Medicinska

Biologija

B3

Juraj Jug

http://perpetuum-lab.com.hr/
 Rekombinantna DNA tehnologija
- Genetičko inženjerstvo bavi se direktnom i namjernom modifikacijom genoma nekog
organizma. Najbolji primjeri za to su dobiveni miševi i svinje koji svijetle u mraku pomoću
proteina luciferaze umetnutog u genom životinje.
- Biotehnologija se bavi korištenjem biokemijskih metaboličkih putova nekog organizma u
industrijskoj proizvodnji. Primjer za njezina dostignuća je proizvodnja ljudskog inzulina uz
pomoć bakterija ubacivanjem ljudskog gena za inzulin u bakteriju koja je na kraju
proizvodila ljudski inzulin.
- Gornje dvije znanosti koriste tehnologije rekombinantne DNA tehnologije kod koje se
stvara umjetna DNA molekula nastala kao rezultat dvije DNA iz različitih izvora.
- Polazi se od tvrdnje da je genetički kod univerzalan te da RNA polimeraza jednog
organizma može točno prepisati gen bilo kojeg drugog.
- Stvaranje rekombinantne DNA molekule:
1. Izolacija DNA molekule iz organizma
2. Cijepanje izvađene DNA restrikcijskim enzimima – restrikcijskih endonukleaza
3. Spajanje DNA fragmenata iz različitih izvora
4. Amplifikacija rekombinantne DNA
- Restrikcijske endonukleaze potječu iz bakterija koje se pomoću njih brane od infekcija
bakteriofaga (cijepaju stranu DNA), a pritom metiliraju svoju DNA tako da se ona ne
razgradi. Iz toga se zaključuje da restrikcijske endonukleaze ne prepoznaju metilirane
sekvence. Nazivaju se još i molekularne škare jer režu DNA samo na specifičnim mjestima
u obliku palindroma (jednako se čitaju s lijeva na desno i s desna na lijevo).
- Sekvenca koju prepoznaje restrikcijska endonukleaza naziva se restrikcijsko mjesto. Iako
prepoznaje čitavu sekvencu, cijepa unutar nje uvijek na istom mjestu. Tako, djelovanje
različitim enzimima na istu DNA molekulu daje različite fragmente.
- Danas poznate restrikcijske endonukleaze (imena im potječu od organizama iz kojih su
izolirane):
a) EcoRI – izoliran iz Escherichie coli pri čemu E označava prvo slovo roda, co prva dva
slova vrste, R soj bakterije, a I redni broj izoliranog enzima po kronologiji.
b) BamHI – izoliran iz bakterije Bacillus amyloliquefaciens
c) Sau3A – izoliran iz Staphylococcus aureus
- Restrikcijska karta je fizička mapa u parovima baza na kojima su označena djelovanja
pojedinih endonukleaza.
- Cijepanjem se proizvode ljepljivi i tupi krajevi, a njih spaja DNA ligaza. Ako cijepamo
različite DNA molekule istom restrikcijskom endonukleazom krajevi se lako spajaju pri
čemu nastaje rekombinantna DNA molekula.
- Fragmenti DNA ugrađuju se u vektor koji se dalje samostalno replicira. Vektor definiramo
kao komadić DNA sposoban za samostalan rast jer fragment željene DNA obično nema
sekvencu potrebnu za samostalnu replikaciju.
- Vektore odabiremo prema veličini fragmenata koje amplificiramo:
a) Plazmidi – do 10 kb, to su male kružne DNA molekule unutar citoplazme bakterija (u
jednoj bakteriji može biti i preko 100 plazmida), a repliciraju se neovisno o
bakterijskom kromosomu.
b) Kozmidi (hibridi plazmida i faga) – od 30 do 45 kb
c) Bakteriofag – od 70 do 100 kb
d) BAC (bacterial artificial chromosome) – od 120 do 300 kb
e) YAC (yeast artificial chromosome) – od 250 do 400 kb, umjetni kromosom kvasca
- Vektor sa željenim fragmentom se unosi u bakteriju toplinskim šokom (heat-shock tehnika
– bakterija se ostavi na ledu nekoliko minuta, pa se prebaci na 42°C te ponovno na led ne

2
 bi li njena stanična membrana postala permeabilnija za strana tijela) ili elektroporacijom
(izlaganje bakterije djelovanju električne struje koja otvara kanalne proteine membrane).
- Kako bi bili sigurni da se željena DNA molekula unijela u bakteriju na plazmidu se nalaze
geni rezistencije na antibiotike (barem 2) tako da će samo one bakterije koje su ugradile
plazmid rasti u mediju s antibiotikom.
- Najpoznatiji plazmid je pBR22 koji sadrži 2 gena rezistencije na tetraciklin i ampicilin. Oba
gena moraju imati restrikcijska mjesta za restrikcijske enzime koje koristimo. Na plazmid
se djeluje enzimom koji cijepa gen za tetraciklin te se provodi transformacija bakterije.
Zatim se bakterija nasadi na ampicilin i samo one bakterije koje su rezistentne na antibiotik
rastu na toj podlozi. Sada se traže one koje su osjetljive na tetraciklin jer imaju inaktiviran
gen.
- U proizvodnji ljudskog inzulina nakon provjere ugradnje željenih plazmida u bakterije
dolazi do masovnog kloniranja bakterija. Pri tome se rekombinantni plazmid također brzo
replicira u bakteriji, a svaki proizvodi ljudski inzulin.

KLONIRANJE ŽELJENIH FRAGMENATA DNA in vitro

- PCR metoda (Polymerase chain reaction) – temelji se na saznanju da se DNA na povišenoj
temperaturi ne uništava nego se lanci odvajaju, a sniženjem temperature se spontano
spajaju. DNA koju želimo amplificirati stavlja se u otopinu s DNA primerima, dušičnim
bazama kao deoksiribonukleozidtrifosfati i DNA polimerazom (nazvana Taq polimeraza).
DNA polimeraza je izdvojena iz bakterije Thermus aquaticus koja živi u termalnim izvorima
do 90°C.
1. Razdvajanje DNA molekula na visokoj temperaturi
2. Snižavanje temperature i vezanje primera na jednolančanu DNA
3. Sinteza drugog lanca odsječka DNA između dva primera
4. Povišenje temperature i rastaljivanje novosintetizirane DNA
- Klonirani geni se čuvaju u DNA bibliotekama u genomskim bibliotekama. Čuvani fragmenti
mogu se u bilo kojem trenutku ubaciti u vektor.
- Bakterije nemaju introne pa ih niti ne prepoznaju. Zbog toga kod proizvodnje ljudskih
proteina u bakteriju se treba unijeti kodirajuća sekvenca bez introna. Koristeći reverznu
transkriptazu (DNA polimeraza koja sintetizira DNA prema kalupu mRNA).
- Dvolančana molekula DNA komplementarna mRNA bez introna naziva se cDNA.
- PCR metoda primjenjuje se kod:
 Kloniranja gena koji kodiraju poznati protein – pri tome se konstruiraju primeri
prema sekvenci aminokiselina ili gena
 Amplifikacije stare DNA – pri proučavanju evolucije gena
 Amplifikacije klonirane DNA iz vektora
 Detekcije bakterijske ili virusne infekcije – kod AIDS-a i tuberkuloze.
 Detekcije mutacija koje se događaju u raku
 Genetičke dijagnostike nasljednih bolesti (cistična fibroza, mišićna distrofija,
hemofilija, srpasta anemija), raka (retinoblastom), prenatalnog rizika od spolno
vezanih bolesti
 Forenzike
 Dokazivanja očinstva

LJUDSKI GENOM
- Sastoji se od:
1) GENA – sekvence koje kodiraju proteine nalaze se u samo 1,5% genoma, a one koje ne
kodiraju za proteine u 2% genoma (tRNA, rRNA i siRNA). Kod različitih ljudi 99,9%
kodirajuće DNA je identično.

3
 2) NEKODIRAJUĆIH SEKVENCI DNA – regulatorne sekvence koje djeluju kao promotori,
pojačivači i utišivači. „Junk“ DNA – introni, ponavljajuća DNA kod centromera,
telomera i uzastopnih ponavljanja, te umetnute raspršene sekvence kao Alu sekvence
kod ljudi. Sve ove nekodirajuće sekvence vrlo su varijabilne kod ljudi.
- Episom je svaki izvankromosomski replikacijski element koji može postojati samostalno ili
integriran u kromosom.
MINISATELITI
- čine uzastopna ponavljanja od 1 do 20 kb. Nalaze se u nekodirajućim regijama kao VNTR
(variable number of tandem repeats). Njihov broj ponavljanja se razlikuje, a nisu od
posebnog značaja pa nemaju utjecaja na fenotip. Mogu biti korisne jer su karakteristični za
pojedince pa se prema tome njima radi DNA fingerprinting.
- VNTR analiza vrši se PCR tehnikom nakon koje se podvrgava elektroforezi (zbog saznanja
da se nasljeđuje po Mendelu). Različit broj ponovljenih fragmenata će nakon cijepanja s
restrikcijskim enzimima dati fragmente različitih duljina pa su nazvani RFLP (restriction
fragment lenght polymorphysm).
- On može nastati i zbog pojave polimorfizama kao što je SNP (single nucleotide
polymorphism). Do njih dolazi kada se u sekvenci DNA jedan nukleotid zamijeni drugim.
Najčešće do toga dolazi u intronima (bezopasno), ali ako do toga dođe u kodirajućim
regijama dolazi do mutacija. Ako se zamjena dogodi na restrikcijskom mjestu nekog
enzima restrikcijsko mjesto nestane i nastaje RFLP.
- RFLP može otkriti mutaciju u globinskom genu za srpastu anemiju pri čemu CTT prelazi u
CAT pa se gubi restrikcijsko mjesto i ne dolazi do cijepanja enzimom (fragment je dulji).
- Koristi se i kao marker specifičnih gena. Pozicija gena može se odrediti analizom vezanosti
s polimorfnim markerima u obiteljima koje nose gen za bolesti. Marker pronalazi bolesni
gen i određuje njegov položaj.
- DNA fingerprinting je metoda koja uključuje restrikciju, elektroforezu, prebacivanje
fragmenata na membranu i identifikaciju uz pomoć konstruiranih komplementarnih proba
(hibridizacija).
MIKROSATELITI
- Nazvani i STR (short tandem repeats) jer ponavljajuća sekvenca ima samo 1 do 6 parova
baza. Slični su minisatelitima, a broj ponavljanja im se također razlikuje. Imaju iste krajnje
dijelove pa se na njih mogu vezati primeri za PCR metodu. Ona pokazuje da DNA
polimeraza za vrijeme replikacije proklizne i ponovno nastavi replikaciju malo dalje – u
ponovljenim regijama dolazi do različitog broja ponavljanja.
- Nasljeđuju se kodominantno pa se kod homozigota nalaze oba alela iste duljine, a kod
heterozigota različite, a mogu se odvojiti i razlikovati jedan od drugog.
- U forenzici se koristi 13 različitih STR lokusa jer nije moguće da dvije osobe imaju toliki broj
istih lokusa.

HIBRIDIZACIJA NUKLEINSKIH KISELINA

- Hibridizacija je formiranje dvostruke uzvojnice zbog komplementarnosti parova baza dviju
jednolančanih molekula nukleinskih kiselina.
- Za nju su potrebne hibridizacijske sonde (probe) koje čine jednolančane molekule
nukleinskih kiselina označene nekim biljegom za vizualizaciju hibridizacije (mRNA ili cDNA
ili sintetski oligonukleotidi). Sonda se sintetizira u prisutstvu radioaktivnog biljega,
najčešće 32P, a markeri se detektiraju pomoću antitijela s fluoroscentnom bojom u
fluoroscentnom mikroskopu (FISH metoda). Ako želimo hibridizirati DNA trebamo ju
prevesti u jednolančani oblik što se radi na visokim temperaturama ili u alkalnim
otopinama razdvanjanjem lanaca.
- Hibridizacija visoke točnosti je ona u kojoj se postiže formiranje potpuno komplementarne
dvostruke uzvojnice, a to se događa pri 42°C.

4
 - Hibridizacija smanjene točnosti je metoda kod koje se na nižim temperaturama stvaraju
uzvojnice od molekula koje nisu posve komplementarne pa se tom metodom mogu otkriti
srodni geni.
IN SITU HIBRIDIZACIJA
- Metoda kojom se direktno u jezgri stanice ili na kromosomima mogu locirati sekvence
karakteristične za kromosom, pojedini geni ili mRNA u citoplazmi. Stanice se fiksiraju na
stakalce te se zatim dodaje radioaktivna cDNA proba označena radioaktivnim markerom.
cDNA se hibridizira komplementarnom mRNA. Ispiranjem stakalca na emulziju djeluje
radioaktivnost fosfora te ostaju točkice koje ukazuju na lokalizaciju mRNA u stanici
(autoradiografija)
- FISH metoda se koristi i za preimplantacijsku dijagnostiku kod otkrivanja spola i bolesti
zametka. Završetkom metode zametak se može vratiti u uterus i normalno razvijati dalje
(do stadija blastociste)
- Kod bakterijskih klonova u bakterijskim kolonijama možemo detektirati gene ili fragmente
DNA pomoću hibridizacija kolonija. Izolira se DNA na filteru i inkubira s radioaktivnom
sondom pa će, ako na filteru postoji određeni gen, doći do hibridizacije molekula pri nižoj
temperaturi.
SOUTHERN BLOTTING
- Dokazivanje određene DNA nakon njene izolacijeiz krvi ili tkiva. Elektroforetski razdvojeni
fragmenti DNA stavljaju se na nitrocelulozni filter. Prethodno su fragmentirani pomoću
neke restrikcijske endonukleaze. Na običan filter papir umočen u alkalnu otopinu u kojoj
se odvoje lanci DNA uzvojnice. Na njega se postavi gel, prekrije filterom od nitroceluloze, a
na vrh puno slojeva suhog papira i pritisne utegom. Kapilarnom elevacijom preko filtera
kroz gel u papir putuje jednolančana DNA na nitrocelulozni filter koji se inkubira s
radioaktivnom sondom i autoradiografijom se traži prisutnost određene DNA molekule u
uzorku.
NORTHERN BLOTTING
- Dokazuje prisutnost određene molekule RNA u stanici ili tkivu. Princip rada je sličan kao
kod Southern blottinga. Ovom metodom može se pokazati kada se i gdje točno aktivira
koji gen ako se izolira mRNA iz različitih razvojnih stadija vrste.
WESTERN BLOTTING
- Metoda koja određuje prisutnost određenih proteina nakon njihove elektroforeze.
Umjesto sondi se koriste markirana antitijela na određene proteine.

SEKVENCIRANJE DNA
- Određivanje redoslijeda nukleotida, tj. primarne strukture DNA molekule. Način za
otkrivanje točkastih mutacija koje se ne mogu otkriti PCR metodom.
a) Sangerova dideoksi metoda – radioaktivni primeri se dodaju brojnim kopijama iste
jednolančane DNA molekule. Uz njih dodaju se i DNA polimeraza i 4 različita
deoksiribonukleozidtrifosfata (dTTP, dATP, dCTP, dGTP), po jedan u četiri različite
epruvete. Slijedi ugradnja dideoksiribonukleozidtrifosfata koji ne posjeduje slobodnu
OH skupinu za daljnju sintezu pa u epruveti nastaju brojne dvolančana DNA molekule
različitih duljina. Na autoradiogramu se takva pojava pokazuje u obliku ljestvica.
b) Maxam-Gilbertova metoda – koristi jednolančanu DNA markiranu s 32P na 5' kraju.
Ponovno se koriste 4 različite epruvete u koje se ubacuju četiri različite kemikalije pa
svaka od njih razgrađuje DNA na određenom mjestu (G, G+A, T+C ili C).

5
 Bakterijska genetika
- U prirodi bakterije mogu prenijeti svoju DNA u drugu bakteriju na tri načina:
1) Transformacija – uzimanje DNA iz okolnog medija u kojem se bakterija nalazi.
Receptor na staničnoj membrani za prihvaćanje i prodiranje DNA pri čemu se jedan
lanac razgrađuje, a drugi ulazi u stanicu, naziva se kompetencijski faktor. Prvi dokaz o
njenom postojanju dao je Frederick Griffith pokusom. Korištenjem dvije vrste kolonija
bakterije Streptococcus pneumoniae (jedne bez zaštitne kapsule, druge s
polisaharidnom zaštitnom kapsulom). Ako se u miša ubaci:
a) Kolonija bez zaštitne kapsule, miš preživi
b) Kolonija sa zaštitnom kapsulom, miš umire
c) Ubijena kolonija sa zaštitnom kapsulom, miš preživi
d) Kolonija bez zaštitne kapsule + ubijene kolonije sa zaštitnom kapsulom, miš umire
(došlo je do transformacije u zaštitnu kapsulu)
2) Transdukcija – prijenos bakterijskih gena uz pomoć bakteriofaga. Bakteriofagi su virusi
koji inficiraju bakterije i dijelimo ih na virulentne (ulazi samo u litički ciklus) i umjerene
(ulaze i u lizogeni i u litički ciklus). Hershey i Chase su pokazali pokusom da DNA
bakteriofaga ulazi u bakteriju, ali njegov proteinski omotač ostaje vani.
- LITIČKI CIKLUS – virusi koji imaju sposobnost izazivanja bolesti (virulentni fagi)
pričvršćuju se na mjesto na bakteriji i enzimom lizozimom razaraju stijenku i ubacuju
svoj genetički materijal i preuzimaju metabolizam bakterije. Virus se replicira u više
kopija i stanica domaćina puca te dolazi do oslobađanja stotine novih virusnih čestica.
- LIZOGENI CIKLUS – umjereni fagu koji ugrađuju svoju DNA u kromosome domaćina
(profagi) i dolazi do prijenosa informacija na stanice kćeri koja postaje otporna na
infekcije, a u nepovoljnim uvjetima virusna DNA može izaći iz bakterijskog kromosoma
i ući u litički ciklus.
- Tipovi transdukcije:
a) OPĆA – mogu sudjelovati i virulentni i umjereni fagi te nije potrebna integracija
genoma virusa u kromosom domaćina. Fag inficira bakteriju svojom DNA, a
bakterijski enzimi pomažu u replikaciji proizvodnje proteina tog faga. Jedna
glava bakteriofaga se formira oko bakterijskog fragmenta DNA umjesto od
faga te se otpušta zajedno s njome. Dolaskom do nove bakterije, fragment te
bakterijske DNA koju je donio bakteriofag se rekombinira u novoj bakteriji.
b) SPECIFIČNA – sudjeluju samo umjereni fagi koji se ugrađuju na različita mjesta
u bakterijskom kromosomu stvarajući profage. Kod lizogenog ciklusa faga,
genom bakteriofaga se ugrađuje u genom bakterije te stvara profag. Mali dio
bakterijske DNA spaja se s ostatkom DNA bakteriofaga te se nalazi u glavama
novonastalih bakteriofaga. Inficiranjem nove bakterije, genom bakteriofaga se
ugrađuje u bakteriju. Poznati primjer je lambda fag Escherichie coli koji se
uvijek ugrađuje između lokusa gal i bio, pa će prilikom transdukcije uvijek
ponijeti jedan od ta dva gena.
3) Konjugacija – fizički kontakt bakterija i izmjena DNA uz formiranje konjugacijskog
mostića. Kod gram negativnih bakterija pilus proizvode bakterije donori koji se vežu
na primaoce (skraćivanjem pilusa dolazi do kontakta). Kod gram pozitivnih bakterija
površina je obložena ljepljivim molekulama pa se lako stupa u direktan kontakt.
Zahtijeva se pristutstvo F plazmida (fertility factor) koji prenosi 25 gena druge
bakterije. Bakterija s plazmidima naziva se F+ (muška), a bakterija bez plazmida F-
(ženska).
a) F plazmidi započinju konjugaciju
b) R plazmidi sadrže gene rezistencije na antibiotike i otrove
c) Col-plazmidi nose gene za kolicine koji ubijaju druge bakterije

6
 d) Plazmidi virulencije pretvaraju bakteriju u patogen
 F+ konjugacija je prijenos plazmida donora, u bakteriju primaoca bez plazmida.
Jedan dio plazmida ostaje kod donora pa se lako naprave komplementarne
kopije. Ovim putem može nastati i F' bakterija kod koje abnormalno izrezan F
plazmid nosi dio bakterijskog kromosoma.
 Hfr konjugacija (high frequency recombination) – integracija F plazmida u
bakterijski kromosom koji potiče konjugaciju. Mostićem zajedno s F plazmidom
prelazi i bakterijski kromosom koji se rekombinira u genom. Budući da ovim
putem ne mora biti prenesen cijeli F plazmid, bakterija primalac ostaje F
negativna.
 Konjugacija R plazmida – identičan postupak kao u prethodnima pri čemu se
jedan lanac R plazmida odvaja od donora i prelazi u primaoca gdje se stvara
komplementarna DNA i prenosi rezistentnost na antibiotike te može stvarati
piluse.
- U sva tri slučaja prenešena DNA se integrira u kromosom primaoca pomoću „crossing
overa“ pri čemu nastaje rekombinantni kromosom. Takav način prijenosa u kojem izmjena
nije recipročna (davaoci ne sudjeluju jednako u davanju genetskog materijala) naziva se
horizontalni prijenos nasljedne tvari u bakterija.
- Jacob i Monod su istraživali Eschericiu coli i njezin mehanizam za laktozu. Potrebna joj je
laktoza za prehranu, a da bi ona ušla u njezino tijelo potrebni su enzimi koje stvaraju
strukturni geni:
a) β galaktozidaza koji razgrađuje laktozu na glukozu i galaktozu
b) Permeaza je protein koji omogućuje ulazak razgrađene laktoze u organizam
c) Transacetilaza je protein koji omogućuje iskorištavanje laktoze u tijelu
- Ispred strukturnih gena koji kontroliraju sintezu proteina nalazi se slijed parova nukleotida
na koji sjeda RNA polimeraza, a mjesto se naziva promotor. Sve dok je to tako on
normalno vrši sintezu mRNA i proteina (transkripciju).
- Gen regulator kontrolira strukturne gene i nalazi se na bilo kojem mjestu u stanici. Nosi
uputu za sintezu regulatornih bjelančevina, a kada on sjeda na promotor blokira nastanak
mRNA – ponaša se kao represor. (do toga dolazi samo u slučaju da laktoze nema).
- Kada je laktoza prisutna na hranjivoj podlozi na represor se veže enzim alolaktoza i mijenja
mu konfiguraciju te više blokade nema.
- Enzim alolaktoza u ovom slučaju je induktor jer omogućuje suprotan proces od
postavljenog.

Regulacija ekspresije gena u eukariota

- Različiti geni su aktivni u različito vrijeme razvitka organizma tako da normalan razvitak
zahtijeva ekspresiju pravog gena u pravo vrijeme i na pravom mjestu. Odraslom
organizmu nisu potrebni svi genski produkti.
- Svaki gen ima više regulacijskih proteina koji kontroliraju njegovu ekspresiju, ali također
svaki regulacijski protein kontrolira ekspresiju više gena zbog toga što jedan eukariotski
gen ima veliko regulacijsko područje s više modularno regulacijskih mjesta.
- Kontrola ekspresije gena vrši se na više nivoa:
1. Kontrola transkripcije – metilacijom DNA i modifikacijom histona. Gen se sastoji od
regulatorne i kodirajuće regije između kojih se nalazi promotor. Regulatornu regiju
sačinjavaju enchanceri (pojačivači) i silenceri (utišivači).
CIS REGULATORI
- Promotor je mjesto vezivanja RNA polimeraze, većina ih sadrži TATA box te bazalne
transkripcijske faktore. Vezivanje RNA polimeraze za promotor određuje se metodom
otisaka stopala (DNA footprinting) pri kojoj se fragment DNA na jednom kraju

7
 radioaktivno označava i inkubira RNA polimerazom. Dolazi do parcijalne razgradnje DNA-
zom. Tamo gdje je vezana RNA polimeraza neće biti fragmenata na elektroforezi.
- Enchancer je sekvenca DNA koja aktivira korištenje promotora (kontrolira jačinu
transkripcije). Bez njih transkripcija bi bila na niskom bazalnom nivou. Može aktivirati
samo cis-vezane promotore koji ne moraju biti blizu njega (ali moraju na istom
kromosomu). Najčešće se nalaze uz gene koji se puno prepisuju (npr. imunoglobulinski
gen).
TRANS REGULATORI
- Aktivatori transkripcije kodirani genima koji ne moraju biti blizu mjesta djelovanja. Vežu se
na regulatornu DNA te se eksprimiraju samo u specifičnim tkivima i u određenim
razdobljima razvoja (Hox homeodomene)
TRANSKRIPCIJSKI REGULACIJSKI AKTIVATORI
- Regulacijski proteini koji se vežu na specifične regulacijske sekvence promotora.
Sintetiziraju se u citoplazmi stanice. Dijele se na:
1) Cinkovi prsti – dobili ime po karakterističnoj strukturi koja oblikuje petlje u obliku
prstiju, a svaki je prst je stabiliziran centralno smještenim cinkovim ionom vezanim s
dva cisteina i histidina. Regije cinkovih prstiju vežu DNA molekule.
2) Steroidni receptori – drugi tip proteina s motivom cinkovih prstiju s receptorima za
razne hormone (tj. elemente gena specifične za odgovor na hormon). Sadrže regiju za
vezivanje liganda, regiju za vezivanje DNA i regiju odgovornu za aktivaciju ciljnog gena.
3) „Helix – turn – helix“ – najpoznatiji homeotički proteini koji kontroliraju ekspresiju
gena u embrionalnom razvoju u kojem je odgovorna za pojavu kranio-kaudalne osi, a
ako je nema može doći do homeoze (zamjene jednog dijela tijela drugim).
4) „Helix – loop – helix“ – vezuju se na DNA kao dimeri.
5) Leucinski zatvarač – djeluju kao dimeri. Leucini kao zatvarači spajaju dvije molekule u
području domena za dimerizaciju. Imaju oblik Y i vežu se na simetrične dijelove
nukleotida kao homodimeri. Heterodimeri se sintetiziraju iz dva proteina i vezuju
različite sljedove nukleotida DNA.
METILACIJA DNA
- Dodavanje metilne skupine na peti C atom citozina pa nastaje nova baza 5-metilcitozin.
Pronalazi se unutar CpG sekvenci u kojima se uz pomoć DNA metiltransferaze (Dnmt)
dodaje metilna skupina. Nisu svi citozini u CpG sekvencama metilirani. Metilirani citozini ne
dozvoljavaju pristup transkripcijskim faktorima pa nema transkripcije i govorimo da su
takvi geni inaktivni. U genomu sisavaca ima oko 40 000 CpG otoka.
- Velika aktivnost Dnmt 1 je pronađena na hemimetiliranoj DNA gdje održava metilacijski
obrazac.
- Dnmt 3a i 3b nemaju afinitet prema hemimetiliranoj DNA pa nastaje de novo metilacija.
Najčešće su kod ranog razvoja nakon stadija blastociste.
- Metilacija DNA je ključna za inaktivaciju X kromosoma kod žena – Barrovo tjelešce. X
inaktivacijski centar nalazi se na Xist genu te uzrokuje stabilnu inaktivnost CpG otoka X
kromosoma. Jajna stanica je gotovo nemetilirana, a spermij izrazito metiliran jer njegov
genski materijal nema nikakvu ulogu dok ne dođe do jajne stanice koja se prirema za
oplodnju (potreban genetski materijal).
- Metilacija DNA dovodi do promjene ekspresije gena bez promjena u sekvenci DNA. Iz ove
tvrdnje i samih osobitosti metilacije razvila se epigenetika („na genetičkoj informaciji“).
- Epigenom se uspostavlja za vrijeme ranog razvitka pa tako prehrana velikom količinom
donora u trudnoći može promijeniti ekspresiju gena – folna kiselina i B vitamini. Metilne
skupine otpuštaju se tijekom raznih metaboličkih procesa iz hranjivih tvari i prenose se na
molekulu DNA.
- Miševi i ljudi imaju agouti gen koji je odgovoran za pretilost i proizvodnju inzulina. Ako je
metiliran (normalno stanje), miš će imati smeđe krzno, bit će mršav i imat će nizak rizik od

8
 razvitka bolesti. Nemetilirani gen će dati žuto krzno kod miša, bit će debel i sklon razvoju
dijabetesa i raka. Oba miša su genetički IDENTIČNA.
- Jednojajčani blizanci naslijede identičan set gena, a ipak što su stariji, sve se više razlikuju.
Ovisno o vanjskim faktorima (prehrana, fizička aktivnost, pušenje) daje se mogućnost
povećane epigenetske modifikacije. Takvi blizanci imaju i različite predispozicije bolestima.
MODIFIKACIJA HISTONA
- Histoni mogu zaustaviti ekspresiju gena pomoću histonskog koda. Acetilacija odstranjuje
pozitivan naboj i smanjuje afinitete između histona i DNA pa se povećava mobilnost
nukleosoma duž DNA. Kod metilirane DNA 5mC privlači histonske deacetilaze te dolazi do
inaktivacije kromatina.
UTIŠAVANJE GENA POMOĆU RNAi
- RNA interferencija uz pomoć dvolančane RNA koja nastaje dvosmjernom transkripcijom.
Dvolančanu RNA prepoznaje molekula Dicer koja ju cijepa u male siRNA te aktivira RISC
koji odvaja lance i odvodi kratku jednolančanu RNA do prve komplementarne mRNA i
cijepa ju pa ne dolazi do translacije. RISC se sastoji od helikaze i nukleaze. Helikaza odvaja
lance, a drugi veže na komplementarnu RNA, odvojeni lanac razgradi nukleaza.
GENOMSKI IMPRINTING
- Ako stvorimo uniparentalni zametak (dva seta kromosoma od istog roditelja) dobivamo
androgenetski (2 muška pronukleusa) ili ginogenetski embrij (2 ženska pronukleusa) i ne
dolazi do razvitka. Eksperimentom je pokazano da ukoliko su prisutni samo majčini geni u
zametku dolazi do vrlo slabog razvitka placente iako je embrij relativno normalan. Ako su
prisutni samo očevi geni dolazi do razvitka velike placente i abnormalnog embrija.
Pokazana je različita ekspresija dvaju roditeljskih alela istog gena što govori da genom
sisavaca sadrži gene kod kojih je jedan roditeljski alel transkripcijski inaktivan zbog razlike
u metilaciji. Različita ekspresija genoma roditelja naziva se genomski imprinting. Zaključak
je da očevi geni ne vjeruju majčinima da će napraviti dovoljno invazivnu placentu. Uz to
ginogenetski zametci imaju veliku glavu (zbog razvoja mozga) i malo tijelo, a
androgenetski imaju malu glavu (nedostaje razvoj mozga - cortex) i ogromno tijelo te
imaju izrazit nagon za opstanak (hrana, agresija i spolni nagon) - hipotalamus.
- Primjer delecije band q11-13 15. Kromosoma dovodi do razvitka 2 vrste bolesti ovisno od
kojeg je roditelja delecija potekla. Ako dolazi od majke nastaje Angelmanov sindrom kod
kojeg su djeca neprestano vesela i neprestano se smiju, vrlo su hiperaktivni s pokretima
poput lutke, rumenih obraza i velikih mandibula. Nasljeđivanjem iste mutacije od oca
dolazi do pojave Prader-Willijevog sindroma kod kojih ljudi imaju male ruke i stopala, male
genitalije, inaktivne gonade, mentalnu retardaciju, vrlo su usporeni i pretjeranog apetita.

2. Post transkripcijska kontrola:

a) Alternativni splicing – različita obrada pre mRNA pri čemu jedan gen može dati više
sličnih proteina (1 gen = 1 familija proteina). Pojavljuju se kod skeletnih i glatkih mišića,
fibroblasta i u mozgu.
b) Kontrola transporta – iz jezgre u citoplazmu moguć transport samo potpuno
obrađene mRNA koja mora imati izrezane introne, na 5' kraj dodanu kapu 7mG, a na 3'
kraj dodan poli A rep. Iznimka je kod HIV-a koji ugrađuje DNA kopiju svog RNA genoma
u DNA stanice domaćina. Različite vrste mRNA dolaze u citoplazmu te se prevode u
Rev protein koji se veže na RRE element RNA i omogućuje transport mRNA koja nije
potpuno obrađena. Ako nema Rev proteina, nema niti transporta.
c) Kontrola stabilnosti – poluživot mRNA je od 30 min do 20 sati. Njihova razgradnja
počinje skraćivanjem poli A repa i odstranjivanje 5' kape. Ako u stanici postoji
adekvatna količina željeza dolazi do razgradnje mRNA na 3' kraju, a kod niske količine
Fe dolazi do vezanje binding proteina IRE (iron response element) na mRNA koji ju štiti
od razgradnje. mRNA ujedno kontrolira sintezu transferina koji je receptor za ulazak
željeza u stanicu.

9
 d) Kontrola translacije – kod svih mRNA dolazi do postupne razgradnje poliA repa u
citoplazmi, ali isto tako postoji i kontrola određenih poliA repova koji se mogu
produljivati ili skraćivati. Npr. kod sazrijevanja organizma potreba za proteinima raste
te se dodavanjem poliA repova stimulira početak translacije.

Mutacije
- Mutacijom se naziva bilo koja promjena u genomu organizma, a njezin učinak može biti
pozitivan, neutralan, negativan i letalan. Može se dogoditi na genu ili čitavom
kromosomu.
1) Mutacije gena – pogađaju jedan ili nekoliko parova baza, nazivaju se još i točkaste
mutacije. Može doći do supstitucije, delecije ili adicije baza. Mogu biti inducirane
različitim mutagenima ili spontane kao prirodna genska varijabilnost. Greške u
kopiranju vrlo vješto popravlja DNA polimeraza pa grešaka gotovo i nema.
a) Tiha mutacija (silent mutation) – zamjena dušične baze na način da se
aminokiselina ne promijeni (više različitih tripleta kodira istu aminokiselinu).
b) Missense – mutacija krivog smisla pa ne dolazi do sparivanja prave aminokiseline.
 Najpoznatija missense mutacija je srpasta anemija kod koje se zamjenom
dušičnih baza s jednog na drugi komplementarni lanac DNA mijenja
aminokiselina glutamin u valin.
 Drugi primjer je osteogenesis imperfecta u missense mutaciji za kolagen
pri čemu dolazi do nemogućnosti formiranje heliksa ili nedovoljne
sinteze kolagena (lomovi kostiju ostvaraju se već in utero).
 Treći primjer je obiteljska hiperkolesterolemija u kojoj za LDL receptor
od njegovih 840 mora biti samo jedna kriva aminokiselina u slijedu.
 Četvrti primjer je Marfanov sindrom kao autosomalna dominantna
bolest gdje je mutirani gen za fibrilin (FBN1) – protein vezivnog tkiva.
c) Nonsense – besmislene mutacije koje mijenjaju kodon u STOP (UAA, UAG, UGA).
Primjer je cistična fibroza gdje se u velikom genu koji kodira gen za transport
kloridnih iona (CFTR) prerano završava sinteza proteina. Epidermolysis bullosa je
autosomna dominantna bolest kod koje se događa mutacija u genu za keratin i
dolazi do stvaranja mjehura kože.
d) Frameshift mutacije – pomak okvira čitanja kod adicije ili delecije baza pa ponovno
može doći do nekih od prethodnih mutacija.
 Kod β talasemije β lanac proteina je potpuno nefunkcionalan – dovodi do
anemije i stvaranja previše eritrocita pa slezena bubri.
 Fenilketonurija je nakupljanje fenilalanina u tjelesnim tekućinama što
dovodi do mentalne retardacije zbog nemogućnosti konverzije fenilalanina
u tirozin. To je autosomna recesivna bolest.
 Alkaptonurija je bolest u kojoj dolazi do nemogućnosti metabolizma
homogentizinske kiseline pa se ona izlučuje mokraćom. Kiselina se
nakuplja u hrskavicama pa ona potamni.
2) Mutacije koje mijenjaju broj kopija ponovljenih sekvenci DNA
a) Fragile X sindrom – ekspanzija CGG tripleta u FMR1 genu pa se kod žena izražava
pri izmjeni oblika lica i umjerene mentalne retardacije, a kod muškaraca kao
umjerena retardacija, autizam, velike uši, veliki testisi i dugačko lice.
b) Huntingtonova bolest – ekspanzija tripleta CAG za glutamin. Normalan broj
ponavljanja kod ljudi je 19-21, a kod bolesnika je preko 50 (što je veći broj
ponavljanja kraći je život bolesnika). Abnormalni huntingtin povećava nivo p53
proteina u stanicama mozga što uzrokuje povećanu apoptozu. Nasljedna je
autosomalna dominantna bolest, a započinje u različito doba života.

10
 c) Miotonična distrofija – gen za miotoničnu protein kinazu – CTG triplet se
amplificira na kraju 3'. Dolazi do kontrakcije mišića, ali ne i do njegove relaksacije.
- Mutacije mogu biti inducirane različitim mutagenima kao što je UV svjetlo koje stvara
timidinske dimere. X i γ zrake uzrokuju pucanja fosfodiesterskih veza i dolazi do različitih
kromosomskih mutacija. Aflatoksin je kancerogena tvar izolirana iz pljesnivog kikirikija,
pšenice ili kave, a uzrokuje pucanje veze guanina i šećera te vezivanje timidina na
apurinsko mjesto.
- Popravak oštećenja DNA vrši se tako da se oštećenje odreže, a DNA polimeraza koristi
neoštećeni lanac kao kalup (pukotinu spaja ligaza). Dušićne baze popravlja DNA
glikozilaza koja prepoznaje promijenjene baze DNA i katalizira njihovo odstranjivanje.
Veliki enzimatski kompleksi prepoznaju distorziju lanaca nukleotida.
- Organizam se od mutacija brani i apoptozom
3) Mutacije kromosoma:
a) Promjena broja kromosoma – posljedice nerazdvajanja u mejozi. Najpoznatije
trisomije su:
 Downov sindrom – trisomija 21. Kromosoma. Uzrokuje mentalnu
retardaciju, žene su fertilne, muškarci nisu. Bolesnici imaju niske oči, debeli
su, krtatki vrat, mala glava, probleme sluha,…Može nastati kao
Robertsonova translokacija (kod akrocentričnih kromosoma 13,14,15,21,22)
pri čemu se q krak kromosoma 21 translocira na 14 uz normalan broj
kromosoma. Može doći do mozaicizma tako da neke stanice mitozom
imaju 47, a neke 46 kromosoma.
 Patauov sindrom – trisomija 13. Kromosoma. Simptomi su sindaktilija,
polidaktilija, mala glava, rascijep nepca, abnormalne uši.
 Edwardsov sindrom – trisomija 18. Kromosoma. Simptomi: mikrocefalija,
kratki sternum, fokomelija, retardacija.
 Klinefelterov sindrom – XXY – mali penis, mali testisi, slaba dlakavost,
ginekomastija, visoko tijelo. Osobe su sterilne, a imaju povećane
koncentracije ženskih spolnih hormona. Terapija se provodi
testosteronom.
 Supermuškarci – XYY – povećana razina testosterona, niži IQ, agresivnost.
Monosomije:
 Turnerov sindrom – XO – udaljene bradavice, trokutasto lice,
malformacije srca i bubrega, kratki vrat. Terapija se provodi estrogenima
i hormonima rasta.
b) Promjene strukture kromosoma – promjene duljine ili rasporeda dijelova
kromosoma.
 Delecija – brisanje dijelova kromosoma. Kod muškaraca su delecije na X
kromosomu uvijek letalne. Poznati primjer je sindrom mačjeg plača („Cri
du chat“) u kojem dolazi do delecije kraćeg kraka 5. kromosoma. Simptomi
su udaljene oči, retardacija, skolioza, kratak život. Delecije mogu nastati
spontano u gonadama roditelja.
 Duplikacija – kopiranje dijelova kromosoma
 Translokacija – promjena mjesta određenog segmenta kromosoma. Može
biti homologna i recipročna.
 Inverzija – obrnuće pozicije određenih dijelova kromosoma. Kao i kod
prethodnog nema gubitna genetskog materijala, ali može doći do pojave
nove kombinacije gena ili gubitka njegove funkcije. Može biti
paracentrična (centromera je izvan područja inverzije) i pericentrična
(zahvaćena centromera).

11
 Tumori
- Karakterizirane abnormalnom proliferacijom stanica i promjenama diferencijacije. Postoje
četiri glavne skupine tumora:
1) Leukemije – zahvaćaju leukocite
2) Limfomi – zahvaćaju limfocite
3) Sarkomi – zahvaćaju vezivno tkivo (mišiće, hrskavice i kosti)
4) Karcinomi – tumori epitelnog tkiva (žlijezde, koža, urogenitalni trakt, probavni trakt,
respiratorni trakt)
- Mogu biti benigni (ogreničeni na određenom mjestu) i maligni (invazivni i šire se na
susjedna tkiva). Mogu nastati zbog mutacije u genima i kromosomima ili zbog
epigenetskih promjena.
- U zdravom tkivu ravnoteža između rasta novih i umiranja starih stanica postoji, a u
tumorima je zbog gubitka kontrole staničnog ciklusa ili gubitka sposobnosti stanice da
ode u apoptozu došlo do nekontroliranog ponašanja stanice (koja zapravo postaje
besmrtna). Stanice raka ne rastu brže od normalnih, samo se mogu dijeliti beskonačno
mnogo dok normalne stanice imaju određen biološki sat koji ovisi o duljini telomera.
- Stanice raka posjeduju enzim telomerazu koji produljuje telomere i onemogućava njihovo
potpuno skraćivanje. Prebrzo skraćivanje telomera naziva se progeria (takve osobe umiru
u mladoj dobi).
- Kod metastaza maligne stanice se odvajaju od tumora i ulaze u krvni ili limfni sustav te
proliferiraju u nekom drugom tkivu. Sve počinje od početne mutacije koja prelazi u benigni
adenom, zatim on prelazi u karcinom od kojeg mogu nastati metastaze.
- Poznati tumori su teratomi. Oni su benigna tumorska nakupina raznih tkiva koja su dobro
diferencirana. Teratokarcinom je tumorska nakupina diferenciranih i nediferenciranih
stanica (totipotentne pa se zovu i EC stanice – embryonal carcinoma cells). Obje vrste
tumora spadaju u tumore spolnih ili embrionalnih stanica.
ONKOGENI
- Prvi put identificirani u retrovirusima koji uzrokuju rak. Najpoznatiji pokus je bio onaj
Peytona Rousa na fibrosarkomu pilića. Filtrirao je tumor kroz vrlo gusti filter (da ne prođu
bakterije) i filtrat ubacio u piliće. Svi pilići su razvili sarkome. Uzročnik sarkoma je bio virus,
nazvan RSV (Rous sarcoma virus). On transvormira fibroblaste u kulturi i dolazi do maligne
transformacije. Uz normalne retroviralne gene sadrži i gen odgovoran za transformaciju
nazvan src gen (sarcoma gen). Stanice ostalih životinja sadrže identičan src gen, a
retroviralni onkogeni koji nastaju potječu od stanica domaćina (ne trebaju virusu za život).
Normalni stanični geni od kojih su retroviralni geni potekli nazivaju se protoonkogeni, a
zbog virusa došlo je do njihove abmnormalne eksprimacije ili mutacije pa su prešli u
onkogene.
- Onkogeni su geni koji uzrokuju malignu transformaciju određenih stanica te djeluju kao
dominantni geni čija funkcija dominira nad njegovim alelom protoonkogenom kao
posljedica „dobitka funkcije“.
- Protoonkogeni su važni geni uključeni u regulaciju rasta (proliferacije stanice) i
diferencijaciju.
- Onkogeni nastaju na 4 načina:
1) Točkastim mutacijama – konstitutivna ekspresija proteina je drugačija pa dolazi do
različitih promjena u aktivaciji i građi proteina (ras mutacije).
2) Amplifikacija segmenata – prekomjerna ekspresija protoonkogena (c-myc, c-myb, c-
abl)
3) Insercija retrovirusa – ugradnjom virusa u blizinu protoonkogena ili njegovih regija
remeti se normalna funkcija protoonkogena i može se pojačati njegova ekspresija.

12
 4) Translokacije – dovode do prekomjerne ekspresije proteina kod npr. kronične
mijeloične leukemije kod koje se translokacija događa s 22. kromosoma (Philadelphia
kromosom) na 9. Pri čemu nastaje fuzijski protein bcr i c-abl. Novootkriveni lijek koji
pogađa točno te gene naziva se Glivec. Burkittov limfom kod kojeg je translokacija
pogodila segment s 8. Kromoma i prenijela ga na 14. Kod tog limfoma dolazi do
kontinuirane proliferacije T-limfocita.
- Epstein Barr virus u toplim krajevima Afrike uzrokuje Burkittov limfom, u Kini
nazofariengealni karcinom, a u razvijenim zemljama mononukleozu (herpes virus)
- Hepatitis B virus ima jedan od najmanjih genoma od svih virusa (3 kb), inficira stanice jetre,
a u 5-10% slučajeva uzrokuje rak.
- Najčešći stanični protoonkogeni su faktori rasta (PDGF, EGF, FGF), receptori faktora rasta,
membranski G proteini (ras – prenose signal od receptora faktora rasta do jezgre), kinaze,
transkripcijski faktori (myc, fos i jun koji potiču transkripciju gena staničnog ciklusa).
- Primjer je hiperprodukcija proteina Ras kod kojeg ako dođe do njegove prekomjerne
transkripcije stanica ulazi u prekomjernu proliferaciju (utječe na kinaze). Faktor rasta se
veže na receptor (tirozin kinaze) čijom fosforilacijom dolazi do aktivacije Ras proteina (u
mutiranom obliku mu faktor rasta niti ne treba). Kinaze aktiviraju transkripcijske faktore
koji se vezuju na DNA u jezgri i dolazi do stanične diobe.
GENI SUPRESORI TUMORA
- Normalni stanični geni koji kontroliraju ponašanje određenih molekula u staničnom
ciklusu. Tumor nastaje gubitkom njihove funkcije. Geni supresori tumora ponašaju se kao
recesivni geni, ali se nasljeđuju autosomno dominantno.
- Tumor se može pojaviti kod heterozigota ako dođe do LOH (loss of heterozygosity),
odnosno inaktivacija zdravog alela.
1) Rb – retinoblastomski gen – u aktivnom obliku veže transkripcijski faktor E2F i ne
dozvoljava transkripciju, a fosforiliran ga otpušta i daje znak za početak S faze. Gen za
Rb protein nalazi se na 14. Kromosomu i mutiran daje tumor retinoblastom. Ako dođe
do mutacije jednog alela Rb gena neće doći do stvaranja tumora. Prisutan je u više
diferenciranim stanicama, dok ga u nediferenciranim nema.
2) p53 – aktivira se u slučaju oštećenja DNA molekule te aktivira transkripciju p21 što ne
dozvoljava stanici da uđe u S fazu. Ako je oštećenje preveliko stanica odlazi u
apoptozu. Mutacijom stanica se dijeli s oštećenom DNA jer ju p53 više ne prepoznaje.
Akumulacijom takvih oštećenja nastaje tumor. Mogućnost liječenja otkrivena je kod
mutiranih adenovirusa koji se mogu replicirati samo u stanicama koje nemaju
normalan p53 gen. Inaktivan u 50% ljudskih tumora.
3) APC – razgrađuje višak β katenina koji služi za stvaranje međustaničnih veza. Dio ulazi
u jezgru i stimulira proliferaciju stanice. Višak β katenina veže se na APC koji pomaže
njegovu razgradnju, a ako ga nema, ne dolazi niti do razgradnje β katenina. U
normalnoj stanici, razgradnjom viška katenina dolazi do zaustavljanja proliferacije.
4) p16 – inhibitor CdK, zaustavlja ciklus G1/S kontrolne točke
5) p15 – inhibitor CdK, inaktivan u hematopoetskim neoplazmama
- Rak se razvija u više koraka. Ne postoji rak koji je nastao iz jedne mutacije pa kažemo da
nastaje iz progresivne serije promjene gena koji kontroliraju proliferaciju, diferencijaciju i
apoptozu u stanicama.
- PAPILOMA VIRUS – mali DNA virusi od 8 kb koji uzrokuju benigne i maligne tumore kod
ljudi i ostalih. Svih 60 vrsta inficira epitelne stanice inaktivacijom Rb proteina i
razgradnjom p53. Benigni uzrokuju bradavice, a maligni karcinom cerviksa uterusa.
Najpoznatiji je HPV čiji proteini E7 i E6 se vežu na Rb (E7) i p53 (E6).
- HEPATITIS C – RNA virus koji uzrokuje kronično oštećenje jetre.
- Stanice raka u usporedbi s normalnima imaju smanjen ukupan stupanj metilacije ali
povećanu metilaciju CpG otoka i povećanu aktivnost DNMT. Globalna hipometilacija
dovodi do nestabilnosti kromosoma i aktivacije onkogena dok je do hipermetilacije CpG

13
 otoka došlo zbog inaktivacije gena za popravak DNA i tumor supresora. U tumorskim
stanicama ponovljene sekvence gube metilaciju, a CpG otoci ju dobivaju i dolazi do
utišavanja gena.

Genska terapija
- Unošenje normalnih gena u stanice koje sadrže defektne gene da bi se nadomjestio
proteinski produkt koji nedostaje ili je defektan. Klonira se čitav gen (strukturalni dio
zajedno s regulatornim i kontrolnim sekvencama)
- Koristi se za popravak deficitarnog fenotipa tako da se sintetiziraju dovoljne količine
normalnog genskog produkta u svrhu poboljšanja stanja nastalog zbog genetskog
poremećaja.
a) Genska terapija spolnih stanica (spermija i jaja) – zdravi funkcionalni gen se unosi u
genom spolne stanice i prenosi na buduće generacije. Iako može spriječiti genetske
bolesti provođenje ove terapije na ljudima je zabranjeno.
b) Genska terapija somatskih stanica – uključuje samo somatkse stanice (ciljana na tkiva
koja eksprimiraju bolesne gene)
- Genskom terapijom liječe se neke monogenske bolesti (cistična fibroza, SCID – severe
combined immunodeficiency, mišićna distrofija,…) da pritom ne liječi njihove simptome.
Nadomiješta se gen unošenjem normalne kopije (modificirane matične stanice) što može
potisnuti ekspresiju mutiranog gena.
- Genska terapija može se provoditi in vivo (unos gena direktno u tijelo) i ex vivo (unos gena
u stanice izvan tijela i vraćanje u tijelo)
- Zdravi gen se u stanicu vraća pomoću liposoma, injekcijom gole DNA ili vektora:
1) Retrovirusi – RNA virusi koji reverznom transkripcijom stvaraju DNA koja se ugrađuje u
genom domaćina. Najčešće korišten MuLV (murine leukaemia virus) kojem se genom
može promijeniti u terapeutski ugrađivanjem cDNA. Problem nastaje zbog toga što
imaju sposobnost nasumične ugradnje vektorske DNA u genom domaćina i ne mogu
inficirati stanice koje se ne dijele. Primjer je liječenje ADA (adenosine deaminase
deficiency) u kojoj nedostaje enzim što dovodi do smrti T limfocita i SCID-a.
Ubacivanjem zdravog ADA gena postigla se normalna količina T-limfocita, ali su bili
kratkog vijeka pa terapiju treba ponavljati. Retrovirusi se mogu ugraditi blizu
protoonkogena pri čemu aktiviraju onkogene ili inaktiviraju tumor supresor gene i
dovode do insercijske mutageneze. Tim otkrićem zaustavljena je genska terapija
retrovirusima.
2) Adenovirusi – DNA virusi koji uzrokuju respiratorne, probavne smetnje i neke infekcije.
Ne integriraju se u genom, nego ulaze u jezgru i repliciraju se kao episomi pa nema
opasnosti od insercijske mutageneze. Inficiraju i stanice koje se ne dijele. Ipak, imaju
neke nedostatke jer izazivaju upalu i imuni odgovor (najčešće prehlada), a njihova
ekspresija je prolazna pa već kod slijedeće diobe stanice neće imati zdravi gen. U
stanicu ulaze endocitozom pomoću receptora. Pokušaj liječenja cistične fibroze nije
bio previše uspješan jer je djelovanje zdravog gena bilo prekratkotrajno te se terapija
morala prečesto ponavljati. Ista stvar dogodila se i kod liječenja mutacije p53.
3) AAV (adenoassociated viruses) – mali jednolančani DNA virusi koji se ugrađuju samo u
19. kromosom. Nepatogeni ljudski virusi koji trebaju neki dodatni virus za proliferaciju
(najčešće herpes). Ulaze u stanice koje se ne dijele, ali ne dovode do upalnih reakcija.
Unošenjem dva AAV vektora simultano možemo postići unos gena i transkripcijskih
fakotra. Primjer je bilo stvaranje eritropoetin gena i faktora zgrušavanja IX. U mišiću
mogu ostati godinama ali nose samo 4kb što je problem kod većih gena. Npr. gen za
Duchennoeovu mišićnu distrofiju (DMD) ima 2,4 Mb pa se konstruiraju minidistrofinski
geni kako bi se ovim načinom mogli prenijeti.

14
 4) Herpes virusi – DNA virusi. Herpes simplex virus (HSV tk) proizvodi timidin kinazu koja
pretvara ganciklovir (dodan u stanice) u fosfoganciklovir koji je citotoksičan, jer
inhibira DNA polimeraze, pa kažemo da je taj gen za timidin kinazu samoubilački.
Koristi se kod liječenja tumora mozga (citotoksičnost spoja ubija stanice tumora).
- Virusi se koriste zato što su sposobni unijeti svoj genetski materijal u ljudske stanice, a
sami određuju koje će to stanice biti. Sposobni su izbjeći uništenje od strane ljudskog
imunološkog sustava.
- Zdravi gen se može unijeti još i pomoću molekularnih konjugata i umjetnih kromosoma
(dodatni 47. kromosom koji ne narušava funkciju ostalih s puno heterokromatina uz
pretpostavku da neće izazvati imunološki odgovor).
- Ekspresija mutiranog gena se može potisnuti uz pomoć:
a) oligonukleotida koji su komplementarni s DNA i formiraju trostruki heliks pa ne
dozvoljavaju transkripciju.
b) Antisense DNA ili RNA – ulaz u jezgru veže se na mRNA i blokira se ekspresija
mutiranog gena (rak, Alzheimerova bolest, autoimune bolesti). Suprimira ekspresiju
gena za sazrijevanje po se koristi u svrhe povećanja trajnosti povrća (flav'r sav'r
tomato prva modificirana namirnica).
c) siRNA – ako je komplementarna s mRNA mutiranog gena sprječava ekspresiju
mutiranog proteina lancima kraćima od 30 pb jer dulji lanci mogu navesti stanicu na
samoubojstvo. (detaljnije str. 9). Primjer liječenja ovim načinom je Huntingtonova
bolest kod koje se pokušalo smanjiti proizvodnju huntingtina. RNA normalnog
zdravog gena se nije razgradila jer nije bila komplementarna sa siRNA.
- Imunogenska terapija ima za cilj označiti stanice tumora tako da ih imunološki sustav
može prepoznati. Transdukcijom se unese gen za interleukin 2 (TNF – tumor necrosis
factor) koji je važan za imunološko prepoznavanje stanica.
- siRNA se koristi i kod liječenja karcinoma uterusa tako što se ugrađuju siRNA
komplementarne s E6 i E7 genima HPV-a

Kloniranje
- za kloniranje gena koristi se rekombinantna DNA tehnologija. Dijeli se na:
1) Reproduktivno kloniranje – biljke, životinje, ljudi,…Cilj je proizvesti jedinku identičnu
postojećoj. Hans Spemann je prvi uz pomoć dlake kose odvojio stanice dvostaničnog
embrija daždevnjaka i dobio normalan razvitak iz obje stanice (indukcija prirodnog
kloniranja – postupak nastanka jednojajčanih blizanaca). Zigotu je pritisnuo tako da jezgra
dospije u jednu polovicu i pustio ju da se dijeli te je na 16 staničnoj moruli olabavio sponu i
jezgra je prešla te se dobio normalni daždevnjak.
- Carter je centrifugiranjem u citohalazinu razgradio mikrovlakanca i razdvojio jezgru od
citoplazme koja je ostala pričvršćena za podlogu. Spajanjem HeLa citoplazme i jezgre
eritrocita pileta došlo je do aktivacije inaktivne jezgre (spajanjem staničnih dijelova).
- Gurdon je pomoću „žive epruvete“ oocite Xenopusa laevisa izraživao injeciranje 200
jezgara HeLa stanica u citoplazmu u kojoj su se jezgre povećale 10 puta ili u samu jezgru
stanice kada su se jezgre povećale 100 puta. Pojavili su se lampbrush kromosomi i došlo je
do sinteze RNA. Somatske jezgre poprimile su obilježja oocite. U oociti žabe dolazi do
selektivne transkripcije pojedinih stranih gena (5S i 40S RNA, virusne DNA) i translacija
stranih mRNA. Preobražaj somatskih jezgri u uoociti uzrokuje aktivaciju gena koji su kod
odrasle jedinke inaktivni (geni se za vrijeme diferencijacije ne gube i ne mijenjaju se trajno)
- Reproduktivno kloniranje vrši se metodom transplantacije jezgara u kojoj se iz somatske
stanice koja je diploidna izvadi jezgra i ubaci u enukleiranu jajnu stanicu donora. Stanica se
implantira u maternicu i nastavlja svoj razvoj. Briggs i King su tako transplantirali jezgre 8 i
16 staničnog stadija jaja žaba. Ako bi dodali jezgre blastula 80% žaba se razvilo u

15
 punoglavce, dodatkom endoderma gastrule razvijalo se 60%, ali je od toga nastalo samo
35% punoglavaca. Najmanji postotak dale su jezgre crijeva kod kojih se razvijalo samo 2%
punoglavaca, a 0,3% se razvilo u fertilne žabe. Može se zaključiti da što je stanica više
diferencirana teže ju je natjerati na razvitak.
- Davor Solter radi sa sisavcima i prebacuje oba pronukleusa jednostaničnog zametka u
mišju zigotu. 90% enukleiranih mišjih zigota s tuđim pronukleusima razvija se do
blastocista. Ako bi se uzele jezgre 4 staničnog zametka embriji se neće razviti.
- Ian Wilmut (1997) izveo je prvo uspješno kloniranje sisavaca. Umjesto transplantacije
jezgara izveo je fuziju stanice mliječne žlijezde ovce u GO fazi i enukleirane oocite. Ovca se
razvila u reproduktivno sposobnu jedinku, a iz pokusa je zaključio da se jezgra
diferencirane stanice odraslog organizma može reprogramirati i vratiti u stanje
totipotentnosti. Od 277 pokušaja nastala je samo 1 ovca – Dolly.
- Kloniranje se za razliku od normalne oplodnje vrši pomoću genskog doprinosa samo jedne
osobe, a ne dva roditelja. Nakon transfera jezgre dolazi do reprogramiranja stanice koje
može dovesti do rane smrti (ako nema aktivacije embrionalnih gena), abnormalnog
fenotipa (ako se aktiviraju krivi geni), ali i normalnog razvitka (ako se pravilno aktiviraju i
embrionalnih i odraslih gena). Do sada je analizom utvrđeno da je kod kloniranih životinja
30-50% gena krivo aktivirano pa zato klonirane životinje ako i prežive do poroda, pate od
ozbiljnog poremećaja ekspresije gena.
- Svi analizirani klonovi pokazuju disregulaciju mnogih gena što znači da sisacci mogu
kompenzirati promjene u regulaciji gena i ostvariti relativno normalan razvitak.
Mehanizam kompenzacije može osigurati opstanak, ali ne može spriječiti pojavu različitih
bolesti u kasnijoj dobi (npr. Dolly je imala artritis i skraćene telomere).
- Rezultati kloniranja su slabi jer dolazi do neadekvatnog reprogramiranja gena (brisanja
epigenetskog statusa zrele stanice i uspostavljanja obrasca genske ekspresije potrebnog
za embrionalni razvoj). Uz to, ponekad se u procesu promjene epigenetskog statusa
događa gubitak normalnog imprintinga (bialelna ekspresija) ili dobitak (bialelno
utišavanje), pa kažemo da dolazi do „epimutacija“.
- Citoplazma oocite sadrži faktore koji u roku od 5 sati nakon oplodnje demetiliraju očev
genom, a metiliraju majčin nakon čega se formiraju pronukleusi čime je selektivno
spriječena interakcija dijela citoplazmatskih faktora oocite majčinim i očevim genomom.
DNMT ne ulazi u pronukleuse nego neki drugi faktori ulaze i ostvaruju epigenetske
promjene. Demetilacija tijekom embrionalnog razvoja ne briše imprinting, briše se prije
razvoja tijekom brazdanja.
- Ljudski klonovi i bez laboratorijskog kloniranja postoje kao jednojajčani blizanci.
- Embrionalne matične stanice (embrioblast) su pluripotentne dok su fetalne matične
stanice multipotentne i dovode do spontanih pobačaja. Odrasle matične stanice su
također multipotentne ali se iz njih može dobiti odrasli organizam.
- Embrionalne matične stanice dobivaju se in vitro oplodnjom ili transferom jezgara, a
pritom ako se diferenciraju in vivo daju sva tkiva, a in vitro određena tkiva ako ih
usmjerimo pomoću različitih medija.
- Odrasle matične stanice su nediferencirane u diferenciranom tkivu odraslog organizma
koje se mogu samoobnavljati i davati sve vrste stanica tkiva u kojem se nalaze (koštana
srž, mozak, jetra, crijeva, koža, oko, skeletni mišići, pupkovina).
2) Terapijsko kloniranje – uključuje transdiferencijaciju stanica, transplantaciju jezgara kao i
reproduktivno kloniranje, ali njime ne nastaje novi organizam (ne dolazi do implantacije
blastociste). Pokus ubacivanja embrionalnih matičnih stanica crnog miša u blastocistu
bijelog miša – kimerični miševi. Sličan je postupak stvaranja transgeničnih životinja koji se
danas koriste za istraživanje različitih bolesti. Primjer je polio virus koji kod običnih miševa
neće izazvati paralizu, no kod transgeničnih hoće.
- Postoje dvije metoda za proizvodnju transgeničnih miševa – transformacija embrionalnih
matičnih stanica u kulturi s ciljnom DNA i njihova injekcija u blastocistu. Druga metoda je

16
 injiciranje ciljnog gena u pronukleus oplođene jajne stanice. U oba slučaja ciljni gen mora
se izolirati, ubaciti u vektor koji će ga unijeti u stanicu.
- Inducirana pluripotentna matična stanica (iPSC) ne dobiva se iz blastociste, a može se
diferencirati u razna tkiva. Dobiva se iz odraslih stanica pomoću faktora reprogramiranja.
Pojava opasnosti vidi se kod saznanja da nediferencirane stanice mogu razviti tumor (npr.
teratokarcinom) što se može spriječiti ugradnjom kontrolnog gena (samoubilački gen).
- Matične stanice porijeklom iz odraslog organizma ne izazivaju tumore ako se ubace u isti
organizam iz kojeg su potekle.
- Transgenične ovce i koze stvaraju se pomoću GOI (gen of interest) kao ciljnim genom koji
zajedno s promotorom gena sudjeluje u proizvodnji mlijeka.
- Transgenični pilići se uzgajaju brže od ovaca pa su i jeftiniji. Isto tako stvaraju se biljke
otporne na herbicide te biljke s proteinima koji ubijaju insekte (kukuruz s Bt genom
(Bacillus thuringiensis)).
3) Pozicijsko kloniranje – utvrđivanje lokusa mutiranog gena kada se ne zna koji mu je
proteinski proizvod. Utvrđuje se pomoću RFLP fragmenata koji se prenose na potomstvo
jer su vezani za gen čija mutacija uzrokuje dotičnu bolest. Dio kromosoma na kojem se
nalazi taj gen se klonira i napravi se njegova genomska biblioteka. Svaki fragment DNA iz
tog redoslijeda upotrijebi se kao hibridizacijska sonda u genomskoj biblioteci druge vrste.
Ako je takav ili vrlo sličan fragment prisutan, hibridizirat će se s ljudskom sondom na
temelju komplementarnosti parova baza. Ako postoji više takvih fragmenata, traži se
fragment DNA koji je u bolesnika različit od onog u zdrave osobe.

Genomika i proteomika
- 25.4.1953. Watson i Crick otkrivaju strukturu DNA molekule
- 2003. Godine izoliran je ljudski genom i otkriveno je da sadrži 3 milijarde parova baza. Na
temelju tog projekta izgrađena je genomika.
- Polimorfizam je mutacija koju nalazimo u učestalosti većoj od 1% populacije. Može se
dogoditi u nekodirajućim i kodirajućim regijama DNA.
- Genomika je znanost koja proučava utjecaj našeg čitavog genoma i okoline na zdravlje i
bolest. Poznate bolesti koje danas proučava su astma, dijabetes, rak, srčane bolesti,…
Strukturalna genomika pokušava otkriti sekvencu genoma, a funkcionalna proučava
obrasce ekspresije gena.
- Ne postoji aparat koji može sekvencirati jako duge dijelove DNA (najviše do 500 parova
baza) pa se cijeli genom odjednom ne može sekvencirati.
- Shotgun metoda – segmenti genoma se nasumično režu (bez znanja kojem kromosomu
pripadaju). Preklapanjem određenih regija otkrije se kojem dijelu genoma su pripadali i
rekonstruira se kompletna DNA sekvenca pomoću fragmenata.
- Za razliku od fizičke genetička mapa daje točan položaj gena i njihove udaljenosti u
centimorganima (temelji se na vezanosti i postotku rekombinacije)
- U ljudskom genomu samo 1,1 do 1,4% DNA kodira proteine. Kromosom 1 ima najviše gena
(2968), a Y najmanje (231). Oko 45% genoma su transpozoni kratkih DNA sekvenci koje se
mogu premiještati unutar genoma (molekularni paraziti). 25% čini RNA koja se ne prevodi
do proteina.
TRANSPOZONI
- Transpozon je odsječak od 300 parova baza do 6,5 kb, a može se sam kopirati ili izrezivati i
premiještati unutar genoma:
a) DNA transpozoni – kodiraju za enzim traspozazu koja se veže na oba kraja
transpozona, izreže ih i premiješta na drugo mjesto.
b) Retrotranspozoni – čine najveći dio svih transpozona:

17
  Endogeni retrovirusi (ERV) sadrže LTR – retroviral like long terminal
repeats – retrovirus je ugrađen u genom spolnih stanica te se prenosi na
sljedeću generaciju i postaje endogen
 Neviralni transpozoni – LINE (long interspersed elements) – sekvence
duge nekoliko stotina parova baza do 9 kb. Ljudski genom sadrži oko
868 tisuća LINE. SINE (short interspersed elements) – kratke DNA
sekvence od 100 do 400 pb koje predstavljaju RNA molekule prepisane
reverznom transkripcijom koje su originalno prepisane RNA
polimerazom II. Najčešća je Alu sekvenca (300 parova baza)

- Transpozoni su mutageni i mogu uzrokovati mutacije:

a) Insercijom u funkcionalni gen čime ga oštećuju. Napuštaju gen i ostavljuju rupu za
sobom koja se ne može popraviti.
b) Insercijom u egzon, intron, promotor, enhancer – remeti aktivnost gena.
- Stanica kontrolira transpozone:
 Metilacijom gena - gubitkom metilacije gena postaju aktivni (oko 90% 5mC genoma
je locirano u retrotranspozonima).
 Obranom uz pomoć nekodirajuće RNA – micro RNA kontrolira razgradnju mRNA,
translaciju i aktivaciju promotora. siRNA – razgradnjom mRNA.
- Geni koji kodiraju proteine traže se pomoću ORF (open reading frame) koji traži sekvencu
koja počinje start kodonom i dovoljno dugo ne sadrži stop kodon da može kodirati
protein.
- Projekt humanog genoma je pokazao da je 99,9% DNA identično kod svih ljudi pa se
znanost sve više posvećuje 0,1% koji prave razliku. Genomika pritom daje razloge i sredstva
da tretiramo svakog pacijenta kao specifičnu osobu.
HAPLOTIP
- To je obrazac razmještanja SNP-a na jednom jedinom kromosomu. Takvi SNP imaju
tendenciju da se naslijeđuju zajedno te s vremenom mogu poslužiti kao markeri bolesti
(genetički markeri). Istraživanje haplotipa je važno zbog toga što mutacija jednog
kromosoma može biti maskirana normalnom sekvencom drugog.
FUNKCIONALNA GENOMIKA
- Pronalazi obrazac ekspresije gena u određenoj vrsti stanice u određenom momentu.
Koristi tehniku Northern blottinga i DNA microarraya. DNA microarray je kolekcija cDNA
pričvršćene na podlogu od stakla, plastike ili silikona. Sadrži veliku površinu za ispitivanje
tisuće gena odjednom.
PROTEOMIKA
- Ekspresijom mRNA možemo vidjeti kao pacijent reagira na određenu dozu lijeka, ali ne
možemo izjednačiti ekspresiju mRNA s prisutstvom proteina u stanici jer ne mora značiti
da ako postoji mRNA da postoji i protein. Proteomika proučava strukturu, ekspresiju i
funkciju proteina koji su uključeni u sve funkcije stanice.
- RNA splicing rezultira različitim proteinima kodiranim istim genom pa nije prikladna za
analizu. Najbolja metoda odvajanja proteina iz mješavine i njihovog detektiranja je 2D
elektroforeza. Za odvajanje mogu poslužiti i SDS elektroforeza i masena spektrometrija.

- Genomika je uzrokovala nastanak farmakogenomike koja uključuje pravi lijek, pravu dozu i
pravo vrijeme doziranja za svakog pacijenta. Svi proteini u stanicama pokazuju određene
polimorfizme među ljudima pa tijelo na isti lijek drugačije odgovara.
- Između čovjeka i majmuna postoji 1% razlike u čitavom genomu

18