实验 20 肝糖原的提取、鉴定与定量

实验 20-1 肝糖原的提取与鉴定

一、实验原理

糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸

能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清

液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，

故先用 95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。

糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋

中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利

用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。

CuSO4 十 2NaOH ═ Na2 SO4+Cu(OH)2↓

2Cu(OH)2 十 C6H12O6 ═ 2CuOH 十氧化型葡萄糖+H2O

2CuOH ═ Cu2O↓(红色)+H2O

Cu(OH)2 ═ CuO↓(黑色)+H2O

二、实验材料

（一）样品

鸡肝。

（二）试剂

1．95％乙醇。

2．0.31mol/L(5％)三氯醋酸溶液：称取未潮解的三氯醋酸（CCl3COOH，163.39）

5g，加蒸馏水溶解至 100 ml。

3． 0.15mol/L NaCl 溶液：称取 8.8g NaCl 加蒸馏水溶解至 1000 ml。

 4．12mol/L HCl：浓 HCl 原液（36%38%）。

5．12.5mol/L(50％)NaOH：称取 NaOH 50g，用蒸馏水溶解至 100ml。

6．碘试剂：碘 l00mg 和 K1 200mg 溶于 50ml 蒸馏水中。

7．班氏试剂：称取柠檬酸钠（C5H5Na3O7·5H2O，294.10） 173g 和无水碳

酸钠（Na2C03，105.99）100g 溶于蒸馏水 700ml 中，加热促溶。冷却，慢慢倾人

17.3％硫酸铜（CuSO4·5H2O，249.68） l00ml，边加边摇。再加蒸馏水至 1000ml，

混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存。

（三）仪器和器材

1．普通离心机，室温100℃恒温水浴箱（×2），可见光分光光度计，精度

为 10mg 级电子天平（×1）

2．剪刀（×1），镊子（×1），研钵（×1）

3．试管架（×1），10ml 离心管（×2），（100×15）mm 试管（×6）

4．刻度吸量管（2ml×1，5 ml×2），1000μl 微量可调取液器（×1）

5．白瓷反应板（×1）

三、实验步骤

（一）实验流程

吸取 1ml 量溶液时使用可调微量移液器，吸取 1ml 以上量溶液时使用刻度

吸量管。

鸡肝约 1 g，剪碎
＋5%CCl3COOH 1 ml
研磨至乳状
＋5%CCl3COOH 3 ml
研磨成肝匀浆

全部转入离心管中，离心 3 分钟（4000 r / min）

 沉淀（弃去） 上清（取 2 ml）
＋2 ml 95%乙醇，混匀，静置 10 分钟
离心 5 分钟（4000 r / min）

上清（弃去） 沉淀
＋蒸镏水 1 ml
沸水浴 2 分钟，溶解沉淀

白瓷板孔穴中 糖原溶液 1ml

＋浓 HCl 5 滴
加碘试剂 2 滴 加碘试剂 2 滴 沸水浴 15 分钟，冷却
糖原溶液 2 滴 ＋50%NaOH 5 滴

呈色对比 糖原水解液 2 滴 糖原水解液

＋班氏试剂 4 滴
混匀

沸水浴 2 分钟，观察变化

（二）操作步骤

1．肝匀浆准备 称取鸡肝约 1g，放入盛有 1ml 5%三氯醋酸的研钵中，将肝组织磨

↓ 至乳状后，再加入 5%三氯醋酸 3ml，再磨成肝匀浆（共约 4ml），

4000 r/min 离心 5min，上清液倾入另一干净离心管中。

2．提取糖原 向上清液中加入等量的 95%乙醇，混匀，静置 10min，离心 5min

↓ （4000r/min）。倾去上清液，白色沉淀为糖原。加入蒸馏水 1ml，并

加热使沉淀溶解，溶液呈乳样光泽。

3．糖原鉴定 （1）与碘反应：

取碘试剂 2 滴于白瓷板孔穴中，加糖原溶液 1 滴，观察其呈色。另

一孔穴只加碘试剂 2 滴，作呈色对比。
 （2）糖原水解液中葡萄糖的鉴定： a 如呈黑色

取糖原溶液 1ml 于小试管中，加浓盐酸 5 滴，置沸水 浑浊，则是

浴中水解 15min，取出冷却。用 50%NaOH 中和（约 因加班氏试

5 滴）。取另一小试管加班氏试剂 4 滴，加上述糖原水 剂过量所

解液 2 滴混匀，在沸水浴中（或直接在酒精灯上）加 致。

热 2min，观察并记录所见 a。

（三）注意事项

1．肝糖原提取一步，向上清液中加人等量的 95％乙醇后，务必注意混匀。

由于上清液为水溶液，比重大于 95％乙醇，溶液分成两层。加之上清液已 4ml

多，加上等量乙醇，总量接近 9ml，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用

玻璃棒搅拌混匀；

2．糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡

萄糖残基在 20 个以下的会使碘呈现红色，2030 个之间使碘呈现紫色，60 个以

上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分枝链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖

残基在 20 个以下（通常 812 个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。

 实验 20-2 肝糖原定量测定

一、实验原理

糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍

生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该

物质在 620nm 处有最大吸收。糖含量在(10100)g 范围内，溶液颜色的深浅与

可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，

通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液

中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保

留肝糖原。

二、实验材料

（一）样品

鸡肝。

（二）试剂

1．5.35mol/L(30％)KOH 溶液：称取 KOH 30g，加蒸馏水溶解至 100 ml。

2．标准葡萄糖液(50mg/L)：称取已干燥恒重的无水葡萄糖 25mg，加蒸馏水

溶解至 500 ml。

3．17mol/L(90％)H2SO4：量取蒸馏水 30ml，加浓 H2SO4500 ml。

4．蒽酮显色剂：称取蒽酮 0.20g，用 17mol/L H2SO4 溶解至 100 ml。此试剂

不稳定，以当日配制为宜，冰箱保存可用 45 天。

（三）仪器和器材

1．普通离心机，室温100℃恒温水浴箱（×2），可见光分光光度计，精度

为 10mg 级电子天平（×1）
 2．剪刀（×1），镊子（×1）

3．试管架（×1），3（100×15）mm 试管（×3）

4．刻度吸量管（2ml×1，5 ml×2），1000μl 微量可调取液器（×1）

5．100ml 容量瓶（×1）

三、实验步骤

（一）实验流程

鸡肝 0.10～0.15 g
＋30%KOH 1.5ml （用吸量管）
沸水浴 15 分钟

冷却，全部转入 100 ml 容量瓶中

加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液

糖原的测定

（二）操作步骤

1．糖原提取 在试管中加入 30%KOH 1.5ml，再称取 0.10~0.15g a 准 确 称 量 并

↓ 肝组织 a 放入试管中，置沸水浴中 15min。取出后 记录数值，用于

冷却，将管内容物全部移入 100ml 容量瓶中 b，加 计算结果。

水至刻度，仔细混匀。 b 用水多次洗

涤试管，一并收

入容量瓶内。

2．糖原的测定 取 3 支试管，按下表操作。

↓ 试剂（ml） 空白管 标准管 样品管

蒸馏水 1.0 — —
 标准葡萄糖溶液 — 1.0 — c 如溶液呈浑

糖原提取液 — — 1.0 浊，则因配制蒽

0.2%蒽酮溶液 酮 溶 液 的
2.5 2.5 2.5
（用吸量管） H2SO4 浓 度 不

混匀，沸水浴 10 分钟，冷却 c。在分光光度计 620 够所致。

nm 波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的

吸光度（A）。

（三）注意事项

1．肝组织必须在沸水浴中全部溶解，否则影响比色。

2．注意定量转移，取量务必准确。

3．蒽酮试剂必须两倍于被测液。

4．此法试剂简单，操作简单、迅速。但肝糖原含量宜在 1.5%~9%之间。若

肝糖原<1%时，则由于蛋白质干扰蒽酮反应，须改用间接法测定。即肝组织消化

后，用 95%乙醇沉淀糖原（消化液:95%乙醇=1:1.25），用蒸馏水 2ml 溶解糖原，

再用蒽酮显色、比色。

四、实验结果

（一）结果

计算：

A样品 100 100

肝糖原( g / 100 g肝组织)   0.05    1.11
A标准 肝组织重( g ) 1000

注：计算公式中的 1.11 为此法测得葡萄糖含量换算为糖原含量的常数，

因为用蒽酮试剂显色时，110μg 糖原与 100μg 葡萄糖显色程度相当。

（二）讨论
1．糖原为什么与碘作用成红色？这与淀粉有何不同？

2．在提取肝糖原实验中，使糖原从溶液中沉淀析出应添加什么试剂？