CODUL EPIGENETIC LA NIVELUL ADN:

5-METIL-CITOZINA I PROCESELE DE METILARE ADN

Primul cod epigenetic descifrat, denumit sugestiv “primadonna epigeneticii” (Vanyushin,

2006), a fost pattern-ul metilrii ADN. În mod evident, numeroasele controverse legate de
acceptarea noului domeniu al epigeneticii au fost dezbtute în jurul comparaiei dintre modificarea
genetic sau mutaia din cadrul secvenei nucleotidice ADN i o modificare aparent minor, de
alchilare a resturilor de citidin cu o grupare chimic alctuit dintr-un atom de carbon, grupa metil
(-CH3).
Dei de cca 50 de ani se cunoate faptul c în cadrul ADN eucariot exist o fracie variabil
coninând resturi de citidin, adenin i guanin metilate, metilarea ADN la eucariote a reprezentat
mult timp o aa-numit “cutie neagr” dificil de descifrat. Absena aparent a metilrii, observat în
perioada de început a dezvoltrii domeniului epigeneticii la unele organisme, cum ar fi drojdiile
(genul Saccharomyces) sau musculia de oet (Drosophila), a determinat pe unii cercettori s
speculeze faptul c aceast modificare a bazelor nu ar juca un rol central în viaa celulei eucariote.
Semnificaia funcional a metilrii ADN la vertebrate a fost deseori pus la îndoial de existena
datelor privind lipsa acestui proces la organismele model amintite. Genomul de la Drosophila
melanogaster de exemplu, prezint un reglaj genic care nu se pe bazeaz pe dinamica unui pattern
de metilare ADN, ci pe activitatea unor factori de remodelare ai cromatinei, precum modificarea
histonelor i a complecilor proteici non-histonici i, recent descoperit, sistemul ARN de
interferen. Lipsa unei tehnologii sensibile de detecie a nivelului extrem de sczut de metilare
ADN la acest organism de referin eucariot, la începuturile dezvoltrii domeniului epigeneticii,
explic numeroasele controverse raportate în acea perioad legate de rolul deosebit pe care unii
specialiti îl sugerau pentru procesele de metilare ADN în reglarea genic.
În prezent, tehnologia a evoluat cu o vitez impresionant i este capabil s detecteze
modificri epigenetice minore, care preau iniial neglijabile sau fr importan, dar care au cptat
o semnificaie crucial în toate procese vitale. Detectarea recent a enzimei ADN metiltransferaza
chiar la organismul controversat, Drosophila, a demonstrat în plus importana proceselor de
modificare a ADN prin metilare, cel puin în etapele timpurii ale embriogenezei (Lyko, 2002).
Studiile dinamicii metilrii ADN la o multitudine de organisme superioare au relevat faptul
c acest proces nu este pur i simplu decorativ, astfel precum nici o structurile asociate acestui
proces de modificare epigenetic precum secvenele repetitive ADN nu sunt meninute întâmpltor
de organismele vii în evoluie; ele nu s-au dovedit a fi inutile (“egoiste” sau“selfish”, nefolositoare
sau “junk”). Numeroase dovezi experimentale s-au strâns timp de cca 4 decenii i pledeaz pentru
corelaia dintre procesul citodiferenierii i variaiei fenotipurilor celulare din esuturile specializate
ale organismelor eucariote i modificarea aparent minor a bazelor prin ataarea grupei metil. O
astfel de corelaie a fcut posibil sugerarea i ulterior implementarea noului concept de “gen”;
acesta s-a îmbogit prin considerarea alturi de fluxul informaional genetic, i a unui flux
adiional, epigenetic, care este codificat în pattern-uri de modificri covalente ale componentelor

2
cromatinei, dintre care metilarea ADN a jucat un rol central la începutul dezvoltrii noului domeniu
al ereditii.
Dezvoltarea relativ recent a domeniului metilrii ADN pe plan mondial i mai puin în ara
noastr, a cptat un ritm accentuat în ultimele dou decenii mai cu seam prin dezvoltarea
cercetrii expresiei genelor în domeniul biologiei dezvoltrii i al transgenezei; noul nivel
informaional a reuit s aduc numeroase explicaii i soluii problemelor majore legate de
dezvoltarea normal i patologic a organismelor eucariote impunând o abordare nou proceselor
evoluiei acestor organisme complexe. Cerinele domeniilor menionate au obligat orientarea
cunoaterii tiinifice ctre înelegerea la nivel molecular a expresivitii genelor eucariote în
corelaie strâns cu factorii endogeni, ereditari i cu cei exogeni, ambientali.

1. METILAREA ADN: UN PROCES FIZIOLOGIC

Metilarea ADN reprezint un termen generic pentru procesele de modificare a resturilor

de baze azotate (adenina, citozina, guanina) din cadrul macromoleculei ADN. Modificarea const
într-o reacie de alchilare (de adiie a grupei funcionale metil: -CH3) la nivelul bazelor azotate
(reprezentate prin inele heterociclice). În urma reaciei, gruparea metil substituie un atom de
hidrogen, aflat iniial într-o legtur covalent cu un atom de C, O sau N. Aadar, metilarea este un
proces de transformare a bazelor majore ale macromoleculei ADN în baze minore.

Fig. 4. Reprezentarea orbitalic a structurii bazei majore (Citozina, C) i a bazei minore (5Mecitozina, 5MeC)

3
 Compusul metilat poate fi rezultatul unei interacii directe cu un agent chimic alchilant sau
poate fi consecina unei reacii endogene enzimatice de transfer al grupei metil de la un donor, la
un rest de baz azotat. Aceasta din urm este denumit i "metilare biologic". Cu alte cuvinte,
metilarea poate avea loc în urma aciunii unor ageni chimici alchilani exogeni, în anumite condiii
- nefiziologice - de reacie sau în urma aciunii unei enzime specifice, endogene, în condiii naturale
- fiziologice. Domeniul epigeneticii studiaz rolul biologic al fenomenului natural de metilare a
ADN. Descifrarea sa se bazeaz pe corelaiile procesului biochimic, enzimatic cu aspectele
structurale ale ADN liber implicat în conformaiile cromatinice i cu aspectele de variaie a
expresiei genice.
Conform unei clasificri actuale, formele cele mai comune ale metilrii ADN produse într-o
activitate chimic sunt reprezentate de O6-metilguanina i derivaii si, iar cele produse în urma
activitii enzimatice sunt: N6-metiladenina, N4-metilcitozina i 5-metilcitozina. Confuziile care
pot persista în prezent au la baz faptul c, relativ la cele dou tipuri de activiti - chimic i
biologic - se cunosc, respectiv, dou tipuri de enzime diferite. Astfel, în cadrul proceselor de
reparare a resturilor de ADN alchilate chimic acioneaz o categorie aparte de ADN
metiltransferaze, ce include enzima mamalian O6-metilguanin-ADN-metiltransferaza (referitor
la aceasta, terminologia actual specific, de altfel, denumirea de ADN-metiltransferaz de
reparare) (Laird i Jaenisch, 1996).
Cu toate c alchilarea chimic i rolul enzimei reparatorii s-au dovedit a fi deosebit de
relevante în carcinogenez, acest proces este în mod uzual tratat separat de procesul natural,
observat în ADN eucariot, care se refer la producerea enzimatic a bazelor minore menionate
anterior. Moleculele cheie ale procesului biochimic de metilare ADN sunt deci ADN
metiltransferaza (DNMTaza), enzima cu rol de catalizator al reaciei de transfer al grupei metil ,
substratul – dubla elice ADN i "donorul" grupei metil, S-adenozil- metionina (SAM sau
AdoMet).
Dintre bazele azotate metilate biologic, 5-metilcitozina (5mC) este cel mai frecvent
detectat în punctele “fierbini” ale de reglajului genic, fapt pentru care a fost sugerat ideea
implicrii sale în funcionarea nivelului informaional epigenetic. S-a dovedit totodat c
resturile de citidin metilat sunt purttoare ale unui potenial mutagen important: în anumite
condiii structurale i funcionale ale ADN, modificarea minora (C - 5mC) are capacitatea de a se
transforma într-o modificare major dramatic, a însi secvenei de baze , prin tranziiile C – U -
T; acestea din urm reprezentând alterri eseniale în funcionarea nivelului informaional genetic.
Transformarea modificrilor epigenetice în modificri genetice poate fi datorat fie deaminrii
spontane (favorizat de temperatur i pH) a citozinei sau a 5-metilcitozinei, fie deaminrii
enzimatice, catalizate de aceiai ADN(citozin-5)-metiltransferaz, care poate deveni mutagen prin

4
modificarea specificitii de reacie. Deoarece astfel de procese pot avea loc în condiii de reacie
specifice este evident c descifrarea lor la nivel biochimic i enzimatic este de importan major în
controlul i prevenirea efectelor dramatice, mutagene. Aceste aspecte ale enzimologiei metilrii
ADN vor fi prezentate în capitolele urmtoare privind componentele i mecanismul reaciei
biochimice de metilare ADN cât i controlul acesteia în condiiile variaiei concentraiei i
specificitii activitii reactanilor.

2. BIOCHIMIA METILRII ADN

Reacia biochimic de metilare ADN

Componentele i etapele reaciei de metilare ADN

Metilarea ADN este o reacie enzimatic de introducere a grupei metil (-CH3) în poziia C-5
a inelului pirimidinic de citozin. Reacia este catalizat de enzima (enzimele) ADN (citozin-5)-
metil-ransferaza (e) (EC 2.1.1.37) (Szyf, 1996 i 1994; Bestor i Verdine, 1994; Wu i Santi, 1985
i 1987). Ecuaia general a reaciei de transfer a grupei metil este redat în Fig.5,6.

Fig. 5. Reacia de metilare a unui rest de citozin din cadrul ADN . Reacia este realizat în prezena unui donor de
grupe metil, S-adenozin metionina (SAM sau Ado-Met) i este catalizat de ADN metiltransferaza (DNMTaza)

Reacia de metilare a ADN se desfoar conform unei scheme comune reaciilor

enzimatice, în care coeficientul Michaelis-Menten este decisiv (Santi i colab., 1984). Astfel, grupa
-SH aparinând aminoacidului cistein din cadrul structurii enzimei responsabile de metilarea ADN
(ADN metiltransferaza, prescurtat: DNMTaza sau DNMT) exercit un atac nucleofil asupra
atomului de carbon din poziia 6 a inelului pirimidinic al citozinei; rezultatul acestui atac este
formarea unui intermediar covalent între enzim i ADN. Protonarea ulterioar a citozinei conduce
la obinerea unui derivat 4,5 enaminic al citozinei, care, la rândul su, atac gruparea chimic metil
din cadrul structurii cofactorului donor, S-adenozil-metionina (SAM sau AdoMet). Dup transferul
grupei metil, are loc stabilizarea structurii restului de citidin prin eliminarea unui proton i
formarea unei legturi duble (C = C). La sfâritul reaciei, enzima se reface printr-o reacie de
ß- eliminare (Santi i colab., 1984; Chen i colab., 1991) (Fig.9).

5
 Fig. 6. Reacia biochimic a transferului grupei metil din cadrul structurii S-adenozilmetioninei (SAM), în cadrul
inelului pirimidinic al citozinei; reprezentarea structurilor participanilor la reacia de metilare a restului de citidin:
substrat (rest citidin); produs: rest de 5-metil citidin (5mC); ADNmetiltransferaza (DNMT); donorul de grupe metil
SAM trece în urma reaciei de cedare a grupei chimice metil în produsul su - SAH (S-adenozil homocistein)

Smith i colaboratorii (1994), au propus urmtoarele etape în reacia enzimatic de metilare a

restului de citidin din cadrul ADN:

(a) formarea, în cadrul macromoleculei ADN, a unei structuri secundare adecvate intirii de
ctre DNMTaza a restului de citidin; o astfel de structur propice aciunii enzimei, se formeaz
frecvent în secvene repetitive dinucleotidice (CpG)n (Fig.8);

(b) pregtirea structural a reactanilor:

substratul – inelul pirimidinic al restului de citidin (în cadrul structurii sale,
pH-ul acid determin redistribuirea efectelor electronice, cu favorizarea unui atac
nucleofil în poziia C-5 ) (Fig.9) i

donorul de grupe metil - S-adenozil metionina (AdoMet sau SAM), la

nivelul cruia are loc labilizarea legturii ce implic grupa -CH3 (Fig.9);

6
Fig. 7. Rsucirea restului de citidin înspre exteriorul dublei elici ADN, determinat de particularitile structurale ale
secvenelor repetitive dinucleotidice CpG, reprezint o cerin fireasc a accesibilitii acestuia pentru aciunea enzimei

(ii) recunoterea i legarea specific a celor dou componente eseniale ale reaciei de
metilare enzimatic: ADN-rest citidin i enzim (Fig.9-11);
(iii) clivarea i transferul grupei-CH3 din structura donorului, în poziia C-5 a inelului
pirimidinic (Fig.9);
(iv) stabilizarea unei legturi covalente formate într-o nou structur (5-metilcitozina),
eliberarea S-adenozil homocisteinei (SAH) i a enzimei în mediul reactanilor (Fig.9).

Fig. 8. Mecanismul reaciei de transfer al grupei metil în inelul pirimidinic al restului de citidin. Se evideniaz legtura
format în condiiile pH-ului acid, dintre enzim i substrat (inelul pirimidinic al citozinei), prin intermediul grupelor SH-
ale restului de cistein (cys) din structura enzimei în poziia C6 i formarea legturii C5-grupa metil (-CH3)

Fig. 9. Structura orbitalic (van der Waals) a unui fragment ADN dublucatenar coninând un rest de citidin
nemetilat (rsucit pentru a fi metilat)

7
 Fig. 10 Structura orbitalic a donorului grupelor metil, S-adenozil-metionina (SAM)

Fig. 11. Fragment ADN dublucatenar coninând un rest de citidin metilat (5mC)

(a) (b)

Fig. 12. Structura orbitalic (a) i perspectivic (b) a complexului format din reactanii ADN (rest de citidin:
galben), enzima ADN metiltransferaza-alb i donorul grupei metil (SAM)-rou

8
Enzimologia metilrii ADN:

Dup cum s-a specificat în partea introductiv, metilarea ADN reprezint un proces major în
cadrul modificrilor native, fiziologice ale genomului eucariot, difereniindu-se de acele modificri
induse prin intermediul aciunii agenilor chimici. Dei ambele tipuri de modificri implic
introducerea, în cadrul macromoleculei ADN, a grupelor metil (-CH3), ele se difereniaz prin
intermediul reaciilor implicate, cât i prin enzimele catalizatoare ale acestora. Agenii chimici
(exogeni) au capacitatea de a aciona direct asupra macromoleculei ADN i de a utiliza potenialul
lor reactiv pentru a realiza o reacie de substituie în inelele purinice (în special) sau pirimidinice ale
ADN, alese oarecum randomic. Dimpotriv, metilarea ADN ca proces natural, fiziologic este o
reacie biochimic endogen mult mai complex, care trebuie s fie extraordinar de bine coordonat
cu procesele de structurare a cromatinei. Acestea din urm mediaz, de altfel, aciunea semnalelor
exogene, ambientale i colaboreaz cu semnalele endogene, ereditare, complicând i mai mult
tabloul factorilor epigenetici de remodelare a cromatinei.
Modificarea chimic indus direct de factorii exogeni în cadrul ADN antreneaz, la rândul
su, tot un efect fiziologic, controlat îns de procese biochimice implicând enzime reparatorii
specifice leziunii ADN introduse, ceea ce determin uneori confundarea celor dou procese de
modificare ADN amintite (chimic i biochimic).
Metilarea ADN se refer, dup cum s-a menionat, strict la procesul biochimic, endogen,
controlat de enzime (metilaze) specifice i mediat de structura genomului eucariot: nucleozomul.
Modificarea ADN printr-un astfel de proces nu este aleatoare i nici dependent de aciunea
agenilor chimici exogeni, ci este un proces nativ extraordinar de bine coordonat în cadrul
ansamblului de remodelare a conformaiilor cromatinice. Aceste procese de remodelare
conformaional stau de altfel la baza exercitrii celor dou funcii bine cunoscute ale informaiei
genetice: replicarea i transcrierea.
Aadar, metilarea ADN este controlat atât de factorii endogeni, cât i de factorii exogeni.
Ea este o modificare epigenetic, independent de secvena nucleotidic ADN. În schimb, ea
depinde de etapa de dezvoltare a organismului i de esut. Este deci un proces de control al
expresiei spaio-temporale a unei anumite gene. Luate în ansamblu, la nivel genomic, fiecare gen
prezint un pattern de expresie în cadrul fiecrui tip celular, respectiv tip de esut. Pattern-urile de
expresie specifice sunt înglobate într-un pattern global fenotipic, care controleaz dezvoltarea unui
organism întreg. Prin aceasta, procesul metilrii ADN capt o importan vital în dezvoltarea
normal a organismelor eucariote complexe, aspecte care vor fi prezentate în detaliu în paragrafele
urmtoare.

9
 În termeni biochimici, considerentele enunate anterior implic activarea unor enzime
specifice, denumite metilaze, în etape bine definite ale dezvoltrii. Deoarece metilarea ADN nu
reprezint un mod unic de codificare a informaiei epigenetice, enzimele implicate în modificarea
ADN se afl în interacie cu enzimele efectoare ale remodelrii conformaiei cromatinei.
În concluzie, componentele fibrei cromatinice (complexului nucleohistonic), sunt descrise
separat, abordarea fiind didactic mai clar, dar activitatea lor de efectori ai remodelrii conformaiei
cromatinei nu are loc decât sinergic i în concordan cu programele epigenetice specifice etapei de
dezvoltare i esutului. Fiecare din biomoleculele – catalizatoare ale reaciilor biochimice prin care
are loc modificarea ADN sau a histonelor, au parteneri de interacie din cadrul componentelor
cromatinice, alctuind un aa-numit cod epigenetic. Azi este din ce în ce mai clar faptul c
informatia ereditara, iniial presupusa a fi codificata doar la nivelul secvenei ADN, s-a complicat în
nivele interdependente. Astfel, s-a demonstrat existena unui cod independent de secventa ADN,
definit de distributia resturilor de 5mC din cadrul ADN; acesta comunic prin intermediul unor
interacii cu proteine speciale (proteine cu afinitate pentru ADN metilat) cu un alt cod epi-genetic
(independent de secventa ADN), definit de situsurile modificate covalent
(metilate/acetilate/deacetilate etc.) din cadrul histonelor. Domeniile funcionale ale acestor din
urm componeni cromatinici, intr în interacii specifice cu domenii bine definite ale unor
compleci proteici cu rol de stabilizare a conformaiilor cromatinei, pentru stri transcripionale
active/inactive. Aceast cascad de evenimente biochimice înglobeaz în prezent i o reea de
molecule cu dimensiuni mici, la fel de informaionale pentru transcriere, replicare i structurare a
cromatinei, denumite sugestiv - ARN de interferen.
Odat stabilit importana acestor factori de remodelare a cromatinei în dezvoltarea normal
a organismelor eucariote, o problem major a cercettorilor în domeniu rmâne elucidarea
interaciilor dintre factorii epigenetici menionai i ierarhia lor în procesul integral al remodelrii
cromatinei. De altfel, dilema cauzalitii care a marcat întreaga dezvoltare a domeniului metilrii
ADN i care nu pare a fi elucidat în mod foarte clar, este stabilirea ierarhiei interaciilor complexe
menionate. Cu alte cuvinte, metilarea ADN este o cauz, sau un efect al silenierii semnalizate în
prealabil prin conformaia cromatinei? Factorul dominant al proceselor de remodelare a cromatinei
în conformaii active/inactive transcripional a fost cel mai frecvent demonstrat în literatura de
specialitate. Rezultatele obinute pân în prezent pledeaz îns pentru un tablou de ansamblu,
alctuit din factorii de remodelare ai conformaiei cromatinice, în cadrul cruia procesele de
metilare ADN ar ocupa un loc major în procesele de sileniere pe termen lung.
Enzimologia metilrii ADN implic discuia deopotriv a substratului, enzimelor efectoare
cât i a cofactorului donor de grupe metil, SAM. În funcie de specificitatea de substrat, enzimele

10
pot prezenta specificitate de activitate, iar concentraia donorului SAM este absolut critic pentru
activitatea nativ (de transferaz) sau aberant (mutagen, de deaminaz) a metilazelor.

Substratul reac
iei enzimatice de metilare ADN

Substratul ADN al reaciilor de metilare este reprezentat în primul rând, dup cum s-a
menionat anterior, de secvenele repetitive dinucleotidice CpG. Acestea pot fi dispuse simetric sau
asimetric, ceea ce implic activarea de enzime specifice. De asemenea, secvenele repetitive CpG
pot fi împrite în doua clase majore: (i) clasa secvenelor CpG din cadrul promotorilor de gene cu
expresie specific de esut, care în mod evident cunoate o dinamic a proceselor de
metilare/demetilare dependent de etapa de dezvoltare i de condiiile ambientale i (ii) o clasa
aparte, denumit “insule CpG”, tocmai pentru a se sublinia caracterul stabil, nemetilat pe care
trebuie s îl adopte în mod normal aceste secvene în orice tip de celul, în orice condiii ambientale
- pierderea proteciei fa de aciunea metilazelor în aceste insule conduce la o metilare aberant,
asociat frecvent cu mecanismele patogene din cancer. Clasa insulelor CpG este prezent evident în
promotorii genelor a cror expresie este vital în orice tip de celul; astfel de gene sunt denumite
“gene housekeeping” sau, conform unei traduceri sugerate în limba român, gene vitale pentru
creterea celular.
Distribuia 5-metil citozinei i concentraia sa relativ la totalul sit-urilor (metilate i
nemetilate) prezint specificitate de esut i de specie (Gama-Sosa i colab., 1983). Un exemplu al
specificitii de esut observat la nivelul general de metilare ADN, este reprezentat de valorile
concentraiei relative (%) a 5mC, determinate prin metoda de analiz a metilrii globale,
cromatografia în lichide la presiune înalta – HPLC. S-a observant c în esuturi normale valoarea
concentraiei relative variaz între 0,76% i 1,00% (Ehrlich i colab., 1982).
Analiza secvenelor repetitive dinucleotidice CpG a relevat, pe de alt parte, faptul c
ponderea acestora reprezint cca 25% din totalul ADN la vertebrate. Cunoscându-se, de asemenea
procentul de cca 21% ca fiind reprezentativ pentru baza major, citozina (C) i c, baza minor
corespunztoare, 5mC, este localizat în secvenele amintite anterior, se poate estima un nivel de
metilare al secvenelor CpG din esuturile umane somatice normale variind între valorile 79%,
pentru ADN extras din esutul cordial, i 91%, detectat în ADN extras din timus. Dimpotriv, prin
comparaie, esuturile specializate pentru reproducere (placentar i testicular) prezint o
hipometilare general. În secvenele CpG ale acestor dou tipuri de esuturi s-au detectat nivele de
metilare doar în proporie de cca 69% i, respectiv, 76%. Pentru o astfel de situaie s-a sugerat
reflectarea descendentei trofoblastice pentru placent i originea germinal a esutului spermatic.

11
 Informaiile referitoare la creterea nivelului de metilare în moleculele de ADN cu un
coninut ridicat în secvene de tipul (5’)CpG(3’) au condus la ipotezele iniiale - referitoare la
specificitatea de substrat a enzimei ADN (citozina-5)-metil transferaza. Acestea au indicat faptul c
resturile de citidin modificat sunt întotdeauna localizate la ADN eucariot lâng resturile de
guanin, pe aceeai caten, în cadrul secvenelor de tipul (5’)CpG(3’), unde p reprezint legtura
3’-5’ fosfodiesteric dintre nucleotidele adiacente. Aceast preferin se explic prin structura
specific a secvenelor repetate Pu-Py, care determin rsucirea inelului pirimidinic într-o poziie
extrahelical, accesibil aciunii enzimei (Fig.). .
La ADN provenit de la animale (vertebrate), 5mC s-a detectat cu precdere în secvene
5mCpG. Studiile comparative iniiale ale moleculelor ADN extrase din diferite surse animale au
relevat urmtoarele reguli de distribuie intragenomic a siturilor 5mc (Romanov i Vanyushin
1981):
(a) la toate speciile de animale studiate, genomul a fost metilat neuniform, un numitor comun al
tuturor regiunilor metilate fiind reprezentat de 5mC; s-a observat prezena acestui rest metilat în
toate tipurile de secvene nucleotidice care prezint un anumit grad de repetiie;
(b) dinamica metilrii acestor situri a fost caracterizat astfel: cea mai mare cantitate de 5mC este
gsit în secvenele înalt repetitive, cum sunt palindroamele i ADN satelit, în timp ce secvenele
unice sunt cel mai puin metilate; de asemenea,
(c) i în secvenele moderat repetate, în anumite fracii ale acestora, s-a constatat o anumit variaie
a gradului de metilare.
Aceste caracteristici ale metilrii genomului au fost verificate la vertebrate înc din anul
1981 prin determinarea distribu iei intragenomice a secvenelor CpG(5mCpG) (Romanov i
Vanyushin 1981).
Numeroase alte date experimentale au dovedit c metilarea ADN poate avea loc i în
secvene non-CpG. Astfel, la ADN de oarece, 5mC a fost detectat în toate secvenele
dipirimidinice coninând citozin, inclusiv 5mCp5mC (Vanyushin, 1984). Sneider (1980)
menioneaz faptul c s-a izolat dinucleotida 5mCpT din ADN de celule coninute în hepatom
Novikoff i c, în cadrul acestui esut, 5mC s-a detectat nu numai în secvene Cp5mCpGpG, dar i
în secvene 5mCpCpGpG. În ADN pentru globina uman, 5mC a fost localizat în secvenele
5mCpCpGpG sau 5mCp5mCpGpG (van der Ploeg i Flavell 1980).
Tot la mamifere s-a detectat o activitate a unei MTaze cu specificitate mare pentru secvene
repetitive în care era implicat restul de citidin, însa diferite de cele dinucleotidice descrise anterior
(ale CpG) (Clark, i colab., 1995). Acestea pot forma suprastructuri în forme specifice de tip "ac de
pr", uor recunoscute de MTaz, cu care pot da natere la interacii stabile. Preri actuale asociate
cu repetiiile de secvene care conin restul de citidin se refer frecvent la un proces numit

12
"slippage" replicativ: prin intermediul acestuia poate avea loc o cretere sau scdere a numrului
de repetiii ale unei anumite secven e, fenomen deosebit de mult speculat în screening-ul
populaional i în cazul deteciei purttorilor de premutaii în gena FMR1, corelat cu fenomenul X
fragil.
Un astfel de fenomen este corelat în prezent cu modificarea expresiei genice a genelor care
conin repetiiile menionate, în funcie de numrul acestora i cu instabilitatea cromozomilor în
regiunile bogate în astfel de repetiii. Efectul variaiei numrului de repetiii poate fi dramatic în
ceea ce privete expresia corect a genei i poate deci iniia un mecanism patogen (azi sunt dovedite
astfel de fenomene de slippage replicativ cu trinucleotide implicând restul de citidin în bolile
neurodegenerative). Având de asemenea în vedere faptul c repetiiile de trinucleotide odat
crescute ca numr pot fi transmise pe linie germinal, la descendent, în decursul vieii cruia,
numrul de repetiii putând s continue ritmul de cretere, se poate trage un semnal de alarm
privind riscul acestor fenomene de slippage replicativ asociate eventual cu condiiile ambientale, cu
stilul de via al genitorilor, pentru a fi responsabili pentru sntatea descendenilor lor.
Un alt tip de secvene preferate pentru activitatea DNMTazelor au fost detectate prin
secvenierea genomului eucariot i au fost numite sugestiv insule CpG. Acestea sunt nemetilate la
organismele dezvoltate normal, metilarea lor fiind considerat aberant i denumit
„hipermetilarea ADN”; acest proces este corelat cu devierea programului genetic ctre patogenez;
literatura de specialitate privind cancerul a adunat de peste un deceniu numeroase dovezi privind
fenomenele de hipermetilare implicând insulele CpG, în prezent fiind demarat un program de
anvergur mondial pentru cartarea acestor insule critice în genomul uman pentru a fi monitorizate
în schemele de diagnostic i tratament (Clark i Wall 1996, Jones, 199, Feinberg, 2000, Szyf, 2001,
Esteller, 2005, 2007, 2008).
Existena insulelor CpG este considerat în prezent un nou nivel informaional, degenerat
din cel epigenetic: codul su este înscris în distribuia insulelor CpG din promotorii de gene vitale
(housekeeping) i în dinamica metilrii acestora (de los Rios i colab).
Insulele CpG i nivelul de metilare în cadrul acestora pot fi considerate factori de
difereniere a promotorilor în cadrul genomului mamalian. Un pachet informativ bogat din literatura
de specialitate pledeaz pentru distingerea a dou categorii de promotori, pe baza criteriului
amintit. O fracie a genomului mamalian reprezentând cca 40% este caracterizat, astfel printr-un
coninut C+G i pattern de metilare variabil similar cu întregul genom, secvenele repetitive ale
dinucleotidei CpG prezentând proprietile epigenetice ale unei pari mari genomice, denumit
“bulk” ADN sau, adaptat la terminologia limbii române, simplu ADN genomic. Cealalt fracie,
reprezentând cca 60% din ADN genomic, este asociat fraciei de “insule CpG”, regiuni distincte
de repetiii ale dinucleotidei CpG care se remarc prin dou proprieti importante: (i) coninut C+G

13
mult mai mare fa de media genomic i (ii) starea de de metilare constant în condiii de
normalitate. Orice proces de activare a ADN metiltransferazelor în insulele CpG este considerat
aberant i asociat cu patogeneza în general i cancerogeneza, în particular. Dac primei grupe de
secvene repetitive CpG i s-au atribuit doar gene cu expresie specific de esut, în cea de-a doua
grup s-au inclus atât genele vitale (house-keeping), cât i numeroase gene specifice de esut (sau,
mai corect, gene cu expresie specific de esut).
Studiul relaiilor amintite anterior, dintre tipul de promotori, genele implicate i gradul de
metilare al insulelor CpG s-a realizat de ctre grupul Antequera (Spania, CNIO-Centrul National de
Investigaii Oncologice). Modelele experimentale comparative au inclus genele murine i cele
umane omoloage, care au prezentat un grad înalt de conservare din punctul de vedere al organizrii
genomice, secvenei nucleotidice i pattern-ului de expresie. Rezultatele au sugerat un mecanism
molecular diferenial al activitii promotorilor din cele dou grupe menionate: acetia se disting
prin intermediul interaciilor de tip protein-ADN. Astfel, la ambele modele experimentale s-a
observat un aspect comun al interaciei amintite, referitor la regiunile cuprinse între secvenele
demarcatoare ale insulelor CpG la capetele 5’ i situsurile de iniiere a transcrierii. Dac
observaia anterioar s-a referit la funcia de transcriere a ADN, o alt observaie interesant relativ
la aceste experimente a vizat corelaia dintre procesele de metilare ADN i o alt funcie vital a
ADN: replicarea. Astfel, s-a demonstrat faptul c situsurile de iniiere a replicrii se afl tocmai în
insulele CpG ale promotorilor studiai.
O concluzie veridic a acestor dou observaii se refer la faptul c diferenierea genelor
prin intermediul tipurilor lor de promotori i deci a caracteristicilor epigenetice ale insulelor lor
CpG se realizeaz înc din etapa replicrii ADN. În plus, abordarea tehnicii de imunoprecipitare a
cromatinei a permis descrierea de ctre grupul de cercettori amintit a unei alte observaii
interesante: promotorii colocalizeaz cu originile replicrii, ambele regiuni având insule CpG.
Rezultatul a demonstrat înc o dat ideea avansat anterior, conform creia, în genomul mamalian
ar exista un control epigenetic coordonat pentru iniierea ambelor procese vitale: de replicare
ADN i transcriere selectiv a genelor, conform unui pattern de expresie perstabilit în replicare.
Scenariile propuse de grupul spaniol ar explica tocmai consecinele alterrilor frecvent
amintite în legatur cu atragerea aberant a unei ADN metiltransferaze care este incapabil s
metileze catena nou sintetizat în replicare astfel încât s respecte cu fidelitate pattern-ul de metilare
de pe catena veche; în acest mod metilaza poate modifica pattern-ul de metilare care se va transmite
în toate celulele rezultate din diviziunile ulterioare. Noi runde replicative, în condiiile activrii
enzimei ADN metilaze “de novo” ar conduce, evident, la acumularea alterrilor pattern-ului de
metilare, conducând la modificari corespunztoare în pattern-ul de expresie al seturilor de gene
definitorii esutului considerat (represia promotorilor sau activarea aberant a genelor controlate de

14
genele cu activitate represoare). Astfel de hipermetilri aberante sunt frecvent relatate în literatura
epigeneticii i cancerului.
Studiul mecanismelor de hipermetilare „ne”controlat în cadrul proceselor de replicare i
tumorigenez este dificil din punct de vedere experimental: este necesar punerea la punct a unui
sistem similar celui patogen, capabil practic s recapituleze aciunea unei ADN metilaze “de novo”,
în condiiile normale (când insulele CpG nu sunt implicate în nici o interacie cu enzimele ADN
metiltransferaze). Un sistem experimental reuit totui în sensul optimizrii menionate mai sus se
refer la reprogramarea epigenetic în decursul proceselor de clonare. Modelul include fibroblaste
prelevate din embrioni de oarece i are în vedere studiul susceptibilitii unor gene-candidat fa de
metilarea aberant“de novo” a insulelor CpG i deci inactivrii transcripionale. Elucidarea acestor
aspecte ale embriogenezei corelate cu reprogramarea epigenetic din etapele de dezvoltare care sunt
caracterizate printr-un proces de diviziune i replicare intens, ar rezolva problemele acute legate
de slaba eficien a clonrii mamiferelor i de fenomenele induse de senescen.
Multitudinea de situsuri prezentate sugereaz existena, în celula mamalian, a unui sistem
multicomponent al enzimei ADN metilaza, care prezint numeroase situsuri de recunoatere. În
sprijinul acestei idei a fost adus argumentul bazat pe descoperirea unui tip diferit de ADN metilaz
în nucleii limfocitelor izolate de la vacile suferinde de limfoleucoz cronic; activitatea sa nu se
aliniaz din punct de vedere al proprietilor fizico-chimice i al situsurilor de recunoatere la cea
caracterizat în limfocitele normale (Vanyushin, 1984).
Un screening atent al repartiiei secvenelor dinucleotidice CpG din cadrul genomului uman
nu a reliefat uniformitatea. Ele sunt abundente în “insule CpG” . Acest tip de secvene repetitive nu
prezint o pondere mare în genomul uman, spre deosebire de cellalt grup de secvene repetitive
CpG, slab reprezentat i rspândit în întregul genom. O caracteristic esenial a insulelor CpG, care
a determinat, de altfel i terminologia lor, este faptul c nu reprezint substrat preferenial pentru
enzimele care catalizeaz procesul de metilare. Toate
esuturile somatice normale studiate au
prezentat practic insulele CpG nemetilate sau, în general, cu un grad extrem de mic de metilare, ele
fiind localizate frecvent la capetele 5’ ale regiunilor codificatoare de gene vitale, denumite i gene
housekeeping (Bird i colab., 1985; Jost i colab., 1997).
Statutul “libere de metilare” al insulelor CpG la vertebrate, poate îns s nu fie constitutiv.
Aceste secvene repetitive pot astfel prezenta o variaie în gradul lor de metilare în funcie de etapa
de dezvoltare i de esutul analizat: în esuturile somatice normale postnatale aceste regiuni pot
prezenta un grad înalt de metilare, cu excepia ADN analizat din esutul testicular; acesta din urm
a fost caracterizat printr-o hipometilare accentuat. Genele asociate unei astfel de hipometilri care
nu au fost detectate i în alte esuturi au fost urmtoarele: exonul 3’ al genei pentru apolipoproteina
E umana, promotorul genei pentru histonele specifice esutului testicular de obolan (murin),

15
secvenele spacer Sp-0,3-10 i 23 din gena pentru ARN ribozomal intergenic uman i secvena LTR
din cadrul familiei endogene retrovirale ERV9/Sp-0,3-16 din genomul uman (Choi i colab., 1991;
Di Cristofano i colab., 1995; Gonzales i colab., 1995; Zhang i colab., 1987). Alte esuturi au
prezentat, pe de alt parte, un tip de metilare a insulelor CpG specific pentru unul din cromozomii
X (fie X inactiv, fie Xactiv) (Litt i colab., 1996; Panning i Jaenisch, 1996; Pfeifer i colab., 1990).
Literatura de specialitate raporteaz de asemenea i o metilare specific de esut a insulelor CpG
(Ohgane i colab., 1998; Sadhu i colab., 1997 i Singal i colab., 1997).
La ADN izolat din plantele superioare s-a constatat c doar o fracie mic din 5mC este
localizat în secvene de tipul 5mCpG, o cantitate esenial, în schimb, fiind detectat în mijlocul
sau la capetele 5’ ale oligonucleotidelor pirimidinice (Vanyushin 1984). Astfel, în ADN extras din
porumb 5mC s-a detectat în urmatoarele tipuri de secvene: (i) Pu-5mC-Pu, 5mCpT i
5mCp5mC, (ii) trinucleotidul CpCpC, în care, câte dou resturi de citidin sunt metilate (Kirnos i
colab.1981). Un grad înalt de metilare a restului citidin (80%) a fost întâlnit i în secvenele
trinucleotidice de tipul CXG (CAG i CTG) izolate din ADN de germeni de porumb (Gruenbaum
i colab.1981), dovedite actualmente i în secvenierea genomului vegetal manipulat genetic (Meyer
i colab.1995).

 Simetria situsurilor metilate în dubla elice ADN - o forma a specificitii de substrat a

enzimelor ADN metiltransferaze

Ipotezele iniiale au sugerat faptul c procesul de metilare are loc simetric, în situsurile
descrise anterior, de tipul repetiiilor dinucleotidei CpG. Datele recente au demonstrat prezena
metilrii i în situsuri nesimetrice de tipul trinucleotidelor CpNpG (Meyer, 1995 ; Clark i colab.,
1995). Discuia preferinei manifestate de enzima DNMT pentru situri simetrice/asimetrice poate
avea ca punct de pornire tipul activitii :"de întreinere", respectiv "de novo". Dac prima activitate
necesit un substrat hemimetilat i conduce la o distribuie simetric a situsurilor metilate pe cele
dou catene ADN, cea de-a doua activitate se desfoar pe un substrat complet nemetilat i nu
necesit secvene caracterizate prin simetrie. Aceasta din urma este iniiat de formarea unor
structuri ADN neobinuite, posibil în form de "ac de pr", de ctre repetiiile de trinucleotide
(CAG, CGG etc.).

Atât la mamifere, cât i la plante s-au detectat prin secvenierea ADN situsuri asimetrice,
care, împreun cu cele simetrice, fac parte din substratul de aciune a MTazei în controlul expresiei
genice.

 Gradul de metilare al substratului

16
 Metilarea resturilor de citidin din cadrul dublei elici ADN este catalizat difereniat, în
primul rând, în funcie de gradul de metilare al substratului ADN. S-a detectat astfel o metilaz cu
activitate preferenial pentru substratul ADN hemimetilat (în cadrul cruia secvenele
dinucleotidice CpG sunt dispuse nemetilate pe o caten i metilate pe cealalt caten ADN); ea se
numete enzim de întreinere (maintenance enzyme). Au fost de asemenea descrise i enzime care
prefer un substrat nemetilat (reprezentat prin dispunerea simetric – bifilar - a secvenelor CpG
nemetilate, pe ambele catene ADN), se numete enzim “de novo”. Cele dou secvene sunt
reprezentate în schemele de mai jos:

secvene CpG hemimetilate: 5’ - 5mCpG – 3’ (catena parental)

3’ - GpC – 5’ (catena fiic)

secvene CpG simetrice – nemetilate 5’ – CpG – 3’ (o caten)

3’ – GpC – 5’ (cealalta caten)

Reaciile catalizate de fiecare enzim poart evident denumiri specifice. Procesul metilrii
de întreinere implic enzima “de întreinere” (identificat la mamifere ca DNA methylase 1,
DNMT1); al doilea proces se numete, cum este firesc, ADN metilare “de novo” i este catalizat de
o enzim “de novo”, identificat ca o familie de enzime DNMT3a. Aceste denumiri sunt în
concordan, de altfel cu pattern-ul de metilare al ADN: dac în primul caz acesta este întreinut cu
fidelitate prin activitatea metilazei de întreinere, în cel de-al doilea caz, acesta se modific (cu alte
cuvinte, îi modific distribuia siturilor de 5mC). Este evident efectul difereniat pe care îl au
enzimele DNMTaze asupra transcrierii i deci expresiei genice. În procesele de dezvoltare normal,
aciunea lor în etape bine definite i cataliza realizat în condiiile fiziologice, normale, conduce la
stabilirea unui pattern ADN corect. Aciunea aberant a uneia din enzime, cum este cea a metilazei
“de novo” în celule somatice de exemplu, este improprie i poate conduce la modificarea aberant a
pattern-ului metilrii ADN în esutul asociat celulelor respective, proces însoit frecvent de iniierea
mecanismelor patogene (Ehrlich, 2003).

 Relaia dintre activitatea metilazic i procesul replicativ

O alt deosebire dintre cele doua procese de metilare i, corespunztor, dintre cele dou tipuri
de enzime care le catalizeaz, este corelat cu funcia replicativ a ADN. DNMT1 face parte din
complexul de enzime replicative, intervenind în bifurcaia de replicare imediat dup formarea dublei
catene ADN-fiice. Prin aceasta, procesul de transmitere conservativ, cu fidelitate a pattern-ului de
metilare este dependent de replicare: matria pattern-ului de metilare de pe catena veche (parental)
ADN este astfel copiat fidel de ctre metilaza de întreinere, pe catena nou sintetizat (catena-

17
fiic), a crei secven, ramâne îns complementar catenei vechi. În anumite etape ale dezvoltrii,
în decursul proceselor adaptative sau chiar în embriogeneza timpurie, activitatea metilazei de
întreinere este blocat de anumii inhibitori; ADN format rmâne astfel, dup cateva runde de
replicare complet demetilate. Procesul este dependent de replicare i se numete demetilare pasiv.
În paragrafele ulterioare se va prezenta o enzim demetilaz cu aciune direct de demetilare ADN.
Procesul de demetilare devine, în acest caz, activ.
Metilaza “de novo”, nu are o matri de copiat; ea acioneaz pe un substrat ADN care nu
prezint un pattern de metilare, este complet demetilat; spre deosebire de enzima de întreinere,
metilaza de novo este independent de replicare. Dup unii autori, ea necesit, în schimb, o
colaborare cu o alt enzim, capabil s demetileze substratele metilate ADN, printr-o activitate
5mC-ADN glicozilazic (Bhattacharaya i colab., 1999; Gjerset i Martin, 1982; Jost, 1993), posibil
în interacie cu o alt protein, cu afinitate specific pentru ADN metilat (Hsieh, 1997).

 Tipul de activitate metilazic la nivelul ADN este specific etapei de dezvoltare

Procesele de metilare ”de novo” i de demetilare ADN, ca i procesele de întreinere a
pattern-urilor de metilare au loc în etape diferite ale dezvoltrii organismului eucariot. Astfel,
activitatea de novo i de demetilare sunt considerate normale în etapele timpurii ale
embriogenezei. Activitatea enzimelor corespunztoare, ADN metilazele din familia DNMT3, este
activat firesc în etapa embriogenezei timpurii, când este nevoie de stabilirea unui pattern de
metilare nou, specific individului în formare. Pe de alt parte, genomul haploid al genitorilor vine
cu o specializare aparte, necesar controlului proceselor de reproducere, el prezentând în faza de
pronuclei, un pattern de metilare corespunztor nivelului su înalt de specializare.
Este tiut faptul ca genomul gameilor este pregtit în decursul dezvoltrii genitorilor înii
printr-un program epigenetic de imprinting genomic. Genomul lor este marcat în alele parentale
corecte, necesare meninerii în celulele somatice ale descendentului a unei expresii dependente de
sex. O marcare greit prin modificri epigenetice atât la nivelul ADN, cât i la nivelul histonelor,
care nu ine cont de acest pattern de expresie în descenden, poate rezulta în stabilirea ulterioar de
programe epigenetice alterate în embriogenez.
Sunt raportate deja în literatura de specialitate astfel de greeli de programare, cu efecte
dramatice asupra dezvoltrii urmailor. Pentru ca procesul de stabilire a programului epigenetic
specific gametogenezei s aibe loc adecvat, în aceast etap critic a dezvoltrii aparatului
reproductiv intervine aciunea unor ADN metilaze specifice etapei; o astfel de metilaz este
denumit DNMT3L: ea face parte din familia DNMT3, a metilazelor de novo.
Pentru ca genomul gameilor ce contribuie la formarea genomului diploid al unui embrion
descendent s poat s se implice în faza de recombinare, trebuie s sufere modificri drastice în
genotipul i epigenotipul su. Are loc deci o reprogramare atât genetic, dar i epigenetic în etapa
fecundrii gameilor i formrii prin recombinare a unui genotip nou. Epigenotipul celulei - ou
sufer reprogramri succesive pân la formarea embrionului, etape caracterizate prin intervenia
enzimelor metilaze cu preferine pentru anumite substrate ADN. Motivaia acestor succesiuni de
programe epigenetice este asociat cu “instruciunile” variate pe care le primete zigotul în procesul

18
de pregtire pentru formarea unui genotip i a unui program unitar de dezvoltare valabil pentru
întregul organism al descendentului.
O prim “instruciune” a programului epigenetic în formare este cea referitoare la tergerea
programelor epigenetice ale genitorilor. O atare operaie poate avea loc prin îndeprtarea grupelor
metil din siturile critice ale pronucleilor, iar acest proces poate avea loc fie printr-o demetilare
pasiv, fie printr-un proces activ de demetilare, respectiv de îndeprtare a grupelor metil din siturile
critice ADN. În acest mod celula-ou (zigotul) pregtete genomul su nou format pentru stabilirea
unui pattern individual de dezvoltare. Are loc practic un proces de demetilare genomic global,
care se desfoar în mai multe etape, pân la faza de blastocist.

Fig. 13. Substrate ADN nemetilate/metilate i hemimetilate pentru activitatea preferenial a enzimelor ADNMT
(DNMT1 i DNMT 3a i 3b)

Marcajele epigenetice care au fost utilizate în pattern-uri specifice de ctre genomul fiecrui
genitor sunt astfel terse, lsând loc pentru un pattern nou, specific individului în formare. Dac
acest proces de tergere a memoriei celulare din gamei are loc cu erori, unele marcaje epigenetice
pot rmâne în mod aberant la nivelul unor alele care s determine activarea/inactivarea
necorespunztoare imprintingului sexului descendentului. Pot aprea astfel aa numitele boli rare,

19
care nu sunt explicate prin teoria mendelian a segregrii, ci prin erorile de tergere/remetilare a
patternurilor specifice de expresie în descenden.
Rezultatul acestor etape de demetilare care dureaz pân la stadiul de blastocist este un
ADN nemetilat, preferat deci ca substrat de metilazele “de novo”. Acestea se activeaz cu precdere
în aceast etap a embriogenezei, pentru a contribui la stabilirea unui pattern nou de metilare,
specific individului în formare. Etapa de demetilare este astfel urmat de o etapa de remetilare
masiv pentru stabilirea pattern-ului individual de expresie. În concluzie, în etapa timpurie a
embriogenezei au loc procese de demetilare masiv, în care se implic evident fie activiti
demetilazice pasive (DNMT1 inhibat în runde succesive de replicare), fie demetilaze active,
independente de replicare. Dovezile experimentale au sugerat implicarea în formarea pattern-ului de
metilare, concomitent atât a unei metilaze de novo cât i a unei demetilaze active (Szyf, 1999).

Fig.14. Reprezentarea substratului hemimetilat i nemetilat. Efectul metilrii celor doua enzime este diferit din
punctul de vedere al pattern-ului de metilare rezultat: metilaza de întreinere transmite fidel pattern-ul de replicare
de pe matria catenei parentale; metilaza de novo modific pattern-ul de metilare pe cele doua catene ADN.

Pattern-ul de expresie caracteristic individului în formare reprezint în faza embriogenezei

de fapt un program unitar de dezvoltare, în cadrul su, fiecare tip de esut fiind reprezentat de un
pattern unic de expresie. În decursul embriogenezei, etapa caracterizat prin procese extensive de
replicare ADN, cele trei activiti enzimatice descrise anterior (demetilare activ, demetilarea
pasiv i remetilarea “de novo”) sunt astfel coordonate încât, în etapa târzie a embriogenezei,
pattern-ul de metilare nou s cuprind câte un pattern de metilare ADN corespunztor
citodiferenierii fiecrui esut în parte.

20
 În etapa ulterioar embriogenezei, programele epigenetice de citodifereniere sunt activate
prin implicarea enzimei de întreinere a pattern-urilor de metilare ADN corespunztoare. Creterea
substanial a activitii DNMT1, de întreinere, concomitent cu procesele de replicare ADN este
dovada activrii procesului de transmitere clonal a pattern-ului specific de esut. Terminologia
asociat procesului de clonare a fost sugestiv aleas de specialiti pentru a explica mecanismul
transmiterii cu fidelitate a pattern-urilor specifice de esut, liniilor celulare care vor forma organele
specializate ale viitorului individ.
Odat formate (specializate sau, mai corect, difereniate prin pattern-uri de expresie în
fenotipuri specific celulare), celulele somatice formeaz un organ matur, care nu se mai divide
ulterior, în condiii normale. Intervenia ulterioar a unei metilaze independente de replicare,
metilaza de novo, care, schimbând pattern-ul de metilare specific de esut, va determina modificarea
fenotipica a acestuia, devine deci aberant. Acesta este evident un pas ctre iniierea unui mecanism
patogen, frecvent dovedit în cancerogenez. (Vairapandi i Duker, 1996).

3. EFECTORII PROCESULUI DE METILARE ADN:

ADN METILTRANSFERAZELE. PARTENERI DE INTERACIE I ROLUL BIOLOGIC

Trei proteine au fost izolate i caracterizate pân în prezent în celulele mamaliene ce

prezint activitate enzimatic capabil s catalizeze reacii de metilare ADN în resturi de citidin.
Ele au rolul de a întreine sau modifica pattern-urile de metilare ADN în cadrul programelor
epigenetice specifice etapelor de dezvoltare. Ele au fost împrite în 3 categorii dup activitatea
“ in vitro” a situsului activ catalitic:
(i) ADN metiltransferaza 1 (DNMT1), (ii) ADN metiltransferaza 3a (DNMT3a) i (iii) ADN
metiltransferaza 3b (DNMT3b). Un alt criteriu, mai general, bazat pe capacitatea de a
menine pattern-ul de metilare ADN, a celor 3 enzime le-a integrat în 2 grupe: (i) metilaza
de “întreinere”, DNMT1 i
(ii) metilazele “de novo”, DNMT3a i DNMT3b (Okano i colab., 1999).
În ciuda unor descoperiri referitoare la controlul activitii acestor 3 enzime corelate cu
fenomenele vitale pe care acestea le influeneaz, exist înc numeroase lacune: sunt nelmurite
înc mecanismele moleculare care le activeaz selectiv, în anumite etape ale dezvoltrii i care
determin afinitatea lor pentru anumite gene, astfel încât ele s poat contribui coordonat la
formarea i întreinerea fidel a unui pattern de metilare ADN corect.

21
 DNMT1

DNMT1 este prima enzim ADN metiltransferaz, a crei gen (Dnmt1) a fost clonat la
mamifere. Ea este cea mai abundent enzim DNMT care acioneaz în cadrul celulelor somatice
mamaliene (Robertson i colab., 1999).
Are activitate preferenial de 10, pân la 40 de ori pentru ADN hemimetilat (Pradhan i colab.,
1997; Pradhan i colab., 1999), necesitând o matri (caten parental ADN metilat), alturi de o
caten-fiic, nou sintetizat în urma replicrii. Motiv pentru care DNMT1 este denumit ADN
metilaza de întreinere. Modul su de aciune este postreplicativ; el explic localizarea sa în
bifurcaia de replicare, alturi de ADN polimeraza. Leonhardt i colab. (1992) au observat faptul c
DNMT1 intete factorul proliferativ PCNA (Fig. 9,10). DNMT1 este responsabil de întreinerea
pattern-ului de metilare ADN în decursul proceselor de citodifereniere care au loc în diviziunile
celulare succesive (Fig.8 i 9).

Fig. 15. Reprezentarea celor trei familii de enzime DNMT i efectele activitii lor.

Din punct de vedere structural, proteina DNMT1 poate fi divizat în doua domenii: (i) domeniul
amino-terminal reglator, format din 1100 aminoacizi i (ii) domeniul carboxi terminal, definit prin
omologia cu ADN metilazele bacteriene (Bestor i colab., 1988). Domeniul reglator N-terminal este
alctuit din subdomenii care definesc preferinele pentru anumite substrate ale enzimei i modul su
de interacie cu ADN i cu alte proteine în procesul de replicare i de metilare. Astfel, în cadrul
acestui domeniu, s-a identificat o regiune care cuprinde semnalul de localizare nuclear (NLS,
nuclear localization signal), o regiune tip “Zinc finger” (denumit i CXXC pentru numrul mare de
resturi de cistein; prin intermediul acestora enzima intete carbonul C6 al inelului pirimidinic de
citozin) i un domeniu PCNA, prin intermediul cruia enzima intete bifurcaia de replicare, mai
precis antigenul nuclear din celula proliferativ (Chuang i colab., 1997). Domeniul mai conine o

22
regiune prin intermediul creia enzima interacioneaz cu o alt enzim important în procesul de
remodelare a cromatinei pentru formarea conformaiei condensate, represive: histon deacetilaza
(HDAC) (Fuks i colab., 2000; Rountree i colab., 2000). Regiunea reglatoare include i situs-ul
Rb, utilizat de ctre enzim în interacia cu gena tumor- supresoare Rb (retinoblastoma) (Robertson
i Wolffe, 2000).
DNMT1 exist sub mai multe isoforme. Spre exemplu, forma sa somatic este reprezentat
de DNMT1s; s-a observat c aceasta este rapid activat în experimentele de implantare a
embrionului. O alta form, DNMT1b, este o variant matisat (Bonfis i colab., 2000), în timp ce
isoforma DNMT10, care specific ovocitelor, este truncat, lipsindu-i primii 118 aminoacizi (Fig. ).
Se presupune c aceasta s-ar fi specializat în meninerea pattern-ului de metilare stabilit în procesul
de imprinting, în celulele germinale (Howell i colab., 2001).
DNMT1 are o importan vital în dezvoltarea embrionar, fapt dovedit prin experiena
grupului LI (Li i colab., 1992; Li i colab., 1993; Beard i colab., 1995), care a obinut oareci
knockout pentru DNMT1. Embrionii lor au prezentat alterri severe la nivelul tubului neural i nu
au supravieuit decât 8,5 zile. Analiza ADN la aceti oareci a relevat o hipometilare general a
genomului, ceea ce a explicat expresia aberant, bialelic a unor gene imprintate i aberaiile
observate la nivelul cromozomului X de la femele (Li i colab., 1992). Celulele stem embrionare
(ES) purttoare de mutaii în gena Dnmt1 nu au capacitatea de a se diferenia decât foarte slab, i se
pot divide mai slab decât celulele slbatice (Lei i colab., 1996).
Rezultatele studiilor care au utilizat DNMT1 au elucidat numeroase probleme legate de rolul
biologic asociat iniial cu procesele de metilare ADN la eucariote: cel de represie transcripional.
Enzima eucariot prezenta de asemenea o similitudine cu activitatea DNMTazei procariote, ambele
enzime având capacitatea de a modifica anumite resturi de citidin din cadrul secvenelor ADN,
astfel încât s blocheze activitatea unei alte enzime: o ARN polimeraz, la eucariote sau o
endonucleaz de restricie, la procariote. Acesta a fost un mod elegant de explicare a rolului
represiv transcriptional pe care îl are DNMT, la eucariote i a rolului defensiv, de blocare de ctre
bacterii a sistemului de virulent utilizat de virusuri sau bacterii patogene.
Un aspect important al activitii enzimei se refer la specificitatea sa pentru substrate
ADN hemi-metilate. Aceasta a fost, de altfel premiza esenial a explicaiei rolului su biologic de
întreinere a pattern-urilor de metilare ADN. Asociat cu procesul de diviziune i deci replicare
ADN, activitatea DNMTazei 1 este considerat ferm legat de transmiterea fidel a distribuiei
siturilor critice de metilare (Bestor i Verdine, 1994). Mecanismul propus de Vanyushin (1987)
indic elementele importante ale activitii enzimei ca proces post replicativ. Acesta implic o
activitate de metilare prin copierea pattern-ului de metilare codificat pe catena ADN veche,
parental. De asemenea, procesul replicativ explic i activitatea DNMT1 ca demetilaz pasiv, în

23
condiiile prezenei unor inhibitori ai metilazei în faza S i formrii nucleozomilor în cadrul
genomului nou sintetizat.
Dei definit iniial ca metilaz de întreinere, unele publicaii referitoare al DNMT1 din
literatura de specialitate descriu i o anume afinitate “in vitro” pentru substrate ADN nemetilate,
ceea ce îi confer o activitate metilazic “de novo”. Astfel de date sunt corelate îns cu
experimente de analiz a nivelelor de expresie a genei Dnmt1 în cazuri patologice, precum tumorile
umane (El-Deiry i colab., 1991; Schmutte i colab., 1996) sau în experimente de transformare a
fibroblastelor murine (Wu i colab., 1993). Ambele abordri au demonstrat nivele de expresie
exagerat a enzimei (dovedite prin concentraii mrite în ARNm), corelate cu hipermetilri ale
insulelor CpG (Vertino i colab., 1996).
Totodat, experimentele de reactivare a genelor tumor-supresoare cu inhibitorul
DNMTazei1, 5-aza-citidina, au întrit teoria conform creia enzima ar fi implicat printr-o activitate
exagerat în controlul cilor oncogene, precum cele de activare a nivelului proteinelor RAS
(Rouleau i colab., 1995) i FOS (Bakin i Curran, 1999) sau de reducere a activitii proteinei p21
(Chang i colab., 1997). Astfel de rezultate ar fi presupus o funcie de protooncogen pentru
DNMT1, dac alterrile mai sus amintite în activitatea sa ar fi putut fi asociate cu vreo mutaie sau
modificare epigenetic.
Rezultatele experimentale au indicat îns ci alternative prin care proteina DNMT1
coordoneaz ci metabolice vitale, a cror alterare poate fi cauza transformrii neoplazice într-un
numr mare de tipuri de cancere. Trei dovezi experimentale importante leag activitatea sa de
cancer: (i) procesele de hipometilare ADN asociate cancerului (Feinberg i Volgestein, 1983); (ii)
activitatea sa de transmitere fidel a pattern-ului de metilare ADN în procesul de replicare a
cromatinei este controlat de multiple ci de semnalizare vitale în dezvoltarea normal, dar
oncogene în dezvoltarea neoplazic (Szyf, 1998) i (iii) hipermetilarea genelor tumor-supresoare
poate fi reglat prin intermediul inhibitorului DNMTazei 1 (5azaC) (Gonzalgo i colab., 1998;
Fournel i colab., 1999), cunoscut fiind c nivelul de expresie al genei DNMT1 este extrem de
ridicat în tumori (el-Deyri i colab., 1991; Wu i colab., 1994).
Mecanismele moleculare care stau la baza controlului exercitat de DNMTaza 1 asupra
expresiei genelor vitale rezid din structura proteic pe domenii active funcional (Fig. ).
Cunoaterea structurii sale proteice i a multiplelor sale funcii reprezint de altfel obiectivul major
al farmacodinamicii i al terapiilor epigenetice anticancer (Szyf,2001; Cucu, 2001).
Dup cum se observ în Fig. , DNMT1 este o protein multifuncional. În primul rând,
fiind responsabil de replicarea fidel a pattern-ului de metilare ADN, concentraia sa este în
concordan cu cea a altor componente ale aparatului replicator celular. Pentru acest fapt pledeaz
creterea observat a concentraiei transcriptelor DNMT1 în primele stadii ale fazei S (Szyf, 2001).

24
 De asemenea, promotorul genei DNMT1 este reactiv la semnalele protooncogene i
mitogene prin intermediul interaciei cu elementele proteinei activatoare AP-1 (Szyf, 1998). O alt
dovad a legturii DNMT1 cu replicarea ADN o constituie un domeniu funcional al structurii sale
proteice: PCNA, denumit dup o protein esenial în procesul de replicare: antigenul nuclear din
celulele proliferative (proliferating cell nuclear antigen); fa de acesta DNMT1 are o afinitate
crescut atunci când este necesar intirea focilor de replicare (Chuang i colab., 1997). Într-o astfel
de interacie, DNMT1 concureaz cu gena tumor-supresoare p21, competiia contribuind eventual la
controlul stoprii ciclului celular. Alterarea procesului propus ar declana procese oncogene
asociate cu aceasta cale de reglaj.
În al doilea rând, DNMT1 poate fi considerat o component cu toate drepturile a
ansamblului de factori remodelatori ai conformaiei cromatinice. Pentru aceasta pledeaz cele dou
domenii funcionale ale sale prin intermediul crora enzima interacioneaz specific cu
histondeacetilazele, HDAC1 i HDAC2 (Fuks i colab., 2000; Rountree i colab., 2000). Un alt
complex proteic format între proteina retionoblastomului ( Rb) i factorul de transcriere E2F1, poate
interaciona de asemenea cu DNMT1, rezultând supresia promotorilor ce conin elemente E2F1
(Robertson i colab., 2000, citat în Szyf, 2001).
Aceste date indic faptul c DNMT1 poate avea i alte funcii, pe lâng cea de transfer al
grupelor metil în cadrul ADN: una dintre acestea este cea de protein represoare a transcrierii, cu
potenial de sileniere a genelor tumor-supresoare implicate în controlul ciclului celular; rolul su
din acest punct de vedere este asociat cu inducerea fazei S a ciclului celular i, o data cu aceasta,
activarea funciei sale metilazice.
Descoperirile neateptate ale funciilor adiionale pe care le prezint DNMT1 a atras atenia
cercettorilor implicai în programe de descoperire a intelor farmacologice care s fie integrate în
schemele terapeutice epigenetice ale cancerului. Un mod de abordare în acest sens este utilizarea
inhibitorului de metilaza, 5azaC. Cunoaterea mecanismelor complexe în care este implicat enzima
int a unui astfel de tratament este deci absolut necesar în estimarea tuturor faetelor activitii
inhibitorului i deci a riscurilor posibile (Szyf, 2001).

DNMT2

Proteina DNMT2 a fost declarat o ADN metiltransferaz prin analogie de secven. Yoder
i Bestor (1998) raporteaz o expresie slab a enzimei în numeroase esuturi. Este o protein de
dimensiuni mici, truncat (Fig.) în regiunea reglatoare N-terminal, însa cu domeniul catalitic
intact, suficient pentru a-i conferi o activitate enzimatic de metiltransferaz. Pân recent nu s-a
dovedit activitatea sa de ADN metiltransferaz “in vitro” deoarece în experimentele în care s-a
realizat deleia sa la nivelul celulelor embrionare nu au condus la afectarea nivelului de metilare a

25
retrovirusului integrat în genomul acestora (Robertson i colab., 1999). Astfel de observaii au
condus la ipoteza conform creia DNMT2 nu ar fi implicat în procesele de metilare ale genomului.
Totui, în anul 2003, observaia grupului Hermann (Hermann i colab., 2003) privind capacitatea
sa redus de a cataliza transferul grupei metil “in vivo” a reintrodus dezbaterea privind dovezile
referitoare la rolul acestei enzime în genomul eucariot.

Familia DNMT3

Familia de enzime DNMT, denumit ADN metiltransferaze “de novo” sau DNMT3, au fost
izolate i caracterizate iar ulterior, genele corespunztoare clonate de ctre grupul Okano (Okano i
colab., 1998). Specificitatea acestor enzime pentru substrat este, spre deosebire de DNMT1,
similar atât pentru ADN hemimetilat, cât i pentru ADN nemetilat. În prezent, familia DNMT3
include 3 membri: DNMT3a, DNMT3b i DNMT 3L. Precum DNMT1, aceast clas de enzime
este foarte conservat, atât în sistemul mamalian, cât i în cel vegetal. Enzimele DNMT3 au fost
caracterizate la Arabidopsis (Cao i colab., 2000), porumb (Cao i colab., 2000), dar i la oarece
(Okano i colab., 1998) i om (Xie i colab., 1999).

DNMT3a i DNMT3b

Cei doi reprezentani ai familiei DNMT3 au fost denumii enzime ADN metiltransferaze “de
novo”, ele dovedindu-se responsabile de procesele de demetilri masive care au fost observate în
etapele post-implantatoare la embrion i în procesele de metilare a secvenelor parazite integrate
prin transfer de gene (Okano i colab., 1999). În perioada embriogenezei i gametogenezei aceste
enzime au un nivel înalt de activitate, spre deosebire de etapele de citodifereniere, în celulele
somatice, în cadrul crora sunt prezente la un nivel extrem de sczut.
Enzimele DNMT3a i DNMT3b prezint o structur care include un domeniu reprezentativ:
PWWP (prolina-triptofan-triptofan-prolina); el a fost detectat frecvent la proteinele asociate
cromatinei (Stec i colab., 2000). S-a sugerat c acest domeniu particip în procesul de intire a
enzimelor la structura heterocromatinic din regiunea pericentromeric (Chen i colab., 2004), cu
toate ca nu au fost descoperite toate elementele participante la acest proces. Este dovedit îns
legtura nespecific dintre ADN i domeniul PWWP al acestor enzime (Qiu i colab., 2002), ca i
slaba afinitate a enzimei DNMT3a pentru ADN (Chen i colab., 2004).
Daca DNMT1 este cea mai studiat enzim pân în prezent, fiind posibil identificarea
numeroilor parteneri de interacie în procesele de întreinere a pattern-ului de metilare, sunt doar
slabe dovezi privind mecanismele de activare a enzimelor “de novo”.
DNMT3a este frecvent studiat ca o component a unui complex format cu DNMT1, ceea ce
dovedete faptul c cele doua procese, de metilare de întreinere i, respectiv, metilare de novo, sunt

26
coordonate în cadrul unui proces unic,: de formare a unui anumit pattern de metilare într-un anumit
genom. Etapele procesului constau în crearea siturilor metilate, deci a unui pattern de metilare, de
ctre DNMT3a, enzima DNMT1având rolul de a întreine, în continuare acest pattern, replicându-l
fidel în liniile celulare ale unui esut dat.
Cercettorii din cadrul grupului condus de Dr. Albert Jeltsch, de la Institutul de Biochimie
(Justus-Liebig-Universitat) din Giessen, Germania (Fatemi i colab., 2002) au demonstrat c pentru
realizarea pattern-ului de metilare nu este necesar contactul fizic dintre cele doua enzime i
formarea unui anumit complex. Este suficient aciunea în prealabil a DNMT3a, pentru ca prezena
grupelor metil transferate de aceasta s accelereze viteza reaciei DNMT1 de întreinere a
distribuiei grupelor metil dintr-un anumit fragment ADN luat în studiu. Modelul propus este în
acord cu proprietile biochimice ale acestor enzime: astfel, s-a demonstrat faptul c legarea ADN
metilat de ctre DNMT3a la domeniul proteic “Zinc-finger” al DNMT1 ar induce o activare
alosteric a centrului catalitic (captul C-terminal) al acestei metilaze de întreinere.
Elucidarea mecanismului de interacie dintre enzimele DNMT3a i DNMT1 a adugat
metilazei de întreinere înc un rol funcional: cel de rspândire sau extindere a regiunilor
heterocromatice, metilate, în cadrul genomului, proces asociat frecvent cu fenotipul de
hipermetilare din perioada de îmbtrânire i din cadrul fenomenelor de cancerogenez. Rolul nou
atribuit DNMT1 este explicativ în primul rând pentru mecanismul complex al formrii pattern-
urilor de metilare ADN i, în cadrul acestuia, al catalizei reaciei metilrii de novo.
O alt metilaza de novo, DNMT3b, prezint un interes particular, atât pentru sistemul murin,
cât i pentru cel uman. Studiile efectuate pe oarecii knockout pentru gena Dnmt3b a demonstrat
rolul esenial al activitii enzimei codificate în dezvoltarea embrionara murin. Pe de alt parte,
pentru sistemul uman, enzima DNMT1 are o importan particular prin asocierea activitii sale
într-o boal genetic umana rar, denumit sindromul ICF; acesta este caracterizat prin
imunodeficien, instabilitate centromeric i anomalii faciale. Cele trei defecte eseniale observate
la bolnavii de acest sindrom sunt atribuite hipometilrii ADN din cadrul regiunilor
heterocromatinice pericentromerice, aparinând cromozomilor 1, 9 i 16.
Intenia de a detecta gene-candidat pentru controlul activrii transcripionale în regiunile
afectate de hipometilare a condus la rezultate nerelevante: pe de o parte, astfel de regiuni
centromerice nu au coninut gene activate, iar pe de alta parte, s-au identificat numeroase alte gene,
al cror status de metilare nu a prezentat vreo dinamic relevant; în schimb, au prezentat o expresie
alterata în sindromul ICF. Din punct de vedere citogenetic, procesul epigenetic de hipometilare a
regiunilor centromerice este comentat în literatura medical, ca fiind corelat cu morfologia alterat
cromozomal observat la pacieni (timing încetinit de condensare i frecvente ruperi
cromozomale).

27
 Rezultate recente au sugerat noi ci de elucidare a activitii speciale desfaurate de
DNMT3b i genele sensibile la procesele de hipometilare ADN în cadrul regiunilor cromozomale
amintite anterior. Cercetrile au indicat faptul c celulele ICF provenite de la femei au coninut
cromozomul X caracterizat printr-o hipersensibilitate fa de aciunea proteinei mutante DNMT3b.
Tot astfel, la sexul masculin, s-a descoperit o familie de gene implicate în cancerul testicular,
prezentând o hipersensibilitate similar fa de expresia mutaiei în gena Dnmt3b. Rezultatele au
sugerat faptul c pierderea grupelor metil în secvenele pericentromerice este corelat cu creterea
nivelului de expresie la genele implicate, ceea ce ar prezenta un potenial important în apariia
fenotipurilor caracteristice sindromului ICF.
Considerarea partenerilor de interacie a enzimei DNMT3b în cadrul ansamblului factorilor
de remodelare ai cromatinei a relevat o noua funcie a acestei proteine: factor de transcriere. Astfel,
s-a constatat c unele represii transcripionale ar fi rezultatul interaciei DNMT3b cu
histondeacetilazele (HDAC) i proteina dependent de ATPaz, hSNF2H. De asemenea, studiile de
co-imunoprecipitare a cromatinei indic faptul c formele mutante ale DNMT3b gsite în celulele
ICF rein capacitatea de a interaciona cu ambele proteine cromatinice menionate.
Un bilan al cercetrilor, pân în prezent, referitor la activitatea particular a enzimei
DNMT3b susine doar ipoteza conform creia DNMT3b poate aciona fie ca metiltransferaz “de
novo”, fie ca factor de transcriere, cu rol reglator în expresia anumitor gene, în special asociate
secvenelor ADN repetitive din regiunea centromeric.

DNMT3L

DNMT3L este un membru particular al familiei DNMT3. El este considerat ca facând parte
din acest grup aenzimatic datorit homologiei sale de secven la nivelul domeniului PHD.
Totodat, aceasta protein nu posed motivele critice pentru activitatea de metilare a ADN (Fig. ),
ceea ce afecteaz capacitatea sa de a metila ADN (Aapola i colab., 2000). Cu toate acestea,
DNMT3L este crucial pentru stabilirea profilului de metilare. Acest fapt a fost demonstrat prin
mutantele pentru gena care codific DNMT3L, care au avut efecte importante la embrionii de
obolan. Aceste efecte difer în funcie de sexul animalului : la femele, DNMT3L este capital
pentru stabilirea imprintului genomic matern (Bourc’his i colab., 2001; Hata i colab., 2002).
Dnmt3L este exprimat în decursul gametogenezei - în procesul impriningului. Întreruperea
activitii sale conduce la o expresie bialelic a genelor care în mod normal sunt exprimate exclusiv
pe linia patern (doar cea de pe alela patern). La masculi, DNMT3L este necesar în
spermatogenez, fapt dovedit de comportamentul animalelor deficiente: ele prezint un
hipogonadism i o aspermie pronunat (Bourc’his i colab., 2001). O publicaie recent a grupului

28
Bourc’his i Bestor a artat ca DNMT3L este indispensabil procesului de metilare a
retrotranspozonilor dispersai precum secvenele LINES i IAP. Acest fapt nu este îns corelat i cu
sateliii majori sau minori (Bourc’his i Bestor 2004).
DNMT3L interacioneaz cu DNMT3a i DNMT3b i este colocalizat în nucleu, ceea ce
sugereaz o cooperare în procesul de metilare a ADN. De fapt, coexistena DNMT3a i DNMT3L
conduce la o stimulare substanial pentru DNMT3a, ceea ce a reprezentat prima dovad privind
existena unui control al activitii catalitice la DNMT (Chedin i colab., 2002).
O alt remarc interesant referitoare la DNMT3L este aceea c aceast proteina nu este
propriu-zis capabil de a metila ADN: ea particip într-o manier important la stabilirea pattern-
ului de metilare.

Concluzii recente privind activitatea metilazic de întreinere i de novo

Proteinele DNMT au fost clasificate iniial în metilaze de întreinere i metilaze de novo.

Aceast clasificare a fost ulterior contestat frecvent de noile observaii privind structura lor,
corelat cu activitatea i localizarea lor.
Astfel, în celulele somatice de adenocarcinoame, s-a observat c defectele condiionale în
gena pentru DNMT1 nu provoac decât o diminuare de cca 20% a procesului de metilare total a
genomului (Rhee i colab., 2000). Dimpotriv, o supraexpresie a DNMT1 observat în liniile
tumorale a fost concomitent cu metilarea de novo în secvenele repetitive CpG endogene (Vertino
i colab., 1996). Întreruperea activitii DNMT3a i DNMT3b în celulele ES a indicat faptul c
aceste enzime sunt implicate de asemenea în întreinerea metilrii ADN (Chen i colab., 20031). Se
presupune c diferenierea net dintre metilarea de întreinere i metilarea de novo nu este atât de
precis precum s-a considerat iniial.
În consecin, Li i colegii au propus un model conform cruia cele trei proteine DNMT
activeaz împreun. Astfel, DNMT3a i b sunt asistentele enzimei DNMT1 în întreinerea pattern-
ului de metilare ADN, având activitatea corectoare: ele metileaz la nivelul acelor secvene CpG
care au fost eronat “scpate” nemetilate de ctre metilaza de întreinere DNMT1. Enzimele
DNMT3a i DNMT3b mai posed un domeniu PHD-like (Plant Homeodomain), care este implicat
în numeroase interacii de tip protein-protein (Burgers i colab., 2002). Acest domeniu se
regsete în numeroase proteine, în special ATRX (£-thalassemia mental retardation X linked), o
protein omoloag familiei SNF2 implicat în sindromul cu acelai nume ( mutaiile responsabile
de aceast maladie se afl în domeniul PHD) (Gibbons i colab., 1997).

29
 Fig.16. Tipuri de ADNMTaze clasificate dup specificitatea de substrat a reaciei de metilare ADN i asocierea
cu procesul replicrii. Sunt reprezentate i activitile de demetilare (activ/pasiv) a ADN

Numeroase studii recente au evideniat legtura dintre DNMT3a cu diveri parteneri în

interacii de tip protein-protein prin care particip în procesele de represie transcripional (cu
HDAC1) sau în procesul de intire a enzimelor DNMT3a/b ctre regiunile specifice din genom
(cum ar fi RP58) (Fucks i colab., 2001).

S TRUCTURA POLIPEPTIDIC A ADN METILAZEI ;

DOMENII FUNCIONALE I PARTENERI DE INTERACIE

Descoperirea proteinelor implicate în metilarea ADN a reprezentat un pas important în

înelegerea acestei modificri epigenetice. Nu numai domenii funcionale ale proteinelor cu
activitate metilazic au stat în centrul ateniei cercetrii epigenetice, dar i interaciile specifice ale
acestor domenii cu factori proteici nonhistonici cu rol de “cititori” sau senzori ai grupelor metil de
la nivelul ADN. Acetia sunt reprezentai de proteinele cu afinitate fa de ADN metilat (proteinele
care prezint domenii cu afinitate de legare a siturilor metilate din cadrul ADN: MBDP, methyl
binding domain proteins). Domeniile unor astfel de proteine prezint caracteristici importante care
stau la baza afinitii lor fa de regiunile metilate ADN.

Enzima ADN metiltransferaza i mecanismul molecular al transferului prezentat anterior au

fost studiate de numeroi cercettori, informaiile obinute vizând soluionarea problemelor

30
disputate în legtura cu rolul biologic al metilrii ADN, în general i cu utilizarea enzimei în
metodologia de modulare a nivelului metilrii ADN în diferite sisteme de eucariote prin
intermediul inhibitorilor specifici. Acest ultim aspect este azi intens exploatat în stabilirea
strategiilor terapeutice noi epigenetice care utilizeaz astfel de inhibitori cu efect citostatic.
Proteinele DNMT au o structur comun enzimelor, respectiv domenii funcionale
corespunztoare activitilor specifice, flancate de capetele N- i, respectiv, C-terminale. Captul N-
terminal (NH2- sau amino-terminal), bazic, are activitate reglatoare iar captul C-terminal (COOH-
sau carboxi-terminal), acid, prezint activitate catalitic (Fig. ). Domeniile funcionale i domeniul
catalitic sunt dispuse diferit, în funcie de tipul de enzim, deci de activitatea enzimatic. Trautner
(1998) a sugerat ipoteza conform creia enzimele DNMT au evoluat dintr-o singur structur
enzimatic, prin permutri ale domeniilor funcionale, deci prin diferite procesri ale intronilor
ARNm.
Complexitatea mecanismului de aciune a unei DNMTaze descrise anterior este în
concordan cu structurarea polipeptidei în domenii funcionale specifice. Astfel, într-o lucrare
recent, sunt semnalate urmtoarele trei regiuni funcionale eseniale ale enzimei, care au fost
identificate atât la MTazele procariote, cât i la MTazele eucariote (Trautner, 1998):
1. regiunea catalitic;
2. regiunea de legare a donorului SAM i
3. regiunea (regiunile) prin intermediul creia (crora) se recunoate inta reaciei.
La toate enzimele analizate s-a observat faptul c (i) primele dou regiuni se caracterizeaz
prin motive de secven extrem de bine conservate, ceea ce reflect universalitatea reaciei de
metilare la eucariote dar i procariote i, respectiv, (ii) utilizarea universal a SAM ca donor de
grupe metil. În schimb, regiunea (regiunile) de recunoatere a intei (substratului) pentru metilare
sunt variabile ca dimensiune i compoziie, dovedindu-se astfel domeniul larg al specificitii de
secven ce caracterizeaz MTazele.

Fig. 17. Structura proteinei DNMT1: evidenierea domeniilor funcionale cu activiti specifice de interacie cu factori
reglatori ai coformaei cromatinei:DMAP: ; PCNA: ; NLS: ; FTR: ; HDAC: ; Rb.

31
 S-a presupus, pe baza observrii unei reprezentri liniare a domeniilor (de la captul N- la
captul C-terminal), c aceste regiuni sunt aranjate la diferite organisme în combinaii de cinci luate
câte trei (Trautner, 1998). La majoritatea MTazelor aceste segmente sunt asamblate uniform în
urmtoarea ordine:
capt N-terminal / regiune de legare a SAM / regiune catalitic / regiune de recunoatere a intei /
capt C-terminal. (Fig.19).
Aceast descriere, în termenii secvenei primare de aminoacizi, nu ine cont de structura
tridimensionala a DNMTazelor, aa cum a fost observat la M.HhaI i la M.HaeIII (Trautner,
1998). La aceste doua MTaze, s-a observat o pliere a unei pri din regiunea C-terminal ctre
captul N-terminal, contribuind astfel la formarea regiunii de legare a SAM. Aranjamentul modular
dintre dou regiuni conservate i o regiune variabil, observat frecvent la ADN (citozin-5)
metiltransferaze, a pus probleme legate de mecanismul catalizei i mai cu seam, probleme legate
de evoluia acestor enzime.
În majoritate, datele referitoare la structura DNMTazelor au fost obinute în sistemul
procariot. Singura specie de astfel de enzim detectat în celulele de mamifere este reprezentat de
o protein de dimensiuni mari, de cca 1502 aminoacizi, în cadrul creia regiunea C-terminal,
alctuit din 500 aminoacizi, prezint similariti cu secvena MTazelor procariote de restricie
(tipul II) ( Bestor i colab., 1988; Posfai i colab., 1989; Bestor, 1992).
MTazele eucariote se disting îns de cea procariot prin cele doua tipuri de reacii pe care le
poate cataliza: metilarea de întreinere i cea "de novo". Din punct de vedere structural, aceast
difereniere este concordant cu prezena, la eucariote, în structura MTazei de întreinere, a unui
domeniu N-terminal aparte, reprezentat de 1000 de aminoacizi, care supreseaz metilarea "de novo"
(Bestor i colab., 1992). Domeniul respectiv conine o regiune nou, bogat în cistein, între
aminoacizii 537 i 575, care leaga specific ionii de Zinc (Bestor i colab., 1992).
Supresia activitii "de novo" corespunde, de altfel, preferinei enzimei astfel alctuite pentru
substratele hemimetilate; paradoxal, aceast proprietate este asociat cu desfurarea unei activiti de
întreinere. Un fapt interesant în legtur cu aceast structur este semnalat de ctre grupul Leonhardt
i colaboratorii (1992) i, ulterior de grupul Laird i Jaenisch (1996): îndeprtarea proteolitic a
domeniului de cca 350 de aminoacizi din regiunea extrem captului N-terminal (aflat între
aminoacizii: 207-455) nu afecteaz activitatea enzimatic a MTazei, în schimb, are un rol deosebit de
important în intirea focilor de replicare mai corect cu PCNA), cu care se asociaz în faza S. Aceasta
secven a fost denumit secven de intire (targeting) a focilor de replicare (Fig.20).

32
Fig.18. Structuri pe domenii funcionale conservate i variabile prezentate de tipurile diferite de DNMT. Sunt
reprezentate i domenii funcionale prin intermediul crora enzimele interacioneaz cu anumii parteneri cu rol de
remodelare a cromatinei

Activitatea i structura ADN MTazei de întreinere sunt în deplin concordan cu

coordonarea strâns dintre replicare i metilare. Transmiterea clonal cu fidelitate a pattern-urilor de
metilare, pe care o realizeaz acest tip de MTaz, este posibil doar datorit urmtoarelor secvene
de mecanisme moleculare: (i)recunoaterea i metilarea tuturor siturilor CpG metilabile, în forma
hemimetilat; (ii) intirea de ctre enzim a focilor de replicare; (iii) asocierea specific a enzimei
cu siturile în care are loc sinteza ADN nou , în nucleii aflai în faza S. Aceast ultim etap a fost
demonstrat prin studiul efectelor produse de deleiile din cadrul regiunii de intire, care nu au
condus la inactivarea enzimei, ci la blocarea localizrii normale a proteinei corespunztoare
(experimente efectuate cu proteine himere, obinute prin fuziuni de secvene între genele pentru
MTaza i B-galactozidaza ca gen raportoare) (Leonhard i colab., 1992).

33
Stabilirea pattern-urilor de metilare ADN: un proces dependent de tipul activitii metilazice
i de etapa de dezvoltare (de programul epigenetic specific etapei de dezvoltare)

Diverse modele mai mult sau mai puin plauzibile sau verificate practic s-au propus în
scopul explicrii mecanismelor moleculare care stau la baza stabilirii profilului de metilare (“de
novo” i “de întreinere”). Unul dintre acestea se refer la influena regiunii genomice în care sunt
de inserare a alogenele (termenul de alogen se refer la fragmentul sau fragmentele de ADN care
se insereaz într-o regiune nou a genomului prin procesele cunoscute de recombinare) (Szyf, 1991;
Meyer, 1993).
În ceea ce privete diferenierea activitii enzimatice pe baza gradului de metilare al
substratului, exist câteva indicaii privind faptul c cele dou activiti menionate pot fi atribuite
unei enzime unice (Christman i colab, 1995). Astfel, s-a dovedit c semnalele inerente din
structura a ADN pot aciona “in vivo” pentru a iniia sau bloca metilarea “de novo” a regiunilor de
ADN adiacente.

Pentru identificarea secvenelor capabile de a iniia metilarea “de novo” a ADN “in vitro”, a
fost studiat o serie de oligodeoxinucleotide cu rol de substrat, coninând restul de citidin în
contexte de secvene diferite. S-a observat c activitatea unei DNMTaze de meninere izolat din
murin poate avea o activitate de metilare “de novo” în anumite secvene oligonucleotidice, dac ar
fi stimulat de resturile de 5mC adiacente secvenei metilate enzimatic. În aceste cazuri, s-a
constatat c eficiena metilrii “de novo” ar fi similar cu cea a metilrii de întreinere, ca i când ar
fi stimulat de resturile de 5mC dintr-o dubl caten ADN hemimetilat (Vanyushin, 1984). Acest
rezultat a sugerat faptul c ADN dublu-catenar nu este în mod necesar substratul primar pentru
activitatea de metilare “de novo”; mai degrab, se consider c anumite structuri monocatenare din
cadrul buclelor ADN formate în cursul normal al proceselor de replicare sau reparare a ADN ar
putea servi drept situsuri de “nucleaie” pentru metilarea “de novo” a regiunilor adiacente unor
astfel de structuri (Kass, 1997).
La o concluzie similar ajung i autorii Matzke i Matzke (1995), sugerând un mecanism
prin care este activat metilarea unor copii unice de transgene în cadrul unui genom vegetal gazd.
Autorii consider integrarea transgenelor un proces de perturbare a domeniilor funcionale genice
(Fig.) respectiv, apariia unui gradient de izocori (dependent de coninutul CG al domeniilor
respective). Gradientul poate fi redus prin metilarea perechilor CG perturbatoare, proces care
conduce dup cum s-a menionat, la silenierea transgenelor respective de ctre genomul gazd, de
altfel, o form a reaciei de aprare.

34
 Astfel de mecanisme au explicat de altfel numeroasele fenomene de variaie a expresiei
transgenelor vegetale în câmp i, mai mult, au stat la baza soluionrii practice a acestei probleme:
inserarea constructului vectorial utilizat în tehnica transferului de gene la plante a unor regiuni
speciale pentru ataarea proteinelor (matrix-ul) eafodale (SAR-uri sau MAR-uri); prezena acestor
secvene speciale la capetele genei de interes, a condus la inserarea acesteia din urm ca domenii
funcionale independente în cadrul genomului gazd, care nu mai pot perturba activitatea altor
domenii funcionale, autohtone. Soluia a fost utilizat cu succes în optimizarea tehnicilor de
transgenez la diferite plante de interes economic (Finnegan i Mc Elroy, 1994).
Un alt model bazat pe formarea suprastructurilor în forma de "ac de pr" în cadrul catenelor
ADN nou-formate prin replicare, în condiiile unui proces de „slippage”, sugereaz preferina
DNMTazei pentru astfel de situsuri (Clark i colab., 1995).
Actiunea metilazei “de novo” este presupus în etapa timpurie a embriogenezei, când are rolul
major de stabilire a unui program epigenetic de expresie spaio-temporal pentru întregul genotip.
În aceast etap, activitatea enzimei este coordonat de semnale care indic alegerea precis a
genelor paterne/materne care vor fi amprentate pentru sileniere/activitate în genomul individului în
formare. Astfel de semnale sunt vag definite, în prezent studiul lor facând parte dintr-un domeniu
modern, denumit imprinting molecular.
Activitatea metilazei de între
inere este intens în procesul denumit sugestiv "transmitere
clonal" (Fig.19 ); acest proces este specific tipului de esut i face posibil specializarea celulelor
din cadrul unui anumit esut. Este de fapt procesul molecular care st la baza citodiferen
ierii i, din
punct de vedere epigenetic, determin transmiterea profilului de metilare specific de esut, stabilit în
embriogenez.
Tot o activitate de întreinere este presupus i în cazul fenomenelor de paramutaie i trans-
inactivare, observate cu precdere în studiile expresivitii transgenelor, la plantele manipulate
genetic cu ADNc viral, în scopul imunizrii fa de anumite viroze(Matzke i Matzke, 1990, 1995).
Dependena activitii enzimatice, de gradul de metilare a substratului este evident i din
structura proteinei DNMT (Leonhardt i colab.1992). Informaiile privind secvena în aminoacizi
atest existena unei regiuni (Fig. ) bogate în cistein, în cadrul creia se afl un situs de legare a
Zn, capabil s discrimineze situsurile CpG metilate de cele nemetilate (Bestor, 1992).

35
Fig.19 ADNMetilazele diferite acioneaz în mod normal în diferite etape ale dezvoltrii: ADNMT1 întreine pattern-ul
de metilare ADN specific de esut prin transmiterea clonal în celulele esutului în formare, DNMT3a i b (de novo)
formeaz un pattern nou de metilare ADN, în mod normal, în embriogeneza timpurie i în mod aberant în
cancerogenez (în celulele stem i somatice)

Daca o activitate de întreinere poate fi activat de grupele metil - ce joac un rol posibil de
semnal - în cazul activitii “de novo” s-a pus pe drept cuvânt problema iniierii activitii
enzimatice de ctre ali factori, probabil legai de stringena activrii sau supresiei unei anumite
gene. Dei exist numeroase date experimentale care difereniaz aceste dou activiti, nu sunt înc
bine definii factorii care determin alegerea “de novo” a situsurilor metilabile. Domeniul
transformrii genetice la plante, ca i cel al imprintingului la mamifere ofer în prezent un cadru de
dezbateri intense în acest sens.

36
 Controlul reaciei biochimice de metilare a citozinei
i efectele alterrii acesteia asupra stabilitii genomice

Ca orice reacie enzimatic, echilibrul reaciei de metilare este supus controlului prin
intermediul reactanilor, al enzimei, produilor, pe de o parte, cât i a condiiilor de mediu (pH,
temperatur, trie ionic) i prezenei inhibitorilor enzimatici.
Mecanismul de control al aciunii DNMTazei procariote a fost propus iniial de ctre Santi i
colegii (Santi i colab.1983; Wu i Santi, 1987). Ulterior, Selker (1990), pe baza acelorai
mecanisme, propune caracterizarea DNMTazei eucariote pornind de la corelaia între KM-ul
reaciei i activitatea activitii metilazice sau deaminazice a enzimei. Recent, grupurile Chen i
colab. (1991), Shen i colab.(1992) au prezentat caracteristici ale structurilor primare (secvenei în
aminoacizi), cât i suprastructurilor polipeptidice corespunzatoare DNMTazei, încercând totodat s
discute anumite corelaii dintre acestea i activitatea enzimei.
Autorii menionai au demonstrat faptul c legtura covalent format între ADN (citozina-
5)-metiltransferaza i C-6 de pe inelul pirimidinic al citozinei (Fig.), ca i concentraia donorului
(SAM) de grupe metil sunt de importan crucial în desfurarea reaciei enzimatice: din reacie pot
rezulta astfel doi produi pirimidinici distinci. Alegerea cii de metilare sau de deaminare se
realizeaz pe baza accesibilitii donorului de metil :
(i) nivelurile SAM cu sau peste valoarea KM corespunzatoare enzimei conduc la modificarea rapid
a citozinei int i la obinerea 5mC (Fig. – reaciile );
(ii) dimpotriv, când nivelurile SAM sunt limitative, poate avea loc deaminarea citozinei la uracil
(Fig. – reacia ) .
Majoritatea studiilor efectuate pân recent au vizat DNMTazele din sistemul procariot.
Acestea au demonstrat faptul ca tranziiile C-U-T pot fi facilitate de însi ADN (citozin-5)-
metiltransferaza sau de aciunea acesteia combinat cu aciunea altor enzime (reparatoare), prin
urmatoarele ci de reacie (Laird i Jaenisch, 1996):
(i) deaminarea citozinei (reacia );

(ii) deaminarea 5mC (reacia );

(iii) blocarea reaciei de reparare a uracilului (produsul reaciei de deaminare a citozinei) (reacia )
i blocarea reaciei de reparare a timinei (produsul reaciei de deaminare a 5-metilcitozinei), prin
intermediul timin-ADN-glicozilazei (reacia);

37
(iv) metilarea uracilului, reacie din care rezult timina (reacia ) sau de o combinaie între aceste
mecanisme.

Fig. 20. Reacii de deaminare spontan/enzimatic i efectul mutagen al acestora.

Deoarece se presupune c toate DN MTazele utilizeaz un mecanism de reacie comun

(Cheng, 1995; Kumar i colab., 1994; Roberts, 1995; Schluckebier, 1995; Wu i Santi, 1987),
acesta a fost extrapolat i la enzima eucariot - mamalian sau vegetal: ea poate deci contribui la
rata mare a tranziiilor mutagene, observate frecvent în dinucleotidele CpG, la organismele
superioare.

Datele privind structura enzimelor ADN MTaze (pro- i eucariote) atest prezena unei
secvene absolut conservate, Pro-Cis (prolina-cisteina) (Bestor i colab., 1988; Lauster i colab.
1989; Posfai i colab. 1989) la toate DNMTazele cunoscute pân în prezent. În contextul interaciei
cu inelul pirimidinic, grupele tiol ale cisteinei au rolul de nucleofile catalitice, ce conduc la
formarea unei legturi covalente cu C-6 al acestui inel (Wu i Santi, 1987) i obinerea unui
intermediar dihidropirimidinic, nearomatic (Fig. ). Studiul acestui complex intermediar a
elucidat numeroase aspecte contradictorii referitoare la poten
ialul mutagen sau doar epigenetic
al enzimei. Astfel, s-a constatat c structura dihidropirimidinic poate fi, ulterior alchilat în poziia
C-5, cu grupa metil donat de SAM. În urma acestei reacii de transfer se obine SAH i totodat, se
elibereaz proteina din complexul iniial, pentru a se forma 5-metilcitozina. Dimpotriv, în cazul în

38
care nivelul SAM este limitat, grupa C-4 amino devine labil, permiând deaminarea
intermediarului i formarea uridinei, favorizând direct mutatia de tranzi
ie: C---U.
Interacia DNMTazei HhaI cu ADN, în absena SAM, a fost studiat de Wu i Santi (1987),
care au artat faptul c enzima se leag de ADN cauzând un schimb rapid de protoni cu apa, în
poziia C-5 a inelului pirimidinic. Rezultatele au fost interpretate ca fiind datorate formrii
reversibile a intermediarului nearomatic dihidropirimidinic, discutat anterior. Cunoscându-se faptul
c, în baza liber (citozina), reducerea dublei legturi C5=C6 determin creterea vitezei reaciei de
deaminare cu un factor de 104 (Selker, 1990), s-a tras concluzia general privind favorizarea
reaciei enzimatice de deaminare a citozinei la uridin, de ctre absena SAM.
În concluzie, aciunea natural a ADN metiltransferazei eucariote sau procariote poate fi
orientat, în funcie de condiiile de reacie, ctre o modificare epigenetic, respectiv transferul
grupei metil pe heterociclul restului de citidin, sau ctre o mutaie de tranziie (modificare
genetic): aceasta poate fi de tipul C-U sau mC-T.

(1) (2)
NH2 NH2 NH2 (3) NH2
Legarea
enzimei CH3 Eliberarea CH3
Transferul m m
C C C C
MTaza grupei metil enzimei
MTaza MTaza

(4) (5) (6) (7)

Deaminare Deaminare Deaminare
Deaminare
spontana enzimatica enzimatica spontana

NH2 NH2 NH2

NH2
O
O O O
CH3
CH3
T
U U T

MTaza MTaza

(11) (13) (14)

(12)
(T C)
(U C)

Enzima reparatoare Enzima reparatoare Enzima reparatoare

uracil - ADN -glicozilaza timin - ADN -glicozilaza timin - ADN -glicozilaza
activa blocata activa

Fig.21. Reacii biochimice în cadrul crora este implicat substratul (rest de citidin) i enzima-ADN
metiltransferaza. Sunt evideniate activitile diferite ale enzimei, produii de reacie (1-7) corespunztori i
activitile enzimatice reparatorii din cadrul sistemelor eucariote

Astfel, s-a constatat c o DNMTaz procariot, având o mutaie în cadrul domeniului su de
legare a SAM, este capabil s acioneze ca o enzim mutagen (Shen i colab., 1995). Dei, înc
39
nu s-au obinut dovezi directe ale unui comportament identic la DNMTaza eucariot, experimentele
bazate pe influena dietei deficiente în substane donoare de grupe metil asupra mutagenicitii
enzimei sunt deocamdat un indiciu clar al implicrii acesteia printr-un mecanism asemntor, în
carcinogenez.

Fig.22. Structura moleculara a complexului ADN dubla elice (schelet glucid-fosfat: verde/bazele azote:
mov)/citozina ; baza major este rotit ctre exterior (reprezentat în rou)/DNMTaza (domenii funcionale
în form de panglici) (dup Smith, 1998)

Se presupune c SAH eliberat din reacie - în urma donrii de ctre SAM a grupei metil -
atac situsul de legare a donorului SAM din domeniul funcional corespunztor al DNMTazei, cu o
afinitate mai mare decât acesta din urm (Wu i Santi, 1987); pe aceasta cale se inhib legarea SAM
la DNMT, având loc blocarea reaciei de metilare a citozinei. Rezultatele descrise de numeroi
cercettori au demonstrat faptul c SAH este un inhibitor al activitii mutagene (deaminazice) pe
care o poate desfura DNMT (probabil, datorit stabilizrii legturii C-4 - NH2), aciunea sa
inhibitorie fiind dependent de concentraie (inhibiia începe la nivelul 3nM i este maxim la
nivelul 3μM).
De asemenea, în cadrul experimentelor de manipulare genomic la plante, în cultura celular
sau tisular (“in vitro”) respectiv, în experimentele de embriogenez somatic, s-a observat faptul
c metilarea citozinei interfer cu calea metabolic de sintez a etilenei, prin intermediul SAM
(Okkels, 1998; Brown, 1989). Nivelul acestuia din urm determin activarea uneia sau alteia din
cile alternative, asigurând astfel o flexibilitate mai mare genomului i deci metabolismului vegetal,
comparativ cu al celorlalte eucariote superioare (acestea tolerând nivele mult mai sczute ale
variaiei nivelurilor metilrii ADN sau SAM) (Reacia ).

40
 Controlul descris al activitii enzimei a fost speculat în numeroase experimente de
investigaii epigenetice. Una din metodele cele mai eficiente este cea de inhibare a activitii
DNMTazei “in vitro” sau “in vivo” prin aciunea unor analogi ai resturilor de citidin (5-
azacitidina, 5-azadeoxicitidina) (Jones i Taylor, 1980, 1981).

Fig.23. Structura analogului citidinei (5-azacitidinei) încorporat în secvena ADN. B. Legtura covalent
format între enzima ADN metiltransferaza (DNMTaza) i restul de 5-azacitidin este foarte puternic i
determin blocarea înaintrii pe catena ADN a enzimei pentru procesarea resturilor de citidin metilabile.

Aciunea 5-azacitidinei (5-azaC) a fost descoperit în experimentele care au vizat

elaborarea strategiilor de tratament în cancer. Tratamentul cu citostaticul 5-azaC s-a utilizat mai cu
seam în cazurile de leucemii, observându-se frecvent activarea întâmpltoare a unor gene, care au
fost sileniate în mod aberant.
Mecanismul inhibiiei exercitate de acest analog asupra DNMTazei se bazeaz pe
incorporarea sa prealabil în secvena nucleotidic ADN, în locul citidinei; o astfel de substituie nu
altereaz interacia enzimei cu ADN i nici siturile specifice de legare a derivatului, ci determin
formarea de legturi covalente stabile între enzim i analog (Fig.23).
Fixarea DNMTazei în legturi covalente cu analogii citidinei blocheaz înaintarea ei pe catena
polinucleotidic i, în consecin, întreaga sa activitate metilazic ulterioar. Molecula ADN rezultat
va fi astfel lipsit de grupele metil, fapt ce determin declanarea procesului de "demetilare"pasiv.
Deoarece acesta din urm are la baz încorporarea analogului pe parcursul sintezei ADN, astfel de
metode nu sunt posibile decât în condiiile unei rate mari de diviziuni celulare, deci în culturi stabile
de celule sau esuturi (Christman i colab.,1980; Jones i Taylor, 1981).
În numeroasele sisteme studiate, tratamentele cu 5-azaC au condus, iniial, la activarea
unor gene sileniate, proces dovedit prin metode care urmresc expresia în transcripte ARN (Real
Time PCR) (Groudine i colab., 1981; Jones i colab., 1981). Articolul original care a raportat
proprietatea de activator de gene a 5-azaC a descris de fapt activarea unui set complex de funcii
celulare, care a condus la diferenierea “in vitro” a fibroblastelor de oarece în celule de muchi

41
(Constantinides i colab., 1977). Studiul mecanismului de implicare a acestui agent în procesul de
activare a anumitor gene a relevat faptul c ac iunea sa se bazeaz pe blocarea enzimei în timpul
replicrii, ceea ce determin demetilarea pasiv a ADN în anumite secvene.
Elucidarea structurii i a mecanismului de ac iune a acestei substan e de sintez a condus la
concluzia c, prin incorporarea sa într-o caten nou sintetizat ADN, urmat de legarea ireversibil
la DNMTaz, 5azaC poate inhiba activitatea enzimatic de metilare i, prin aceasta, evident s
conduc la demetilarea ADN (Hepburn i colab.1987; Jones 1984). Aceast descoperire a
determinat dezvoltarea exploziv a domeniului metilrii ADN, facilitând urmrirea efectelor
demetilrii în procesele de diferen iere/dediferen iere în culturile “in vitro”, atât în sistemul
vegetal, cât i în cel mamalian.

4. PROTEINELE – “CITITORI” SAU SENZORI AI MARCAJELOR

EPIGENETICE LA NIVELUL ADN

Proteinele MBD (MBDP-terminologie derivat din cea englez: Methyl Binding Domain
Protein) sunt grupate într-o familie pe baza omologiei de secven . Ele(în afara proteinei MBD3)
au particularitatea de a se lega specific de resturile metil-CpG i de a determina o scdere a
procesului transcrip ional prin recrutarea altor compleci proteici, care controleaz procesul de
represie a genelor (cum ar fi cele care implic histon deacetilazele, HDAC). Fiecare din aceste
proteine prezint caracteristici proprii, descrise în paragraful urmtor (Fig. ).
MECP2 a fost prima membr clonat a acestei familii (Lewis i colab., 1992; Meehan i
colab., 1992). Ea prezint un domeniu MBD capabil de a lega o dinucleotid CpG metilat simetric,
prin contactul cu catena major ADN (Wakefield i colab., 1999). MeCP2 este capabil s silen eze
transcrierea prin intermediul domeniului su TRD (de la: transcriptional repression domain);
aceasta interac ioneaz preferen ial cu complexul bazal al transcrierii (Nan i colab., 1993; Nan i
colab., 1997; Nan i colab., 1998; Kaludov i Wolffe 2000). MeCP2 face parte din complexul
Sin3a/HDAC (Jones i colab., 1998; Nan i colab., 1998). i a fost cea care, prin intermediul
studiului ei, a permis corelarea mecanismelor moleculare de metilare ADN cu structura cromatinei
(Nan i colab., 1998; Jones i colab., 1998). MeCP2 interac ioneaz în mod egal cu o
metiltransferaz specific pentru lizina 9 din cadrul histonei H3 (Fucks i colab., 2003).
Activitatea alterat a MeCP2 este responsabil de sindromul Rett, caz în care au fost
identificate numeroase muta ii atât în domeniul su MBD, cât i în domeniul TRD (Fig.). MeCP2
este exprimat în majoritatea esuturilor, având un nivel particular mai ridicat în neuroni, ceea ce
concord cu retardul mental ce caracterizeaz sindromul Rett.

42
 MBD1 este singura protein a acestei familii care poate s lege atât promotorii metilai cât i
pe cei nemetilai. Ea posed un domeniu MBD amino-terminal, un domeniu TRD carboxi-terminal
i un domeniu bogat în cistein (CXXC), observat, de asemenea în structura DNMT. Domeniul
CXXC este necesar în procesul de represie independent de metilare (Fujita i colab., 2000). MBD1
este de asemenea capabil de a lega o metiltransferaz a histonelor, cât i proteina specific
heterocromatinei HP1, ceea ce determin de altfel gradul de represie înalt impus de MBD1 (Sarraf
i Stancheva, 2004).

MBD2 posed un domeniu MBD i un domeniu TRD care interfer cu domeniile proteice
din complexul MeCP1/NuRD, un complex proteic de remodelare a cromatinei. Acesta acioneaz
prin deacetilarea cromatinei atunci când aceasta se afl în stare metilat (Zhang i colab., 1999;
Boeke i colab., 2000). Anumite echipe de cercettori au raportat o activitate demetilazic a ADN
atribuit proteinei MBD2.

MBD3 este foarte asemntoare proteinei MBD1 în ceea ce privete omologia de secven,
îns MBD3 este incapabil de a lega ADN metilat (Hendrich i Bird, 1998). Ea face parte, de
asemenea din complexul NuRD i particip la represia transcripional. MBD3 este necesar pentru
dezvoltarea embrionilor de obolan (Hendrich i Bickmore, 2001). În acest context, s-a sugerat
faptul c MBD3 este important în întreinerea integritii complexului NuRD (Szyf 2003).
MBD4 este singurul membru al familiei care nu este implicat în represia transcripional. MBD4
posed o activitate de timinglicozilaz i controleaz integritatea genomului, fiind capabil s
înlocuiasc timina rezultat dintr-o reacie spontan, într-o citozin ce face parte dintr-o secven
dinucleotidic CpG. Numeroase studii indic faptul c MBD4 diminueaz susceptibilitatea secvenelor
CpG fa de mutaii, deci tumorigeneza „in vivo” (Hendrich i colab., 1999; Millar i colab., 2002).

KAISO este de asemenea o protein cu afinitate pentru secvenele CpG metilate simetric
(Prokhrochuk i colab., 2001), dei ea face parte dintr-o alt familie, cea a proteinelor BTB/POZ
zinc Finger). În experienele de transfecie tranzitorie, s-a observat c proteina Kaiso reprim
procesul de transcriere într-un mod independent de metilare (Prokhrochuk i colab., 2001). Kaiso
leag proteina catenina (p120) asociat E-cadherinei. Aceasta sugereaz o legtur între represia
transcripional mediat de metilarea ADN i semnalizarea molecular de la suprafaa celular
(Daniel i Reynolds 1999).

MBD2 - o demetilaz ADN?

43
 Metilarea ADN este un fenomen reversibil, îns datele obinute pân în prezent în domeniu
nu reprezint suficiente elemente pentru a demonstra cu siguran existena acestui proces i
mecanismul corespunztor de aciune. Exist totui numeroase ipoteze în ceea ce privete acest
subiect. Monk i colab. (2004) au postulat o demetilare pasiv care a rezultat din replicarea ADN în
absena metiltransferazei sau prin disimularea siturilor de metilare prin factori de transcriere; a mai
fost propus, de asemenea i o scdere general a activitii metiltransferazice (Monk i colab.,
1991). Îns o demetilare activ nu pare a necesita diviziunea celular i procesul de replicare.
Astfel, în 1999, grupul Ramchandani i colaboratorii au extras din celule de carcinom pulmonar
uman o activitate demetilazic. În acelai an, echipa Bhattacharya a clonat o demetilaz omoloag
cu MBD2 (Bhattacharya i colab., 1999). În 2003 s-a demonstrat c celulele 293 posed o activitate
demetilazic a ADN i c aceasta era inhibat printr-un tratament antisens pentru MBD2 (Detich i
colab., 2003). O demetilare activ a fost raportat într-un singur caz, acela al genei pentru
interleukina 2 (IL-2), în decursul activrii limfocitelor T (Bruniquel i Schwartz, 2003). Aceste
rezultate care atribuie proteinei MBD2 o activitate de demetilare ADN, sunt înc foarte contestate
în domeniul epigeneticii i necesit înc dovezi de confirmare.

MECANISME DE FORMARE, ÎNTREINERE

I MODIFICARE A PATTERN-ULUI DE METILARE ADN

Mecanisme de formare, întreinere i modificare a pattern-ului de metilare ADN

SECVEN
ELE REPETITIVE ADN- SUBSTRAT PREFEREN
IAL PENTRU DNMAZE

Primele indicii privind iniierea procesului de stabilire a pattern-urilor de metilare ADN au

fost obinute prin studiile realizate asupra plantelor modificate genetic i de asemenea asupra
fungilor. Ele au evideniat un criteriu esenial care st la baza preferinei enzimelor metilaze pentru
substratele ADN: perechi de secvene repetitive, omoloage (Bender, 1998). S-a specificat de altfel,
în paragraful anterior faptul c substratul propriu-zis al activitii unei metilaze ADN este un rest de
citidin, mai direct, inelul pirimidinic al acestuia (baza azotat, citozina). Accesibilitatea citozinei
pentru activitatea unei enzime metilaze depinde de rsucirea acesteia în afara dublei elici ADN, o
structur deosebit de rigid, stabil, care „îngroap” practic înspre interiorul su bazele azotate,
dispuse spaial prin intermediul unor fore „stivuitoare” (stacking). O astfel de rsucire în curbura
majora a dublei elici ADN poate avea loc doar în secvenele repetitive ADN, de tip CpG sau în
secvene repetitive coninând restul de citidin, îns non-CpG. Dup cum s-a mai menionat, aceste

44
secvene produc tensiuni în cadrul dublei elici ADN, care determin rsucirea bazei majore citozina
ctre exteriorul dublei elici.
Datele recente au subliniat faptul c toate genomurile eucariote conin secvene ADN
repetitive: se presupune c o presiune selectiv ar fi impus necesitatea stabilirii unui anumit pattern
de metilare i, totodat a unui mod de întreinere a unui anumit nivel de metilare în secvenele
repetitive ale genomului eucariot. Elucidarea mecanismelor de stabilire a unor astfel de profiluri de
metilare ar putea conduce la înelegerea modului în care metiltransferazele îi recunosc substratul i
aleg o cale specific de aciune.
Unele dintre secvenele repetitive, cum ar fi genele pentru ARNr (ARN ribozomal) ca i
secvenele repetitive asociate centromerului joac roluri importante în organisme. Exist, pe de alt
parte, i alte secvene (cum ar fi elementele transpozabile i virusurile), care reprezint parazii
moleculari ce pot avea efecte nefaste asupra gazdelor lor. În numeroase eucariote secvenele
repetitive sunt modificate prin metilarea resturilor de citidin (C) aflate în poziiile 5'. Aceast
metilare a C este asociat cu dou efecte, care sunt considerate drept mecanisme de aprare
împotriva elementelor repetitive mobile (Bender, 1998):
(i) pierderea activitii de transcriere (dependente de ARN polimeraza II) în regiunea
metilat- fie prin împiedicarea iniierii transcrierii, fie prin împiedicarea alungirii transcriptului; de
aceea, metilarea secvenelor elementelor transpozabile poate silenia expresia genelor codificate de
transpozon i astfel s împiedice rearanjamentele ADN mediate de acetia. De asemenea, metilarea
secvenelor elementelor transpozabile poate silenia transcrierea de tip "read-through" de la
promotorii de transpozon ctre genele vecine, gazd, iar prin aceasta putând s blocheze expresia -
neadecvat momentului - a genelor respective.
(ii) reducerea recombinrilor omoloage dintre regiunile metilate; conform acestei idei, rolul
metilrii secvenelor repetitive ar putea fi cel de represie a recombinrii dintre repetiiile aflate în
diferite poziii genomice, care, altfel, ar conduce la translocaii ca i alte rearanjamente
cromozomale.
Un model descris de Bender (1998) privind selecia de ctre enzim a anumitor substrate se
bazeaz pe proprietatea deosebit a perechilor de secvene omoloage. Astfel, s-a observat c unele
dintre secvenele repetitive sunt detectate printr-un mecanism de împerechere de tip ADN-ADN.
Astfel de hibrizi formai între duplexuri ADN cu secvene omoloage ar prezenta caracteristici unice,
care le-ar marca, în cadrul secvenelor adiacente ale genomului, drept inte pentru atacul enzimelor
metilazice. Una din activitile citozin-metiltransferazei la eucariote are deci rolul de a detecta
speciile aberante de ADN formate prin împerecheri de secvene omoloage.
Astfel de specii aberante de ADN s-au detectat la fungi (Neurospora crassa i Ascobolus
immersus) (Selker i colab., 1990; 1993), la plante (Arabidopsis) (Bender, 1998) i la mamifere (în

45
cadrul repetiiilor de trinucleotide CpNpG, ca de exemplu: trinucleotida (CAG)n - caracteristic
bolilor neurodegenerative, precum sindromul Huntington, trinucleotida (CCG)n - caracteristic
sindromului de retard X fragil, trinucleotida (CTG)n - caracteristic distrofiei miotonice). S-a
constatat c numrul crescut de copii de gene sau amplificarea anormala a repetiiilor scurte ca cele
trinucleotidice (microsatelii), în decursul procesului replicrii (printr-un mecanism denumit
"slippage"), determin formarea unor împerecheri diferite de cele normale de tip Watson-Crick
(Clark, 1995 i Rubin, 1999).
Pe baza considerentelor menionate, s-a tras concluzia c o nota comuna eucariotelor, fie ca
acestea sunt fungi, plante, mamifere sau om, este reprezentat de preferin DNMTazei pentru
substrate de ADN în conformaii cu caracteristici speciale. Caracteristicile speciale care
marcheaz substratele pentru interacia cu enzima ar lua natere în cadrul unor hibrizi compleci de
tipul ADN-ADN sau chiar ADN-ARN. Acest tip de "concatemeri" (dubli, tripli etc.) pot aprea
prin împerecherea secvenelor omoloage de ADN dispuse în tandem sau în sens invers sau chiar
dispuse ectopic, la distane mari între ele i dispuse pe cromozomi diferii (Bender,1998). Parametrii
fizico-chimici din secvenele ce conin resturile de citidin (simetrice, de tipul CpG sau asimetrice,
de tipul CpNpG) sunt alterai în cadrul hibrizilor, astfel încât, pe de o parte, ele s poat marca
substratul pentru interacia cu enzima, iar pe de alt parte, s labilizeze legtura N-glicozidic dintre
inelul heterociclic al citozinei i scheletul fosfoglucidic al ADN (rsucirea citozinei în poziia
extrahelical).
Studiile de transgenez la plante au permis îmbogirea cunotinelor în privina acionrii
metilazelor de ctre hibrizii de acizi nucleici. În Fig. este redat un model propus pentru silenierea
transgenelor prin intermediul perechilor de secvene omoloage, aflate în copii multiple (Matzke i
Matzke, 1995).
Un numr mare de informaii din literatura de specialitate indic faptul c Arabidopsis
metileaz nu numai secvenele endogene înalt repetitive, dar metileaz de novo i unele secvene
alogene, transgenice. O trstur comun acestor transgene metilate este îns aceea c secvenele
respective se afl în aranjamente complexe concatemerice, alctuite din dou sau mai multe copii de
transgene inserate într-un singur locus (Bender, 1998). Pentru transgenele care prezint fenotipuri
observabile în frunze de Arabidopsis aflate în dezvoltare, metilarea i pierderea expresiei este
presupus a avea loc în mod somatic, determinând apariia unor fenomene de mozaicare a
sectoarelor de esuturi sileniate i a celor cu expresie activ. De asemenea, dac transgena este
purttoare i de secvene endogene omoloage, este posibil iniierea metilrii i silenierea ulterioar
a tuturor secvenelor rezidente identice. Metilri în "trans" i inactivri similare a secvenelor
identice, îns nelegate, ectopice, de ctre transgenele complexe metilate au fost, de asemenea,
observate la tutun (Bender, 1998).

46
 De asemenea, analiza metilrii unei familii endogene interesante, la Arabidopsis, genele
PAI (ce codific enzime catalizatoare ale celei de-a treia etape din calea biosintetic a
triptofanului), a condus, pe de o parte, la explicarea mecanismelor de metilare dens a
aranjamentelor de transgene complexe, iar pe de alt parte, la lmurirea modului în care acestea pot,
uneori, s iniieze trans-metilarea secvenelor identice (Bender i Finck, 1995).
Tulpina standard de Arabidopsis, Columbia (Col), posed trei copii aproape identice,
nelegate i nemetilate, ale genei PAI. Spre deosebire de aceasta, tulpina Wassilewskija (WS)
prezint o duplicare i rearanjare într-unul din cele trei locusuri PAI, ceea ce a condus la o repetiie
invers (de tip “cap la cap”), implicând dou gene cu lungime integral. S-a observat c, la tulpina
WS, metilarea citozinei este evident în fiecare membru al familiei genei PAI.
La WS, metilarea citozinei este corelat cu silenierea cel puin a unuia din cele trei locus-uri
PAI. S-a sugerat, astfel faptul c repetiia inversat a structurii PAI însi ar reprezenta o structur
de atracie a metiltransferazei. Încruciarea WS cu Col a condus, în hibridul rezultat, la combinaia
repetiiei inversate WS cu genele PAI nemetilate din Col. Aceast combinaie nou a determinat
metilarea genelor Col PAI, observaie concordant cu ideea sugerat anterior.
Pentru explicarea mecanismului de metilare a repetiiilor inversate s-a fcut o analogie cu
metilarea în fungi. Astfel, metilarea la Arabidopsis ar putea fi direcionat ctre secvene
împerecheate neadecvat, detectate în timpul unui proces general de detecie a secvenelor
omoloage, în acest caz, în celulele somatice. Cu toate acestea, perechile generate de ctre secvene
identice dar nelegate, cum ar fi cele dou gene PAI în Col, nu ar putea rezista suficient pentru a fi
recunoscute i metilate. Dimpotriv, o repetiie inversat care poate sa se plieze simplu, de-a lungul
propriei sale secvene, formând o conformaie în “ac de pr” (auto-împerecheat), ar putea fi mult
mai eficient recunoscut ca substrat de metilare, datorit stabilitii sale relativ mari. Repetiiile
directe aflate în tandem, dar separate de o secvena ADN suficient de lung pentru a permite
formarea unei bucle prin auto-împerechere poate de asemenea s formeze regiuni relativ stabile, pe
baza autoîmperecherii; aceste regiuni pot servi drept substrate adecvate pentru metilaza "de novo".
Transpozonii i retrotranspozonii plantelor conin deseori secvene terminale formate din
repetiii directe sau inversate, generând frecvent duplicaii locale adiionale sau inversii, în cadrul
ADN flancator. De aceea, se consider faptul c metilarea eficient a acestor tipuri de secvene ar
constitui, pentru Arabidopsis, o cale de a distinge i de a se apra împotriva transpozonilor, care
sunt considerai secvene opuse familiilor de gene rezidente, desirabile. De asemenea, în cadrul
acestora din urm, între secvenele identice de exoni sunt intercalate secvene intronice divergente,
care blocheaz eficient împerecherea i deci metilarea. Dimpotriv, duplicaiile genelor induse de
transpozoni ar conine secvene neîntrerupte de identitate cu exonii i intronii, ceea ce poate induce
împerecheri ectopice.

47
 La plante s-a detectat i un mecanism de sileniere a genelor omoloage nelegate. Acest
mecanism a fost explicat pe baza stabilitii hibrizilor ADN-ADN. Interaciile dintre genele aflate ca
obiectul cu imaginea sa în oglind, într-o repetiie invers pot produce structuri noi, ce atrag
metilaza "de novo". Se presupune c hibrizii de împerechere formai în loci cu repetiii inverse pot
fixa i stabiliza perechile mai instabile ADN-ADN dintre catene omoloage nelegate; aceti noi
hibrizi, mai compleci, pot persista ulterior, suficient pentru a fi detectai de metilaze i metilai.
Deoarece acest tip de compleci ar consta dintr-un amestec de catene ADN metilate i nemetilate, el
ar putea fi recunoscut atât de metilazele de întreinere, cât i de cele de novo (Bender, 1998).
S-a demonstrat, în cazul a numeroase sisteme biologice studiate, c repetiiile inverse au un
efect negativ asupra expresiei genice. Spre exemplu, atunci când petunia este transformat cu
construcii purttori ai unei versiuni fr promotor a genei pentru chalconsintaza (CHS)-o gen ce
codific biosinteza unui pigment, doar liniile transgenice care achiziioneaz repetiiile inverse ale
inserilor transgenici -CHS- atrag procesele de sileniere tocmai în gena autohton pentru CHS.
Genele R de la porumb reprezint de asemenea un model de studiu a silenierii la plante.
Acestea codific factorii transcripionali pentru expresia genelor pentru pigmeni, iar nivelul
expresiei lor poate fi monitorizat prin inspecia vizual a fenotipurilor pigmeilor vegetali. S-a
constatat c un aranjament complex a patru repetiii în tandem de gene R prezint metilarea
secvenelor R în 5' , determinând o expresie genic joas (slab).
Chiar i la Drosophila melanogaster, un organism la care s-a detectat doar recent (Lycko,
2001) o activitate slab de metilare a resturilor de citidin (doar în embriogeneza timpurie i, mai
târziu, în dezvoltarea organismului, în genele POL, care controleaz activitatea transpozonilor), s-au
observat procese de sileniere în cazuri de transgenez: respectiv, a inseriilor repetate invers a unei
mini-transgene white (Bender, 1998).
Aceste fenomene de sileniere ar putea, în consecin, s reflecte o atracie special pe care o
exercit secvenele repetate invers i împerecheate, împiedicând expresia genic indiferent de starea
de metilare a secvenelor interacionate.

Metilarea ADN i “mutaiile” dinamice: Expansiunea repetiiilor trinucleotidice

la mamifere i silenierea lor prin metilare

Fenomene similare cu cele descrise anterior, de formare a unor conformaii speciale de ctre
repetiiile de nucleotide, s-au detectat i la mamifere. Amplificarea unor astfel de repetiii activeaz
deci DNMTazele, acestea putând conduce la stabilirea unor modificri genomice generatore de boli.
Un numr cresctor de boli genetice este descris în perioada actual în relaie cu
amplificarea anormal a repetiiilor trinucleotidice din cadrul secvenelor transcrise. Mecanismul

48
clasic al expansiunii acestor microsateli
i trinucleotidici este presupus a se baza pe împerecheri
greite, intracatenare, între catena „lagging”, amplificat aberant (prin „slippage”) în procesul de
replicare sau reparare al ADN, în contrast cu minisateli
ii, care implic o unitate repetitiv mult
mai lung i care determin instabilitatea proceselor intercatenare de recombinare i conversie
genic (Chiurazzi,1998).
Astfel, în numeroase boli neurodegenerative, cum ar fi boala Huntington i unele ataxii
spinocerebelare, s-a detectat repeti ia (CAG)n în interiorul secven ei de gene. Aceast repeti ie, în
cazul în care are loc la niveluri aberante, determin sinteza unei polipeptide con inând o regiune
variabil poliglutaminic, dovedit a fi toxic în cazul în care numrul resturilor de glutamin este
dublu (corespunztor la 100 de repeti ii).
Un alt caz este cel al repeti iilor care se situeaz în regiunea netranscris 5' sau 3' a unui
transcript ARN (ca în cazul sindromului de retard mintal datorat situsului X fragil – con inând
repeti ia (CGG)- sau a distrofiei miotonice, con inând repeti ia (CTG); alt pozi ie a repeti iilor
poate s fie localizat într-un intron (ca în ataxia Friedriech, caz în care repeti ia trinucleotidic este
reprezentat de (GAA). Numrul unor astfel de repeti ii poate depi valoarea 1000. În aceste
cazuri, secven a codificatoare a genelor respective este intact, în schimb, ea poate silen ia gena
FMR1 (cazul X fragil).
S-a tras concluzia c, dac tripletele nu sunt traduse, dublarea sau triplarea numrului lor nu
are efect fenotipic, dei secven a amplificat ( denumit frecvent, "premuta ie") (tefnescu, 2001)
devine extrem de instabil i predispus unei expansiuni ulterioare, prin transmiterea meiotic.
Atunci când numrul tripletelor depete un nivel critic (de exemplu, pentru X fragil, acesta este de
peste 200 trinucleotide CGG), func ia genic este alterat i, de asemenea devine evident
instabilitatea mitotic. Indivizii prezint, în aceste cazuri, un mozaic pentru un numr de alele ce
sufer diferite amplificri (Chiurazzi, 1998).
Efectul patogenic al unor astfel de expansiuni extreme de triplete, în cazul distrofiei
miotonice i ataxiei Friedriech, este aparent datorat instabilit ii ARNm; în cazul X fragil, situa ia
este pu in diferit: regiunea (CGG)n devine complet metilat dac dimensiunea sa se afl în
domeniul 200-1000 repeti ii, corespunztoare unei "muta ii fixe sau depline" (Chiurazzi, 1998). Tot
în cel din urm caz s-a observat i un fenomen de metilare complet a insulelor CpG din regiunea
înconjurtoare tripletelor, ca i când s-ar afla pe un cromozom X inactiv.
O regul general desprins din aceste aspecte este aceea c toate aceste repeti ii rezid în
regiuni netranscrise ale genomului i nu au fost asociate cu nici o alta dezordine genetic atunci
când au fost detectate în forma complet de extindere i hipermetilare.
Din punct de vedere structural, expansiunea tripletelor CGG permite formarea
conforma iilor anormale, diferite de cele Watson-Crick, posibile pe catena” lagging”, format în

49
timpul replicrii . Astfel de conformaii reprezint substrate prefereniale pentru DNMTaze (Rubin,
1999), ceea ce determin hipermetilarea acestor repetiii. Ulterior, se presupune c intervenia
proteinei de legare specific a situsurilor metilate, MeCP2 sau MBD, ar determina blocarea
accesului la aparatul transcriptor, ceea ce ar determina, deci, silenierea genelor ce conin repetiiile.
Enzima activ în astfel de situsuri este metilaza "de novo".
Motivaia amplificrii repetiiilor a fost explicat de Bestor i Tycko (1996) pe baza ipotezei
"aprrii genomului": structurile anormale, de tip "slippage", formate de repetiiile amplificate CGG
ar atrage o metilare "de novo", precum intermediarii de integrare sau transpoziie. Prin metilare s-ar
stabiliza mutaia "complet" din celulele somatice, la cazurile X fragil (Chiurzzi, 1998).

Situri "critice"de metilare/demetilare

Experimentele realizate în domeniul expresiei genice au demonstrat faptul c ADN prezint
o dimensiune informaional compus atât din secvene codificatoare, cât i din secvene
necodificatoare, dar care pot suferi modificri ale bazelor cu dimensiune de semnal (în condiiile în
care secvena rmâne neschimbat). Din sumarul datelor prezentate anterior reiese clar faptul c
exist o baz de date suficient de convingtoare pentru fundamentarea ipotezei rolului metilrii
ADN în modularea structurilor macromoleculei informaionale i, prin aceasta, în exercitarea
funciilor sale (replicare, reparare, transcriere, mutagenez etc).
Deosebit de important este, în acest context, observaia faptului c metilarea resturilor de
citidin este nerandomic i, totodat, ereditar. S-a constatat astfel, c nu este doar o simpl relaie
între prezena sau absena grupelor metil în cadrul sau în jurul secvenei unei gene particulare i
activitatea transcripional a acelei gene. Christman i colaboratorii (1977), referindu-se la rolul
inhibitor al metilrii în transcriere, au speculat sugestiv faptul c este posibil ca doar câteva din
situsurile specifice metilabile teoretic s necesite “grefarea sau eliberarea grupelor metil” de pe
inelul pirimidinic al citozinei, pentru a interfera cu legarea unei proteine represor sau pentru a
facilita legarea ARN polimerazei.
Din analiza efectului metilrii asupra structurilor ADN se trage concluzia c profilul
(pattern-ul) de metilare (distribuia situsurilor metilate în macromolecula ADN) depinde strâns de
organizarea cromatinei i de accesibilitatea situsurilor de metilare în cadrul acesteia; spre
exemplu, atunci când se realizeaz metilarea „in vitro” a cromatinei din ficat de obolan (în
prezena ADN metilazelor bacteriene), aceasta accept un numr net mai mic de grupe metil,
comparativ cu acelai ADN „gol” sau liber de interacii (naked DNA), purificat din aceeai
cromatin (Kiryanov i colab.1981). Deoarece sinteza ADN i a histonelor este coordonat, iar
nivelul histonelor din celul este relativ mic, inhibarea sintezei de histone poate conduce la
formarea unei structuri noi de cromatin, cu situri adiionale ADN expuse ctre ADN metilaze.

50
 Modelele descrise anterior au evideniat etapele metilrii i încadrarea proceselor de
metilare în orchestraia complex a factorilor de control a expresiei genice la eucariote. Acestea,
îns nu au explicat mecanismul molecular prin care enzima DNMTaza "alege", din cadrul siturilor
metilabile ale secvenelor repetitive CpG, siturile critice ca substrat activ. Razin (1984) propune un
astfel de model al dinamicii activitii de întreinere i "de novo" a metilazei, pe baza implicrii a
doi parametrii eseniali ai replicrii i metilrii: rata diviziunii i deci a replicrii ADN i, respectiv,
afinitatea variabil a enzimei fa de anumite situsuri de citozin (probabil, în funcie de regiunea
genomic în cadrul creia se afl acestea).

Dinamica nivelului de metilare ADN variaz în funcie de programul epigenetic de

expresie genic-specific de esut i de etapa de dezvoltare

Nivelul de metilare în cadrul unui ADN genomic eucariot variaz în timpul dezvoltrii
organismelor. Aceast dinamic depinde atât în funcie de concentraia resturilor de 5mC,
comparativ cu resturile de citozin nemetilata (C), dar i de o anumit distribuie a situsurilor
metilate fa de cele nemetilate, distribuie denumit „pattern de metilare ADN”. Acesta poate fi un
pattern general, referitor la întregul organism sau un pattern specific de esut.
În decursul etapelor de dezvoltare a organismelor complexe, precum cele eucariote
superioare, pattern-ul de metilare al ADN genomic se schimb: de la pattern-ul specific celulei-ou
sau zigotului i pan la pattern-urile detectate în celulele somatice. Acestea din urm sunt specifice
esuturilor care contribuie la funcionarea specializat, corect a organelor mature dintr-un organism
pluricelular. Dei secvena genelor într-un genom, denumit genotip, este identic în toate celulele
organismului, indiferent de specializare, pattern-ul de metilare ADN care este specific de esut, este
factorul de citodifereniere între celule. El difer în funcie de tipul de esut i de etapa de
dezvoltare. Pattern-ul de metilare ADN codific informaia epigenetic referitoare la expresia
spaio-temporal a genotipului controleaz expresia unui anumit set de gene într-un anumit tip de
esut, într-o anumit etap de dezvoltare a acestuia, determinând astfel un pattern de expresie genic
i deci un fenotip celular specific.
Formarea pattern-urilor de metilare ADN i întreinerea lor sub forma distribuiei corecte a
siturilor metilate 5mC reprezint un proces crucial pentru dezvoltarea normal a organismelor.
Pattern-rile corecte de metilare ADN sunt de altfel cheia unui metabolism corect celular i fiziologia
corecta la nivel de organe i la nivelul întregului organism. Modificri ale distribuiei siturilor
critice metilate conduc la modificarea dramatic a pattern-ului de expresie specific de esut i deci
a fenotipurilor celulare.
O bogat literatur se ocup, începând din anii 80 i extensiv în zilele noastre de
mecanismele moleculare ale stabilirii i întreinerii, în condiii normale sau, modificrii, în condiii

51
patologice, a pattern-ului de metilare în ADN genomic. Cu toate acestea, numeroase aspecte legate
de detaliile biochimice, în special cele privind interaciile dintre modificrile proceselor de metilare
ADN i cele de modificare a histonelor, respectiv integrarea proceselor de metilare ADN în cadrul
proceselor de remodelare a confromaiei cromatinei, ramân înc neelucidate.
Problematica rmâne de mare actualitate. Procesele epigenetice, spre deosebire de cele
genetice, fiind reversibile sunt actualmente în centrul ateniei cercetrilor din domeniul
diagnosticului timpuriu al unor boli nonfamiliale, inexplicabile prin segregarea clasic mendelian.
În perioade „deschise’ modificrilor pattern-urilor epigenetice, induse de mediu (condiii
ambientale-poluare, diet sau stil de via), pot avea loc schimbri în pattern-urile de metilare
specifice de esut. Ele, spre deosebire de mutaii (modificri în secvena nucleotidic ADN, sunt
reversibile, cu alte cuvinte pot fi redresate prin aciunea unei enzime care catalizeaz îndeprtarea
direct a marcajelor reprezentate de grupele metil de la nivelul ADN sau prin modularea activitii
unei metilaze de novo sau de întreinere prin aciunea inhibitoare a unor substane chimice (precum
5-aza-citidina i derivaii acesteia). În cazul în care pattern-ul de metilare modificat aberant nu se
corecteaz, el se transmite ereditar, determinând în descenden, pân la a patra generaie (Skinner,
2006), reprogramri epigenetice al pattern-urilor de expresie specific de esut, cu efecte dramatice
asupra dezvoltrii individului.
Pentru înelegerea funcionrii proceselor de metilare ADN este necesar cunoaterea
enzimologiei acestora i mecanismele moleculare care implic intervenia activitilor metilazice
specifice. Mecanismele biochimice care stau la baza proceselor epigenetice în general i a
proceselor de metilare ADN, în special, pot fi abordate doar prin cunoaterea etapelor de dezvoltare
specifice, ce cunosc o variaie important a pattern-ului de metilare. În capitolul urmtor se vor
enumera i defini fiecare din aceste etape, punctându-se totodat tipurile de activiti metilazice care
acioneaz asupra ADN în stabilirea unui anumit pattern de metilare.

Dinamica nivelului de metilare ADN variaz în funcie de programul epigenetic de

expresie genic-specific etapelor de dezvoltare

Nivelul de metilare în cadrul unui ADN genomic eucariot variaz în timpul dezvoltrii
organismelor pe care aceast macromolecul informaional le controleaz. Caracteristicile acestei
modificri epigenetice a ADN sunt nu numai concentraia resturilor de 5mC, comparativ cu resturile
de citozin nemetilat (C), dar i o anumit distribuie a situsurilor metilate fa de cele nemetilate,
în aa-numite situsuri critice atât din punct de vedere al localizrii, cât i al numrului lor. Un astfel
de mod de distributie a situsurilor metilate fata de cele nemetilate sau metilabile, se numete
“pattern de metilare a ADN ”. Acesta poate fi un pattern general, referitor la întregul organism sau
un pattern specific de esut, coninut în cadrul celui general. În decursul etapelor de dezvoltare a

52
organismelor complexe, precum cele eucariote superioare, pattern-ul de metilare în cadrul ADN
genomic se schimb de la cel caracterizat în celula-ou sau zigot i pân la cele detectate în celulele
somatice, din cadrul esuturilor, organelor mature, ale unui organism pluricelular. Dei secvena
genomului, ADN, denumit genotip, este identic în toate celulele organismului, indiferent de
specializare, pattern-ul de metilare ADN, deci informaia epigenetic a expresiei spatio-temporale a
genotipului identic, este factorul de citodifereniere între celule. O bogat literatur se ocup,
începând din anii 80 i pân în zilele noastre de mecanismele moleculare ale stabilirii i întreinerii,
în condiii normale sau, modificrii, în condiii patologice a pattern-ului de metilare în ADN
genomic. Cu toate acestea, numeroase aspecte de detalii biochimice, în special legate de integrarea
proceselor de metilare ADN în cadrul proceselor de remodelare cromatinic, rmân înc
neelucidate. Problematica rmâne îns de mare actualitate. Procesele epigenetice, spre deosebire de
cele genetice, fiind reversibile, dar, totodat, stabilite în gametogenez, putând deveni ereditare,
reprezint centrul ateniei cercetrilor din domeniul diagnosticului timpuriu al modificrilor posibil
ereditare, dar cu rol în patogenez, cât i din domeniul terapiei cancerului prin metode epigenetice,
mai puin costisitoare i, posibil, mult mai eficiente.
Pentru înelegerea funcionrii proceselor de metilare ADN este necesar cunoaterea
enzimologiei acestora i mecanismele moleculare care implic intervenia activitilor metilazice
specifice. Mecanismele biochimice care stau la baza proceselor epigenetice în general i a
proceselor de metilare ADN, în special, pot fi abordate doar prin cunoaterea etapelor de dezvoltare
specifice, ce cunosc o variaie important a pattern-ului de metilare. În capitolul urmtor se vor
enumera i defini în parte fiecare din aceste etape, punctându-se totodat tipurile de activiti
metilazice care acioneaz asupra ADN în stabilirea unui anumit pattern de metilare.

1. EFECTUL 5mC ASUPRA STRUCTURILOR ADN

Structura primar- secvena nucleotidic

Modificarea bazei azotate prin metilare nu are efect asupra ordinii nucleotidelor în secven
a
ADN, cu alte cuvinte, nu afecteaz informaia genetic. Baza minor, 5mC, se obine dup cum s-a
descris anterior, “in vivo”, în procesul post-replicativ, dup sinteza noii catene ADN. Replicarea se
realizeaz prin copierea secvenei genetice de pe catena matri nu i a distribuiei grupelor metil.
Catenele ADN rezultate sunt, într-o prim faz dup replicare, demetilate, chiar dac în cadrul
catenei matri au existat resturi de citidin metilate (Adams, 1974)(Fig.). Pattern-ul de metilare
ADN se reface imediat dup sinteza secvenei ADN, prin aciunea DNMT1, activat în bifurcaia de
replicare prin ataarea la PCNA (Cap.1). Macromolecula dublucatenar ADN nou sintetizat este

53
hemimetilat, reprezentând de fapt substratul preferat de DNMT1. Aciunea acestei enzime va
determina deci ataarea unei grupe metil în situl rest de citidin pe catena ADN nemetilat, simetric
fa de situl metilat de pe catena veche (parental), care a reprezentat de fapt matria pattern-ului
parental de metilare.
Considerându-se structura cromatinei i replicarea acestui complex nucleoproteic,
modificarea minor a restului de citidin prin metilare se realizeaz prin aciunea enzimatic a
DNMTazei, concomitent cu sinteza celor doua fragmente de ADN: Okazaki i, respectiv, ADN de
legtura. Enzima DNMT, s-a discutat anterior, poate alege între calea de transfer a grupei metil pe
inelul pirimidinic al citozinei (în pozitia C-5) i calea de îndeprtare a grupei amino din pozitia C-4
a aceluiai inel pirimidinic. În funcie de condiiile de reacie enzimatic, modificarea minor, cu
rol de modulare a informaiei epigenetice, constant în acest proces, poate deveni o modificare
major, mutagen, cu un efect dramatic asupra însi informaiei genetice, codificat în secven.
Aadar, modificrile catalizate de DNMTaze pot fi orientate ctre modificri epigenetice, ereditare
i reversibile sau chiar alterri genetice, mutaii. Ambele modificri influeneaz fenotipul genei
considerate: spre deosebire, îns, de modificarea genetic, "fixat" în cadrul secvenei nucleotidice,
care poate fi anulat doar printr-o alt mutaie (fenomenului reversiei), modificarea epigenetic,
dei ereditar este, în anumite condiii, reversibil: marcajul stabilit prin ataarea grupei metil poate
fi îndeprtat prin aciunea pasiv a aceleiai enzime sau prin aciunea unei enzime diferite.
Aadar, modificarea epigenetic prin metilarea resturilor de citidin nu afecteaz informaia
genetic în condiiile în care enzima implicat, DNMT, acioneaz ca transferaz. Modificarea
condiiilor de reacie enzimatic, dup cum s-a descris anterior, poate conduce îns la modificarea
specificitii de reacie, enzima devenind mutagen. În acest caz, nu mai este vorba de modificare
epigenetic. Ea se transform în mutaie sau modificare a informaiei genetice însai. Numeorase
date din literatura indic faptul ca regiuni genomice cu grad înalt de metilare pot deveni spoturi
fierbini (hotspot-uri) de mutagenez. Ele se pot transforma spontan sau în condiii ambientale
necorespunztoare (diet cu nivel sczut în compui bogai în grupe metil, precum metionin, folai,
betain, colin; diet cu coninut inadecvat în vitamine i cationi implicai în reaciile de
transmetilare care implic refacerea donorului de metil, SAM, din produsul su, SAH).
Condiiile enumerate mai sus sunt frecvent speculate în explicarea fenomenelor de
cancerogenez, mai cu seam, asociate cu prevenia acestui proces patogen, dar i cu necesitatea
deteciei timpurii a regiunilor genomice care imprim vulnerabilitate mrit fa de cancerogenez.

Structura secundar

Dubla elice ADN (structura secundar) ia natere prin împerecherea specific a bazelor
azotate aflate pe cele dou catene opuse. S-a demonstrat c metilarea resturilor de citidin (C) din

54
cadrul ADN altereaz proprietile fizico-chimice ale ADN i, prin aceasta, afecteaz interaciile
eseniale din procesul de expresie genic, de tip ADN-proteine. Analiza efectelor exercitate de
grupele metil inserate în inelele pirimidinice ale resturilor C din ADN a condus la concluzia c
procesul de metilare a acestei macromolecule informaionale întrunete criteriile necesare unui
determinant epigenetic al caracteristicilor fenotipice din celulele difereniate ale eucariotelor
(Christman 1984 .a.).
În cele ce urmeaz se vor trece în revist etapele de suprastructurare a ADN liber (sau
“nud”, termen corespunztor macromoleculei obinute în soluie sau în forma cristalin, de fibr) i
complexat în fibrele cromatinice, nucleoproteice, caracteristice materialului genetic eucariot.
Grupa metil inserat în poziia C-5 a inelului pirimidinic al citozinei nu afecteaz
complementaritatea bazat pe formarea legturilor (punilor) de hidrogen între citozin i guanin
(respectiv, între grupele cetonice i amino ale acestor baze majore) (Fig.34).

Fig.24. Grupa metil în poziia C5 a inelului pirimidinic al citozinei nu afecteaz punile de hidrogen
cu guanina în împerecherea complementar

Totui, se presupune c grupele metil, prin efectul lor electronic (respingtor de electroni),
influeneaz distribuia electronic în inelele pirimidinice, determinând astfel o cretere a energiei
de legtur în punile de hidrogen. În consecin, stabilitatea mrit a perechilor 5mC:G determin
creterea direct proporional a temperaturii de topire (Tm sau melting temperature) a moleculelor
ADN, odat cu creterea coninutului în 5mC (Ehrlich i colab.,1986).
Alte modificri induse prin metilarea citozinei în cadrul proprietilor fizico-chimice ale
dublei elici ADN se refer la parametrii unghiulari ce caracterizeaz conformaiile structurale
secundare ale acestei macromolecule.
Este binecunoscut faptul c ADN poate adopta conforma
ii diferite. Studiile de difracie a
razelor X prin cristale ADN au relevat existena a trei modele diferite majore pentru structura
secundar a ADN dublu catenar fundamentat de Watson i Crick. Acestea difer prin valori
diferite ale parametrilor dublei elici.

55
Fig. 25. Structurile comparative ale ADN-B, A, Z

S-a constatat c macromoleculele ADN, respectiv anumite secvene nucleotidice din cadrul
acesteia, pot exista în diferite conformaii, în funcie de interacia cu moleculele de ap i de sruri,
de repulsiile electrostatice dintre grupele fosfat, de tria ionic, dar i de pH-ul mediului. Dintre
aceste secvene, CpG sunt cunoscute a avea o capacitate deosebit de a-i modela conformaia, în
spe, datorit capacitii de metilare a resturilor de citidin, implicând deci efectele hidrofobe i
hidrofile în stabilizarea anumitor conformaii.
Tipurile de conformaii eseniale ADN sunt caracterizate prin urmtoarele proprieti:
*ADN-A (Fig.25a): bazele sale sunt puternic înclinate fa de axa elicei i sunt situate în interiorul
acesteia din urm. Diametrul moleculei este de cca 2,3 nm. Curbura major este adânc i îngust
(abrupt), în timp ce curbura minor este larg i domoal. Conformaia -A este cea mai rigid din
serie i de aceea cea mai insensibil la modificarea condiiilor de mediu. Aceasta este caracteristica
structurii ADN în mediul alcoolic (etanol).
*ADN-B (Fig. 53b): bazele se afl aproape perpendicular fa de ax i de asemenea îndreptate spre
interiorul acesteia. Diametrul moleculei în aceast conformaie este mai mic, de cca 1,9 nm.
Curburile sunt mai domoale, dar cu adâncimi diferite: cea major fiind mai adânc i mai larg fa
de cea minor. Structurile în B sunt mai puin rigide, sunt caracteristice pentru soluiile apoase i,
mai mult, predomin în condiiile fiziologice ("in vivo") ca structuri "native".
* ADN-Z (Fig.35c): spre deosebire de formele anterioare, aceasta este o conformaie de stanga a
dublei elici, cu scheletul glucid-fosfat urmând o traiectorie în zig-zag. Resturile fosfat sunt
alternativ apropiate i îndeprtate una de cealalt, astfel încât unitatea repetitiv devine o
dinucleotid. Formele Z sunt detectate doar la moleculele coninând în secven, alternativ, baze
purinice i pirimidinice. Sunt formele cel mai instabile i cele mai vulnerabile la mutaii. Un grad
mare de metilare în situri repetitive CpG este asociat cu ADN-Z.

56
 Aceste familii de structuri se pot obine i caracteriza în anumite condiii de preparare (in
vitro), în prezent existând puine dovezi referitoare la conformaiile de acizi nucleici în vivo.
Stabilizarea uneia sau alteia dintre structurile descrise are loc în funcie de condiiile monitorizate
"in vitro".
Astfel, hidratarea fibrelor ADN(cristalelor ADN) depinde de umiditatea relativ din mediu.
O umiditate de peste 80% determin o hidratare complet a dublei elici (cu 20 molecule de ap per
nucleotid), ceea ce determin o stabilizare a formei ADN-B. În particular, curbura minor poate
concentra molecule de ap în poriunile sale bogate în A-T.
La o valoare relativ mic a umiditii (cca 65%) bazele nu mai sunt hidratate, fiecare
nucleotid fiind legat cu doar 11-12 molecule de ap. La o umiditate i mai sczut, doar grupele
polare de fosfat (oxigenul din cadrul acestora) ramân hidratate cu cca 3,6 molecule de ap per
nucleotid. Aceast scdere în umiditatea general induce tranzi
ia B---A (observat în mediile cu
proporie ridicat de etanol, de exemplu). În cristalul de forma-A, studiat prin metoda difraciei
razelor X, curbura minor nu mai este accesibil din cauza împachetrii intermoleculare. În aceast
form, spre deosebire de ADN-B, resturile de glucid i de baze nu sunt hidratate, în timp ce
moleculele de ap prezint o structur foarte ordonat între grupele fosfat.
Tranzi
ia B--Z are loc în soluii concentrate de sruri sau etanol. În ceea ce privete aceast
tranziie, o importan deosebit o au dinucleotidele CpG. Chiar la trii ionice fiziologice ( 200mM
NaCl), domeniile CG ale unei duble elici superhelicoidale negative pot adopta forma Z, pentru a
relaxa stress-ul torsional. Stabilizarea acestei conformaii poate fi indus în diferite moduri. Astfel,
metilarea resturilor de citozin în poziia C-5, din cadrul unui oligomer poli(dC.dC).poli(dG.dC),
determin o scdere masiv în concentraia Mg2+ necesar pentru inducerea tranziiei B--Z (Behe i
colab.1981). Conform experimentelor de difracie cu razele X, grupele metil sunt mult mai puin
accesibile moleculelor de ap în forma Z, comparativ cu forma B. Poliaminele (cum ar fi spermina
i spermidina), stabilizeaz, de asemenea forma Z în soluie. Mecanismul acestei stabilizri nu este
îns elucidat i ar putea fi diferit de cel observat la cristale.
Experimentele "in vivo" au demonstrat faptul c tranzi
iile A--B--Z sunt frecvente în
procesele de replicare i transcriere ale ADN, având deci roluri biologice bine definite. S-a
evideniat anterior faptul c, din punct de vedere chimic, aceste tranziii pot avea loc în soluie
datorit modificrii interaciilor ADN-ap, prin intermediul srurilor, a grupelor metil, temperaturii
i pH-ului. În condiiile fiziologice s-a constatat c natura a adoptat anumite interacii deosebit de
ingenioase, pentru modularea acestor conformaii, una din aceste interacii fiind tocmai cea dintre
anumite secvene repetitive din cadrul genomului (CpG sau CpNpG) i grupele metil din cadrul
5mC. Elucidarea mecanismelor de tranziie ale conformaiilor de acizi nucleici în vivo ar explica
deci numeroase procese funcionale la nivel structural.

57
 Explicaia corelaiei dintre ADN-Z i metilarea resturilor de citidin în dinucleotidele CpG

ADN-Z reprezint o form de stânga a dublei elici, denumit astfel i datorit faptului c
scheletul fosfoglucidic are o traiectorie în zig-zag sau probabil, faptului c aceast form este total
opus formelor A i B. ADN-Z are un diametru ceva mai mic decât cel al formei ADN-B, este
alungit i extrem de rigid. Diagramele van der Waals ale formelor ADN-B i ADN-Z sunt
reprezentate în Fig.35. .
Modificarea major în cadrul tranziiei B--Z este o modificare conformaional intern, în
cadrul creia perechile de baze sufer o rsucire în jurul legturii glicozidice: citozina rmâne în
conformaia „anti”, pe când guanozina adopt conformaia „sin”. De asemenea, resturile de citidin
sufer o rotaie în cadrul acestui proces, dând natere la forma în zig-zag a scheletului fosfoglucidic.
Spre deosebire de pirimidine, formarea de ctre purine a conformaiilor sin are loc fr pierdere de
energie. Din cauza prezenei conformaiilor alternante în sin, ADN-Z este favorizat în secvenele
care prezint alternane în purin i pirimidin, cum sunt CpG.
Pohl i Jovin (1972) au demonstrat prin metoda dicroismului circular modificarea
conformaional a ADN-B (poli (dG-dC)) în ADN-Z, în soluii saline concentrate. Analiza
spectrelor Raman pentru astfel de oligonucleotide, atât în condiii de salinitate joas, cât i în soluii
saline concentrate, a fcut posibil demonstrarea faptului c poli (dG-dC) în soluii saline
concentrate are conformaia ADN-Z. Totodat, Rich (1984) a demonstrat c, în condiii variabile de
mediu, polinucleotidele pot suferi modificri importante ale conformaiei. Concluzia cercettorilor a
sugerat existena unui echilibru între conformaiile Z , B i A, astfel încât conformaia ADN-B s
corespund nivelului energetic cel mai sczut în condiiile fiziologice. Acest echilibru este
influenat de o multitudine de factori:
(i) Secvena nucleotidic: alternana purinelor i pirimidinelor favorizeaz stabilizarea ADN-Z,
dintre acestea, cele mai favorizante fiind C i G (dei s-au detectat astfel de tranziii în conformaia
Z i la alte secvene, care nu au o strict alternan de purine i pirimidine) (Nordheim i colab.,
1982) (Fig.I.15b).
(ii) Modificarea chimic: bromurarea poli(dG-dC), în care atomii de Br sunt ataai la atomul C8 al
guaninei, stabilizeaz ADN-Z. Polimerii poli(dG-dC) bromurai exist, în condiii fiziologice saline,
în conformaia ADN-Z. Acetia s-au remarcat prin caracterul lor puternic imunogen, producând
anticorpi foarte specifici pentru ADN-Z. În consecin, derivaii bromurai sunt în prezent utilizai
eficient în demonstrarea existenei formei ADN-Z în genomul eucariot sau procariot.
Studiile “in vivo” cu anticorpi monoclonali pentru 5mC i ADN-Z (Sano i colab., 1980) au
relevat faptul c tranziii B-Z sunt frecvente în cazul unui grad mare de metilare a secvenelor CG.

58
Totodat, aceast tranziie a fost corelat (în unele cazuri) cu situsurile CG de înalta mutabilitate.
Factorii cunoscui pentru stabilizarea formei ADN-Z "in vivo" sunt:
(i) proteinele cu legare specific de ADN-Z, izolate dintr-o varietate de tipuri de celule
(Nordheim i colab.1982);
(ii) cationii metalelor (Na+ sau Mg2+) sau policationii (poliamine, precum spermina i
spermidina) i
(iii) suprarasucirea negativa a dublei elice (formarea ADN-Z într-un segment de
plasmid reduce numrul de suprarsuciri i determin scderea energiei negative de
suprarsucire).
Poli (dG-dC) sintetic formeaz ADN-Z la concentraii ridicate de NaCl (punctul median de
conversie fiind 2,2 M NaCl) sau de MgCl2 (cu punctul median de conversie de 0,7 M) (Pohl i
Jovin, 1972). O diferen major dintre ADN-Z i ADN-B este apropierea grupelor fosfat pe cele
dou catene polipeptidice. În forma B, distana cea mai apropiat este de 11,7 Å , pe când în forma
Z aceasta este de 7,8Å. În soluii concentrate de sare, cationii formeaz clusteri în jurul grupelor
fosfat încarcate electric, reducând prin aceasta energia de repulsie dintre grupe, ceea ce determin
stabilizarea formei ADN-Z.
Aa precum bromurarea (modificarea chimic) altereaz echilibrul B-Z, prin stabilizarea
guaninei în conformaia sin, fa de cea anti i prin aceasta favorizând tranziia ADN-B  ADN-
Z, metilarea citozinei în poziia C-5 în unitile dinucleotidice (CpG) ale unui lan polinucleotidic
are un efect dramatic asupra aceluiai echilibru B-Z. Acest din urm proces stabilizeaz molecula în
conformaia Z (Behe i Felsenfeld, 1981). Într-adevr, într-o soluie salin fiziologic, catenele
poli(5mdC-G) sunt stabilizate în conformaia ADN-Z. Punctul median de conversie, în condiiile
citozinei metilate, sunt MgCl 0,6mM, ceea ce reprezint o scdere cu trei ordini de mrime a
cantitii de cation bivalent necesar conversiei B-Z.
Poliaminele, cum sunt spermina i spermidina (în concentraii micromolare) stabilizeaz
polimerul în conformaia ADN-Z, la fel ca i metilarea citozinei (Behe i Felsenfeld, 1981). Demn
de remarcat este faptul c, pentru a produce aceste efecte dramatice asupra conformaiei ADN dublu
elicoidal, atât resturile de citidin metilate, cât i poliaminele sunt necesare în concentraii extrem
de mici, echivalente cu cele detectate în nucleii celulelor.
S-a propus un mecanism care explic modul în care care grupele metil stabilizeaz forma
ADN-Z prin legturi hidrofobe. Acesta se refer la rearanjarea moleculelor de solvent în cadrul
polinucleotidei metilate, cristalizate. Efectul net al acestei rearanjri const în faptul c molecula de
ap (care, în catena nemetilat, poate ptrunde într-o regiune hidrofob), este exclus de ctre grupa
metil.

59
 De asemenea, s-au observat tranziii B-Z i în cadrul secvenelor AT, îns mult mai dificil
de realizat, comparativ cu secvenele CG i cu secvenele autocomplementare de tipul d(CGTACG)
(Rich ,1984).
Studiile detaliate întreprinse în vitro pe secvene metilate/nemetilate ADN au avut o
importan major în explicarea diferitelor evenimente de tranziii care pot avea loc în vivo. Ele au
fost abordate mai ales sub aspectul interaciei dintre genomul eucariot i cel mai simplu genom,
genomul viral sau cel procariot. Actualmente, noi descoperiri în acest domeniu sunt ateptate pentru
a lmuri aspecte importante în fenomenele de virulen, imunitate, rezisten la infecii i
îmbolnviri. Evenimentele de tranziie B-Z se presupun c au loc “in vivo”, în legtur cu procesele
de replicare, transcriere, mutagenez. Între dovezile fizice i cele biologice, înc nu s-a putut face o
legtur direct. Detectarea unor proteine cu legare specific a situsurilor de citozin metilat, care,
s-au dovedit a fi necesare într-o cantitate infim pentru a induce supresia unei gene, ar crea o astfel
de “punte” de legtur între cele dou sisteme “in vitro” i “in vivo”. În prezent, aceste proteine de
legare specifica au fost detectate i se presupune ca au rolul de a stabiliza suprastructurile deja
existente, datorit prezenei grupelor metil (proteinele MBDP) (Boyes i Bird, 1992).

Suprastructurile de tipul concatenamerilor, formate prin

interacia de tip ADN-ADN, între dublele elici sunt, de asemenea, influenate de ctre inserarea
grupei metil în secvenele ADN. Astfel de compleci pot lua natere în cadrul hibrizilor
intermediari de împerechere fizic a secvenelor omoloage din cadrul aceluiai cromozom (dispuse
în cis) sau aflate pe cromozomi diferii (dispuse în trans). În primul caz, iau natere interacii
alelice, cel de-al doilea caz, referindu-se la aa-numitele interacii ectopice ( Matzke i Matzke,
1995, 1996).
Studiile termodinamice ale duplexurilor i triplexurilor ADN (Xodo i colab.1994) au dus la
concluzia c metilarea resturilor de citidin într-una din catene are un efect puternic de stabilizare
asupra complecilor polinucleotidici formai. Mai mult, oligonucleotidele pirimidinice coninând
5mC pot disloca analogii lor nemetilai din cadrul duplexurilor ADN. Factorii entropici descrii în
stabilizarea structurilor superioare ale ADN prin metilare nu sunt foarte concludeni în explicarea
rolului stabilizator al grupelor metil. S-a emis totui ipoteza conform creia, 5mC ar induce
stabilitatea prin intrmediul entropiei, fapt explicat prin alterarea solvatrii bazelor de pe catena
polinucleotidic. Autorii care raporteaz astfel de descoperiri se refer la posibilitatea utilizrii
oligonucleotidelor metilate în tehnologiile antisens, pentru împiedicarea formrii dublei elici stabile
în cadrul monocatenelor ARN.
Astfel de explicaii ar fi deosebit de utile în discuia interaciilor alelice i chiar ectopice de
tip ADN-ADN, considerate a fi premizele metilrii în vivo i, prin aceasta, s explice fenomene
vitale, precum supresia transgenelor la plantele manipulate genetic (Matzke i Matzke, 1995).
60
Influena metilrii ADN asupra structurii fibrei de cromatin

În celula eucariot, materialul genetic - reprezentat de fibra de cromatin - poate adopta

diferite aranjamente de compactare, caracterizate prin grade diferite de suprastructurare (de la
nivelul decondensat, reprezentat de fibra solenoidal, la nivelul final, compactat, al cromozomului
metafazic).
Dinamica suprastructurilor este posibil doar prin intermediul interaciilor de tip ADN-
histone i ADN-nonhistone (spre exemplu, HMG sau proteinele cu mobilitate înalt ), mediate de
interaciile specifice de tip protein-protein. Astfel, trecerea la un nivel superior de compactare se
realizeaz prin interacia dintre ADN de legtur i H1, în urma creia apar rsuciri specifice,
stabilizate în uniti de câte ase nucleozomi (structura solenoidal). În continuare, fibra solenoidal
poate suferi suprastructurri în diferite aranjamente, care sunt finalizate în forma de compactare
maxim, cea a cromozomului metafazic.
Modificarea interaciilor amintite poate avea loc prin procese de acetilare, fosforilare sau
metilare, pe de o parte a proteinelor histonice, iar pe de alt parte, a bazelor azotate din ADN.
Aceasta are repercursiuni dramatice asupra stabilizrii anumitor suprastructuri necesare în diferitele
etape ale ciclului celular pentru funcionarea corect a materialului genetic în celula eucariot
(stocare, replicare i transcriere) (Caiafa, 1999).
Considerarea elementelor de baz ale structurilor cromatinice specifice eucariotelor este
esenial în elaborarea modelelor mecanismelor metilrii ADN i explicarea rolului acestei
modificri epigenetice în expresia i în mutaia genic. Numeroase studii actuale încearc o
corelaie între aciunea grupelor metil din cadrul bazelor minore i cea a histonelor, în spea histona
H1, deinatoarea unui rol major în compactarea cromatinei, dar recent evideniat i histona H3,
metilat în resturi de aminoacizi specifice (9, 27 sau 4). Cu toate acestea, informaia precar asupra
acestei corelaii determin înc numeroase controverse legate de modularea expresiei genice prin
intermediul dinamicii structurale în fibra cromatinic, întârziind stabilirea unui model clar, direct al
mecanismului corespunztor.
Referiri recente la aceste aspecte sunt de fapt controverse la adresa interaciei dintre histona
H1 i situsurile specifice de metilare din ADN, CpG. Una din aceste preri (Campoy i colab. 1995)
se refer la faptul c legarea preferenial a H1 la dinucleotidele CpG bogate în 5mC ar putea
explica efectele represive ale metilrii asupra activitii genice. Autorii, prin studiul asupra afinitii
H1 purificat fa de ADN “nud” (naked) i cromatin, au negat preferina de legare a H1 la ADN
nud, nemetilat; rezultatele lor au fost confirmate i prin studiile efectuate pe Xenopus laevis (s-a

61
studiat reasamblarea cromatinei în ovocite). Cu alte cuvinte, interacia cooperativ potenial dintre
H1 i complecii polinucleosomali nu este îmbuntit de prezena metilrii în ADN.
O alta prere (Caiafa i colab. 1995) referitoare la interferena efectelor H1 i ADN metilat
în compactarea fibrelor cromatinice se bazeaz pe studiul efectului inhibitor exercitat de H1 asupra
însui procesului enzimatic de metilare ADN “in vitro”. S-a constatat c metilarea artificial a
oligonucleotidelor conduce la pierderea capacitii ADN de a interaciona cooperativ cu alte
interacii, de tipul H1-H1 (importante în formarea solenoidului), în condiiile triei ionice care ar
permite tranziia filamentului de 10nm, la fibra cromatinic de 30nm. Rezultatele atest c
hipometilarea ADN în regiunea “linker” ar permite histonei H1 exercitarea funciei de compactare a
ADN în fibra solenoidal.
Pe de alt parte, grupul Johnson i colaboratorii (1995) au studiat gradul de transcriere a
unei matrie coninând dou gene pentru ARNt în funcie de gradul de metilare din catena matri i
în condiiile modificrii concentraiei histonei H1. Astfel, s-a constatat c activitatea
transcripional a fost inhibat, în cazul ambelor matrie (nemetilat i metilat), de ctre creterea
concentraiei H1. O observaie interesant a fost i aceea c inhibarea, în cazul matriei metilate, a
avut loc pentru un raport mai mic H1:ADN. Dintre izoformele proteice H1, H1c a prezentat efectul
preferenial pentru inhibiia matriei metilate. S-a tras concluzia c ADN metilat influeneaz cel
mai pregnant activitatea H1 în împiedicarea formrii complecilor de iniiere a transcrierii.
Informaiile referitoare la astfel de interacii au fost îmbogite prin studiul efectului
exercitat de fraciile H1 asupra activitii enzimatice de metilare ADN i asupra celei de formare a
complecilor ADN-enzim (Santoro i colab., 1995; Strom i colab.,1995). Dintre acestea, s-a
dovedit c doar fraciile îmbogite în H1 e-c au avut un efect pregnant, datorit capacitii de a lega
competitiv DNMTaza la siturile bogate în CpG i, prin aceasta, s contribuie la meninerea nivelului
de metilare sczut din regiunile bogate în CpG (denumite insule CpG), respectiv în ADN linker.

Efectul 5mC asupra structurii c r o m o z o m a l e a fost studiat în

ultimul deceniu prin abordarea metodelor moderne de detecie specific a acestei modificri :
tratamente cu restrictaze sensibile la metilare, cum ar fi HpaII, MspI, HhaI, EcoRII etc.; detecia
imunochimic a siturilor 5mC cu anticorpi monoclonali, în cadrul tehnicilor FISH sau GISH
(respectiv, fluorescent/genomic in situ hybridisation); amplificare în lan catalizat de polimeraz
(PCR) combinat cu restricie sensibil la metilare sau cu mutageneza mediat de bisulfitul de
sodiu.
Abordrile moderne au permis astfel detecia i caracterizarea situsurilor prefereniale de
metilare în cadrul cromozomului i, totodat s se urmreasc dinamica acestui proces de
modificare a citozinei în corelaie cu starea transcripional a unei anumite gene, stabilitatea

62
genomic într-un anumit esut etc. S-a observat c situsurile prefereniale au constat din secvene
repetitive de dinucleotide CpG. Peste 80% din insulele CpG se afl în fracia reprezentând 45% din
genom. Aceasta este detectabil sub forma benzilor-R, reprezentând regiuni cromozomale
distincte, difereniate prin studii de bandare i caracterizate printr-o compactare mai slab i o
replicare timpurie.
Insulele GpG au o structur cromatinic distinct: histona H1 este prezent în cantiti mici,
iar histonele H3 i H4 sunt acetilate într-un grad înalt. Prezena regiunilor libere de nucleozomi, în
anumite poriuni ale structurii, demonstreaz aranjamentul de împachetare mai relaxat. Se
presupune c o astfel de conformaie cromatinic ar determina o accesibilitate crescut fa de
factorii transcripionali. Dei natura unor astfel de interacii nu este clar descifrat, se consider c
insulele CpG se pot structura în semnale importante în procesele de reglaj genetic eucariot.
Studiile citogenetice recente au demonstrat corelaii importante dintre mutaiile
cromozomale, asociate cu situsurile fragile, i insulele CpG, acestea, la rândul loc, fiind implicate în
manifestarea anumitor boli. Dei numeroi cromozomi prezint situri cu susceptibilitate crescut la
mutagenez, la puini dintre acetia se cunosc cu exactitate cauzele unei astfel de condiii speciale.
Astfel, s-a constatat faptul c o hipometilare în siturile CpG (forat printr-o diet srac în
colin i metionin, respectiv, în donori de grupe metil i folat) a determinat o cretere a numrului
de scindri cromozomale mai cu seam, în regiunea genei p53 (cunoscut a avea un rol determinant
în cancerogenez) (Pogribny i colab., 1995). Autorii au descoperit faptul c acumularea siturilor
fragile i chiar a ruperilor cromozomale a fost asociat cu hipometilarea genomic progresiv i cu
creterea concomitent a activitii DNMTazei. O explicaie a acestui efect este legat de alterarea
conformaiei i stabilitii structurii cromatinice prin hipometilare, ceea ce ar face unele situsuri
ADN mai accesibile metilrii (cu predispoziie ctre mutaii, deci) i activitii unor endonucleaze
sau chiar aciunii unor radicali liberi oxidani.
Efecte similare ale hipometilrilor din regiunile cheie ale genomului eucariot (centromeri,
organizatorul nucleolar, telomere) s-au raportat a fi, de asemenea, implicate în apariia unor
fenotipuri noi, indicatoare ale alterrii dezvoltrii organismelor eucariote.
Studiul efectului demetilrii ADN asupra structurilor cromozomale mamaliene a demonstrat
importana proceselor de metilare în stabilizarea morfologiei specifice cromozomilor. Astfel,
incorporarea analogilor citidinei în ADN a condus la decondensarea structurilor cromatinice, la
instabilitatea cromozomilor i modificarea dinamicii ciclului celular (timingului de replicare i de
condensare a cromozomilor metafazici) (Haaf, 1995). Astfel de modificri sunt, evident, corelate cu
modularea potenialului metastatic în celulele transformate. Experimentele au fost iniiate pe baza
cunotinelor referitoare la activitatea citostatic i antineoplasic a 5azaC i a analogilor acesteia.

63
 Studiile de restricie a cromozomilor cu endonucleaze sensibile la metilare (Sau3, HpaII)
au relevat, de asemenea, la plante, faptul c decondensarea cromozomilor prin tratamentul cu 5azaC
(în 5 cicluri celulare, respectiv, dupa 72 ore de tratament), determin un profil de bandare (de tip C)
mai puternic, obinerea de fragmente ADN micorate, întârzierea intrrii celulelor în mitoz i
decondensarea vizibil a cromozomilor. Aceast decondensare a fost atribuit demetilrii
eucromatinei i pierderii proteinelor cromozomale. În aceste condiii, pattern-ul de replicare ADN a
rmas neschimbat (Olzewska i colab.,1995).
Digestia difereniat a regiunilor centromere heterocromatice din cromozomii umani
decondensai prin tratamentul cu 5azaC, a demonstrat existena unei structuri complexe în cadrul
acestei regiuni cromozomale (Martinez i colab.1995). Dup tratamentul cu agentul demetilant,
cromozomii 1,9,15 i 16 au prezentat doua regiuni distincte în regiunea centromeric, reprezentate
respectiv, prin (i) heterocromatina centromerului - o poriune foarte condensat i (ii)
heterocromatina pericentromerului, caracterizat printr-o decondensare avansat. Cromozomii
netratai cu 5azaC au prezentat un profil diferit de digestie cu enzimele sensibile la metilare,
caracterizat prin regiuni centromere nedigerate, la toi cromozomii, cu excepia perechii de
cromozomi 1, la care s-a observat o regiune pericentromeric accesibil i deci extensiv digerat.
Studiul dimensiunii benzilor-C la cromozomii umani embrionari i extraembrionari
(cromozomii 1 i 6, care conin satelitul 2ADN) a demonstrat un polimorfism dependent de tipul de
celule din care se obin cromozomii: astfel, s-a observat c dimensiunea regiunilor C este crescut
în esuturile extraembrionare. Studiul acelorai benzi de cromatin din cadrul cromozomului 9 i Y
(primul conine satelitul 3ADN, iar cellalt conine toate tipurile clasice de satelii ADN), au relevat
în schimb, lipsa de polimorfism fa de cele dou linii celulare (Nazarenko i colab., 1995). Astfel
de date au condus la corelarea compactrii cromozomului cu metilarea ADN. Variaia observat în
lungimea benzii-C a reflectat un profil de metilare a heterocromatinei specifice de esut. Satelitul 2
ADN a fost, probabil, inta cea mai sensibil pentru decondensarea datorat alterrii în metilarea
ADN, comparativ cu alte tipuri de satelii.
Studiile cu anticorpi monoclonali anti 5mC asupra cromozomilor la plante au demonstrat
o dinamic a metilrii acestora corelat cu diverse aspecte de dezvoltare (Friediani i colab.1996).
La Allium cepa i Vicia faba, s-a demonstrat astfel o distribuie preferenial a resturilor de 5mC în
cadrul cromozomilor metafazici, în regiunile telomerice i/sau subtelomerice, precum i în benzile
de intercalare.
Tratamentele cu agentul demetilant au relevat, de asemenea capacitatea acestuia de inducere
a micronucleilor în sistemele mamaliene (chiar în concentraii foarte mici, de 0,2M) i efectul su
asupra structurilor de kinetochori (Stopper i colab.1995).

64
 Majoritatea studiilor aspectelor privind siturile fragile cromozomale au fost efectuate pe
material uman. Acestea au fost asociate, în special, cu cromozomul X. Astfel, se cunoate fenotipul
esenial al sindromului X [(Fra(X)], respectiv, retardul mental, a doua, ca important, dup
sindromul Down. În trecut, diagnosticarea era bazat pe detectarea citogenetic a sitului fragil,
sensibil la folat, pe braul Xq27.3(FRAX A). S-au depistat îns numeroase variante moleculare
corespunzatoare acestei modificri cromozomale. Referitor la aceasta, în 1991, s-a caracterizat gena
FMR-1 (Fragile X mental retardation 1), care, în acel moment era considerat singura rspunztoare
de condiia descris. S-a observat c regiunea situat în jurul genei FMR-1 este, de asemenea,
responsabil de expresia bolii. Factorii implicai includ:(i) dimensiunea unei repetiii în tandem a
trinucleotidei CGG, care este prezent într-unul din exonii genei FMR-1 i (ii) nivelul de metilare a
unei insule CpG de 250 pb, situat în amonte de repetiia trinucleotidic. Orice expresie anormal a
acestor factori determin apariia sindromului X fragil (Claark i Wall, 1996).
Astfel de expresii aberante sunt asociate cu expansiunea repetiiei trinucleotidice (posibil
responsabil, de altfel, i de sensibilitatea crescut la folat a cromozomului), iar aceasta, la rândul
ei, cu metilarea insulei CpG.
În concluzie, modificarea minor din cadrul anumitor secvene, aparent fr rol important
(dac se asociaz cu codul genetic al genei respective), cum este metilarea restului de citidin din
secvenele repetitive CpG, poate conduce la modificri dramatice în cadrul structurilor secundare
ale ADN i a suprastructurilor cromatinice. Prin acestea, îns se pstreaz, între anumite limite,
secvena primar, dar impunând o anumit structur funcional cromatinei, ele pot altera procese
vitale, precum gametogeneza, embriogeneza, citodiferenierea, îmbtrânirea. Cunoaterea acestor
modificri, a rolului lor în funcionarea normal a materialului genetic, cât i a metodelor de
detecie, deosebit de sensibile, ar putea fi premizele unor soluii cu valoare deosebit în
diagnosticarea rapid i timpurie a unor stri de boal, cât i în stabilirea schemelor de prevenie sau
terapeutice (Szyf, 1995).

CORECTAT!

65