Professional Documents
Culture Documents
Grundlæggende Analyseteknik 2 Og 3
Grundlæggende Analyseteknik 2 Og 3
Grundlæggende Analyseteknik 2 Og 3
Grundlæggende
analyseteknik
Øvelsesvejledninger
Øvelse 1
Klargøring og arbejde i LAF-bænk
Estimeret tidsbrug: 0,5 lektioner
Mål:
At klargøre og lære at arbejde sterilt i LAF-bænk
Princip:
Princippet i en LAF-bænk bygger på at der arbejdes i et område med sterilfiltreret luft.
Relevant teori:
• Praktisk mikrobiologi: Kap. 10
• Arbejdsmiljø i laboratoriet: Kap. 11
Reagenser og kemikalier:
• 70% Ethanol
Materialer og apparatur:
• LAF-bænk
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalier:
• 70 % Ethanol
Fremgangsmåde:
Før arbejdet påbegyndes
1. Ca. 10 min før arbejdet påbegyndes tændes for ventilatoren på LAF-bænken ved
fuld hastighed.
2. Arbejdskammeret på LAF-bænken desinficeres omhyggeligt med 70% Ethanol.
• Ved alt arbejde i en LAF-bænk skal det tilstræbes at man opnår så aseptiske
arbejdsforhold som muligt. Brug af handsker kan derfor efterfølgende være
hensigtsmæssigt. Som alternativ kan man ’vaske’ sine hænder og underarme i
70% Ethanol.
Affald:
Handsker og papirklude til almindeligt affald.
Øvelse 2
Dyrkning og subkultivering af adherente
cellekulturer
Estimeret tidsbrug: 2 + 0,25 lektioner
Mål:
At opnå kendskab til arbejde med adherente mammale cellekulturer.
Princip:
Hvis man ønsker at vedligeholde en adherent mammal cellekultur i vækst, må cellerne
tilses jævnligt for at kontrollere væksten og undersøge for kontaminering.
Ligeledes skal væksten tilses for at undersøge om der behov for at skifte medie eller
om cellekulturen skal subkultiveres (overføres til frisk medie), fordi celletætheden er
blevet så stor at væksten er gået i stå.
Relevant teori:
• Kompendie i celledyrkning
Materialer og apparatur:
• Spildflaske (T-75 eller T-175)
• T-75 dyrkningsflaske til færdigblandet medium
• T-75 dyrkningsflaske til subkultivering
• 2 stk. TC-disk
• Omvendt fasekontrastmikroskop
• CO2 - inkubator
• 1 NucleoCounter kassette
• NucleoCounter
• Automatisk pipettesuger
• Engangspipetter 1 mL, 5 mL, 10 mL (Sterile)
• 1 stk. Centrifugerør 50 mL (Sterile)
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalier:
• 70 % Ethanol
Fremgangsmåde:
Dag 1 (subkultivering):
50 ml Ham’s F12
50 ml DMEM
10 ml newborn calf serum
1 ml L-glutamin
1 ml pen/strep
(husk at blande godt og skriv navn og dato på flasken , samt markere at mediet er
færdigblandet)
5. Overfør 20 ml celledyrkningsmedie til den nye T-75 flaske. (Skal bruges i pkt. 22a).
6. Overfør 2,4 mL celledyrkningsmedium til hver af de to stk. TC-disk (Skal bruge i pkt.
22b).
10. Rens cellelaget ved tilsætning af 20 ml DPBS-buffer. Vug flasken roligt frem og
tilbage og hæld fra i spildflasken.
11. Gentag punktet 10 og frasug afslutningsvis det sidste af DPBS-bufferen med pipette.
13. Anbring flasken ved 37C i 2-4 min i inkubatoren. Noter i skema 2 starttid for
inkubation.
14. Udtag flasken af inkubatoren (Noter tidspunkt i skema 2) og undersøg cellelaget ved
omvendte fasekontrastmikroskop. Cellerne skal være ”rundet op”, dvs. blive
kugleformede og slippe flaskens bund. Slå evt. let på siden af flasken for at løsne
cellerne.
15. Hvis cellerne ikke er ”rundet op” inkuberes yderligere indtil cellerne har sluppet
flaskens bund. Husk også at noter tiden, hvis yderligere inkubation kræves.
16. Vip cellesuspensionen i T-175 flasken et par gange. Hæld dernæst forsigtig
cellesuspensionen over i centrifugerøret med de 20 ml færdigblandet medium (fra
pkt. 7).
18. Hæld forsigtigt mediet fra cellerne ned i spildflasken. Det er vigtigt at dette foretages i
én bevægelse uden at der vippes frem og tilbage – da cellerne ellers kan løsne sig.
1. Udtag T75 flasken med den subkultiveret cellekulturen fra inkubatoren og undersøg
væksten ved omvendt fasekontrast-mikroskopi. Noter observationerne i skema 4.
Affald:
Affald fra spildflaske håndteres som Klinisk Risikoaffald ifølge tilhørende vejledning
• Hvis celler er meget tætte (95% konfluente eller mere) bliver cellelaget så tæt, at
trypsinen kan have svært ved at ”komme til” og løsne cellerne, dvs. jo længere
inkubation med trypsin skal man have før cellerne runder op.
o Hvordan passer jeres konfluens overens med jeres inkubationstid?
o Sammenlign med de andre hold.
Resultatskemaer
Resultatskemaer til journalbog. Klip ud og sæt ind FØR, der indsættes resultater.
Start tidspunkt for inkubation Slut tidspunkt for inkubation Inkubation i alt
Beregningseksempel:
Laborantuddannelsen
Institut f or Teknologiske
Øvelse 3: Farvning af adherente mammale celler
Øvelse 3
Farvning af adherente mammale celler
Estimeret tidsbrug: 2 lektioner
Mål:
At få kendskab til farveteknik af adherente cellekultur
Princip:
Cellekulturer kan farves med fluorescensfarvestofferne Acridin Orange og
Bisbenzamid (Hoechts).
Acridin Orange binder sig til cellernes DNA og RNA. dsDNA vil ved belysning med
UV-lys fremstå lysende grønne (500-526 nm), mens ssDNA og RNA vil lyse
rødt/orange (460-650 nm).
Hoechts-farve binder sig også til cellernes DNA. Cellekernen og kromosomer vil ved
belysning ved UV-lys fremstå lysende blå (460-490 nm).
Relevant teori:
Kompendie i celledyrkning.
Materialer og apparatur:
• Spildflaske (T-75 eller T-175) med 4 % diversol
• 1 stk. plastikrør 10 mL (Sterilt)
• Mikropipetter
• Omvendt fasekontrastmikroskop
• Mikroskop med tilhørende UV- lamper, kamera og PC
Laborantuddannelsen
Institut f or Teknologiske
Øvelse 3: Farvning af adherente mammale celler
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalier:
• 70 % Ethanol
• 96 % Ethanol
• Fiksativ: DPBS:96 % Ethanol i forholdet 1:1
Fremgangsmåde:
Forberedelse til begge farvninger:
Acridin Orange-farvning:
4. Gentag punkt 2. og 3.
5. Tilsæt 2,5 mL fiksativ, og lad det stå 5 min. ved rumtemperatur.
6. Frasug fiksativ til spildflaske med 4% diversol
7. Tilsæt 2,5 mL 96% ethanol, og lad det stå 10 min. ved rumtemperatur.
Hoechts-farvning:
Laborantuddannelsen
Institut f or Teknologiske
Øvelse 3: Farvning af adherente mammale celler
Affald:
Affald fra spildflaske håndteres som Klinisk Risikoaffald ifølge tilhørende vejledning
Laborantuddannelsen
Institut f or Teknologiske
Øvelse 4: Nedfrysning af mammale celler og viabilitetstest
Øvelse 4
Nedfrysning af mammale celler og viabilitetstest
Estimeret tidsbrug: 0,5 + 2 lektioner
Mål:
At få kendskab til procedurer i forbindelse med opbevaring og vibilitetstests-
undersøgelser af cellekulturer
Princip:
Hvis man vil nedfryse en cellekultur, er det nødvendigt at fjerne en stor del af den
mængde vand, som findes i cellerne. Dette gøres ved at erstatte vandet med
kryokonserverende stoffer som fx dimethylsulfoxid (DMSO) eller Glycerol. DMSO og
Glycerol nedsætter muligheden for krystaldannelsen af vandet i cellerne.
DMSO og glycerol kan ved længere tids påvirkning af celler, reducerer overlevelsen
af cellerne. Derfor er det vigtigt, at cellerne nedfryses hurtigt og ved en tidsafhængig
proces, hvor man afkøler materialet langsomt i det temperaturinterval, hvor risikoen
for fryseskader er størst.
En cellesuspension nedfryses i ampuller (kryorør). Volumet skal være så lille, at
varmetransporten gennem suspensionen er så hurtig at der opnås et jævnt
temperaturfald i hele cellesuspensionen.
Viabilitets-test på cellekulturer udnytter forskelle i intakte og beskadigede
cellemembraners evne til at lade stoffer passere cellemembranen.
Relevant teori:
Kompendie i celledyrkning.
Laborantuddannelsen
Institut f or Teknologiske
Øvelse 4: Nedfrysning af mammale celler og viabilitetstest
Materialer og apparatur:
• Spildflaske (T-75 eller T-175)
• 1 stk. plastikrør 10 mL (Sterilt)
• 1 stk. Kryorør
• Nedfrysningsboks
• Mikropipetter
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalier:
• 70 % Ethanol
Fremgangsmåde:
Dag 1:
Laborantuddannelsen
Institut f or Teknologiske
Øvelse 4: Nedfrysning af mammale celler og viabilitetstest
Dag 2:
1. Kryorøret tøs op (kan opvarmes forsigtigt i hånden eller stilles kortvarigt i en inkubator
ved 37C).
2. Bestem cellekoncentrationen (total antal celler og antal døde celler) ved hjælp af
NucleoCounteren. Se øvelse 5.
3. Bestem cellekoncentrationen (total antal celler og antal døde celler) ved hjælp af
tællekammer. Se øvelse 5.
Affald
Affald fra spildflasker håndteres som Klinisk Risikoaffald ifølge tilhørende vejledning
Laborantuddannelsen
Institut f or Teknologiske
Øvelse 4: Nedfrysning af mammale celler og viabilitetstest
Laborantuddannelsen
Institut f or Teknologiske
Øvelse 4: Nedfrysning af mammale celler og viabilitetstest
Resultatskemaer
Resultatskemaer til journalbog. Klip ud og sæt ind FØR, der indsættes resultater.
Skema 1 Viabilitet %:
Total celler Døde celler Viabilitet
(celler/mL) (celler/mL) (%)
Før nedfrysning
talt med NucleoCounter
Efter nedfrysning
talt med NucleoCounter
Efter nedfrysning
talt med tællekammer
Beregningseksempler:
NucleoCounter:
• Total celler = CTotal x MTotal
Tællekammer:
• Total celler =
Gennemsnit Cellekonc. (Levende celler) + Gennemsnit Cellekonc. (Døde celler)
Øvelse 5
Celletælling vha. NucleoCounter og tællekammer
Estimeret tidsbrug: 2 x 0,5-1 lektioner
Mål:
At bestemme antallet af celler (evt. døde og levende) i et givent volumen.
Princip:
De anvendte farvninger af celler udnytter forskelle i intakte og beskadigede
cellemembraners evne til at lade farvestoffer passere cellemembranen.
NucleoCounter:
Princip for farvning og måling ses i bilag 1.
Tællekammer:
For at skelne mellem levende og døde celler anvendes trypan-blå. Levende celler vil
forblive ufarvede, da trypan-blå ikke kan trænge gennem den intakte cellemembran ,
hvorimod døde celler bliver blåfarvede, da trypenblå kan trænge gennem den
beskadige cellemembran.
Princip for måling med tællekammer ses i bilag 2.
Relevant teori:
• Kompendie i celledyrkning
• Bilag 1
• Bilag 2
Reagenser:
• Cellesuspension fra øvelse 2 og øvelse 4
• Reagens A100 til nucleocounter
• Reagens B til nucleocounter
• Trypan-blå opløsning
• 70% Ethanol
Materialer og apparatur:
• NuleoCounter
• NucleoCounter kassetter
• Whirlingmixer
• Mikroskop
• Tællekammer med dækglas (Fuchs-Rosenthals)
• Vatpind
• Eppendorfrør
• Pasteurpipetter
• Mikropipette
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalier:
• 70% Ethanol
Fremgangsmåde:
NucleoCounter (se også bilag 1):
Bemærk:
Ved bestemmelse af celletallet til øvelse 2 skal der kun udføres Total Cell, dvs.
eppendorfrør 1. Resultaterne noteres i skema 3 under øvelse 2.
Ved bestemmelse af celletal til øvelse 4 skal der både tælles Total Cell og Non-viable
cell, dvs. både eppendorfrør 1 og 2. Resultaterne noteres i skema 1 under denne
øvelse.
Prøveforberedelse:
1) Mærk to eppendorfrør med henholdsvis 1 og 2.
2) Sørg for at cellerne er i suspension og overfør 200 µL cellesuspension til hver af de
to eppendorfrør.
3) Til eppendorfrør 1 (Total Cell):
a. Tilsættes 200 µL reagens A100 og bland grundigt med whirlingmixer.
b. Tilsæt derefter 200 µL reagens B og bland grundigt med whirlingmixer.
4) Eppendorfrør 2 (Non-viable cell = døde celler)
a. Der skal ikke tilsættes nogle reagenser
Tælling:
5) Tænd for NucleoCounteren.
6) Ved håndtering af Nucleocasetten er det vigtig at du ikke rører ved målecellen
(measurement chamber).
7) Dyp spidsen af Nuclecasetten ned i eppendorfrør 1 (Total cell) og tryk stemplet
(piston) ned – vent i 10 sekunder, så cellesuspensionen kan nå at blive suget op i
kassetten.
8) Placer kassetten i NucleoCounter- apparatet og tryk run.
9) Noter antal celler i skema 1. (Ved måling af celletal til øvelse 2 noteres resultatet
under øvelse 2).
10) Kasser kassetten.
11) Gentag pkt. 7) -10) med eppendorfrør 2 (Non-viable cell = Døde celler).
Fyldning af tællekammer:
4) Et dækglas (specielt beregnet til tællekammer) anbringes på Fuch-Rosenthals
tællekammeret.
5) Sug herefter lidt cellesuspension aseptisk op i en pasteurpipette.
6) Pasteurpipettens spids sættes ved randen af tællekammerets dækglas, og væske
med cellesuspension vil trækkes ind i tællekammeret på grund af vandets
overfladespænding.
Tælling:
7) Der skal tælles både levende celler (ufarvet) og døde celler (blå).
8) Ved mikroskopi (anvend fasekontrastmikroskopi) med passende forstørrelse, tælles
cellerne i et antal ruder (lille kvadrat) til der opnås et celletal på mindst 100 celler
(samlede celletal).
Celler på øverste streg og celler på højre streg tælles med, medens celler på
nederste og venstre streg ikke tælles med (se bilag 2).
9) Noter i skema 2 både hvor mange ruder der er talt samt antal celler.
10) Tællekammeret og dækglasses renses med en vatpind dyppet i sprit og lægges
tilbage i æsken.
Affald:
Affald håndteres som Klinisk Risikoaffald ifølge tilhørende vejledning.
Resultatskemaer
Resultatskemaer til journalbog. Klip ud og sæt ind FØR, der indsættes resultater.
NucleoCounter:
Skema 1: Celletælling før og efter nedfrysning (til øvelse 4):
Antal celler Fortyndings Antal døde Fortyndings Viabilitets %
total faktor celler faktor
(CTotal ) (MTotal ) (CNV) (MNV)
Før
nedfrysning
Efter
nedfrysning
Beregningseksempler:
Tællekammer:
Rude type der er talt i (Hel kammer / stort kvadrat / lille kvadrat):_______________________.
Rudens volumen (3,200 µL /0,200 µL / 0,0125 µL):______________________.
2.
tælling
Døde
1.
celler
tælling
2.
tælling
Beregningseksempler:
Bilag 1: Om NucleoCounter
NuleoCounter: Cell viability – How it works:
The cell viability of a sample is determined using the total cell count and the count of non -
viable cells (see the figure below).
When a sample is mixed with Reagent A-100 and Reagent B, a lysis of the viable cell
membrane takes place rendering all the cell nuclei susceptible to staining with propidium
iodide (PI) resulting in a total cell count.
Non-viable cells are permeable without treatment and are therefore stained directly with
PI, resulting in a non-viable cell count.
Calculation of Vialility
The percentage of viable cells (%viability) can be
calculated from following equation.
Bilag 2: Om tællekammeret
Fuchs-Rosenthals tællekammer består af et tykt objektglas med et lavere midterfelt, der
fungerer som kammer. Kammerhøjden er 0,2 mm, og det er angivet ved dybden af kammeret
(tiefe).
I det lave midterfelt er indridset to tællefelter omgivet af afløbsbrønde. Tællefelterne kan uden
forstørrelse skimtes som to små kryds.
De to små kryds, der består af meget fint indridsede streger, afskærer et tællefelt på 16 mm2,
som inddeles i 400 små kvadratiske felter.
Tællefelt
Tællekammer
Forstørret tællefelt
Fuchs-Rosenthals tællekammer
Viabilitets % = (Total antal celler – antal døde celler)/Total antal celler x 100%
Exercise 6
Protein quantification in beer using the Biuret
Method
Estimated time: 2 lessons
Aim:
To quantify the amount of protein in beer.
Principle:
Biuret is a chemical test used to quantify the amount of protein. The test is based on the
ability of Cu 2++ ions to form complexes with peptide bonds, which are present in all
proteins. The Cu2++-peptide bond complex is blue which has an absorption maximum at
approximately 550nm. The intensity of the formed colour is directly proportional with the
protein concentration.
Caution: Several compounds and substances may interfere with the quantification such
as ammonia, amines (including tris) as well as amino acids as these also forms blue
complexes with Cu 2++. EDTA, sucrose and other compounds such as detergents must
not be present in the sample and measurements will also be affected by ammonium
sulphate at concentrations > 15%
Relevant Theory:
From textbook: “Kemiske enhedsoperationer”
• Mikropipette
From textbook: “Laboratoriebegninger”
• Fortyndinger
• Standardkurve, kurveaflæsning
From textbook: “Analyse teknik”
• Lambert Beers lov
• UV-VIS-spektrofotometri
Procedure:
Sample (beer) preparation:
1. Place a Büchner funnel, equipped with a Whatman filter (Grade 6), on a flask with
suction.
2. An appropriate volume of beer is filtered.
3. Transfer an appropriate volume of filtered beer to a beaker.
4. To degas the beer, place the beaker in an ultrasound bath for at last 10min.
Sample dilution:
5. The concentration range of measurement is between 1–10 mg/mL and beer contains
approximately 0,5g protein/100 mL.
6. Choose a suitable dilution of the beer. If the beer is to be diluted, this must be done in
dem. H2O.
Spectrophotometer measurement:
Trash:
Samples and chemicals may be disposed of directly in the sink.
Results:
BEFORE the tables are filled out with the obtained exercise data, the below tables (1&2) are
to be cut out and glued into your journal book.
Calculated
Solution Solution - Blind
concentration
(Absorbance) (Absorbance)
(mg/mL)
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K Concentration.
L
M Control
%CV
N
O
Sample
P
(beer)
Q
Øvelse 7
Bestemmelse af proteinkoncentration i æggehvide
ved UV-metoden
Estimeret tidsbrug: 2 lektioner
Mål:
• at bestemme koncentrationen af protein i æggehvide.
Princip:
De aromatiske aminosyrer tyrosin og tryptofan absorbere UV-lys med et
absorptionsmaksimum ved 280 nm. Denne egenskab anvendes til en hurtig og ikke
destruktiv metode til bestemmelse af proteinkoncentrationen. Nukleinsyrer – DNA og
RNA – har et absorptionsmaksimum ved 260 nm, men har også en lysabsorption ved
280 nm. Dette kan man korrigere for ved en samtidig måling ved 260 nm.
Proteinkoncentrationen kan bestemme med følgende formel:
Proteinkoncentration (mg/mL) = (1.55 x A280) - (0.76 x A260)
Relevant teori:
Fra lærebog: “Analyse teknik”
• Lambert Beers lov
• UV-VIS-spektrofotometri
Reagenser og kemikalier:
• Hønseæg
• Dem. vand
Materialer og apparatur:
• UV-Spektrofotometer
• Nanofortometer
• UV-plastkuvetter
• Bægerglas
• Glastragt
• Osteklæde
• Mikropipette med egnede pipettespidser
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalie:
• Der er ingen bemærkninger til denne øvelse.
Fremgangsmåde:
Prøveforberedelse
1) Knæk et æg over et 250 mL bægerglas (1 æg pr. studiegruppe).
2) Skil æggehviden fra blommen ved forsigtigt at hælde blommen frem og tilbage
mellem de to skal halvdele.
3) Anbring en glastragt med 2 lag våd og opvredet osteklæde over et bægerglas.
4) Hæld forsigtigt æggehviden op i tragten og lad den filtrere forsigtigt. Det er vigtigt
ikke at presse hviden igennem, men blot lade den løbe af sig selv (kan tage lidt
tid). Evt. kan man forsigtigt løfte osteklædet og slå det forsigtigt imod tragten. Hele
ægget behøver ikke at blive filtreret, da der kun skal anvendes en lille del.
5) Fortynd prøven: Æggehviden fra hønseæg indeholder 10-11g protein/100 mL (≈
100 mg/mL) og den skal fortyndes til ca. 1mg/mL med dem. vand.
Affald:
Al affald kan hældes i vasken.
Resultatskemaer
Resultatskemaer til journalbog. Klip ud og sæt ind FØR, der indsættes resultater.
Skema 1: Spektrofotometer
Beregningseksempler:
Skema 2: Nanofotometer
Indstillingsparameter:
Lid Factor: A260 Factor:
Delution Factor: A280 Factor:
Background: Units:
Øvelse 8
Celletælling, OD-måling og pladespredning
Estimeret tidsforbrug: 5 timer + 1 time
Mål:
• At kunne vurdere statistisk sikkerhed på kimtællingsresultater.
• At kunne vurdere egne laboratoriefærdigheder m.h.t. fremstilling af
fortyndingsrække og udpladning.
• At kunne foretage en celletælling ved brug af et tællekammer.
• Bestemme sammenhængen mellem den optiske densitet og celletallet
• på en E. coli kultur.
Princip:
Kimtalsbestemmelse ved pladespredning: Ved kimtalsbestemmelse efter
pladespredning på agarplader og inkubation, tælles kimene makroskopisk på
pladerne, idet man forudsætter at ét kim efter inkubation frembringer én synlig koloni
én Colony Forming Unit (CFU).
Ved metoden tælles kun levende kim.
Da en prøves kimtal oftest ikke engang kendes tilnærmelsesvis er det nødvendigt at
foretage fortyndinger af prøven med meget store fortyndingfaktorer for at kunne
opnå et acceptabelt kolonital på nogle af pladerne.
Fortyndingen foregår ved aseptisk at udtage 1 mL prøve som overføres til et rør med
9 mL steril fortyndingsvæske. Der blandes omhyggeligt og 1 mL blanding overføres
til et nyt rør med 9 mL fortyndingsvæske .... osv., indtil ønsket fortyndingsgrad er
opnået (Se skitse under fremgangsmåde for pladespredning).
Celletælling: Ved anvendelse af et tællekammer er det muligt at tælle små objekter i
et veldefineret volumen.
Ud fra det opnåede tælletal i tællekammeret, kan koncentrationen af de talte objekter
bestemmes. (Se desuden nærmere i afsnittet om tællekammer).
OD-måling: OD-måling er en turbidimetrisk måling, der udnytter det forhold at
tilstedeværelse af mikroorganismer i en suspension vil svække det lys der passerer
gennem suspensionen.
OD-målingen foretages med brug af et spektrofotometer. Den anvendte
bølgelængde til målingen kan være bestemt af hvilken organisme des måles på. Her
anvendes bølgelængden 600 nm.
Substrater og kulturer:
• Overnight (ON)-kultur af E. coli i LB-medium
• Saccharomyces cerevisiae (Bagegær)
• 250 mL PCA – smeltet (deles mellem 2 studerende)
• 6 støbte PCA plader (støbt under Indledende laboratoriearbejde)
• 10 x 9 mL Sterilt 0,9% NaCl-opløsning i rør
• 10 x 5 mL Sterilt 0,9% NaCl-opløsning i rør
• 200 mL Sterilt 0,9% NaCl-opløsning (pr. studiegruppe)
Materialer og apparatur:
• Petriskåle
• Mikropipetter (1000 μL og 100 μL)
• Sterile spidser til mikropipetter
• Drigalskispatel
• Whirlingmixer
• Teknisk vægt
• Thoma´s tællekammer
• Mikroskop (med fasekontrast)
• 2 stk Pasteurpipetter
• Spektrofotometer
• Kuvetter (VIS)
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalier:
• Der er ingen bemærkninger til denne øvelse.
Fremgangsmåde:
Kimtalsbestemmelse af E.coli ved pladespredning
Øvelsen udføres individuelt.
Udpodning:
1) Indret først arbejdspladsen med nødvendige utensilier, rør, petriskåle,
mikropipetter og sterile spidser. Støb straks 6 PCA-plader og lad dem størkne
(eller brug allerede støbte plader).
2) Til fortyndingsrækken mærkes 9 stk. 9 mL NaCl-rør 10-1 → 10-9. (fremstillet på
Indledende laboratoriearbejde)
Anbring rørene i rækkefølge i et reagensglasstativ (se nedenstående fig.).
3) Petriskåle/støbte plader mærkes på siden af pladen langs kanten med småskrift,
Substratforkortelse, bakterieart, fortyndingsgrad, dato for udsæd og initialer.
a. Mærk 6 tomme petriskåle efter ovenstående med fortynding 10 -5 → 10-9 og
kontrol.
b. Mærk på samme måde de 6 støbte plader 10 -5 → 10-9 og kontrol. Brug evt. de
plader i har støbt under ”indledende laboratoriearbejde”.
ON kultur 1 mL fortynding
af E. coli Dybdeudsæd: -5 -6 -7 -8 -9 opblandes i ca. 15 mL
agar
5) Udsæd:
a. Dybdeudsæd foretages fra rørene 10-5 → 10-9
Rørene whirliemixes og der overføres 1 mL til den tilhørende tomme petriskål.
Du kan benytte den samme pipettespids, hvis du starter med den mest
fortyndet dvs. 10-9
Medtag en sterilitetskontrol ved at afpipettere 1 mL sterilt saltvand i en tom
petriskål.
Efter alle afpipetteringerne påhældes hver skål med ca. 15 mL smeltet PCA
(ca. 45C) og indholdet blandes grundigt, men forsigtigt ved rotation af
skålen.
b. Overfladeudsæd foretages fra rørene 10-4 → 10-8
Hvis pladerne er støbt samme dag, skal de tørres i varmeskab (37 C) i
minimum 15 min.
Udsæden skal fortages fra ét fortyndingsrør af gangen.
Røret whirliemixes og der overføres 0,1 mL med mikropipette til overfladen af
den støbte PCA plader. Med en steril drigalskispatel stryges væsken grundigt
over hele pladens overflade. Sørg for at have kontakt med agaren hele vejen
rundt.
Medtag en sterilitetskontrol ved at afpipettere 0,1 mL steril saltvand til
overfladen af en støbt PCA plader og stryg med drigalskispatlen.
Lad alle pladerne tørre ca. 15 min. inden inkubation.
Bemærk at en udsæd af 0,1 mL, – fx fra fortyndingen 10-4, medfører at den
tilhørende plade skal være mærket 10 -5!
Inkubation:
6) Pladerne (inkl. kontrolpladerne) inkuberes ved 37C med bunden opad i 1
døgn.
Aflæsning:
7) Læg pladerne fra de to metoder i rækkefølge 10 -9 – 10-5 + kontrol
8) Antallet af kolonier på de enkelte plader tælles og noteres i skemaet. Start med
10-9 pladen.
For de plader hvor kolonitallet er så højt, at det ikke er praktisk muligt at tælle
antallet, noteres det med TNTC.
Prøveforberedelse:
1) Fremstil en gæropslemning ved at afveje 0,2 g bagegær, som opslemmes i 200
mL sterilt 0,9% NaCl-opløsning. Der fremstilles kun én gæropslemning til hele
studiegruppen.
Fyldning af tællekammer:
2) Et dækglas (specielt beregnet til tællekammer) anbringes på tællekammeret.
3) Sug herefter lidt gæropslemning op i en pasteurpipette.
4) Pasteurpipettens spids sættes ved randen af tællekammerets dækglas, og
væske med gærsuspension vil trækkes ind i tællekammeret på grund af vandets
overfladespænding.
5) Begge tællefelter fyldes.
Tælling:
6) Ved mikroskopi (anvend evt. fasekontrastmikroskopi) med passende forstørrelse,
tælles cellerne i en B-rude. Hvis der opnås et celletal, som er mindre end 100
celler, tælles endnu en B-rude.
7) Celler på øverste streg og celler på højre streg tælles med, medens celler på
nederste og venstre streg ikke tælles med (se bilag 1).
8) Gentag tælling af celler i det andet tællefelt på tællekammeret.
9) Notere tællekammerets højde.
10) Tællekammeret og dækglasses renses med en vatpind dyppet i sprit og lægges
tilbage i æsken.
Fortyndingsrække:
1) Mærk 10 sterile 5 mL NaCl-rør nr. 1 til 10.
2) Udtag 5 mL E.coli kultur til rør mærket nr. 1.
3) Foretag en tofolds-fortynding af E.coli- kulturen med udgangspunkt i rør nr. 1.
Der benyttes en ny pipettespids ved hver udtagning og indholdet blandes
omhyggeligt på whirlingmixeren inden udtagningen til det næste rør dvs.
Whirling-mix rør 1 og overfør 5 mL fra rør 1 til rør 2. Whirling-mix rør 2 og
overfør 5 mL fra rør 2 til rør 3 osv.
Affald:
Mikrobiologisk affald behandles i henhold til SOP nr. 04.01.3 Håndtering af biologisk
affald.
C 1 + C 2 + .....+ C n
Kim = ,
V 1 + V 2 + .....+ V n
hvor C 1, C2, ..... C n er antallet af kolonier talt i fortyn dingerne V 1, V2, ..... Vn .
• Kommenter de 2 sterilitetskontroller.
Resultatskemaer
Resultatskemaer til journalbog. Klip ud og sæt ind FØR, der indsættes resultater.
Antal kolonier
Kim/mL
10-5 10-6 10-7 10-8 10-9
Dybdeudsæd
Overfladeudsæd
Sterilitetskontrol dybdeudsæd: Antal kolonier
Celletal i en B-rude
Sum af celletal i de
Rude Rude Rude Rude
talte B-ruder
1 2 3 4
1. tællefelt
2. tællefelt
Gennemsnit Gennemsnit
Konc. Antal gærceller pr.
af celletal i af konc. %RSD
celler/ mL celler/ mL gram gær
én B-rude
1. tællefelt
2. tællefelt
BILAG 1
Om tællekammeret
Et tællekammeret består af et tykt objektglas med et lavere midterfelt, der fungerer som
kammer. Kammerhøjden kan være 0,1mm eller 0,05 mm, og er angivet som dybden af
kammeret (tiefe).
I det lave midterfelt er indridset to tællefelter omgivet af afløbsgrøfter. Tællefelterne kan
uden forstørrelse skimtes som to små kryds.
De to små kryds, der består af meget fint indridsede streger, afgrænser et tællefelt på 1
mm2, som inddeles i mindre kvadratiske eller rektangulære felter.
Hvis kammerdybden er 0,1 mm vil et tællefelt med siderne 1 mm rumme 0,1 mm x 1 mm2
= 0,1 mm3 = 0,1 L= A-rude (se skitsen side 10 for andre kammerdimensioner)
Hvis kammerdybden er 0,05 mm vil et tællefelt rumme 0,05 mm x 1 mm2 = 0,1 mm3 =
0,05 L = A-rude.
Tællefelt
Thoma´s tællekammer
Forstørret tællefelt
B-rude
←
← 0.25 mm →
0.25 mm →
BB-rude
B
-
r
← u mm
0.25 →
d
e
← 1.00 mm ~ A-rude →
A-rude : 1 x 1 mm B-rude: 0,25 x 0,25 mm Lille kvadrat: 0,050 x 0,050 mm
Øvelse 9
Introduktion til DNA-arbejde, PCR og
gelelektroforese
(Estimeret tidsbrug: 6 lektioner)
Mål:
Målet med øvelsen er at stifte bekendtskab med DNA-arbejde, herunder brug af PCR-
metoden til opformering (amplifikation) af DNA, gelelektroforese til visualisering af DNA
og Nanodrop til kvantificering af DNA.
Princip:
”Polymerase Chain Reaction”, som forkortes PCR, er en metode til amplifikation af et
bestemt fragment af DNA fra lav koncentration til en koncentration, der kan detekteres.
Metoden har mange anvendelsesmuligheder, fx detektion af specifikke gener,
bakterieidentifikation, kloning mv.
To primere, en buffer og et mix af de fire forskellige nukleotider (dNTP-mix), som DNA
består af, blandes sammen i et PCR-rør med varmestabilt enzym og DNA-template.
Røret placeres i et PCR-apparat, som kører et temperaturprogram, hvorved der sker en
in vitro DNA-syntese i røret. På denne måde kan man i løbet af få timer fremstille
millioner af kopier af sit udgangsmateriale.
Gelelektroforese er en metode til visualisering af DNA og bestemmelse af DNA-
fragmenters størrelse (fx fra en PCR-reaktion). Ved påsætning af DNA på en
agarosegel, og påvirkning af et elektrisk felt, adskilles DNA-fragmenterne efter størrelse,
idet de mindre molekyler bevæger sig hurtigere i gelens netværksstruktur end større
molekyler. Et fluorescerende farvestof i gelen binder specifikt til DNA, således at man
ved belysning af gelen med UV lys vil kunne se fragmenterne som lysende bånd på
gelen.
Nanofotometer er et spektrofotometer, der kan måle på meget små voluminer (1-5 µL).
Bestemmelsen af DNA-koncentrationen vha. Nanofotometer bygger på UV
spektrofotometri, idet DNA har et absorptionsmaximum ved 260 nm.
Relevant teori:
Fra lærebogen: ”Molekylæbiologi og biokemi”:
• Genteknologiske metoder: Bestemmelse af DNA-koncentration, PCR-metoder,
agarose gelelektroforese.
Reagenser og kemikalier:
PCR:
• PCR-buffer (10X) uden MgCl 2
• MgCl 2 opløsning (10X) 25 mM
• dNTP mix (10 mM af hhv. dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
• Template 1: pUC18 DNA 1 ng/L opløst i sterilt vand.
• Template 2: -DNA (Lambda-DNA) 1 ng/L opløst i 1x TE-buffer
• Varmestabilt enzym (Taq polymerase, 5 units/μL)
• Sterilt vand
• Primere:
- amp1: (5´ GAT ACG GGA GGG CTT ACC AT 3´) 10μM
- amp2: (5´ CCG AAG AAC GTT TTC CAA TG 3´) 10μM
- KP 1: (5´ GAT GAG TTC GTG TCC GTA CAA CTG G 3´) 10μM
- KP 2: (5´ GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CGC C 3´) 10μM
Elektroforese:
• Elektroforesebuffer: 1 X TAE som fremstilles ud fra 10 X TAE (10 X TAE buffer købes
færdigblandet: 200 mM Tris-acetat, 10 mM EDTA, pH 8,0)
• Agarosegeler: 1 % agarosegel, 1 X TAE-buffer, GelRed (10000X) i mikrocentrifugerør
• DNA loading buffer (købes færdigblandet):
• Molekylvægt standard : 100 bp Ladder, 0,1 g/L
Apparatur og materialer:
• Pipetter og spidser
• Eppendorfrør
• PCR rør
• PCR-termocycler
• Elektroforesekar + strømforsyninger
• Mini centrifuger
• Fotoudstyr
• Nanofotometer
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalie:
• Der er ingen bemærkninger til denne øvelse.
Fremgangsmåde:
I denne øvelse skal I vha. PCR-metoden identificere et ampicillin-resistensgen (bla),
som sidder på et plasmid kaldet pUC18. Et plasmid er oftest et lille ringformet DNA-
molekyler, som ikke er knyttet til genomet hos bakterier. Bakterier, som bærer pUC18, er
resistente over for antibiotikummet ampicillin.
I øvelsen benyttes specifikke primere, som forventes at amplificere et DNA-fragment på
590 basepar (bp) fra bla-genet på pUC18. Amplifikatet verificeres efterfølgende ved
agarose-gelelektroforese.
Som kontrol for at reaktionsbetingelserne under PCR-forløbet er i orden medtages
kontrolprimere og kontroltemplate (-DNA som er virus DNA). Amplifikationen af denne
kontrol skal give et amplifikat på 500 bp under de givne PCR-betingelser.
DAG 1.
Opsætning af PCR-reaktion og PCR-kørsel
1) Øvelsen udføres parvis, og der benyttes handsker ved håndtering af alle reagenser.
2) Det er vigtigt at alle afpippeteringen foretages visuelt dvs.:
- ved udtag fra et rør holdes røret i hånden, og det observeres at der suges reagens
op i pipettespidsen.
- ved tømning af pipettespidsens indhold til det nye rør holdes røret i hånden, og det
observeres af reagenset udskydes til det nye rør.
3) Alle reagensblandinger til PCR udleveres af en tekniker eller en underviser.
4) Reagensblandingerne centrifugeres kortvarigt (1-2 sek.) for at samle indholdet på
bunden af rørene og sættes op på is
5) I et Eppendorfrør fremstilles et mastermix til 4 prøver. I skal køre 3 prøver, men
pga. forventet ”spild” ved pipettering mm. fremstiller man typisk et mastermix til det
antal prøver, man vil undersøge + en ekstra prøve (eller evt. + 10%).
Nedenstående komponenter blandes til fremstilling af mastermix:
- 4 μL dNTP-mix (10 mM af hver dNTP)
- 20 μL 10X PCR buffer (uden MgCl2)
- 20 μL MgCl 2 (25 mM)
- 2 μL Taq polymerase (5 units/μL)
- 130 μL sterilt vand.
6) Mærk 3 PCR rør 1-3 og overfør 44 μL mastermix til hvert af de 3 PCR-rør
7) Til hvert af PCR rørerne 1 og 2 tilsættes 2,5 μL primer amp1 (10 μM) og 2,5 μL
primer amp2 (10 μM)
8) Til PCR rør 3 tilsættes 2,5 μL primer KP1 (10 μM) og 2,5 μL primer KP 2 (10 μM)
Efter opsætning af prøverne vil den endelige koncentration af reagenser i hvert PCR
rør (i 50 μl) være:
MgCl2: 2,5 mM
DAG 2.
Elektroforese af PCR produkt
1) Gelen placeres i elektroforesekarret, så prøverne vandrer mod den positive pol (rød).
2) Kammen trækkes forsigtigt op, og der påfyldes buffer, til bufferen lige netop dækker
hullerne efter kammen.
3) Prøverne forberedes til elektroforese (punkt 4-7). Dernæst loades prøver og markør.
4) Fra hvert af de 3 PCR rør udtages 10 μL prøve i et nyt rør, som efterfølgende
tilsættes 3 μL loadingbuffer. Der blandes forsigtigt ved pipettering. Husk at gemme
PCR rørene til DNA-koncentrationsbestemmelsen, se nedenfor.
5) Som markør benyttes molvægtstandarden 100 bp Ladder (se fragmentstørrelserne i
bilag 2). 5 L molvægtstandard (0,1 μg/μL) blandes med 5 μL sterilt vand og 3 L
loadingbuffer i et nyt rør. Bland ved pipettering.
6) Centrifuger kort for at spinne prøverne ned i bunden af rørene og fjerne en evt.
bobledannelse.
7) For at træne prøvepåsætning til gelen (kaldet loading) afpipetteres 10 μL
loadingbuffer til de yderste gelbrønde.
8) 10 µL af hver prøve og markør påsættes gelen.
9) Spændingen sættes til 80V, og elektroforesen kører i ca. 90 min. Sæt elektroforesen
i gang straks efter påsætning af prøver og kontrol på gelen.
10) Strømmen slukkes, og gel og støbeform tages forsigtigt op af karret. Pas på at gelen
ikke falder på gulvet.
11) Gelen fotograferes under UV-lys. Få hjælp at en tekniker eller underviser.
Affald:
Biologisk aktivt materiale må ikke hældes i vasken.
Brugt engangsudstyr opsamles i plastdunke med passende desinfektionsmiddel.
Dunkene bortskaffes som biologisk affald.
Handsker smides i biologisk affald.
Geler lægges i en pose og smides til biologisk affald.
• Udfylde skema 5: Angiv vandringslængde for hvert PCR-produkt (mål direkte på gel-
billede med en lineal). Bestem ved hjælp af ovenstående standardkurve PCR-
produkternes størrelse i pb. Angiv om resultaterne passer med det forventede.
Resultatskemaer:
Resultaterne skal indføres i skemaer i journalbogen. Resultatskemaer klippes ud og
sættes ind i journalbogen FØR, der indføres resultater.
Background:
Bilagsoversigt:
Bilag 1
Plasmidet pUC18 er et lille, cirkulært DNA-molekyle, som indeholder forskellige gener, herunder genet
for ampicillin resistens (bla). Plasmidet er kunstigt fremstillet og benyttes i kloningssammenhænge. De
farvede forkortelser øverst til højre er eksempler på enzym-skæringssteder i MCS-sitet på plasmidet.
Bilag 2:
Øvelse 10
Gramfarvning
Estimeret tidsbrug: 1 lektion
Mål:
At kunne fremstille mikroskopiske præparater og udføre en gramfarvning af disse.
Princip:
Gram-farvning: En farvning hvor de Gram-positive bakterier farves blå, og de Gram-
negative farves røde.
Relevant teori:
Praktisk mikrobiologi: Kap. 3.11, 3.12.3
Mikrobiologi: Kap. 3.6.2
Materialer og apparatur:
• Øje-podenål 1 µL
• Bunsenbrænder
• Træklemme
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalier:
• Decolorisation opløsning
Fremgangsmåde:
Fiksering
1. Lidt kolonimasse udrøres med podenål i en lille dråbe vand på et objektglas.
2. Fordel på så stort areal som muligt og lad det lufttørre til vandet er fordampet.
3. Præparatet fikseres ved at objektglasset, med præparatsiden opad, føres 3 gange
gennem en gasflamme, ca. 1 sek. pr. gang. Brug en træklemme til at holde
objektglasset.
4. De fikserede præparater farves og undersøges i mikroskop.
Gramfarvning
Bemærk at nedenstående opskrift er lidt forskellig fra opskriften angivet i praktisk mikrobiologi.
1. Lidt natriumthiosulfat hældes i farvebakken.
2. Objektglasset placeres ved hjælp af et par glasstænger oven på farvebakken. Brug en
træklemme til at hold objektglasset.
3. Det fikserede område dækkes af Krystalviolet (solution 1) og henstår i 90 sek.
4. Solution 1 hældes ned i farvebakken og der skylles med lidt vand og henstår i 30 sek.
5. Lugol’s opløsning (solution 2) tilsættes og henstår i 3 minutter.
6. Solution 2 hældes ned i farvebakken og der skylles med lidt vand og henstår i 20 sek.
7. Decolorisation opløsning (solution 3+4) tilsættes og henstår i 5 – 10 sekunder.
8. Solution 3+4 hældes ned i farvebakken og der skylles med lidt vand og henstår i 30
sek.
9. Safranin opløsning (solution 5) tilsættes og henstår i 1 minut.
10. Solution 5 hældes ned i farvebakken og der skylles med lidt vand og henstår i 60 sek.
11. Vandet afdryppes og objektglasset tørres på underside og kanter.
12. Objektglasset lufttørres i 5 minutter før mikroskopering.
Affald:
Objektglas og podenåle håndteres som Klinisk Risikoaffald ifølge tilhørende
vejledning.
Væsken i farvebakken opsamles i affaldsdunk mærket Affald H.
Resultatskema:
Resultatskemaer til journalbog. Klip ud og sæt ind FØR, der indsættes resultater.
Øvelse 13
Indledende AAS – Kalium i ice tea
Estimeret tidsforbrug: 5 lektioner, enkeltmandsøvelse, dog enkelte aktiviteter som studiegruppe
Mål:
At blive fortrolig med brugen af AAS apparatur.
At opnå en forståelse af, hvilke indvirkning ændring af forskellige parametre har på et
måleresultatet.
At sikre at AAS apparaturet er optimeret korrekt.
At fremstille en standardrække og en standardkurve.
At kontrollere standardkurvens validitet.
At kvantificere metalindholdet i en prøve.
Princip:
Atomabsorptionsspektrofotometri (AAS) er en metode til kvantitativ bestemmelse af
metaller i organisk/uorganisk opløsning.
AAS er opbygget af en lyskilde (hulkatodelampe), atomiseringsenhed (forstøverenhed
og brænderhoved), monochromator, detektor (fotomultiplikator) samt en
signalforstærker.
Prøven suges op i forstøverenheden og blandes med oxidant (atm. luft) og fuel
(acetylen). I flammen bringes metalionerne på atomform. Hulkatodelampen, der er
belagt med det metal, der ønskes detekteret, udsender en lysstrøm med tilstrækkelig
energi til at exciterer metalatomerne i flammen. Lysstrømmen, der ikke absorberes af
metalatomerne, passere monochromatoren og registreres af detektoren.
Måleprincippet i AAS bygger på Beers lov: A = konstant x C. Der er lineær
sammenhæng mellem absorbans og koncentration i et givent koncentrationsområde.
Forudsætningen for denne sammenhæng er bl.a., at AAS apparatet er korrekt
optimeret. Dette undersøges ved at foretage et sensitivity check (karakteristisk
koncentrations check). Den målte opløsning skal give en absorbans ≥ 0,2.
Relevant teori:
Analyseteknik 4. udgave; Jeppesen H.; Bergsøe M.N; Simonsen F.
AAS – ”Analyse teknik” s. 271-283
Opbygning og analyseprincip
Optimering – herunder sensitivity
Måleprocedure
Resultatbehandling
Reagenser og kemikalier:
65% HNO3
0,1 M HNO3 (opløsningsmiddel/reagens)
1000 mg K/L (stamopløsning)
10 mg K/L (standard A opløsning – fremstilles af studerende)
1,0 mg K/L (kontrol – fremstillet af tekniker)
2,0 mg K/L (sensitivity check – fremstillet af tekniker)
Fersken ice tea
Apparatur og materiale:
AAS
Målekolber
Fuldpipetter
Bægerglas
10 mL engangssprøjter
0,45 µm membranfilter
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalier
Intet at bemærke
Fremgangsmåde:
Indledende
Anvend dobbelt demineraliseret vand til fremstilling af 0,1 M HNO3.
Alt anvendt glasudstyr skal skylles med 0,1 M HNO3 inden brug. Dette gøres
for at minimere risikoen for kontaminering med uønskede metaller såsom Na
og Ca.
Som opløsningsmiddel anvendes 0,1 M HNO3.
Følg apparatvejledningen ved opstart. For korrekt bølgelængde og slit se
”Standard Conditions for the determination af individual elements” Perkin
Elmer (ligger ved AAS apparatet og er vedlagt apparatvejledning).
Som udgangspunkt vælges de parametre indstillinger der, samlet set,
angives ved lavest ”Relative Noise”.
Korrekt lampestrøm ses på hulkatodelampen og/eller lampens
opbevaringskasse.
Betjeningsvejledning punkt 1.12 INT.TIME: anbefales 3 sec.
Betjeningsvejledning punkt 1.14 REPLICATES: anbefales 3.
Betjeningsvejledning punkt 1.22 READ DELAY: anbefales 3 sec.
For at sikre at brænderhovedet er gennemvarm inden måling, skal AAS
apparatet være opstartet ca. 10 min. inden måling.
Lysudsendelse
(fælles for studiegruppen)
1. Opsug hhv. alm. ledningsvand, demineraliseret vand og dobbelt demineraliseret
vand.
2. Noter flammefarve.
3. Med en finger røres rundt i dobbelt demineraliseret vand.
4. Opsug opløsningen.
5. Noter flammefarve.
Sensitivity check
Standardrække og standardkurve
Ud fra standard A opløsningen (10 mg K/L) fremstilles en standardrække med følgende
K-indhold:
Opløsning nr. 1: 0,4 mg K/L
Opløsning nr. 2: 0,6 mg K/L
Opløsning nr. 3: 1,0 mg K/L
Opløsning nr. 4: 1,5 mg K/L
Opløsning nr. 5: 2,0 mg K/L
Kørsel af prøver
Apparatindstillingen:
Punkt 1.12 INT.TIME: 3 sec.
Punkt 1.14 REPLICATES: 3.
Punkt 1.22 READ DELAY: 3 sec.
2. Apparatindstillingen:
Punkt 1.12 INT.TIME: 3 sec.
Punkt 1.14 REPLICATES: 3.
Punkt 1.22 READ DELAY: 1 sec.
3. Ændre apparatindstillingerne:
Punkt 1.12 INT.TIME: 3 sec.
Punkt 1.14 REPLICATES: 3.
Punkt 1.22 READ DELAY: 3 sec.
Nedlukning
Affald:
Klassificering:
Saltpetersyre…% (kilde: C&L - forordningen)
Ox. Liq. 2; H272
Udarbejdet af: TIPE Dato: 26.06.2018 Side 5 af 10
Sidst revideret af: HMAR Dato: 24.02.2020
Grundlæggende analyseteknik
Laborantuddannelsen
Øvelse 13: Indledende AAS Institut for Teknologiske
Resultatskemaer:
Klippes ud og limes ind i journalbogen før det praktiske arbejde. Resultatskemaerne udfyldes
med rådata under det praktiske arbejde. Resultatbehandling under og efter det praktiske
arbejde.
Skema 1: Lysudsendelse
Flammefarve
Abs.
Angivet krav
Krav overholdt
Standardopløsning 1 2 3 4 5
Koncentration
mg K/L
Abs.
Krav til
standardkurve
Resultat/Krav
overholdt
Beregnet Beregnet
Kontrol Abs. 1 Abs.2
koncentration koncentration
mg K/L
/ /0 -
Abs.
Angivet krav
Krav overholdt
Koncentration Resultat/krav
Beregnet mg K/L overholdt
Krav til
Prøve Abs. koncentration FF
præcision
mg K/L
Ufortyndet prøve (n=3)
Øvelse 14
AAS II - Calcium og magnesium i øl
Estimeret tidsbrug: 5 lektioner, enkeltmandsøvelse
Mål:
At blive fortrolig med brug af AAS apparatur
At fortynde prøver til relevant koncentration
At kvantificere metalindholdet i en prøve vha. ekstern standard og fremstilling af en
standardrække.
Princip:
Atom aborption spektrometri (AAS) er en metode til bestemmelse af spormetaller i
en organisk/uorganisk opløsning.
Fra en hulkatodelampe udsendes lys af en passende bølgelængde. Dette lys
sendes gennem en acetylenflamme. Metalioner i opløsning forstøves i flammen.
Derved omdannes ionerne til gasformige atomer. Metalatomerne vil da absorbere
energi i form af lys. Reduktionen i lysenergien er proportional med indholdet at
metalatomer på gasform i flammen. Lysstrømmen, der ikke absorberes af
metalatomerne, passerer monochromatoren og registreres af detektoren.
Måleprincippet i AAS bygger på Beers lov: A = konstant x C. Der er lineær
sammenhæng mellem absorbans og et givent koncentrations område.
Forudsætningen for denne sammenhæng er bl.a., at AAS apparatet er korrekt
optimeret. Dette undersøges ved at foretage et sensitivity check (karakteristisk
koncentrations check). Den målte opløsning skal give en absorbans ≥ 0,2.
Relevant teori:
Analyseteknik 4. udgave; Jeppesen H.; Bergsøe M.N; Simonsen F.
AAS – herunder opbygning og analyseprincip
Optimering – herunder sensitivity
Måleprocedure
Resultatbehandling
Reagenser og kemikalier:
65% HNO3
0,1 M HNO3 (opløsningsmiddel/reagens)
1000 mg Ca/L (stamopløsning)
10 mg Ca/L (standard A - Ca opløsning – fremstilles af studerende)
4,0 mg Ca/L (sensitivity check – fremstillet af tekniker)
1000 mg Mg/L (stamopløsning)
10 mg Mg/L (standard A - Mg opløsning – fremstilles af studerende)
0,25 mg Mg/L (kontrol – fremstillet af tekniker)
0,3 mg Mg/L (sensitivity check – fremstillet af tekniker)
Prøve: Alm øl – afgasset på ultralydsbad
Prøveopløsninger (P – Ca). Opløsningerne skal indeholde en 20X fortynding
af prøven (afgasset øl). Fortyndingen skal laves med 0,1 M HNO3.
Prøveopløsninger (P – Mg). Opløsningerne skal indeholde en 200X
fortynding af prøven (afgasset øl). Fortyndingen skal laves med 0,1 M
HNO3 ud fra de gemte prøveopløsninger fra tidligere (P – Ca) som
fortyndes yderligere 10X
Apparatur og materiale:
AAS
100 mL målekolber
Fuldpipetter
Mikropipetter
Bægerglas
Ultralydsbad
10 mL engangssprøjter
0,45 µm membranfilter
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalier
Intet at bemærke
Fremgangsmåde:
Indledende
Alt anvendt glasudstyr skal skylles med 0,1 M HNO3 inden brug. Dette
gøres for bl.a. at minimere risikoen for kontaminering med uønskede
metaller såsom Na og Ca.
Som opløsningsmiddel anvendes 0,1 M HNO3.
Følg apparatvejledningen ved opstart. For korrekt bølgelængde og slit se
”Standard Conditions for the determination af individual elements” Perkin
Elmer (ligger ved AAS apparatet og er vedlagt apparatvejledning).
Korrekt lampestrøm ses på hulkatodelampen og/eller opbevaringskasse.
Betjeningsvejledning punkt 1.12 INT.TIME: anbefales 3 sec.
Betjeningsvejledning punkt 1.14 REPLICATES: anbefales 3.
Ekstern standard
1. Ud fra standard A – Ca opløsningen (10 mg Ca/L) fremstilles en standard
med en koncentration på 2,5 mg/L
2. Nulstil apparatet på det reagens standardopløsningen er fremstillet på.
3. Mål på standardopløsningen.
Prøveforberedelse:
Alle gruppemedlemmer fremstiller tre uafhængige prøveopløsninger (P –
Ca). Hver opløsning skal indeholde en 20X fortynding af prøven (afgasset og
filtreret øl). Fortyndingen skal laves med 0,1 M HNO3.
Ifølge DTU fødevaredatabase
https://frida.fooddata.dk/ShowFood.php?foodid=198&1 er der ca. 6,5 mg
Ca/100g øl.
Magnesium
Sensitivity check
1. Nulstil apparatet på det reagens sensitivity check opløsninger er fremstillet
på.
2. Mål sensitivity check opløsningen.
3. Hvis den målte opløsning ikke giver en absorbans ≥ 0,2. Tilkald
underviser/tekniker. (der må under inden omstændigheder indstilles på
lampe/brænderhoved position).
Ekstern standard
1. Ud fra standard A – Mg opløsningen (10 mg Mg/L) fremstilles en standard
med en koncentration på 0,2 mg/L
2. Nulstil apparatet på det reagens standardopløsningen er fremstillet på.
3. Mål på standardopløsningen.
Kvantitativ bestemmelse af Mg i alm. øl ud fra ekstern standard.
Prøveforberedelse:
Alle gruppemedlemmer fremstiller tre uafhængige prøveopløsninger (P –
Mg) baseret på de første prøveopløsninger (P – Ca).
Hver opløsning skal indeholde en 200X fortynding af prøven (afgasset øl)
hvilket betyder at (P – Ca) skal fortyndes yderligere 10X for at fremstille
(P – Mg). Fortyndingen skal laves med 0,1 M HNO3.
Ifølge DTU fødevaredatabase
https://frida.fooddata.dk/ShowFood.php?foodid=198&1 er der ca. 7,5 mg
Mg/100g øl.
Standardrække
Alle gruppemedlemmer fremstiller en standardrække.
Ud fra standard A - Mg opløsningen (10 mg Mg/L) fremstilles en standardrække
bestående af 5 opløsninger, i henhold til Standard Conditions for Mg, der findes i
bilag 1 og apparatmappen.
Nedlukning
Affaldshåndtering:
Klassificering:
Saltpetersyre…% (kilde: C&L - forordningen)
Ox. Liq. 2; H272
Skin corr. 1A, H314
Egne grænser:
Ox. Liq. 2; H272: C ≥ 99%
Ox. Liq. 3; H272: 65 % ≤ C < 99 %
Skin Corr. 1A; H314: C ≥ 20 %
Skin Corr. 1B; H314: 5 % ≤ C < 20 %
Konklusion:
Affaldet kan bestå af koncentreret og fortyndet syre (under 1 w/w %).
På laborantuddannelsen ved Københavns Professionshøjskole hældes
koncentrerede syrer og baser i vasken i et stinkskab. Der efterskyldes med vand.
(Laborantuddannelsen Københavns Professionshøjskole har en syrebrønd i
kælderen).
Fortyndet syre (under 1 w/w %) og fortyndet base (under 0,5 w/w %) hældes i
vasken i laboratoriet. Der efterskyldes med vand.
3. Kommenter på de 2 konfidensintervaller.
Resultatskemaer:
Klippes ud og limes ind i journalbogen før det praktiske arbejde. Resultatskemaerne
udfyldes med rådata under det praktiske arbejde. Resultatbehandling under og efter det
praktiske arbejde.
Angivet krav
Krav overholdt
Koncentration
Beregnet (mg Ca/100 mL)
Abs. koncentration FF
(mg Ca/L)
Ufortyndet prøve
Eks. st.
1. prøve
2. prøve
3. prøve
Sensitivity koncentration
(mg Mg/L)
Abs.
Angivet krav
Krav overholdt
Beregnet Koncentration
Abs. koncentration FF (mg Mg/100 mL)
(mg Mg/L) Ufortyndet prøve
Eks. st.
1. prøve
2. prøve
3. prøve
Nr.____
Nr.____
Nr.____
Sensitivity koncentration
(mg Mg/L)
Abs.
Angivet krav
Krav overholdt
Skema 6: Mg - Standardrække
Standardopløsning 0 1 2 3 4 5
Koncentration
(mg Mg/L)
Abs.
Krav til
standardkurve
Resultat/Krav
overholdt
Beregnet
Beregnet
Kontrol Abs. 1 Abs.2 koncentration
koncentration
(mg Mg/L) (mg Mg/mL)
/ / -
Ved øvelsen benyttes bølgelængden 285,2 nm. Standard conditions kan også findes i
apparatmappen.
Øvelse 20
Gaschromatografi I
Temperaturprogrammering og præcision
Estimeret tidsbrug: 5 lektioner, 2-mandsøvelse
Mål:
At blive fortrolig med brug af gaschromatografen og tilhørende software, og at indøve
præcision ved manuel injektion. At forstå hvordan en ændring af ovntemperaturen
under chromatograferingen har indflydelse på adskillelsen af en alkoholblanding med et
bredt kogepunktsområde.
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalier:
Standardblanding 1 (fremstilles af de studerende)
Standardblanding 2
Methanol
Ethanol
Propan-1-ol
Butan-1-ol
Pentan-1-ol
Acetone
Princip:
Gaschromatografi (GC) er en analytisk teknik til separation, kvalitativ og kvantitativ
bestemmelse af analytter i en prøve. Analytterne i en prøveblandning separeres ved at
bringe dem på gasform, og lade dem passerer en kolonne. Analytternes kogepunkt
spiller en afgørende rolle for hvilken rækkefølge de kommer ud i. Til kvalitativ
bestemmelse kan retentionstider for en analyt enten sammenlignes med retentionstiden
for en standard eller prøven kan spikes med standard for at se et forøget areal ved den
givne retentionstid.
Temperaturprogrammeringen er en kontrolleret ændring af ovntemperatur under
chromatograferingen. Det benyttes med fordel når de analytter der analyseres er fordelt
over et meget bredt kogepunkts område. Det vil i den situation være svære at
chromatografere med både tilfredsstillende retentionstider og topadskillelse for de
første og de sidst analytter (laveste og højeste kogepunkt).
Relevant teori:
Fra lærebog: “Analyse teknik” og Almen, Uorganisk og organisk kemi.
GC – herunder princip og opbygning (bestanddele af apparatur).
Optimering af separation
GC præcision
Kvalitativ bestemmelse ved GC
Polaritet
Reagenser og kemikalier:
Standardblanding 1: Ethanol i acetone (fremstilles af studerende)
Methanol Ethanol
Propan-1-ol
Butan-1-ol
Pentan-1-ol Propanon/Acetone
Materialer og apparatur:
GC
Polær kolonne: DB-WAX
Injektionssprøjte, 1 l
Acetone til rensning af sprøjte
Fremgangsmåde:
1) Start med at fremstille Standard 1, ved at indveje ca. 0,1 ml ethanol 99,9 % med
ca. 0,6 ml acetone i et hætteglas med parafilm eller gummilåg
Stemplet trækkes tilbage til 1µl, så der suges luft ind i spidsen, før der
injiceres. Det tilstræbes at der trækkes samme mængde luft op hver gang.
Del 1: Præcision ved injektion
Isotermisk chromatografering ved 85C.
3) Undersøg nu Hamiltonsprøjten, dens inddeling og virkemåde, - prøv at suge væske
op i sprøjten og se om kanylen er stoppet; - selv 0,5 L kan ses som en lille dråbe
når stemplet trykkes ned.
4) Injicér 0,5 µL Standard 1. Hvis toppene ikke adskilles tilfredsstillende kan
ovntemperaturen nedsættes yderligere.
Del 2: Temperaturprogramering
Forsøg 3: Temperaturprogrammering
Sammensæt ud fra forsøg 1 og 2 og prøvekørsler et optimalt temperaturprogram. I
denne sammenhæng betragtes et program med basislinjeadskillelse, der tager op til 7
min., som optimalt program.
HUSK AT notere programmets indstillinger under ”comments” i ”sample info” da dette
ikke vil fremgå automatisk af jeres rådata
1. Injicer standardblanding 2 to gange ved det optimale temperaturprogram
og identificer toppene. Identifikation af toppen skrives på chromatogram her
under øvelsen eller ved databehandling.
Forsøg 4: Prøve
1. Prøven Injiceres to gange under samme omstændigheder som i forsøg 3. Er der tvivl om
identifikationen af analytterne i prøven, kan der tilsættes standard til prøven for at se om
toppen derved bliver højere eller om der kommer en ekstra top. Dette kaldes spiking.
Identifikation af toppen skrives på chromatogram her under øvelsen eller ved
databehandling.
Affaldshåndtering:
I denne øvelse produceres farligt affald, som skal opsamles.
Indhold og koncentration:
Alle former for rester af analytterne; acetone, ethanol, propan-1-ol, butan-1-ol, pentan-
1-ol og methanol opsamles i affaldsdunk.
Brugte hætteglas dampes af i stinkskab og smides i glasaffald.
Klassificering:
Acetone (Kilde: C&L – forordningen)
Flam. Liq. 2; H225
Eye Irrit. 2; H319
STOT SE 3; H336
Egne grænser
STOT SE 1; H370: C ≥ 10%
STOT SE 2; H371: 3% ≤ C < 10%
Konklusion:
Affaldet opsamles i en affaldsdunk mærket ”Affaldsgruppe C – Brandfarligt organisk
affald uden halogen og svovl”
4. Ved denne øvelse benyttes gaschromatograf med en FID detektor. Bemærk at FID
ikke kan detektere vand (vindestillat). Hvad står FID for og hvorfor kan FID detektoren
ikke detektere vand?
Komponent Kogepunkt °C
Methanol
Ethanol
Propan-1-ol
Butan-1-ol
Pentan-1-ol
Propanon/acetone
Del 1: Præcision
Del 2: Temperaturprogrammering
3. Forsøg 1 og 2:
a. Retentionstiderne for de enkelte Analytter (sat i relation til kogepunkterne) og
chromatogrammets udseende (topadskillelse) kommenteres.
4. Forsøg 3:
a. Det valgte temperaturprogram begrundes ud fra forsøg 1 og 2 og kørslerne
under forsøg 3. Chromatogrammernes udseende kommenteres. Identifikation
af toppen skrives på chromatogram her hvis dette ikke er gjort under øvelsen.
5. Forsøg 4:
a. Analytterne i prøven identificeres ud fra retentionstiderne på
standardchromatogrammet i forsøg 3 og evt. spiking. Identifikation af toppen
skrives på chromatogram her hvis dette ikke er gjort under øvelsen.
6. Alle chromatogrammerne sorteres efter løbenummer og vedlægges som bilag i
journalbogen.
Resultatskemaer:
Resultatskemaer klippes ud og limes ind i journalbogen FØR øvelsen påbegyndes.
Efter/under øvelse skal resultatskemaer udfyldes.
Skema for 1 person: Præcision ved injektion- retentionstid og areal for ethanol
Chromatogramnr. tr i min Areal
Gennemsnit
Standardafvigelse
%RSD
Øvelse 21
Gaschromatografi II
Kvantitativ bestemmelse af ethanol i spiritus
Estimeret tidsbrug: 5 lektioner, 2-mandsøvelse
Mål:
At blive fortrolig med at bruge gaschromatografen med autosampler og tilhørende
software
At fremstille en standardrække ved indvejning
At bestemme indholdet af ethanol i spiritus
Princip:
Gaschromatografi (GC) er en metode til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse. For
udstyrerets opbygning, se ”Analyseteknik” - bogen.
Til kvantitativ bestemmelse af ethanol i spiritus, benyttes her en standardkurve.
Standardkurven fremstilles ved måling på standardopløsninger i forskellige
koncentrationer. Herved fås nogle toparealer, der afbildes som funktion af
koncentrationerne.
Kurvens validitet kontrolleres visuelt, samt ved brug af korrelationsfaktoren (r), linjens
skæring med y-aksen (~ 0,0) og måling på en kontrol.
Relevant teori:
Fra lærebog: “Analyseteknik”
Gaschromatografi
Kvantitativ bestemmelse
Standardkurve
Fra lærebog: ”Laboratorieberegninger”
Standardrække
Standardkurve
Reagenser og kemikalier:
Pentan-1-ol, p. a.
Ethanol 99,9 %
Spiritus
Pentan-1-ol til rensning af sprøjte
Kontrol: ~50 w/w% EtOH opløst i Pentan-1-ol
Materialer og apparatur:
GC, AGILENT 6850
Polær kolonne: HP-1
Autosampler til GC, AGILENT 6850
Engangssprøjter med kanyler 1 mL
Hætteglas
Analysevægt
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalier:
Ethanol
Pentan-1-ol
Spiritus
Fremgangsmåde:
Opstart af GC’en
1) Opstart hele programmet inden i går videre til fremstilling af standardopløsninger. Følg
apparatmappen til og med ”programmering af autosampler”
2) GC’en opstartes iflg. apparatvejledning. Flow sættes til 1,0 ml/min. Splitforholdet sættes til
100:1. Ovntemperatuen sættes til 100C, injektor- og detektortemperatur sættes til 250
C. Lad gaschromatografen stabilisere sig i ca. 10 min før første kørsel.
Fremstilling af standardopløsninger
1) I mellemtiden fremstilles standardopløsningerne med ethanol fortyndet i pentan-1-ol i
følgende koncentrationer: 20, 40, 50, 60 og 80 w/w%. Indvejningen udføres på
analysevægt ud fra de masser, der er fundet under forberedelsen af øvelsen. Husk at
notere de nøjagtigt afvejede masserr i tilhørende resultatskema.
2) Da de benyttede kemikalier let fordamper, er det nødvendigt altid at holde standarder og
prøver tæt tillukkede. Indvejning bør derfor foregå med sprøjter og kanyler ned i
hætteglas.
Prøveforberedelse
1) Overfør ca. 1 mL prøve til et hætteglas.
Affaldshåndtering:
I denne øvelse produceres der farligt affald, som skal opsamles.
Indhold og koncentration:
Alle former for rester af komponenterne pentan-1-ol og ethanol opsamles i affaldsdunk.
Brugte hætteglas dampes af i stinkskab og smides i glasaffald.
Klassificering:
Pentan-1-ol (Kilde: ”C&L – forordningen)
Flam. Liq. 3; H226
Skin Irrit. 2; H315
Acute tox. 4; H332
STOT SE 3; H335
Konklusion:
Affaldet opsamles i en affaldsdunk mærket ”Affaldsgruppe C – Brandfarligt organisk
affald uden halogen og svovl”.
1. Der skal fremstilles standarder med koncentrationer som angivet i skemaet nedenfor.
Udfyld skemaet med hvor meget Pentan-1-ol og ethanol der skal anvendes til
fremstilling af standarderne.
Angiv et eksempel på beregning af mængder der skal afvejes for at fremstille
standardopløsningen der indeholder 60 w/w% ethanol.
Resultatskemaer
Resultatskemaer klippes ud og limes i journalbogen før øvelsen påbegyndes.
Efter/under øvelsen skal følgende udfyldes:
Ethanol (g)
Pentan-1-ol (g)
Areal 1
Areal 2
Skema 3: Kontrol
Angiv værdi
/ Krav Vurdering
Ja/Nej
Bøjer kurven af
Korrelationskoefficient 0,999
Skema 5: Prøve
Øvelse 22
Indledende HPLC
Estimeret tidsbrug: 5 lektioner
Mål:
At blive fortrolig med brug af HPLC apparatur og tilhørende software – herunder lave
en kolonnetest, ændring af eluent sammensætning
At udføre en kvalitativ analyse
At forstå hvilken indvirkning ændringer af forskellige parametre har på et
chromatogram/resultatet.
Princip:
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) er en analytisk teknik til
separation, kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af analytter i en prøve. Ved hjælp
af en pumpe bliver en eluent/mobil fase sammen med en prøve eller standard ført
gennem en kolonne fyldt med stationær fase. Hver komponent i prøven vil have
forskellig affinitet til den stationære fase, hvorved de vil elueres med forskellig
hastighed og en separation af stofferne finder sted. Til kvalitativ bestemmelse kan
retentionstider for en standard og analyt sammenlignes eller prøven kan spikes med
standard. For at undersøge kolonnens effektivitet/selektivitet udføres en
kolonnetest, hvorved antal teoretiske bunde (N), asymmetrifaktor (As) og
kapacitetsfaktor kan bestemmes.
Ved denne øvelse skal der laves chromatografiske undersøgelser vedr.
konserveringsmidlerne benzoesyre, ethylparahydroxybenzoat og
propylparahydroxybenzoat (de to sidstnævnte er måske bedre kendt som eksempler
på parabener):
O O CH3 O O
HO O CH3
OH OH
Benzoesyre Ethylparahydroxybenzoat Propylparahydroxybenzoat
4-hydroxy ethylbenzoat 4-hydroxy propylbenzoat
Relevant teori:
Fra lærebog: “Analyseteknik”
HPLC – herunder princip og opbygning (bestanddele af apparatur).
Typer af stationær og mobil fase
Selektivitets – parametre
Optimering af separation
Kvalitativ bestemmelse
Reagenser og kemikalier:
Methanol, HPLC grade, til rensning af sprøjte
60:40 methanol:phosphatbuffer til fortynding af prøve
Mobile faser:
A: Til rensning af kolonne: 80:20 methanol:vand
B: Til rensning af kolonne: 50:50 methanol:vand
C: 1 L methanol
D: 1 L phosphatbuffer
(fremstillet af 1,0 mL konc. H3PO4 og 33 g NaH2PO4, 2H2O til 1 liter)
Bestemmelse af dødtid
0,2 g natriumnitrat/100 mL
Kolonnetestblanding:
100 µg/mL phenol, 775 µg/mL toluen og 8 µg/mL antracen i
methanol:vand 80:20.
Opløsning af konserveringsmidler:
0,2 % benzoesyre, 0,01 % ethylparahydroxybenzoat og 0,01%
propylparahydroxybenzoat opløst i 60:40 methanol:vand
Prøve:
Sukkerfri læskedrik indeholdende et eller flere af konserveringsmidlerne
Materialer og apparatur:
HPLC og PC med tilhørende printer
Kolonne med C18 (ODS)-materiale
1 mL sprøjte med stump kanyle
Engangsmembranfilter 0,45 μm
Engangssprøjte 10 mL
Ultralydsbad
Præparatglas med skruelåg
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalie:
Methanol
Fremgangsmåde:
Indledende
Vedrørende start og betjening af apparatur henvises til apparatvejledningen
Tjek at affald/spild flasken på eluenthylden ikke er fuld. Er den fuld skal
denne først tømmes i ”affald C”
Alle eluenter skal afgasses i ultralydsbad inden de anvendes (Dette er gjort af
tekniker)
Flowet af eluent A (80:20 methanol:vand) sættes til 1,0 mL/min
Bølgelængden på detektoren sættes til 254 nm
A
Bestemmelse af dødtid
1) Eluent A (80:20 methanol:vand) anvendes med et flow på 1 mL/min
2) Injicer opløsningen af natriumnitrat én gang
3) Chromatogrammet udskrives
4) Udfyld skema for kapacitetsfaktor i software (se apparatvejledning)
5) Gem metoden
B
Kolonnetest med standardblanding (phenol, toluen og anthracen)
1) Eluent A (80:20 methanol:vand) anvendes med et flow på 1 mL/min
2) Injicér kolonnetestblandingen én gang
3) Der skal anvendes automatisk beregning af antal teoretiske bunde,
asymmetrifaktor, resolution og kapacitetsfaktor. Chromatogrammet
udskrives. Udskriv datarapporten som ”performence” i stedet for ”short”
C
Optimering af mobil fase
1) Skift eluent – således at forholdet mellem eluent C (100%methanol) og
D (phosphatbuffer) er 80:20 med et flow på 1 mL/min
2) Lad systemet ækvilibrere ca. 10 min. (i mellemtiden sættes prøven til
afgasning i ultralydsbad)
D
Kvalitativ analyse
1) Prøveforberedelse:
Den afgassede prøve fortyndes 1:1 med 60:40 eluent C:D og filtreres
gennem membranfilter ned i et lille præparatglas med skruelåg
2) Prøveblandingen injiceres 1 gang.
3) Chromatogrammer udskrives med antal teoretiske bunde,
asymmetrifaktorer, resolution og kapacitetsfaktorer
4) Hvis der er nogle små irrelevante toppe på chromatogrammerne – forsøg
da at fjerne resultaterne for disse i HPLC-software, således at de ikke
medtages i chromatogramrapporten
E
Ændring af bølgelængde
1) Brug den eluent sammensætning, der er optimal og skift bølgelængden
til 220 nm
F
Optimering af mobil fase for prøve
1) Skift evt. forholdet mellem eluent C og D for at opnå optimal separation
og kørselstid. HUSK at ækvilibrere efter skift af eluent
2) Prøveblandingen injiceres 1 gang.
3) Chromatogram udskrives med antal teoretiske bunde,
asymmetrifaktorer, resolution og kapacitetsfaktorer
G
Nedlukning
Affald:
I denne øvelse produceres der farligt affald, som skal opsamles.
Indhold og koncentration:
Alle former for mobil fase og restindhold med methanol opsamles efter behov i
affaldsdunk. Brugte hætteglas dampes af i stinkskab og smides i glasaffald.
Klassificering:
Methanol (Kilde: ”C&L – forordningen)
Flam. Liq. 2; H225
Acute Tox. 3; H331
Acute Tox. 3; H311
Acute Tox. 3; H301
STOT SE 1; H370
Egne grænser
STOT SE 1; H370: C ≥ 10 %
STOT SE 2; H371: 3 % ≤ C < 10 %
Denne klassificering gælder også for den svageste mobil fase 60:40 C:B
Flam. Liq. 2 nedskrives dog til Flam. Liq. 3; H226 (Kilde: Kemibrug)
2) Bliver der gennem denne øvelse anvendt normal fase eller omvendt fase
chromatografi? (svaret begrundes)
5) Opskriv formlerne til beregning af antal teoretiske bunde (N), asymmetri faktor
(As), resolution (Rs) og kapacitetsfaktor (k)
Resultatskemaer:
Resultatskemaer klippes ud og limes ind i journalbogen FØR øvelsen påbegyndes.
Efter/under øvelse skal resultatskemaer udfyldes.
Natriumnitrat
Stof Retentionstid N As k Rs
(min)
Phenol -
Toluen
Anthracen
Mobil fase
C:D = 80:20
Mobil fase
C:D = 60:40
Mobil fase
C:D = :
Nbenzoesyre Nethylparahydroxybenzoat Npropylparahydroxybenzoat
Mobil fase
C:D = 80:20
Mobil fase
C:D = 60:40
Mobil fase
C:D = :
k benzoesyre k ethylparahydroxybenzoat k propylparahydroxybenzoat
Mobil fase
C:D = 80:20
Mobil fase
C:D = 60:40
Mobil fase
C:D = :
t benzoesyre t ethylparahydroxybenzoat t propylparahydroxybenzoat
(min) (min) (min)
Mobil fase
C:D = 80:20
Mobil fase
C:D = 60:40
Mobil fase
C:D = :
Rs
Rs Rs ethylparahydroxybenzoat/
Benzoesyre benzoesyre/ ethylparahydroxybenzoat propylparahydroxybenzoat
Mobil fase -
C:D = 80:20
Mobil fase -
C:D = 60:40
Mobil fase -
C:D = :
Øvelse 23
Kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af koffein
ved HPLC
Estimeret tidsbrug: 5 lektioner, 2-mandsøvelse
Mål:
At blive fortrolig med brug af HPLC apparatur og tilhørende software – herunder lave
metodeafhængig kolonnetest og bestemme arbejdsbølgelængde
At lave en kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af koffein i forskellige prøver.
Princip:
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) er en analytisk teknik til
separation, kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af Analytter i en prøve. Ved hjælp
af en pumpe bliver en eluent/mobil fase sammen med en prøve eller standard ført
gennem en kolonne fyldt med stationær fase. Hver komponent i prøven vil have
forskellig affinitet til den stationære fase, hvorved de vil elueres med forskellig
hastighed og en separation af stofferne finder sted. For at undersøge kolonnens
effektivitet/selektivitet udføres en metodeafhængig kolonnetest, hvorved antal
teoretiske bunde (N) og asymmetrifaktor (As) kan bestemmes.
For at få størst mulig respons for en komponent når der anvendes UV-detektor i
HPLC, er det vigtigt at den optimale bølgelængde (arbejdsbølgelængde)
bestemmes og indstilles.
Til kvalitativ bestemmelse kan retentionstider for en standard og en analyt
sammenlignes eller prøven kan spikes med standard. Til kvantitativ bestemmelse
kan forskellige metoder anvendes. Ved denne øvelse laves en standardrække
(standarder med forskellig koncentration af koffein) ud fra en stamopløsning. Koffein
har en kort levetid i lys, så stamopløsninger og standarder opbevares koldt og mørkt
i laboratoriefryseren. Hver standard injiceres, hvorved areal for toppene registreres.
Toparealerne afsættes som funktion af de respektive koncentrationer til konstruktion
af en standardkurve. Prøven injiceres og ud fra analyttens topareal kan
koncentrationen bestemmes ved lineær regression – det forudsættes at
standardkurven er lineær (korrelationskoefficient r 0,995), hældningen på
standardkurven er acceptabel (undersøges ved at medtage en kontrol) og skæring
med y-akse er tilstrækkelig lille.
O CH3
H3C N
N
O N N
CH3
Koffein
Relevant teori:
Fra lærebog: “Analyseteknik”
HPLC – herunder princip og opbygning (bestanddele af apparatur).
Typer af stationær og mobil fase
Selektivitets – parametre
Optimering af separation
Kvalitativ bestemmelse
Kvantitativ bestemmelse
Standardkurve
Reagenser og kemikalier:
Methanol, HPLC grade til rensning af sprøjte
Vand, HPLC grade til fortynding
Mobile faser:
A: Til rensning af kolonne: 80:20 methanol:vand
B: Til rensning af kolonne: 50:50 methanol:vand
C: Til forsøg: 1 L methanol
D: Til forsøg: 1 L HPLC vand
Bestemmelse af dødtid
0,001 g tartrazin/100 mL
Stamopløsning
1000 mg koffein/L – er fremstillet
Skal opbevares koldt og mørkt, så kan dermed hentes i fryseren
Prøver
Prøver indeholdende koffein
Materialer og apparatur:
HPLC og PC med tilhørende printer
Kolonne med C18 (ODS)-materiale
UV-spektrofotometer
Kuvetter til måling i UV-området
1 mL sprøjte med stump kanyle
Membranfilter 0,45 μm og engangssprøjte 10 mL
Transfer pipette
Ultralydsbad
Præparatglas med skruelåg
Mikropipetter: 20-5000µl
50 og 200 mL bægerglas
5 og 100 mL glas fuldpipette
Urglas
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalie:
Methanol
Fremgangsmåde:
Indledende
Vedrørende start og betjening af apparatur henvises til apparatvejledningen
Tjek at affald/spild flasken på eluenthylden ikke er fuld. Er den fuld skal
denne først tømmes i ”affald C”
Alle eluenter skal afgasses i ultralydsbad inden de anvendes (Dette er gjort af
tekniker)
A
Metodeafhængig kolonnetest og dødtid
1) Skift eluent og flow hastighed til de anbefalede værdier for apparatet
(se computerskærmen)
B
Bestemmelse af arbejdsbølgelængde
1) Overfør med transfer pipette én dråbe af stamopløsningen af koffein
(1000 mg/L) til en egnet kuvette og tilsæt vand. Bland ved at suge og
puste opløsningen forsigtigt ud med transfer pipette. Som blindprøve
anvendes vand.
2) Indstil spektrofotometret til at scanne i bølgelængdeområdet 220-400 nm
3) Udskriv scanningsspektret med tilhørende arbejdsbølgelængde
C
Standardrække og standardkurve
1) Ud fra stamopløsningen af koffein (1000 mg/L) fremstilles 6 standarder
inklusive en blindprøve i koncentrationsområdet 0 – 300 mg/L. Der
fremstilles 5,00 mL af hver ved brug af mikropipetter. Der anvendes
HPLC-grade vand til fortyndinger. Standarderne laves i præparatglas
2) Hver standard og blindprøven (HPLC-grade vand) injiceres
randomiseret en gang
3) Chromatogrammer udskrives med antal teoretiske bunde og
asymmetrifaktorer
D
Kontrol (holdes koldt og mørkt)
1) Injicer kontrollen (100 mg koffein/L) én gang
E
Kvalitativ og kvantitativ bestemmelse
1) Prøveforberedelse:
Kaffe:
Øvrige prøver:
Skal eventuelt afgasses på ultralydsbad og filtreres gennem
membranfilter
F
Nedlukning
Apparatet nedlukkes som beskrevet i apparatvejledningen
Affald:
I denne øvelse produceres der farligt affald, som skal opsamles.
Indhold og koncentration:
Alle former for mobil fase og restindhold med methanol opsamles efter behov i
affaldsdunk. Brugte hætteglas dampes af i stinkskab og smides i glasaffald.
Klassificering:
Methanol (Kilde: ”C&L – forordningen)
Flam. Liq. 2; H225
Acute Tox. 3; H331
Acute Tox. 3; H311
Acute Tox. 3; H301
STOT SE 1; H370
Egne grænser
STOT SE 1; H370: C ≥ 10%
STOT SE 2; H371: 3% ≤ C < 10%
Denne klassificering gælder også for den svageste mobil fase 30:70 C:D
Flam. Liq. 2 nedskrives dog til Flam. Liq. 3; H226 (Kilde: Kemibrug)
Konklusion:
Affaldet opsamles i en affaldsdunk mærket ”Affaldsgruppe C – Brandfarligt
organisk affald uden halogen og svovl”.
2) Bliver der gennem denne øvelse anvendt normal fase eller omvendt fase
chromatografi? (svaret begrundes)
Blind 0 5000 0
5 300
7) Beregn %RSD for den fundne koffein koncentration. Krav: %RSD <5%
9) Reduceres eller øges koffein indholdet i kaffe over tid? Hvad kan dette
skyldes?
Resultatskemaer:
Resultatskemaer klippes ud og limes ind i journalbogen FØR øvelsen påbegyndes.
Efter/under øvelse skal resultatskemaer udfyldes.
Stof Retentionstid N As
(min)
Koffein
D) Skema 4: Kontrol