óþekktur er aðeins hægt að
auðkenna hlutfallslegan styrk, þar sem óþynnt sýni hefur styrkinn 1,00 og aðrar þynningar reiknaðar
út frá því.

Glas SSC (ml) Sýni (ml) Hlutfallsstyrkur Samtals ml

DNA
0 (óþ. sýni) 1,00 Endurleyst DNA
1 2 2 0,50 4
2 3 1 0,25 4
3 3,6 0,4 0,10 4
4 3,8 0,2 0,05 4
5 3,96 0,04 0,01 4
Kennari mun útbúa staðalsýnalausnir á sama hátt, gefa upp styrk þeirra og ljósgleypni.
Kveikið á ljósgleypnimæli og stillið bylgjulengd á 260 nm. Athugið að merkja vel svo hver hópur
þekki sín glös. Skráið allar mæliniðurstöður! Sýnið þolinmæði, aðeins einn hópur getur ljósmælt í
einu.

Notið kvarz kúvettur í ljósmælinn, fyllið þær a.m.k. að ¾ hlutum fyrir mælingar. Pússið ljósflöt þeirra
með linsupappír vættum í etanóli. Pípettið fyrst SSC buffer í kúvettuna og núllstillið mælinn við 260
nm (tómasýni). Mælið gleypni hverrar lausnar fyrir sig og skráið ljósgleypnina. Skolið kúvettuna vel

21
LFR1106 Verklegar æfingar Haust 2019

með eimuðu vatni á milli mælinga og þurrkið af henni áður en mælt er. Gætið þess að henda ekki
óþynntu sýnunum.

Stillið nú ljósgleypnimælinn á 280 nm, núllstillið aftur og endurtakið mælingarnar fyrir óþynnta sýnið.

3.5 Úrvinnsla
Reiknið A260/A280 bæði fyrir DNA staðallausnina og ykkar sýni. Í hreinni DNA lausn er hlutfallið mjög
nálægt 2,0 en gildi á bilinu 1,8 – 2,0 eru almennt talin ásættanleg fyrir hreinleika. Virðast sýnin vera
hrein?

Notið reynslu úr efnafræðinni og búið til staðallínurit með mæliniðurstöðum fyrir staðal-DNA. Gerið
einnig línurit fyrir mælingar á eigin sýni. Hafið A260 á y-ás og þynningu á x-ás og reiknið jöfnu bestu
línu í gegn um mælipunktana. Veljið hentuga mælingu og notið hana til að reikna styrk DNA í
sýnunum ykkar út frá staðallínuritinu.

Ræðið niðurstöðurnar og dragið ályktanir (í umræðukafla). Veltið fyrir ykkur eftirfarandi spurningum
og metið sjálf hvort þið fjallið um svör við þeim í inngangi eða umræðukafla:

• Voru niðurstöður tilraunanna í samræmi við væntingar út frá heimildum? Er þessi aðferð til
útdráttar og mælingar hentug eða óhentug að ykkar áliti, út frá þessum gögnum?
• Hvað hefur sápuefnið til að bera sem hentar til að leysa upp himnur?
• Hvers vegna er sýnið hitað?
• Hvers vegna er sýnið síað?
• Hvað gerir sprittið í einangrunarferlinu? Af hverju er það haft kalt?
• Hvað er ljósgleypni?
• Hvernig nýtast staðallínurit til magnmælinga á tilteknum efnum?
• Útskýrið hvernig mengun af prótínum í sýnunum getur haft áhrif á niðurstöðurnar.
• Hvers vegna hentar A260/A280 betur til að meta DNA-mengun í prótínsýnum en prótínmengun
í DNA-sýnum?
• Í tilrauninni var DNA einangrað úr matvæli, er algengt að DNA sé í matvælum? (Vísbending:
Maðurinn er ófrumbjarga lífvera).

22