Mejoramiento de la producción funcional de una lipasa dependiente de

chaperonas en Escherichia coli, utilizando el plásmido en casete con doble

expresión
Thi Dinh Quyen, Chi Hai Vu y Giang Thi Thu Le

Instituto de Biotecnología, Academia de Ciencia y Tecnología de Vietnam, Calle Hoang Quoc

Viet Nº 18, Distrito Caugiay 10600, Hanoi, Vietnam.

Recibido: el 11 de septiembre de 2011. Aceptado: el 01 de marzo de 2012. Publicado: el 01

de marzo de 2012.

ANTECEDENTES

Las lipasas (hidrolasas de ésteres de triglicéridos, EC 3.1.1.3) catalizan la

hidrólisis de los triacilgliceroles de cadena larga en medios acuosos para liberar
diacilgliceroles, monoacilgliceroles, y gliceroles, además ácidos grasos [1]. En
medios no acuosos, catalizan las reacciones de esterificación y transesterificación
[2]. A diferencia de las esterasas, las lipasas prefieren ácidos grasos de cadena
larga y se activan en la interfaz del sustrato de lípidos y el agua. Debido a su
especificidad de sustrato, especificidad de región, selectividad quiral,
termoestabilidad y estabilidad alcalina, las lipasas microbianas han sido
ampliamente utilizadas en los campos industriales para la producción o la
modificación y diagnóstico de detergentes y productos lácteos, así como también
para el procesamiento del petróleo, biotransformaciones, y la separación o síntesis
quiral [3].

La familia I de lipasas bacterianas ha sido dividida en siete subfamilias en base a

la homología de secuencia en sus aminoácidos [3]. La subfamilia I.1 contiene a las
lipasas de Pseudomonas aeruginosa [4,5], Pseudomonas fragi [6], y Acinetobacter
sp. [7,8]; y la subfamilia I.2 comprende a las lipasas de Pseudomonas glumae [9],
Pseudomonas luteola [10], Burkholderia cepacia [11], Chromobacterium viscosum
[12], y Ralstonia sp. M1 [13].

Estas dos subfamilias de la lipasa, la I.1 y la I.2, muestran una homología mayor al
33% en las secuencias de sus aminoácidos [14] y la mayoría de los miembros
comparten otra característica común de que sus genes están agrupados con sus
genes secundarios localizados inmediatamente ‘aguas abajo’ [4,5,8 , 11,13,15] o
‘aguas arriba’ de los genes de la lipasa [7]. Los productos proteicos de los genes
secundarios son las llamadas ‘plegasas’ (porque ayudan al plegamiento de las
lipasas, o ‘foldasas’ por ‘folding’ = plegamiento en inglés), que son específicas
para la lipasa (proteína moduladora, activadora, auxiliar o chaperona) y que se
requieren para el plegado de la lipasa en una conformación activa además de su
secreción en el medio de cultivo. Durante el proceso de secreción de la lipasa a
través de la ruta de secreción de tipo II en dos etapas, las chaperonas de la lipasa
participan directamente en el plegamiento in vivo y en el proceso de secreción.
A pesar de las diversas aplicaciones de las lipasas de Pseudomonas y
Burkholderia provenientes de las subfamilias I.1 y I.2, respectivamente, tales como
aditivo de los detergentes y para una variedad de biotransformaciones, la
sobreproducción de la lipasa funcional en E. coli ha sido mucho más difícil de
lograr debido al requerimiento de la chaperona para que pliegue a la lipasa en una
conformación activa [14]. A fin de mejorar la expresión funcional de las lipasas en
E. coli, se han desarrollado dos estrategias. La primera de ellas era producir y
purificar por separado en E. coli tanto a la lipasa como a su chaperona, para
conseguir posteriormente la plena actividad lipasa mediante el proceso de
replegamiento in vitro utilizando diversos enfoques [11,16-20]. Recientemente, la
segunda estrategia fue dirigida para producir lipasas funcionales en condiciones in
vivo en el hospedero heterólogo E. coli, utilizando el sistema de co-expresión de
dos plásmidos sin necesidad del replegamiento in vitro [21-24]. Hasta la fecha, no
se ha logrado la expresión de una lipasa funcional in vivo en el hospedero
heterólogo E. coli, utilizando un sistema de doble expresión con plásmido en
casete.

En el estudio anterior [13], los genes lipA que codifica a la lipasa y lipB que
codifica a su chaperona, provenientes de Ralstonia sp. cepa M1, fueron clonados,
secuenciados, y se sobre-expresaron en E. coli BL21 por separado. La lipasa
recombinante era una lipasa alcalina, termófila, altamente resistente a los
disolventes orgánicos además de inducible por detergentes. El plásmido pELipAB a
que lleva el grupo de genes que codifica a LipA y LipB bajo el control del promotor
T7 fue expresado en la cepa BL21 de E. coli. La cantidad de LipA representaba el
40% de proteína celular total, sin embargo la cantidad de LipB era menor al 1% en
comparación con la cantidad total de proteínas. Por otro lado, para el óptimo
replegamiento in vitro de la lipasa, tanto LipA como LipB son requeridas en
cantidades iguales para formar al complejo lipasa:chaperona (1:1) [19]. Eso
significa que el nivel desigual de expresión de la lipasa y su chaperona en el
hospedero heterólogo, condujo a la baja formación de lipasa activa en condiciones
in vivo, sólo el 1-3% de la lipasa expresada fue activada in vivo.

Para mejorar la cantidad de lipasa funcional, sobre-expresamos a la LipA (70 mg

por gramo de peso celular húmedo) y a la LipB1 (12 mg por gramo de peso celular
húmedo) en E. coli cepa BL21, y el replegamiento in vitro aumentó la actividad de
la lipasa en 4,4 veces. Sin embargo, en estos estudios, se requirió el
replegamiento in vitro para plegar a la lipasa en su conformación activa. El
propósito del presente estudio era mejorar la producción de la lipasa activa LipA
de Ralstonia sp. M1 en el hospedero heterólogo E. coli, sin el proceso de
replegamiento in vitro, empleando los sistemas de co-expresión con dos plásmidos
y los sistemas de doble expresión con plásmido en casete. Por primera vez, una
lipasa activa fue expresada en un sistema de doble expresión con plásmido en
casete en E. coli.