L4.

Lựa chọn được

hệ thống chủng chủ -
vector phù hợp
NGUYỄN TRÍ NHÂN
TA: TRẦN HÀ LẠC

1
Tại sao cần sử dụng vector trong dòng hóa gen?

2
 Ví dụ một số chủng chủ trong biểu hiện gen

– E. coli tăng trưởng

nhanh, dễ thao tác nhưng
không có biến đổi sau
dịch mã
– Nấm men tăng trưởng
khá nhanh (chậm hơn E.
coli), dễ thao tác, có thể
thực hiện glycosyl hóa
(nhưng đôi khi quá mức)
– Tế bào động vật có vú
tăng trưởng chậm, chi phí
cao, nhưng biến đổi sau
dịch mã chính xác hơn
3
 PHAGE
Các loại vector Phage DNA + target gene

PLASMID

NST nhân tạo của vk

VECTOR VIRUS
4
Plasmid

✓ DNA vòng tồn tại độc lập trong tế bào vi khuẩn

✓ Luôn mang một hay nhiều gen → gen quy định những đặc
điểm có lợi cho tế bào chủ, vd: khả năng kháng kháng sinh
ở nồng độ thông thường gây độc
Đặc điểm của plasmid

✓ Phần lớn plasmid chứa ít nhất 01 trình tự khởi đầu sao

chép
ORIgin of replication ≠ Replicator ≠ Initiator
Nấm men: Autonomously Replicating Sequences (ARS)

Plasmid nhỏ: sử dụng enzyme tế bào. Một số plasmid lớn:

mang gen chuyên biệt cho sao chép plasmid
✓ Một số plasmid sao chép bằng cách chèn vào bộ gen vi
khuẩn (một số giai đoạn tồn tại độc lập)

Integrative plasmid (plasmid sát nhập)/Episome

Plasmid không sát nhập vs. sát nhập
Kích thước plasmid

✓ Từ nhỏ nhất 1kb đến lớn nhất 250kb

297 bacteria carrying plasmids that range in size from 5 to 250 kb were
identified from more than 1,000 aerobic heterotrophic bacteria isolated from
coastal California marine sediments. The majority of the natural isolates
typically contained one large (40- to 100-kb) plasmid. (Appl. Environ.
Microbiol., Mar 1997, 63:3, p888-895)
Số lượng bản sao plasmid

✓ Các plasmid kích thước lớn thường có số lượng bản sao

thấp: 1-2 bản sao/tế bào → stringent plasmid
✓ Các plasmid kích thước nhỏ có thể có số bản sao từ 50
hay hơn trên 1 tế bào → relaxed plasmid
✓ Ví dụ:
• Số bản sao thấp: 1-2/tế bào (mini-F, pSC101)
• Số bản sao trung bình: 2-10/tế bào (pACYC177,184)
• Số bản sao cao: 20-50/tế bào (pBR322)
• Số bản sao rất cao: ~100/tế bào (pUC plasmids)
Plasmid tiếp hợp và không tiếp hợp

✓ Plasmid tiếp hợp (conjugative plasmid): có khả năng kích

thích thực hiện giao nạp/tiếp hợp bởi sự hiện diện của gen
tra (tạo pilus) và gen mob (tạo protein chuyển)
✓ Plasmid không
tiếp hợp/plasmid
được vận
chuyển: không có
khả năng kích
thích sự tiếp hợp,
nhưng có thể
được vận chuyển
cùng plasmid tiếp
hợp
Ví dụ plasmid không tiếp hợp/được vận chuyển

✓ Gen tra trên bộ gen, gen mob trên plasmid được vận chuyển
Tính tương thích của plasmid

✓ Một số tế bào vi khuẩn mang nhiều hơn 01 loại plasmid. Vd:

E. coli mang 7 loại plasmid khác nhau
✓ Để cùng tồn tại trong 1 tế bào các plasmid khác nhau phải
tương thích nhau (compatible)
✓ Các plasmid không tương thích nhau (incompatible)
được xếp chung vào một nhóm không tương thích:
• 02 plasmid khác nhau trong cùng nhóm không tương
thích → không có thể cùng tồn tại chung trong tế bào
• 02 plasmid thuộc hai nhóm không tương thích khác
nhau → có thể cùng tồn tại trong cùng một tế bào
• Vd: các plasmid thuộc các nhóm không tương thích khác
nhau: ColE1, p15A, pSC101, F, R6K, RP4
Plasmid ở sinh vật khác

✓ Ở eukaryote plasmid chỉ tìm thấy ở

Saccharomyces cerevisiae: 2µm plasmid
✓ Plasmid chưa được tìm thấy ở các loài
eukaryote khác như nấm sợi, thực vật hay động
vật
Phần lớn các plasmid sử dụng trong chuyển
gen là plasmid tự nhiên hay được biến đổi?
Các plasmid được
biến đổi và thương
mại hóa:
- Hiệu suất biến
nạp cao hơn
- Có thể mang
các đoạn DNA pBR322
lớn
- Có thêm các
gen để sàng
lọc, các trình
tự để biểu
hiện gen
Cách đặt tên plasmid pBR322

PLASMID

BOLIVER

RODRIGUEZ

Mã số giúp phân biệt với các plasmid

khác do cùng nhóm nghiên cứu phát
triển như pBR325, pBR327, pBR328
Cách đặt tên plasmid?

Các plasmid khác có cùng

cách đặt tên như pBR322?
Vd: pUC, pET, pCMV?
Ví dụ cách đặt tên plasmid

Không phải plasmid nào cũng

có cùng cách đặt tên với
pBR322
pUC: UC = University of California
pET: E = Expression vector, T = T7 promoter
pCMV: CMV = CytoMegaloVirus promoter
Quy trình hình thành plasmid pBR322
Thiết kế của plasmid pBR322?

Tại sao lại thêm 2 gen ampR và

tetR vào pBR322?
Sàng lọc dòng TTH bằng 2 gen ampR và tetR

Có thể sử dụng 2 gen ampR và tetR để sàng lọc

dòng tế bào mang gen mục tiêu bằng bất hoạt
chèn
Thiết kế của pUC8?

Những thay đổi của pUC8 so với

pBR322 là gì? Ý nghĩa?

pBR322

pUC8
Gen lacZ’

1. Thay đoạn gen tetR bằng gen lacZ’ ➔ sàng lọc

sơ bộ chỉ bằng 1 bước
Vùng MCS, ori và vị trí cắt trên ampR
2. Thêm vào nhiều vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn
(multi-cloning site, MCS) tăng thêm nhiều lựa chọn vị trí cắt cho người sử dụng

3. Biến đổi vùng trình tự ori (bằng đột biến ngẫu nhiên) → tăng số
bản sao plasmid lên 500 – 700 (so với chỉ ~15 bản sao của
pBR322) Đột biến bằng cách đưa gen vào tb chủ rồi chiếu uv, hoá chất, pcr.
4. Biến đổi trình tự gen ampR (bằng đột biến điểm định hướng) để
không mang vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn (vd: mất PstI)
Mất PstI để tránh cắt đôi vòng và không làm thay đổi chứ năng ampR
Hệ thống pET
Plasmid 2µm của nấm men S. cerevisiae

– Plasmid duy nhất ở

eukaryote
– Sao chép plasmid sử
dụng trình tự ori,
enzyme của tế bào và
2 protein REP1 và
REP2
– Protein FLP chuyển
plasmid dạng A (hình
bên) sang dạng B
(trình tự sắp xếp các
gen thay đổi)
– Trình tự D chưa biết
chức năng
Yeast episomal plasmid (YEp)

– Plasmid có nguồn gốc từ plasmid 2µm

– Có thể chứa toàn bộ hay chỉ 1 phần của plasmid 2µm
– Có thể sao chép độc lập hoặc chèn vào bộ gen tế bào nấm
men
– Có thể chứa những trình tự giúp sao chép và sàng lọc trong
chủng chủ E. coli ➔ “shuttle plasmid” (plasmid con thoi):
vừa sao chép được trong nấm men, vừa sao chép được
trong E. coli
Tại sao cần
shuttle plasmid?
YEp13
Dòng hóa
E.coli-nấm men
bằng shuttle
plasmid YEp13

Gắn gen vào nấm men và sàng lọc rất khó khăn nên sẽ
làm ở E.Coli trước
YEp13 chèn vào bộ gen tế bào

Tái tổ hợp tương đồng

Sàng lọc dòng nấm men mang YEp13 tái tổ hợp

Chủng
chủ đột
biến
khuyết
dưỡng

LEU2: b-isopropyl-malate dehydrogenase, một trong

những enzyme tham gia quá trình chuyển hóa pyruvic
acid thành leucine
Yeast integrative plasmids (YIp)
Từ plasmid của E. coli thiết kế mang thêm trình tự của nấm
men → trình tự này giúp sát nhập plasmid vào bộ gen nấm
men. Vd: trình tự URA3 trong YIp5

1. Plasmid này có thể

sao chép trong E. coli
không?
2. Sàng lọc trong nấm
men bằng cách nào?

3. Đặc điểm của chủng

chủ sử dụng? URA3: orotidine-5'-phosphate
decarboxylase, tham gia sinh tổng hợp
uracil
Yeast replicative plasmids (YRp)
Plasmid có nguồn
gốc từ E. coli
mang thêm trình
tự giúp sao chép
từ bộ gen nấm
men (ARS:
autonomously
replicating
sequence) và một
trình tự khác từ
nấm men để sàng
lọc.

TRP1: tham gia sinh

tổng hợp tryptophan
Yeast artificial chromosome (YAC)

YAC có thể mang 1 đoạn

DNA đến 1400Kbp

Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men gồm 3 thành phần cơ bản
cần có của 1 NST:
1. Centromere: giúp NST phân chia đồng đều về 2 tế bào
con
2. Telomere: bảo vệ 2 đầu mút NST
3. ARS: các điểm giúp khởi đầu sao chép
pYAC3
Dòng hóa gen bằng pYAC3
3 yếu tố khi lựa chọn vector

1. Hiệu suất biến nạp: số thể biến nạp thu nhận được
từ 1 µg plasmid

YEp: 10,000 - 100,000; YRp: 1000 - 10,000; YIp: 1 - 10

2. Số bản sao/tế bào:

YEp: 20 – 50, YRp: 5 – 100, YIp: 1

3. Mức độ ổn định trong tế bào:

YEp và YRp: plasmid có khuynh hướng tập hợp lại
trong tế bào mẹ khi nảy chồi → tế bào con không mang
plasmid
Yip và YAC: ổn định hơn
Chuyển gen ở thực vật bằng Ti plasmid

Nguồn gốc Ti
plasmid?

Agrobacterium
tumefaciens

Ri plasmid of
Agrobacterium rhizogenes
Ti plasmid chèn gen vào bộ gen tế bào chủ
Hệ thống vector 2 thành phần (binary vector)
Biến nạp cây bằng A. tumefaciens

Target gene
Chuyển
gen trực
tiếp