Journal of Science – 2016, Vol.

11 (3), 33 – 41 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology

NUÔI CẤY MÔ LÁ ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA L. HARMS ) TẠO

MÔ SẸO VÀ NHẬN BIẾT HOẠT CHẤT SAPONIN TÍCH LŨY

Nguyễn Trung Hậu1, Mai Thị Phương Hoa2, Trần Văn Minh3
1
Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh
2
Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Thành phố Hồ Chí Minh
3
Trường Đại học Quốc Tế, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

Thông tin chung: ABSTRACT

Ngày nhận bài: 22/07/2015
Ngày nhận kết quả bình duyệt:
19/08/2015
Ngày chấp nhận đăng: 09/2016
Title:
Callus induction derived from
leaf of Dinh Lang (Polyscias
Fruticosa L. Harm) and
identification of saponin in
cultures
Từ khóa:
phát sinh mô sẹo, tốc độ tăng
sinh, Polyscias fruticosa,
saponin,
nuôi cấy dịch huyền phù
Keywords:
Lavandula angustifolia,
creating the bud, disinfected,
tissue culture,
micropropagation
To sterilize leaf samples of Dinh lang (Polyscias fruticosa L. Harm),
they were collected from 3 years old plants, surface-sterilized with
TCCA (0.5%) for 15 minutes. Sterilized leaf samples were cultured on
MS medium, supplemented with NAA (2 mg/l) for callus initiation. The
medium for the best callus proliferation was MS supplemented with
NAA (3 mg/l), reached to 0.390 g/cluster and proliferation rate of 1.921
(folds) after 6 weeks of cultures. Survey the growth dynamic of callus,
they were transferred to MS medium supplemented with NAA (3 mg/l)
and coconut water (10%). Multiplication rate reached to compensation
point at 1.548 (folds) after 4 weeks, higher than control without coconut
water (1.455 folds). Contents of oleanolic acid 115,9 µg/g and saponin
378,8 µg/g accumulating in cultures were measured by HPLC method.
TÓM TẮT
Mẫu lá từ cây mẹ 3 năm tuổi được khử trùng bằng TCCA (0,5%) trong 15 phút.
Mẫu lá vô trùng được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 2 mg/l cho
phát sinh mô sẹo. Môi trường nuôi cấy tăng sinh mô sẹo tốt nhất là môi trường
MS có bổ sung NAA 3 mg/l, đạt 0,390 g/cụm mô sẹo và tốc độ tăng sinh là
1,921 lần sau 6 tuần nuôi cấy. Khảo sát động thái sinh trưởng của mô sẹo, mô
sẹo được cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung NAA 3 mg/l và nước dừa
10%. Tốc độ tăng sinh đạt 1,445 lần. Hàm lượng oleanolic acid 115,9 µg/g và
saponin 378,8 µg/g tích tụ trong nuôi cấy mô sẹo được định lượng bằng HPLC.

1. MỞ ĐẦU
Đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harms) thuộc
họ Araliaceae, là loài cây có thân bụi, lá thường
xanh được trồng nhiều ở các quần đảo Thái Bình
Dương và vùng Đông Nam Á như Indonesia, Lào,
Malaysia, Papua New Guinea, Philippines,
Singapore, Thái Lan và Việt Nam (Brickell,
2003).
Đinh lăng có tác dụng tăng cường sinh lực, tăng
tính hòa tan các dược chất khác, chống viêm,
kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế hoạt động của
virus, diệt các loài nhuyễn thể, tăng tính thấm biểu
mô đường hô hấp, an thần (Huan và cs., 1998),
chống oxy hóa, giảm stress (Bensita và cs., 1998).
Một số loài trong chi Polyscias còn chứa
hederagenin, oleanolic acid glycosides,
polyacetylenic, có tác dụng lợi tiểu như

33
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 33 – 41
furosemide (Lutomski và Trần Công Luận, 1992;
Lutomski và cs., 1992).
Một số nghiên cứu về thành phần hóa học ở đinh
lăng đã được công bố. Masruri và cs. (2007) đã
phát hiện 3 hợp chất từ vỏ rễ đinh lăng 3-O-β-D-
Glucopyranosyl (1→2)-β-D-Glukopiranosyl, 3-O-
β-Drhamnopyranosyl (1→2)-β-D-
rhamnopyranosyl (1→3)-β-D-glucopyranosyl và
3-O-β-D-glucopyranosyl. Huan và cs. (1998) đã
định tính trong dịch chiết rễ, thân và lá đinh lăng
có các glycosid, alkaloid, tanin, vitamin B1,
khoảng 20 loại acid amin khác và phân lập được
11 triterpen. Trần Công Luận và cs. (2001) đã
định tính 5 hợp chất polyacetylen từ lá đinh lăng,
trong đó 2 hợp chất chủ yếu: panaxynol và
heptadeca 1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol có tác
dụng kháng khuẩn.
Những tính chất sinh học đặc sắc của Polyscias
fruticosa được phát hiện qua nuôi cấy tạo mô sẹo
(Slepyan và cs., 1975b) và tế bào huyền phù
(Furmanowa và cs., 2002). Hoạt chất oleanolic
acid glycosides trong dịch chiết sinh khối tế bào
qua nuôi cấy bằng bioreactor ở Viện Sinh lý Thực
vật (Viện Hàn lâm Khoa học Moscow) đã thương
mại hóa dưới thương hiệu “Vitamal” được uống
hàng ngày đặc trị tính thích ứng và miễn dịch môi
trường (Furmanowa và cs., 2002).
Trong bài báo này, chúng tôi nghiên cứu khả năng
tạo mô sẹo và tích lũy saponin trong mô sẹo nuôi
cấy là nền tảng cho phát triển kỹ thuật nuôi cấy
huyền phù tế bào đinh lăng dễ thu nhận saponin.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu: Chồi ngọn dài 20 cm của cây đinh lăng 3
năm tuổi được thu thập tại huyện Trảng Bom, tỉnh
Đồng Nai được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy.
Phương pháp
Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS (Murashige
và Skoog, 1962) được khử trùng ở 121 oC (1 atm)
trong 30 phút. Mẫu nuôi cấy được đặt trong phòng
sáng ở nhiệt độ (26 + 2) oC, cường độ chiếu sáng
22,2 µmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày.
Có bổ sung 2,4D (2,4-dichlorophenoxyacetic
acid), NAA (α-naphthaleneacetic acid), kinetin (6-
Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
furfurylaminopurine), oleanic acid (Sigma
Aldrich) và saponin (không có chuẩn này). TCCA
90 (Trichloroisocyanuric 90).
Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo: Mô lá non của
cây đinh lăng 3 - 4 năm tuổi được thu thập và khử
trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, rửa mẫu bằng
nước cất vô trùng 3 lần, sau đó khử trùng bằng
TCCA 90 (Trichloroisocyanuric 90) nồng độ 0,5 -
1,5%, bổ sung với 3 - 4 giọt tween 80% trong thời
gian 5 - 15 phút, tiếp tục rửa mẫu 5 lần bằng nước
cất vô trùng. Mẫu sau khử trùng được cấy vào môi
trường nuôi cấy tạo mô sẹo và nhân sinh khối.
Thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu
nhiên với 9 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức lặp lại
3 lần, mỗi lần lặp lại nuôi cấy trong 3 bình tam
giác 300 ml, mỗi bình tam giác nuôi cấy 5 mẫu.
Số liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm
Statgraphics Centurion XV. Chỉ tiêu theo dõi:
Tỷ lệ mẫu vô trùng = Số mẫu không nhiễm / Tổng
số mẫu nuôi cấy (%)
Tỷ lệ mẫu chết = Số mẫu bị hoại tử / Tổng số mẫu
nuôi cấy (%)
Hệ số tăng sinh = Sinh khối sau nuôi cấy / Sinh
khối ban đầu đưa vào nuôi cấy (%)
Xác định hàm lượng saponin bằng phương pháp
phân tích HPLC (Trịnh Thị Nhung, 2012): Ngoài
phương pháp tạo bọt (Nguyễn Kim Phi Phụng,
2007), oleanic acid và saponin được phân tích
định lượng bằng phương pháp HPLC:
 Chuẩn bị mẫu phân tích oleanolic acid: cân
150 mg mẫu vào ống COD, chiết siêu âm 4 lần
với 10 mL ethylacetatat chứa 1% acid formic.
Thổi khô ethyl acetat. Hòa tan phần cặn bằng
pha động, lọc qua màng lọc 0,45 micro trước
khi tiêm vào hệ thống HPLC.
 Chuẩn bị mẫu phân tích saponin tổng số: cân
150 mg mẫu vào bình cầu cổ nhám, thêm 50
mL nước nóng và ủ tại 90 oC trong 10 phút.
Thêm 7,5 mL HCl đậm đặc và đun hoàn lưu
cách thủy trong 2 giờ. Tiếp theo, chiết 4 lần x
100 mL dicloromethan, pha dicloromethan cô
quay tới gần cạn, phần còn lại được thổi khô
hoàn toàn bằng dòng khí N2. Hòa tan phần cặn
34
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 33 – 41
bằng pha động, lọc qua màng lọc 0,45 micro
trước khi tiêm.
Để định lượng saponin tổng số, các nhánh đường
gắn trên aglycone được thủy phân trong môi
trường acid để chuyển hết về dạng aglycone. Do
đó, saponin tổng số được định lượng thông qua
acid oleanolic.
* Quy trình HPLC phân tách và định lượng
oleanolic acid và saponin
Hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp Agilent 1200
(USA) bao gồm: bơm đôi cao áp (trộn dòng áp
suất cao), bộ tiêm mẫu tự động, lò cột, đầu dò
DAD.
Pha tĩnh: cột ACE3- C18 (4.6 mm x 150
mm, 3,5 µm), được ổn nhiệt ở 20 0C.
Pha động: chương trình pha động được
thực hiện tại tốc độ dòng 0,5 mL/phút tại tỷ lệ pha
A: pha B là 10:90 v/v. Trong đó, pha A là đệm
trietylamine/HCl, pH 3 và pha B là MeOH chứa
0,1 % acid formic bước sóng 210 nm.
* Phương pháp tính toán hàm lượng oleanoic acid
và saponin tổng số trong mẫu được thực hiện theo
phương pháp ngoại chuẩn: Pha 5 điểm chuẩn
oleanoic acid các nồng độ C1, C2, C3, C4, C5.
Sau đó tiến hành ghi tín hiệu sắc ký của các điểm
chuẩn này. Từ sắc ký đồ thu được của các điểm
chuẩn, lấy tín hiệu diện tích mũi sắc ký của từng
điểm chuẩn được các giá trị S1, S2, S3, S4, S5.
Từ đó, dựng đường tuyến tính diện tích mũi sắc
ký theo nồng độ thu được hàm số bậc nhất: y = ax
+ b. Trong đó y là diện tích mũi, x là nồng độ
dung dịch chuẩn oleanoic đã biết từ sắc ký đồ của
các mẫu phân tích, lấy diện tích của mũi sắc ký
oleanoic acid được giá trị S mẫu. Giá trị S mẫu
được áp vào đường tuyến tính y = ax + b sẽ thu
được giá trị nồng độ oleanoic acid trong mẫu.
Quá trình thủy phân mẫu giúp chuyển các saponin
về dạng acid oleanoic. Do đó, hàm lượng saponin
tổng số (mSaponin) được tính bằng cách lấy hàm
lượng acid olenoic sau thủy phân (m Oleanoic STP)
trừ cho hàm lượng acid oleanoic không thủy phân
(m Oleanoic KTP).
mSaponin = m Oleanoic STP - m Oleanoic KTP
Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
trong đó, hàm lượng oleanoic được tính theo
phương pháp ngoại chuẩn.
Thiết kế thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ chất khử
trùng và thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu vô
trùng. Lá đinh lăng với kích thước 4 cm x 5 cm,
có màu xanh được sử dụng để khử trùng. Mẫu lá
sau khi khử trùng được cấy vào môi trường có
kích thước 2 cm x 2,5 cm. Sau 3 tuần nuôi cấy,
xác định tỷ lệ mẫu sống vô trùng.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của NAA và 2,4D đến
tạo sẹo của mẫu lá đinh lăng. Mẫu lá đinh lăng
sống vô trùng từ thí nghiệm 1 được cắt với kích
thước 0,5 cm x 1 cm, cấy vào môi trường MS bổ
sung chất điều hòa sinh trưởng và được đặt trong
tối. Ghi nhận tỷ lệ tạo mô sẹo và đặc điểm của mô
sẹo sau 6 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của NAA và kinetin
đến sự tăng sinh mô sẹo. Mẫu sẹo lá đinh lăng từ
thí nghiệm 2 được tách với khối lượng 0,2 g/mẫu,
có kích thước (0,25 x 0,25 x 0,25) cm/mẫu, cấy
chuyển vào môi trường MS bổ sung các chất điều
hòa sinh trưởng. Sau 6 tuần theo dõi, ghi nhận sự
tăng sinh mô sẹo và đặc điểm của mô sẹo.
Thí nghiệm 4: Động thái sinh trưởng của mô sẹo
được khởi phát từ lá đinh lăng. Xác định đường
cong tăng trưởng của tế bào mô sẹo được khởi
phát từ lá đinh lăng trên môi trường MS bổ sung
NAA 3 mg/l (G3) và NAA 3 mg/l + CW (10%)
(GD3). Mẫu mô sẹo lá đinh lăng từ thí nghiệm 2
được tách với khối lượng 0,2 g/mẫu, có kích
thước (0,25 x 0,25 x 0,25) cm/mẫu. Xác định
đường cong tăng trưởng của tế bào mô sẹo khởi
phát từ lá đinh lăng sau 6 tuần nuôi cấy, xác định
hệ số tăng sinh mô sẹo và đặc điểm của mô sẹo.
Thí nghiệm 5: Định lượng oleanic acid và
saponin trong khối mô sẹo khởi phát từ lá đinh
lăng bằng HPLC.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ chất
khử trùng và thời gian khử trùng đến tỷ lệ
mẫu sống vô trùng.
35
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 33 – 41 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology

Kết quả Bảng 1 cho thấy không có sự khác biệt về
tỷ lệ mẫu sống vô trùng giữa nghiệm thức T8 và
T9, nhưng nghiệm thức T8 và T9 cho tỷ lệ mẫu
sống vô trùng (100%) cao hơn có ý nghĩa thống
kê so với các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức
T1 cho tỷ lệ mẫu sống vô trùng (60%) thấp nhất
có ý nghĩa thống kê khi so sánh với các nghiệm
thức. Trong khi đó không có sự khác biệt về tỷ lệ
mẫu sống vô trùng (93,33%) giữa các nghiệm
thức T3, T6 và T7 nhưng các nghiệm thức này
cho tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao hơn có ý nghĩa
khi so sánh với nghiệm thức T5 (86,67%), T4
(80,00%) và T2 (73,33 %). Do nồng độ chất khử
trùng càng cao thì mẫu lá vô trùng biểu hiện sức
sống càng yếu.
Như vậy, nghiệm thức T3 (TCCA 90 (0,5%) trong
thời gian 15 phút) cho hiệu quả khử trùng tốt nhất
(Hình 1). Điều này cho thấy ở nồng độ TCCA 90
(0,5%) trong thời gian 15 phút đủ để tiêu diệt
nguồn lây nhiễm, đồng thời hạn chế thấp nhất ảnh
hưởng đến sinh trưởng mô lá cây đinh lăng.

Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng độ TCCA 90 và thời gian khử trùng đến khả năng khử trùng mẫu lá

Nồng độ Thời gian khử Tỷ lệ mẫu sống vô Đặc điểm mẫu vô trùng
NT
TCCA 90 (%) trùng (phút) trùng (%) (> 50% số mẫu)
T1 0,5 5 60,00e Mẫu sống có màu xanh
T2 0,5 10 73,33d Mẫu sống có màu xanh
T3 0,5 15 93,33b Mẫu sống có màu xanh
T4 1,0 5 80,00c Mẫu sống có màu xanh
T5 1,0 10 86,67c Mẫu sống có màu vàng
T6 1,0 15 93,33b Mẫu sống có màu vàng
T7 1,5 5 93,33b Mẫu sống có màu vàng
T8 1,5 10 100,00a Mẫu sống có màu vàng
T9 1,5 15 100,00a Mẫu sống có màu vàng

Hình 1. Mẫu lá khử trùng ở nghiệm thức T3 và T8 sau 3 tuần nuôi cấy

36
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 33 – 41 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của NAA và 2,4D
đến tạo sẹo của mẫu lá đinh lăng.
Mẫu lá đinh lăng vô trùng được nuôi cấy trên môi
trường MS có bổ sung NAA và 2,4D nhằm kích
thích quá trình tạo sẹo ở lá đinh lăng. Kết quả ghi
nhận ở Bảng 2 cho thấy trên môi trường nuôi cấy
MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng sẽ
không tạo sẹo. Ở các nghiệm thức còn lại, trong
các môi trường nuôi cấy khác nhau, lượng mẫu
tạo mô sẹo có ý nghĩa thống kê. Nồng độ NAA
càng tăng (từ 0,5 đến 2 mg/l) thì tỷ lệ mẫu tạo mô
sẹo càng tăng. Số mẫu tạo mô sẹo đạt kết quả cao
nhất (80%) ở nghiệm thức A3 (NAA 2 mg/l). Tuy
nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng độ NAA cao hơn 2
mg/l đến 4 mg/l (A4) thì khả năng tạo sẹo lại
giảm. Số mẫu tạo mô sẹo đạt kết quả thấp nhất
(40%) ở nghiệm thức A4 (4 mg/l).
Bảng 2. Ảnh hưởng của NAA và 2,4D đến sự tạo mô sẹo lá
Tương tự, ở các nghiệm thức bổ sung 2,4D vào
môi trường nuôi cấy, nồng độ 2,4D tăng từ 0,5
đến 1 mg/l thì tỷ lệ tạo mô sẹo tăng có ý nghĩa
thống kê, trong đó nghiệm thức D2 (1 mg/l) cho
tỷ lệ tạo sẹo là cao nhất (46,67%). Nhưng tiếp
tục tăng nồng độ 2,4D cao hơn 1 mg/l đến 4 mg/l
thì khả năng tạo sẹo lại giảm có ý nghĩa thống kê,
nghiệm thức D4 (4 mg/l) cho kết quả thấp nhất
(20 %).
Trong hai loại auxin (NAA, 2,4D) bổ sung trong
thí nghiệm thì NAA thích hợp cho việc tạo sẹo
hơn. Sau 6 tuần nuôi cấy, ta nhận thấy ở nghiệm
thức A3 (NAA 2 mg/l) có tỷ lệ mẫu lá tạo sẹo lớn
nhất (80%), sẹo có màu trắng và kích thước khối
mô sẹo tạo ra cũng lớn hơn nghiệm thức D2 (Hình
2).

NAA 2,4D Tỷ lệ mẫu tạo sẹo Đặc điểm mô sẹo

NT
(mg/l) (mg/l) (%) (> 50% số mẫu)
MS0 - - 0,00 -
A1 0,5 - 53,33c Sẹo ướt xốp, có màu vàng
A2 1 - 66,67b Sẹo ướt xốp, có màu vàng
A3 2 - 80,00a Sẹo ướt xốp, có màu trắng
A4 4 - 40,00d Sẹo ướt xốp, có màu trắng
D1 - 0,5 33,33e Sẹo ướt xốp, có màu vàng
D2 - 1 46,67d Sẹo ướt xốp, có màu vàng
D3 - 2 26,67f Sẹo ướt xốp, có màu nâu
D4 - 4 20,00f Sẹo ướt xốp, có màu nâu

Hình 2. Mẫu lá được nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo
(MS0, A3, và D2 sau 6 tuần nuôi cấy)

37
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 33 – 41
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của NAA và kinetin
đến sự tăng sinh mô sẹo.
Mô sẹo thu nhận được ở thí nghiệm 2 được dùng
làm nguyên liệu nuôi cấy khảo sát sự tăng sinh
mô sẹo. Mẫu mô sẹo có khối lượng 0,2 g/mẫu
được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
NAA và kinetin. Nghiệm thức G1 đến G3 (Bảng
3) tương ứng với NAA (1 đến 3 mg/l) có hệ số
tăng sinh mô sẹo tăng dần và giảm ở nghiệm thức
G4 tương ứng NAA (4 mg/l). Trong đó, G3 (NAA
3 mg/l) cho kết quả tăng sinh cao nhất, trọng
lượng tươi sau thời gian nuôi cấy đạt được là
Bảng 3. Ảnh hưởng của NAA và kinetin đến sự tăng sinh sẹo được khởi phát từ lá
NT NAA (mg/l) Kinetin (mg/l)
G0 - -
G1 1 -
G2 2 -
G3 3 -
G4 4 -
G5 2 1
Thí nghiệm 4: Động thái sinh trưởng mô sẹo
khởi phát từ lá đinh lăng.
Trong thí nghiệm này, mô sẹo được khởi phát từ
lá đinh lăng được cấy chuyền sang môi trường
MS bổ sung NAA với nồng độ 3 mg/l (nghiệm
thức G3) - nghiệm thức tốt nhất của thí nghiệm
tăng khối mô sẹo được khởi phát từ lá đinh lăng,
sau đó theo dõi sự biến động tăng và hệ số tăng
sinh của khối mô sẹo được nuôi cấy, nhằm mục
đích xác định động thái sinh trưởng và thời gian
tốt nhất thu hoạch lượng mô sẹo phục vụ tách
chiết, sản xuất hợp chất saponin.
Sau 6 tuần nuôi cấy, ảnh hưởng của auxin và nước
dừa đến sự tăng trọng lượng tươi của khối mô sẹo
khởi phát từ lá đinh lăng được thể hiện qua Bảng
4.
Trong quá trình phát triển, tế bào thực vật thường
trải qua 4 giai đoạn: thích nghi, tăng trưởng, cân
Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
0,390 g/mẫu so với mẫu nuôi cấy ban đầu là 0,200
g/mẫu, với hệ số tăng sinh là 1,921. Ở nghiệm
thức G5 (2 mg/l NAA và 1 mg/l kinetin) cho hệ số
tăng sinh là 1,360. NAA kích thích quá trình phân
chia tế bào và kinetin kích thích quá trình phân
chia và biệt hóa tế bào; sự phối hợp NAA và
kinetin có vai trò kích thích tăng sinh và biệt hóa
tế bào. Việc kết hợp cả NAA và kinetin cho việc
tăng sinh tế bào mô sẹo lá đinh lăng là chưa phù
hợp, tương tự kết quả của (Śliwińska và cs.,
2008).
Trọng lượng tươi (%) Hệ số tăng sinh (lần)
0,203 1,000
0,286 1,409
0,312 1,537
0,390 1,921
0,294 1,448
0,276 1,360
bằng và suy giảm. Trong tuần đầu tiên, tế bào mô
sẹo lá đinh lăng đang trong giai đoạn thích nghi
với môi trường nuôi cấy nên phát triển chậm, sự
tăng trọng lượng tươi của khối mô sẹo là không
đáng kể ở cả 2 nghiệm thức G3 (NAA là 3 mg/l)
và GD3 (NAA là 3 mg/l có bổ sung 10% nước
dừa). Từ tuần thứ 2 đến tuần thứ 4, tế bào mô
sẹo bước vào giai đoạn phân chia mạnh và trọng
lượng tươi của khối mô sẹo ngày càng tăng và cao
nhất vào tuần thứ 4 (hệ số tăng sinh ở nghiệm
thức G3 là 1,455 và nghiệm thức GD3 là 1,548).
Đến tuần thứ 5, tế bào bước vào giai đoạn cân
bằng, số tế bào sinh ra bằng số tế bào chết đi dẫn
đến trọng lượng tươi của khối mô sẹo ngày càng
giảm. Đến tuần thứ 6, trọng lượng tươi của khối
mô sẹo tiếp tục giảm (hệ số tăng sinh ở nghiệm
thức G3 là 0,860 và nghiệm thức GD3 là 0,877).
38
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 33 – 41 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology

Trong môi trường nuôi cấy có bổ sung nước dừa
ở nghiệm thức GD3 (NAA 3 mg/l có bổ sung 10%
nước dừa), nhận thấy sự tăng trọng lượng tươi của
khối mô sẹo diễn ra mạnh hơn so với môi
trường nuôi cấy không bổ sung nước dừa ở
nghiệm thức G3 (NAA 3 mg/l) (Hình 3). Nước
dừa có chứa các đường đơn, amino acid, các chất
điều hòa sinh trưởng tự nhiên giống cytokinin có
vai trò thúc đẩy sự phân chia mạnh của tế bào mô
sẹo; nước dừa không thể thiếu trong nuôi cấy tăng
sinh tế bào soma, phát sinh phôi soma và thể
giống phôi (protocorm like body) ở hầu hết các
loài cây trồng và hoa lan (Trần Văn Minh, 2013).

Bảng 4. Ảnh hưởng của NAA và nước dừa đến sự tăng sinh của mô sẹo khởi phát từ

Thời gian NAA (3 mg/l) NAA (3 mg/l) + CW (10%)

nuôi cấy Trọng lượng tươi Hệ số tăng sinh Trọng lượng tươi Hệ số tăng sinh
(tuần) (g) (lần) (g) ( lần)
0 0,200 1,000e 0,200 1,000e

1 0,224 1,122d 0,228 1,140d

2 0,258 1,150c 0,267 1,171c

3 0,310 1,258b 0,336 1,258b

4 0,451 1,455a 0,520 1,548a

5 0,430 0,953f 0,505 0,971f

6 0,370 0,860g 0,443 0,877g

Hình 3. Tăng sinh mô sẹo trên môi trường

G3 (NAA 3 mg/l) (trái) và GD3 (NAA 3 mg/l + CW 10%) (phải)

Thí nghiệm 5: Định lượng oleanolic acid
saponin trong mô sẹo từ lá đinh lăng.
Phân tích định lượng bằng HPLC cho thấy hàm
lượng tích lũy oleanolic acid 115,9 µg/g và
saponin 378,8 µg/g trong mô sẹo (Hình 4). Sự
tăng sinh mô sẹo trong thời gian ngắn (30 ngày)
cho thấy khả năng tổng hợp oleanolic acid và
saponin; ngược lại cần thời gian dài trên 2 năm ở
cây đinh lăng trong tự nhiên để tiến hành quá
trình tương tự.

39
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 33 – 41
Hình 4. Định lượng oleanolic acid và saponin bằng HPLC từ mô sẹo tăng sinh
4. KẾT LUẬN
Khử trùng mẫu lá đinh lăng bằng TCCA 90
(0,5%) trong thời gian 15 phút thích hợp nhất, tỷ
lệ mẫu sống vô trùng đạt 93,33%. Môi trường
thích hợp cho sự phát sinh mô sẹo từ lá cây đinh
lăng là môi trường MS bổ sung NAA (2 mg/l), tỷ
lệ mẫu lá tạo mô sẹo là 80%. Môi trường thích
hợp tăng sinh mô sẹo là môi trường MS bổ sung
NAA (3 mg/l), trọng lượng tươi đạt 0,390 g, với
hệ số tăng sinh là 1,921 lần sau 6 tuần nuôi cấy.
Sinh khối mô sẹo tăng cao nhất trong môi trường
MS bổ sung NAA (3 mg/l) và nước dừa (10%) ở
tuần thứ 4 (hệ số tăng sinh là 1,548 lần), tăng cao
hơn so nghiệm thức không bổ sung nước dừa (hệ
số tăng sinh là 1,455). Kết quả phân tích định
lượng bằng phương pháp HPLC đã chứng tỏ sự có
mặt của oleanic acid và saponin trong mô sẹo tăng
sinh khởi phát từ lá đinh lăng.
Nuôi cấy tế bào thu nhận các chất hoạt tính sinh
học là kỹ thuật hiện đại của công nghệ sinh học
thực vật. Cho phép nuôi cấy tế bào quanh năm
trong điều kiện môi trường có khống chế. Kỹ
thuật cho phép vượt qua rào cản khắc nghiệt của
tự nhiên về độ cao và nhiệt độ thấp ở những loài
cây trồng thuộc họ nhân sâm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
Bensita, M. B., Nilani, P. & Sandhya, M. S.
(1998). Studies on the adaptogenic and
antibacterial properties of Polyscias fruticosa
(L) Harms. Ancient Science of Life, 18: 3-4.
Brickell, C. H. (2003). American Horticultural
Society A–Z encyclopedia of garden plants.
Dorling Kindersley, London, pp 818–819.
Furmanowa, M., Nosov, A. M., Oresnikov, A. V.,
Klushin, A. G., Starościak B.;Śliwińska A,
Guzewska J & Bloch R. (2002). Antimicrobial
activity of Polyscias filicifolia cell biomass
extracts. Pharmazie 57, 424–426.
Huan, V. D., Yamamura, S., Ohtani, K., Kasai, R.,
Yamasaki, K., Nham, N. T. & Chau, H. M.
(1998). Oleane saponins from Polyscias
fruticosa. Phytochemistry 47, 451–457.
Lutomski J & Luan TC. (1992). Polyacetylenes in
the Araliaceae family. Part II. Polyacetylenes
from the roots of Polyscias fruticosa (L.)
Harms. Herba Pol 38, 3–11.
Lutomski, J., Luan, T. C., Hoa, T. T. (1992).
Polyacetylenes in the Araliaceae family, Part
IV. The antibacterial and antifungial activities
of two main polyacetylenes from Panax
vietnamensis Ha et Grushv. and Polyscias
fruticosa L. Harms. Herba Pol, 38, 137-140.
40
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 33 – 41
Masruri, E., Elvina, D. I., Kristianingsih, E. P. U.,
Rahman, M. F. & Rurini, R. (2007).
Indentification of triterpenoid compound from
Polyscias fruticosa Harms (Araliaceae) root
bark. International Conference on Chemical
Sciences 2007.
Murashige, T. & Skoog, R. (1962). A revised
medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, (15),
431-497.
Nguyễn Kim Phi Phụng. (2007). Phương pháp cô
lập hợp chất hữu cơ. Nxb ĐHQG TPHCM
2007.
Slepyan, L. I., Dzhabava, L. A. & Loshchilina, I.
A. (1975b). Khimicheskoe
ifarmakologicheskoe zuchenie biomassy
kultury tkanei Polyscias filicifolia. Ailey. Rast.
Res., 11, 523–528.
Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
Śliwińska, A., Olszowska, O., Furmanowa, M. &
Nosov, A. (2008). Rapid multiplication of
Polyscias filicifolia by secondary somatic
embryogenesis. In Vitro Cell Dev Biol Plant,
44, 69-77.
Trần Công Luận, Hồ Thị Tuyết Linh, Phạm Thị
Xuân Thắm, Nguyễn Thành Nguyên &
Nguyễn Thượng Dong. (2001). Hợp chất
polyacetylen trong lá đinh lăng (Polyscias
fruticosa L. Harms., Araliaceae). Tuyển tập
Công trình NCKH 1987-2000, Nxb KHKT
2001, trang 238-240.
Trần Văn Minh. (2013). Công nghệ sinh học thực
vật. Giáo trình dành cho Cao học và Nghiên
cứu sinh. Đại học Nông Lâm TPHCM.
Trịnh Thị Nhung. (2012). Bước đầu nghiên cứu
định lượng acid oleanolic trong Đinh lăng
bằng HPLC. Luận văn Thạc sĩ, ĐH Dược Hà
Nội 2012.
41