ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

MAI THỊ NGỌC ANH

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PHTHALATES

TRONG DẦU ĂN BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ
KHÍ GHÉP NỐI HAI LẦN KHỐI PHỔ GC - MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018
 MỞ ĐẦU
Phthalates (PAEs) là các este của axit phthalic, được sử dụng phổ biến trong
ngành công nghiệp polyme. Phthalates được đưa vào sản xuất công nghiệp từ
những năm 1920 với tư cách là chất làm dẻo nhựa PVC và sản lượng DEHP - một
phthalate phổ biến nhất - đã bùng nổ trong năm 1931. Kể từ đó, PAEs tồn tại trong
nhiều vật dụng hằng ngày như đồ vật bằng nhựa, nylon, đồ chơi trẻ em, hóa mỹ
phẩm, thiết bị y tế [7]. Trong năm 2010, sản lượng PAEs toàn cầu ước tính 4,9 triệu
tấn. PAEs không bền và bị thôi nhiễm trong quá trình lão hóa của vật liệu do chúng
không tạo liên kết cộng hóa trị với nền [34]. Chúng có thể hấp thụ qua da do tiếp
xúc, qua đường hô hấp do hít phải và qua đường tiêu hóa do ăn uống. PAEs hiện
diện ở khắp nơi: nước mưa, nước mặt, đất, trầm tích, không khí, bụi trong nhà, thực
phẩm, đặc biệt là thực phẩm béo [15]. Mortensen và cộng sự (2005) tìm thấy sự có
mặt của PAEs trong sữa mẹ và nước tiểu của trẻ sơ sinh [20]. Theo dữ liệu từ
Scopus, chỉ với từ khóa ―phthalate‖ đã cho ra kết quả hơn 8000 tài liệu liên quan từ
năm 2010 đến 2018, điều này cho thấy tầm quan trọng và sự quan tâm của các nhà
khoa học đến nhóm chất đặc biệt này.
PAEs không tích lũy sinh học, nhưng sản phẩm oxy hóa của chúng là mono
este phthalate gây ra nhiều tác hại đối với cơ thể con người và môi trường [37].
Chúng bị nghi ngờ gây ung thư gan, thận, cơ quan sinh sản, gây dị dạng, quái thai,
biến đổi nội tiết trong cơ thể, …[32, 34]. Mức độ phơi nhiễm phthalate ở trẻ sơ sinh
cao hơn đáng kể so với người trưởng thành khi so sánh tương quan theo trọng
lượng cơ thể. Nghiên cứu nước tiểu của trẻ sơ sinh dưới 3 tháng tuổi cho thấy 80%
mẫu phân tích chứa 7/9 monophthalate (thường có mặt trong các loại kem dưỡng
da, bột talc dùng cho trẻ sơ sinh) [26]. Năm 2009, Cơ quan bảo vệ môi trường Hoa
Kỳ USEPA 2009 [3] đã thêm 8 loại phthalate vào danh sách hóa chất đáng lo ngại,
riêng DEHP ở nhóm các chất có khả năng gây ung thư mức độ 2 [47]. Ngày càng
nhiều các quốc gia trên thế giới đã ban hành luật cấm lưu hành vật liệu có chứa
phthalate tùy mức độ. Luật Hóa chất (REACH) của Hội đồng Châu Âu đã đưa 03
phthalate bao gồm DEHP, DBP và BzBP vào mục 52, phụ lục XVII từ năm 2007

1
nhằm hạn chế sản xuất, buôn bán và sử dụng chúng. Danh sách các phthalate bị
cấm không ngừng tăng lên theo các năm. Chỉ thị RoHS 2 EU/65/2011 ban hành
năm 2016 đã nhắc lại luật hạn chế về hàm lượng của DEHP, BzBP, DBP và DiBP
< 0,1% (công bố từ 2011) và sẽ bị cấm trong tất cả các thiết bị điện và điện tử tính
từ ngày 22/7/2019.
Theo dự báo của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam có mức tiêu thụ dầu thực
vật tính đến năm 2020 là 18,5 - 20 kg/người/năm và sẽ tăng theo các năm do xu thế
phát triển nhanh của kinh tế và nhu cầu xã hội. Nhập khẩu dầu thô và dầu tinh
luyện tính đến 2011 là gần 800 nghìn tấn, trong đó dầu cọ, dầu đậu nành chiếm đa
số (70%). Việc xác định đồng thời nhiều loại phthalate trong dầu thực vật tại Việt
Nam gần như chưa có, các nghiên cứu hầu hết chỉ tập trung vào một số phthalate
điển hình như DEHP, DEP, DBP. Nhận thấy sự cấp thiết của việc tìm hiểu PAEs,
các nghiên cứu đã được phát triển và ứng dụng trên nhiều nền mẫu khác nhau [1,
11, 27, 35, 38, 39].
Phương pháp phân tích sắc kí khí ghép nối hai lần khối phổ GC - MS/MS
cho phép xác định trực tiếp các phthalate dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và tính
ổn định nhiệt của từng phthalate, được coi là phương pháp phân tích có độ nhạy và
độ chọn lọc rất cao. Độ chọn lọc cao của detector MS/MS cho phép giảm nhẹ việc
chuẩn bị mẫu, phép tích phân peak dễ dàng và nhanh hơn, từ đó đơn giản hóa việc
xử lý dữ liệu, loại bỏ nhiễu có trong chế độ SIM và Scan, tăng hiệu quả phân tích
cho GC, đưa ra kết quả tin cậy hơn. Độ nhạy cao khiến MS/MS có thể phân tích
được những mẫu mà GC - MS không làm được, nền mẫu phức tạp càng thể hiện
tính năng vượt trội so với GC - MS, đồng thời cho phép phân tích lượng mẫu bơm
ít hơn vào cột, chu kỳ phân tích nhanh hơn.
Xuất phát từ tính cấp thiết của xã hội và tính ưu việt của phương pháp phân
tích này, chúng tôi thực hiện đề tài: ―Xác định hàm lượng phthalates trong dầu ăn
bằng phương pháp sắc kí khí ghép nối hai lần khối phổ GC - MS/MS‖.

2
 Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về các phthalate
1.1.1. Cấu trúc, phân loại các phthalate
Phthalates (este axit phthalic - PAEs) là các este của axit 1, 2 - benzen
đicacboxylic. Công thức cấu tạo chung của các phthalate như sau:

Hình 1. Cấu trúc hóa học chung của phthalate

PAEs được điều chế dễ dàng thông qua phản ứng giữa phthalic anhydrit và
ancol mạch thẳng hoặc mạch nhánh (từ metanol, ancol chứa một đến hai cacbon cho
đến ancol chứa nhiều cacbon như tridexy ancol). Hai nhóm R và R’ có thể giống
hoặc khác nhau tùy thuộc ancol tham gia phản ứng, từ đó dẫn đến tính chất vật lý,
hóa học, hoạt tính sinh học của các phthalate có sự khác biệt [33, 49].
PAEs được chia thành thấp và cao tùy thuộc khối lượng phân tử. Phthalate
cao bao gồm những phân tử có từ 7 - 13 nguyên tử cacbon ở R và R’, có độ bền cao,
phổ biến là diisononyl phthalate (DiNP), diisodecyl phthalate (DiDP),
dipropylheptyl phthalate (DPHP). Phthalate thấp bao gồm những phân tử có 3 - 6
nguyên tử cacbon ở R và R’, phổ biến nhất là di (2-etylhexyl) phthalate (DEHP) và
dibutyl phthalate (DBP).
1.1.2. Tính chất lý hóa của các phthalate
PAEs là những chất lỏng dạng dầu, thường không màu, không mùi, dễ bay
hơi, ít tan trong nước và CCl4 nhưng tan tốt trong các dung môi: metanol,
acetonitrin, hexan, dầu thực vật, chất béo. Chúng cũng có thể tan trong máu và
những dịch cơ thể có chứa lipoprotein.
Khi tham gia vào thành phần của vật liệu polyme, phthalate cho phép các
phân tử polyvinyl dài có thể trượt trên mặt của các phân tử polyvinyl khác, làm thay
đổi tính chất của vật liệu: tăng độ bền, độ linh động, chịu được một số tác động môi

3
trường. Bảng 1 chỉ ra một số PAEs điển hình với tên gọi, cấu tạo và tính chất vật lý
của chúng.
Bảng 1.Tên gọi, cấu tạo và tính chất của một số PAEs điển hình
Nhiệt Độ tan
Viết KLPT Số hiệu
Tên gọi CTCT hóa hơi trong
tắt (g/mol) CAS
(oC) nƣớc

Dimetyl 4 mg/L
DMP 194,18 284oC 131-11-3
phthalate (25oC)

1080
Dietyl
DEP 222,24 295oC mg/L 84-66-2
phthalate
(25oC)
Di - n -
propyl DPP 250,29 318oC - 131-16-8
phthalate
Di - n - 11,2
butyl DBP 278,34 340oC mg/L 84-74-2
phthalate (20oC)
Di - iso- 6,2
butyl DiBP 278,34 320oC mg/L 84-69-5
phthalate (24oC)
Dicyclo
4,0
hexyl DCHP 330,42 222°C 84-61-7
(24oC)
phthalate
Butyl 2,69
benzyl BzBP 312,36 370oC mg/L 85-68-7
phthalate (25oC)

4
 Di - n - 0,05
hexyl DnHP 334,45 186oC mg/L 84-75-3
phthalate (25oC)

Di (2 - 0,27
etylhexy) DEHP 390,56 285oC mg/L 117-81-7
phthalate (25oC)

Di - n - 0,022
octyl DNOP 390,56 385oC mg/L 117-84-0
phthalate (25oC)

PAEs bị nung nóng hoặc cháy tạo thành anhydrit phthalic có mùi khó chịu và
độc. PAEs có phản ứng với các chất oxi hóa mạnh, với axit, kiềm và các hợp chất
nitrat.
1.1.3. Ứng dụng của các phthalate và nguồn gốc phát tán vào thực phẩm.
1.1.3.1.Ứng dụng của các phthalate [3, 14, 54]
PAEs được sử dụng trong nhiều loại sản phẩm: chất kiểm soát độ nhớt, chất
tạo gel, tạo màng, chất ổn định, chất phân tán, bôi trơn, kết dính, chất nhũ hóa.
PAEs là hợp chất phụ gia quan trọng trong công nghiệp, nông nghiệp, vật liệu xây
dựng, sản phẩm chăm sóc cá nhân, thiết bị y tế, các chất tẩy rửa, chất hoạt động bề
mặt, bao bì, dụng cụ chứa đựng, đồ chơi trẻ em, mô hình đất sét, sáp, sơn, mực in,
chất phủ dược phẩm, thực phẩm, trong công nghiệp dệt may, công nghiệp hóa mỹ
phẩm như nước hoa, các loại kem, sơn móng tay, xà phòng, keo xịt tóc. Ngoài ra,
PAEs cũng được tìm thấy trong các thiết bị điện tử hiện đại và các ứng dụng y khoa
như ống thông và thiết bị truyền máu. PAEs được sử dụng rộng rãi từ những năm
1930, nhất là di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), diisodecyl phthalate (DIDP), và
diisononyl phthalate (DINP). DEHP là chất làm mềm dẻo được sử dụng trên toàn
cầu trong PVC do chi phí thấp. Benzyl butyl phthalate (BBP) được sử dụng trong
sản xuất PVC bọt, hay các phthalate với mạch ngắn được sử dụng làm dung môi
trong nước hoa và thuốc trừ sâu. Hiện nay, trong ngành công nghiệp sản xuất nhựa,

5
tiêu biểu như trong polyvinyl clorua (PVC), polyethylene terephthalate (PET),
polyvinyl acetates (PVA) và polyethylene (PE), PAEs chiếm từ 10 - 60% trọng
lượng.
Các nhóm cacboxyl phân cực đóng góp tạo nên tính chất vật lý của phthalate,
đặc biệt trong các PAEs có mạch cacbon (ở R và R’) ngắn, nhờ đó tạo nên tính dẻo
của vật liệu polyme thông qua cơ chế tương tác lưỡng cực giữa các trung tâm phân
cực của phthalate (nhóm C = O) và các vùng tích điện dương của của chuỗi vinyl
(trong PVC, thường nằm trên nguyên tử cacbon của liên kết C - Cl. Để cho tương
tác này được thiết lập, các polyme thường được nung nóng chảy trong sự có mặt
của chất làm dẻo. Từ đó tạo ra một hỗn hợp đồng nhất giữa polyme và chất làm dẻo,
và cho phép những tương tác phân cực này xảy ra. Trong khi các PAEs tương tác
với các phân tử polyme qua những liên kết lưỡng cực lỏng lẻo, PAEs liên kết với
nhau bằng những liên kết hydro và lực liên kết Van der Walls. Do không hình thành
liên kết cộng hóa trị với vật liệu nền, PAEs có thể dễ dàng bị đào thải trong quá
trình lão hóa của vật liệu và gây ra những tác hại lớn cho con người và môi trường
khi phân tán vào nước, đất, bầu khí quyển.
Các PAEs mạch ngắn, như dimethyl phthalate (DMP), diethyl phthalate
(DEP) và dibutyl phthalate (DBP) thường được sử dụng trong mỹ phẩm, các sản
phẩm chăm sóc cá nhân, nhựa epoxy, và các este xenlulo để làm tăng độ kết dính
của sản phẩm. Các PAEs mạch dài như butyl benzyl phthalate (BBP), dicyclo hexyl
phthalate (DCHP), di - n - octyl phthalate (DnOP), di - n - nonyl phthalate (DnNP),
di - iso - decyl phthalate (DiDP) và diethyl hexyl phthalate (DEHP) được sử dụng
rộng rãi như một hoạt chất làm dẻo trong ngành công nghiệp polyme để cải thiện độ
mềm dẻo của vật liệu polyme tùy thuộc vào yêu cầu của vật liệu.
Bảng 2. Ứng dụng của các phthalate điển hình trong cuộc sống
PAEs Sử dụng Các sản phẩm
Mỹ phẩm, nước hoa, kem dưỡng da,
DMP Chủ yếu làm dung môi
dầu gội, sáp nến.

6
 Chủ yếu làm dung môi, chất
DEP cố định hương trong nước
hoa
DnBP Chủ yếu làm dung môi
Chất làm dẻo cho PVC và
BzBP
làm dung môi
Chất làm dẻo cho PVC và
DiBP cao su, làm dung môi và
chất cố định màu, mùi.
Chủ yếu được sử dụng như
DnOP
một chất làm dẻo cho PVC
Chủ yếu được sử dụng như
DEHP
một chất làm dẻo cho PVC
Chủ yếu được sử dụng như
DiNP
một chất làm dẻo cho PVC
Chủ yếu được sử dụng như
DiDP
một chất làm dẻo cho PVC
7
Mỹ phẩm, nước hoa, kem dưỡng da,
sáp nến, dầu gội đầu, thuốc trừ sâu.
Mỹ phẩm, nước hoa, kem dưỡng da,
sáp nến, dầu gội đầu, chất kết dính,
sơn, sàn vinyl, keo dán, sản phẩm
chăm sóc xe hơi.
Bao bì, cuộn bọc thực phẩm, thắt lưng,
giấy dán tường, rèm cửa, vòi hoa sen,
mô hình đồ chơi.
Keo dán cao su, chất bịt kín, sản phẩm
chăm sóc xe hơi, mỹ phẩm, mực và
thuốc nhuộm, thuốc trừ sâu, vật liệu
bao bì thực phẩm, đồ trang trí nội thất,
sơn, quần áo.
Sàn, nắp chai, băng tải, ống nước, đồ
chơi, giày dép, quần áo, thiết bị y tế
(ống nhựa và chai đựng dịch tiêm tĩnh
mạch).
Da bọc ô tô, thiết bị điện tử, hệ thống
ống nước, gạch lát sàn, mô hình, đồ
chơi, găng tay, ống hút uống, chất kết
dính, mực.
Sơn và sơn mài, bao bì thực phẩm,
quần áo, giày dép, da làm nội thất xe
hơi, ván sàn.
Dây điện, da cho nội thất xe hơi, ván
sàn, nhựa PVC.
 Ngoài ra do tính chất không tan trong nước nên chúng còn được sử dụng làm
chất tạo đục trong các sản phẩm nước như thạch rau câu, sữa, nước ngọt... điển hình
như DEHP và DINP được sử dụng trong thực phẩm thay cho dầu cọ. Tuy nhiên,
lượng phthalate có trong thực phẩm còn có một lượng nhỏ là do bị thôi nhiễm từ vỏ
bao bì bằng nhựa. Trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, phthalate có mặt trong sơn
móng tay, keo vuốt tóc, dầu gội, kem dưỡng da, thuốc nhuộm tóc, son môi, phấn...
Những chất này được thêm vào để tạo độ tươi mới, tạo độ mịn, hấp dẫn, sáng bóng
hơn, bền lâu hơn, bám dính hơn. Chất DEP còn được dùng như một chất định
hương trong nước hoa, giúp nước hoa giữ mùi thơm được lâu hơn và mùi không bị
biến đổi trong các điều kiện thời tiết khác nhau. Trong ngành sản xuất các loại dụng
cụ, thiết bị y tế, các phthalate thường có trong những túi nhựa đựng máu, dây truyền
nước và hóa chất, ống thông tiểu, ống súc dạ dày, ... DEP được dùng như một chất
trị bệnh ghẻ vì có tính diệt khuẩn (hiện không còn sử dụng để điều trị nữa), làm chất
hóa dẻo trong bao phim viên thuốc, nhưng lớp phim bao này thường rất mỏng cộng
với việc sử dụng hàng ngày chỉ một lượng nhỏ nên coi như lượng vào cơ thể không
đáng kể.
1.1.3.2. Nguồn gốc phát tán các phthalate vào thực phẩm
Phthalates trong thực phẩm chủ yếu là do bị nhiễm trong quá trình sản xuất
và do thôi nhiễm. PAEs hay được thêm vào trong nhựa cũng sẽ có mặt một lượng
nhỏ trong các mẫu thực phẩm như DBP, BBP, DINP, DNOP, DIDP,... khi dùng vỏ
hộp nhựa đựng đồ ăn nóng và nhiều dầu mỡ, hoặc cho quay nóng trong lò vi sóng.
Tsumura (2001) đã chỉ ra rằng hàm lượng DEHP tăng lên trong thịt gà từ 80 µg/kg
trước khi nấu đến 13,100 µg/kg sau khi rán trong chảo được tráng Teflon, và còn
cao tới 16,900 µg/kg sau khi đóng gói [58]. Làm nóng thực ăn trong các vỏ bọc trực
tiếp của đồ ăn nhanh tạo điều kiện rất lớn cho sự thôi nhiễm PAEs từ vật liệu bọc
thức ăn. Trong khi kiểm tra các bữa ăn được chuẩn bị tại 3 bệnh viện tại Nhật cũng
cho thấy việc sử dụng găng tay cao su cũng đóng góp 600 µg PAEs mỗi ngày. Các
bữa ăn ở bệnh viện đó chứa trung bình khoảng 160 µg DEHP; 12,5 µg DEHA;
4,7µg DINP và 3,4µg BBP một ngày.

8
 PAEs có trong thực phẩm không chỉ do thôi nhiễm từ vật chứa hoặc tiếp xúc.
Những sản phẩm giàu chất béo như bơ, phomai, mayonaise... đều được thêm một
lượng nhỏ PAEs vào để làm chúng trông tươi ngon và mịn hơn. PAEs ít tan trong
các dạng thức ăn ít béo, chứa nước mà tạo thành dạng nhũ tương giữa hai hay nhiều
pha trong một dạng thức ăn. Vì vậy PAEs thường được thêm vào nước hoa quả
hoặc đồ uống có cồn để làm tăng độ đục và tạo cảm giác tự nhiên hơn cho các loại
thực phẩm đó. Thực tế mặc dù PAEs bị cấm sử dụng trong các trường hợp như vậy,
tuy nhiên theo Cục quản lý Thực phẩm và Thuốc Đài Loan, vẫn có những cơ sở sản
xuất sử dụng PAEs để làm chất tạo đục để giảm giá thành so với các sản phẩm tự
nhiên như dầu cọ, gum arabic... và tạo độ ổn định trong sản phẩm. Chủ yếu
phthalate được dùng trong trường hợp này là DEHP và DINP. Thường thì các nhà
sản xuất nếu có dùng các phthalate này trong thực phẩm thì cũng khó có thể ghi nó
lên thành phần của thực phẩm đó vì nhiều lý do.
1.1.4. Độc tính của các phthalate
Có rất nhiều đồ dùng chứa PAEs, do vậy nguy cơ bị nhiễm PAEs vào cơ thể
rất cao. Mỗi một nguồn nhiễm khác nhau sẽ khác nhau về lượng và về tác động đến
cơ thể. Sự hấp thu phthalate qua da (từ không khí và các sản phẩm chăm sóc cá
nhân) sẽ di chuyển trực tiếp vào các mô và các cơ quan bởi hệ thống mao mạch.
PAEs cũng có thể xâm nhập vào cơ thể người thông qua ăn uống hoặc tiếp xúc trực
tiếp. Qua các thử nghiệm lâm sàng, phơi nhiễm qua da bởi phthalate thường được
xác định là sự hấp thụ từ pha khí lên bề mặt của cơ thể tiếp xúc. Mức độ ảnh hưởng
của mỗi phthalate tới động vật phòng thí nghiệm và con người đều khác nhau, trong
đó có sự khác biệt cả về liều lượng cũng như con đường xâm nhập vào cơ thể sinh
vật.
Chưa có nhiều thử nghiệm về tác hại của PAEs đối với cơ thể con người.
Tuy nhiên đối với những nghiên cứu trên động vật (cụ thể là chuột ở cả hai giới
tính) đã cho ta thấy những kết quả đáng ngại về PAEs. Bell và cộng sự đã chỉ ra độc
tính của PAEs này trên những con chuột được tiêm vào một lượng nhất định và
nhận thấy tác hại đến hệ sinh sản từ năm 1982 [2]. PAEs càng thấp thì càng độc hơn

9
so với PAEs cao (gốc ancol từ C6-C9). Khi tiêm vào tĩnh mạch chuột, PAEs tích tụ
lại trong phổi, gan và lá lách với những lượng khác nhau và dần làm mất chức năng
của các bộ phận đó. PAEs gây xáo trộn nội tiết do can thiệp vào hệ nội tiết trong cơ
thể [6]. Tiếp xúc với PAEs lâu dài sẽ làm tăng tỷ lệ mắc các đột biến như hở hàm
ếch, dị tật xương và tăng tỉ lệ thai lưu ở vật thí nghiệm có thai [10, 12, 51].
Trẻ sơ sinh có nguy cơ phơi nhiễm PAEs ngay khi còn trong bụng mẹ [17]
và đã có nhiều nghiên cứu về tác hại của phthalate đối với trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ bao
gồm hệ thần kinh và sinh sản [4, 30]. Các dẫn xuất phthalate được xác định là các
xenoestrogen, do đó chúng sẽ là những chất làm rối loạn nội tiết (endocrine
disruptors), cụ thể là làm rối loạn hệ thống hoóc môn giới tính và gây ra dậy thì
trước tuổi ở cả bé gái lẫn trai [56]. Ở phụ nữ, nhiều nghiên cứu cho thấy các
phthalates làm tăng nguy cơ lạc nội mạc tử cung (endometriosis) cũng như ung thư
vú [21, 29, 31]. Trong một số nghiên cứu trước đây các nhà nghiên cứu đã chứng
minh được rằng: DnBP, BBP, DEHP và DiNP có thể ảnh hưởng bất lợi đến hệ
thống sinh sản nam giới [13, 48], DEP có thể gây tổn thương DNA trong nhân tinh
trùng và các thông số tinh dịch của con người [9], DEHP có thể phá vỡ hệ thống nội
tiết và gây ra sinh non ở người [8, 41], nồng độ cao của DEHP trong bụi nhà sẽ làm
tăng tỷ lệ mắc bệnh hen suyễn và mức BBP cao làm tăng tỷ lệ viêm mũi và eczema
ở trẻ em [5]. Tổ chức nghiên cứu về ung thư (IARC, 1982) đã công bố phthalate là
một chất có thể gây ung thư cho con người như ung thư gan, tụy bởi khả năng kích
hoạt, làm tăng chiều dài các chuỗi PPAR - α [18, 42].
Bảng 3. Các cấp độ rủi ro do phơi nhiễm PAEs theo thống kê của Heudorf [49]

Mức độ
PAEs Quốc gia Tổ chức (mg/kg/ MRL/TDI/RfD
ngày)

7,00 MRL tiếp xúc qua miệng cấp tính

DEP Mỹ ATSDR
5,00 MRL tiếp xúc qua miệng mãn tính

10
 Mức độ
PAEs Quốc gia Tổ chức (mg/kg/ MRL/TDI/RfD
ngày)

US-EPA 0,800 RfD phơi nhiễm mãn tính

ATSDR 0,500 MRL tiếp xúc qua miệng cấp tính

Mỹ
US-EPA 0,100 RfD phơi nhiễm mãn tính

DnBP Health
Canada 0,060 TDI
Canada

Châu Âu CSTEE 0,100 TDI

Mỹ US-EPA 0,200 RfD phơi nhiễm mãn tính

BBzP
Châu Âu CSTEE 0,200 TDI

US-EPA 0,020 RfD phơi nhiễm mãn tính

MRL intermediate duration

Mỹ 0,100
ATSDR exposure

0,060 MRL phơi nhiễm mãn tính

Health
Canada 0,044 TDI
Canada
DEHP
CSTEE 0,050 TDI

TDI với trẻ sơ sinh < 3 tháng và

0,020
phụ nữ ở độ tuổi sinh sản
Châu Âu
ECB/EU 0,025 TDI với nhũ nhi 3 – 12 tháng

TDI nói chung, trừ trẻ sơ sinh và

0,048
nhũ nhi< 12 tháng, phụ nữ ở độ

11
 Mức độ
PAEs Quốc gia Tổ chức (mg/kg/ MRL/TDI/RfD
ngày)

tuổi sinh sản

3,00 MRL tiếp xúc qua miệng cấp tính

Mỹ ATSDR
DnOP 0,400 MRL nhiễm độc cấp tính

Châu Âu CSTEE 0,370 TDI

DiNP Châu Âu CSTEE 0,150 TDI

DiDP Châu Âu CSTEE 0,250 TDI

Chú thích: ATSDR (Agency for Toxic Substances and Disease Registry): Cơ quan
đặc trách các chất độc hại và theo dõi bệnh tật, Bộ Y Tế Hoa Kỳ. CSTEE (Scientific
Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment): Ủy ban khoa học về độc tính,
độc tính sinh thái và môi trường. ECB (European Chemicals Bureau): Cục hóa chất châu
Âu. EPA (Environmental Protection Agency): Cơ quan bảo vệ môi trường châu Âu.
MRL (minimal risk level): cấp độ rủi ro nhỏ nhất; TDI (tolerable daily intake): mức dung
nạp hàng ngày; RfD (reference dose): liều tham chiếu.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu và đối tƣợng nghiên cứu

 Mục tiêu của bản luận văn này bao gồm các mục tiêu cụ thể sau:
- Xây dụng quy trình phân tích đồng thời 10 phthalate trong mẫu dầu thực vật
bằng phương pháp sắc kí khí ghép nối 2 lần khối phổ. Nội dung bao gồm
việc khảo sát điều kiện tối ưu trên thiết bị GC - MS/MS, quy trình xử lý mẫu
(dung môi, thời gian chiết, làm giàu mẫu) và thẩm định phương pháp (xác
định đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, độ đúng và độ
chụm).
- Áp dụng quy trình đã tối ưu để xác định các phthalates trong một số mẫu dầu
thực vật bán trên thị trường ở Hà Nội.

12
  Đối tượng được nghiên cứu trong bản luận văn này gồm có:
- 10 phthalate: DMP, DEP, DPP, DiBP, DBP, DnHP, BzBP, DCHP, DEHP và
DnOP.
- 18 mẫu dầu thực vật, phân loại thành 3 nhóm: dầu tổng hợp, dầu đậu nành và
dầu oliu. Các mẫu dầu tổng hợp và dầu đậu nành được đóng gói trong chai
nhựa, mẫu dầu oliu đựng trong chai thủy tinh.
1.3. Các phƣơng pháp xác định phthalate
Phương pháp phân tích PAEs trong thực phẩm gặp khó khăn do việc ô nhiễm
PAEs có thể diễn ra ở khắp mọi nơi, ngay cả trong phòng thí nghiệm: dung môi,
thuốc thử, dụng cụ nhựa, thủy tinh đều có chứa hoặc nhiễm PAEs. Hầu hết các loại
thực phẩm đều tìm thấy lượng nhỏ PAEs. Do đó việc đánh giá mức độ ô nhiễm
PAEs trong thực phẩm cần áp dụng biện pháp thích hợp để hạn chế tối đa nguồn ô
nhiễm, đảm bảo chất lượng kết quả phân tích.
Nhiều tài liệu cung cấp phương pháp đánh giá PAEs cụ thể đã được công bố
[33]. Quá trình phân tích PAEs được chia làm hai bước: (1) xử lý mẫu thực phẩm và
(2) phân tích PAEs trong mẫu. Các PAEs sẽ được chiết xuất khỏi mẫu thực phẩm
sau đó được làm giàu trước khi đi vào hệ thiết bị phân tích. Dụng cụ, hóa chất, thiết
bị thí nghiệm được lựa chọn, sử dụng, bảo quản, làm sạch cẩn thận để giảm thiểu tối
đa bị nhiễm PAEs từ bất kì nguồn nào khác có thể dẫn tới sai số thực nghiệm (kể cả
những dụng cụ từ các khâu thu thập mẫu, xử lý đến các thiết bị phân tích). Phòng
thí nghiệm phân tích PAEs cũng như các dụng cụ vật dụng trong phòng hay không
khí, nhiệt độ phòng, cũng cần được kiểm soát nghiêm ngặt. Dụng cụ thí nghiệm cần
được bảo quản trong bao bì (được làm bằng vật liệu không có chứa PAEs). Trước
khi phân tích, các mẫu thường được chia thành các aliquots (tối đa 300 mL) đối với
mẫu dạng lỏng. Mẫu dạng rắn được xay, nghiền đồng nhất, được bổ sung nước hoặc
dung môi hữu cơ phân cực để PAEs di chuyển hết từ mẫu sang dung môi sau đó
được chia nhỏ từ 0,1-10,0 g, tùy theo hàm lượng chất béo.

13
1.3.1. Xử lý mẫu trong phân tích PAEs
Việc loại bỏ nền mẫu béo trước khi tiến hành phân tích PAEs là điều bắt
buộc. Hầu hết các thí nghiệm đều sử dụng chiết lỏng - lỏng để phân tách PAEs ra
khỏi nền mẫu do có ưu điểm đơn giản, chính xác, LOD nhỏ, độ thu hồi cao, tiết
kiệm chi phí [25]. Dung môi chiết thường dùng là n - hexan, n - heptan, ACN,
diclometan hoặc iso - octan, trong đó tối ưu nhất là n - hexan [27]. Trường hợp thực
phẩm giàu chất béo dạng rắn thì dùng dung môi diclometan, hỗn hợp diclometan
với cyclohexan, n - hexan, hỗn hợp n - hexan với aceton hoặc ACN để tăng độ chọn
lọc từ thực phẩm, dựa trên khả năng tan kém của các chất béo vào trong ACN.
Trước khi đưa vào hệ sắc ký để phân tích hàm lượng PAEs, mẫu phải được
đồng nhất, loại nền và làm giàu. Với mẫu lỏng có thể dùng biện pháp chiết, lắc, trộn
lẫn hay khuấy. Đối với mẫu rắn thường sử dụng máy trộn để làm đều hoặc có thể
cho thêm dung môi hữu cơ phân cực hoặc nước cất. Bước loại nền có thể sử dụng
chiết pha rắn để tách lấy PAEs. Nhiều nghiên cứu đã tách PAEs khỏi chất béo bằng
cột chiết Biobeads SX3 hoặc PL - gel, rửa giải bằng hỗn hợp diclomethan -
cyclohexan [45, 53, 57]; hoặc dùng cột florisil, silica gel [52].
PAEs thường được chiết xuất từ nền mẫu lỏng như nước, đồ uống có cồn
hoặc không cồn, dung môi chiết là clorofom, n - hexan, n - heptan hoặc iso - octan,
sau đó thực hiện phân tích trực tiếp mà không cần xử lý làm sạch hay làm giàu. Hỗn
hợp ACN hoặc ACN/H2O chủ yếu được sử dụng trong quá trình chiết xuất PAEs từ
thức ăn rắn không béo. Trong trường hợp thực phẩm có chất béo, PAEs được chiết
xuất cùng với chất béo trong diclo metan, hoặc trong hỗn hợp của n - hexan với
aceton hoặc ACN để quá trình chiết xuất PAEs chọn lọc hơn. Chiết xuất có thể
được thực hiện bằng cách lắc mẫu với dung môi chiết xuất hoặc hỗn hợp, hoặc bằng
cách áp dụng siêu âm hoặc lò vi sóng.
Việc chiết xuất làm sạch các mẫu thực phẩm lỏng không béo thường được
thực hiện bởi quá trình chiết lỏng/lỏng (L/L). Phương pháp chiết này cũng có thể
được áp dụng với việc làm sạch các mẫu thực phẩm rắn [16, 33, 58]. Trong trường
hợp mẫu thực phẩm có chứa chất béo [33] có đề cập tới các phương pháp như sắc

14
ký gel thẩm thấu (GPC) làm một phương pháp được sử dụng rộng rãi. Quá trình
được thực hiện trên cột silica, sử dụng Biobeads S-X3 (Phòng thí nghiệm Bio-Rad,
Hercules,CA, USA) và diclometan/cyclohexan (1: 1 v/v) hoặc cyclohexan/ etyl
axetat (tỷ lệ 1: 1 v/v) được sử dụng làm dung môi rửa giải.
Các phương pháp chiết PAEs và các công trình liên quan trên các nền mẫu
đa dạng được công bố từ những năm 2010, chủ yếu thực hiện trên các phương pháp
như chiết pha rắn thông thường (SPE), chiết pha rắn phân tử đánh dấu (MISPE),
chiết pha rắn từ tính (MSPE) chiếm hơn 60% các kĩ thuật chiết tách thường được sử
dụng, theo sau đó là chiết lỏng lỏng (10%), QuEChERs (8%) và chiết pha rắn vi
sóng (SPME, 7%). Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chiết
lỏng lỏng để tách các phthalate ra khỏi nền mẫu dầu thực vật. Quy trình chiết tách
sau khi tối ưu từng thông số được áp dụng vào xử lý các mẫu thực.
1.3.2. Phương pháp phân tích PAEs trên hệ sắc ký
Sắc ký là một trong những phương pháp phân tích hiện đại được ứng dụng
rộng rãi nhất hiện nay nhờ độ nhạy cao và khả năng định lượng tốt, phù hợp để xác
định nhiều đối tượng khác nhau như các chất khó bay hơi, chất phân cực/ ít phân
cực. Kỹ thuật phân tích này có ứng dụng rộng rãi trong xác định chất phụ gia, thuốc
diệt cỏ, thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm và môi trường như phương pháp sắc
ký khí, sắc ký lỏng sử dụng các detector kết hợp khác nhau: detector UV, DAD,
huỳnh quang, detector bắt điện tử. Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần
sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích,
phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối.
PAEs là este của axit phthalic với hai hoặc một rượu nào đó, do đó tính chất
và cấu tạo của chúng có tính tương đồng cao. Vì là các este nên có thể sử dụng cả
sắc ký khí và sắc ký lỏng để phân tích. Sắc ký khí ghép nối với detector khối phổ
khi phân tích PAEs cho hiệu quả cao. Ngoài ra có thể sử dụng sắc kí khí ghép nối
với các detector khác để xác định PAEs như detector bắt điện tử (ECD), hay ion hóa
ngọn lửa (FID) tuy nhiên độ nhạy kém hơn. Sắc ký lỏng kết hợp sử dụng detector
UV cũng có thể định lượng cũng như định tính được PAEs, tuy nhiên dùng HPLC -

15
UV thì khi phân tích mẫu thực, kết quả phải được kiểm chứng lại bằng một phương
pháp mạnh hơn như ghép nối với MS. Sự kết hợp 2 kỹ thuật này (GC/MS - Gas
Chromatography Mass Spectometry) khi phân tích PAEs giúp đánh giá, phân tích
định tính và định lượng tốt.
1.3.2.1 Các phương pháp sắc kí khí ghép nối detector khối phổ
Phương pháp sắc ký khí phổ biến để xác định các phthalate là kết hợp với
detector khối phổ hoặc hai lần khối phổ (GC - MS, GC - MS/MS). Các yếu tố cơ
bản quyết định phép tách sắc ký PAEs bao gồm khí mang (loại khí mang, tốc độ khí
mang), cột tách (thành phần pha tĩnh, độ phân cực pha tĩnh, bề dày lớp phim pha
tĩnh, chiều dài cột tách) và chương trình nhiệt độ lò.
Loại khí mang được sử dụng phổ biến nhất để tách PAEs là khí hiếm Heli,
độ tinh khiết trên 99,99%, thường được duy trì ở chế độ đẳng dòng với tốc độ dòng
từ 1,0 - 1,5 mL/phút.

Bảng 4. Một số nghiên cứu PAEs bằng sắc ký khí ghép nối detector khối phổ

TLTK Nền mẫu Đối tượng, phương pháp phân tích, tách chiết
Cavalier Dầu oliu - Phân tích 6 PAEs: DMP, DEP, DBP, BzBP, DEHP và
e 2008 DnOP.
[46] - Làm sạch mẫu bằng sắc ký thẩm thấu gel (GPC) với
pha động là cyclohexan: diclometan tỉ lệ 7: 3 (v/v) để
loại bỏ các hợp chất cao phân tử có trong dầu oliu. Ba
chế độ chạy (EI - MS/MS, CI - MS/MS và EI - SIM)
đã được kiểm tra đối chiếu lẫn nhau. Kết quả cho thấy
chế độ EI - MS/MS cung cấp dữ liệu tốt nhất. Đặc biệt,
so sánh với phương pháp SIM phổ biến hơn đã chứng
minh khả năng của detector MS/MS có độ nhạy và độ
chọn lọc đều tăng. Kết hợp kỹ thuật GPC với detector
MS/MS cho độ thu hồi từ 71,7% đến 112,2%; RSD <
9% cho thấy tính hiệu quả của phương pháp khi xác

16
 định hàm lượng phthalates trong nền mẫu phức tạp.
Barp, một số - 09 loại PAEs được nghiên cứu là DMP, DEP, DPP,
Luigi mẫu dầu DiBP, DBP, BBP, DCHP, DEHP và DiNP + DiDP.
Mondell thực vật - Hệ thiết bị sắc ký khí ghép nối detector khối phổ ba
o - Viện đựng cực (GC - MS QQQ). Cột SLB 5ms N28465 - U (10m
Hóa trong chai x 0,1mm x 0,1 µm), nhiệt độ lò 900C trong 5 phút, tăng
phân lọ bằng nhiệt 300C/phút đến 3100C. Nhiệt độ bơm 2800C, khí
tích (ĐH nhôm, mang He với tốc độ dòng 50mL/giây, detector MS ba
Messin, thủy tinh cực. LOD 0,015 - 0,144ppm, LOQ 0,035 - 0,2ppm. Kết
Italy) và nhựa quả cho thấy hàm lượng 7/9 loại PAEs trong mẫu dầu
[1] oliu đựng trong chai thủy tinh ở dưới giới hạn định
lượng (tuy nhiên lượng DiNP + DiDP lại cao nhất);
DMP, DPP và BBP có nhiều nhất trong mẫu dầu
hướng dương đựng trong chai nhựa; còn hỗn hợp dầu
thực vật đựng trong chai nhựa có hàm lượng DEP và
DEHP cao nhất.
Tiêu Đồ chơi - Đưa ra tiêu chuẩn xác định một số PAEs trong đồ chơi
chuẩn trẻ em trẻ em.
CPSC - - Hệ thiết bị GC - MS. PAEs được chiết ra khỏi đối
CH - tượng bằng dung môi THF và n - hexan. Với điều kiện
C1001 - chạy GC - MS trên cột DB - 5MS 30 m × 0,25 mm ID
09.3 của × 0,25µm, tốc độ dòng ban đầu 1ml/phút, dòng chảy
Hiệp hội liên tục, khí mang He, van tiêm mẫu 1µl ở nhiệt độ
tiêu 2900C, áp suất 35 psi, từ 2 - 5 phút giữ ở 500 C, sau đó
dùng an tăng 300C/phút tới 2800C, sau đó tăng 150C/phút tới
toàn 3100C, giữ trong 4 phút. Thu được thời gian lưu của
Hoa Kỳ các chất BB (m/z=105), DBP (m/z=223) từ 5,0 - 9,5
phút, BBP (m/z=206) và DEHP (m/z=279) từ 9,5 -
10,8 phút và của DNOP (m/z=279), DINP (m/z=293)

17
 và DIDP (m/z=307) ra sau phút 10,8. Có phân tích mẫu
chuẩn CRM để xác nhận giá trị của phương pháp.
Hao- 15 loại - 07 phthalate (DEHP, DOP, DEP, DPP, DBP, BBP) và
Yu- mẫu mỹ 04 paraben (Metyl paraben, Etyl paraben, Propyl
Shen và phẩm paraben và butyl paraben).
cộng sự như: gel - Sử dụng cả hai phương pháp là sắc ký khí ghép nối
[55] dưỡng detector khối phổ và sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
tóc, kem ghép nối detector DAD. Sau khi đã được làm sạch với
dưỡng da, cột chiết pha rắn C18, độ thu hồi 85-108%, RSD 4,2 -
sữa 8,8%. Điều kiện tối ưu khi sử dụng GC - MS: mảnh cơ
dưỡng bản m/z = 149 để định lượng các phthalate, còn m/z =
thể,... 121 để định lượng các paraben. Thiết bị Agilent
6890N, bơm mẫu tự động ghép với detector MS, cột
HP - 5MS 30 m × 0,25 ID × 0,25 µm, cột mao quản
5% diphenyl, 95% dimetyl polysiloxane, khí mang He.
Chạy với gradient nhiệt: 1000C giữ trong 0,5 phút tăng
từ từ 50C mỗi phút cho đến 2200C, tăng tiếp 100C một
tới 2750C, giữ 5 phút. Tốc độ khí mang ở 1,0 ml/min.
Tiêm mẫu ở 2500C. Khoảng tuyến tính của các chất
phân tích nằm từ 0,54-100 mg/l. Các điều kiện khác
như đồng nhất mẫu, lắc, rung ... đều được tối ưu.
Zheng X Một số - Xác định 23 PAEs.
và cộng mẫu thực - Chiết pha rắn kết hợp với sắc ký khí ghép nối detector
sự [43] phẩm khối phổ. Các mẫu được chiết bằng n - hexan hoặc
giàu chất acetonitril, làm sạch bằng cột chiết pha rắn ProElut
béo PSA. Việc xác định và định lượng PAEs được thực
hiện bằng chế độ chạy SIM trong GC - MS. Khoảng
tuyến tính của PAEs từ 0,05 - 5,0 mg/L với hệ số tương
quan R2 = 0,989 - 0,999(6). Giới hạn phát hiện PAEs

18
 trong khoảng 0,005 - 0,05 mg/kg (S/N = 3) và giới hạn
định lượng dao động từ 0,02 - 0,2 mg/kg (S/N = 10).
Hiệu suất thu hồi (n = 10) từ 77 - 112% với độ lệch
chuẩn tương đối RSD = 4,1% cho thấy tính phù hợp
của phương pháp để định tính và định lượng 23 PAEs
trong nền mẫu thực phẩm.

Phương pháp sắc ký khí có ưu điểm là ngoài yếu tố thời gian lưu như trong
phương pháp sắc ký dùng detetor ECD, việc sử dụng detector MS còn cung cấp
thêm thông tin quan trọng khác cho việc định danh là khối phổ của hợp chất phân
tích. Một lợi điểm quan trọng khác là trong trường hợp có sự trùng lặp một phần
hoặc toàn phần, hai hay nhiều peak được rửa giải ra cột thì việc chọn lại mảnh ion
có thể giúp ta xác nhận lại hợp chất cần xác định và đồng thời cho phép định lượng
được chúng. Chính vì vậy chúng tôi chọn phương pháp này để xác định phthalate
trong dầu thực vật. Quá trình phân tích trên thiết bị GC - MS/MS được chia thành
hai giai đoạn:
- Giai đoạn tách các chất xảy ra trên cột sắc ký khí: Mẫu được bơm vào trong
và theo dòng khí mang (He) đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh). Mẫu khi qua cột này sẽ
được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó. Sau đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng
khí ra ngoài được ghi nhận bởi detector (detector).
- Giai đoạn nhận biết, đo lường xảy ra trên detector khối phổ và bộ phận xử
lý số liệu. Các cấu tử được tách khỏi cột sắc ký sẽ lần lượt được đưa vào các nguồn
ion của máy khối phổ. Tại đây, tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, sẽ
diễn ra quá trình ion hóa với các kiểu ion hóa khác nhau (CI, PI, EI, FI, FD,…), sau
đó các ion được ghi nhận bởi bộ nhân quang để chuyển hóa thành tín hiệu điện.
Ứng với mỗi peak trên sắc ký đồ sẽ nhận được một khối phổ đồ riêng biệt và hoàn
chỉnh.
Chế độ ion hóa - phân tách trong sắc ký khí có cơ chế là bớt hay thêm một electron,
một proton, thêm hay bớt ái lực điện tử âm hay dương và tạo nhóm cũng như hướng
tới tạo thành các ion khác. Ion hóa một phân tử là một quá trình tiêu hao năng

19
lượng, năng lượng này có thể được cung cấp bằng các electron gia tốc hay gia nhiệt
(va chạm electron hay bắt giữ electron), bằng các photon (dưới tác động của bức xạ
điện từ, chùm tia laze, hay quá trình phóng điện tích corona), bằng các nguyên tử
hay các ion được gia tốc bằng việc biến đổi trường tĩnh điện cao hoặc va chạm
nhiệt.
Ion hóa điện tử (EI) là kỹ thuật phổ biến nhất, được ứng dụng nhiều nhất trong sắc
ký khí ghép nối detector khối phổ. Quá trình tương tác xảy ra khi bắn phá một
electron với electron của phân tử. Các electron có thể dễ dàng thu nhận bằng cách
cho dòng điện đi qua điện cực âm/dây tóc, thêm vào đó năng lượng của electron có
thể điều chỉnh với nguồn điện dương với năng lượng tiêu chuẩn trung bình là 70eV.
Ion hóa hóa học (CI) là phương pháp ion hóa nhẹ nhàng hơn, sử dụng để ion hóa
các phân tử dễ bay hơi, bền nhiệt nhưng không ổn định và không có ion phân tử nào
được ghi trong thư viện phổ khối. Quá trình này dùng electron trong điều kiện áp
suất thấp hoặc chân không.
Cả hai phương pháp ion hóa điện tử (EI) và ion hóa hóa học (CI) đều được dùng
trong kỹ thuật sắc kí khí ghép nối khối phổ GC - MS. Tuy nhiên, việc sử dụng CI
đòi hỏi sự thay đổi thể tích ion (buồng ion hóa) do áp suất dư được sử dụng trong CI
cao hơn rất nhiều (lên tới 1 mm Hg) so với áp suất sử dụng trong EI (10-5 - 10-7
Torr). Với đối tượng nghiên cứu là các phthalate có khối lượng phân tử khá lớn,
kém phân cực, nhiệt hóa hơi khá cao nên nguồn ion hóa được lựa chọn trong nghiên
cứu này từ nguồn ion hóa điện tử EI với năng lượng va chạm tối đa 70eV.
1.3.2.2. Các phương pháp sắc ký khác xác định phthalates
Một số tác giả cũng đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép
nối với detector UV để xác định các phthalate trong nhiều đối tượng khác nhau.
Knauer đưa ra quy trình tách 08 phthalate là benzylbenzoat, benzylbutyl phthalate,
dibutyl phthalate, dihexyl phthalate, di (2 - etylhexyl) phthalate, di - n - octyl
phthalate, di - iso - nonyl phthalate, di - iso - decyl phthalate trên hệ HPLC pha đảo,
cột Eurospher II 100-3 C18 H, 250×3,0 mm ID [19]. Hệ dung môi là ACN - nước
với gradient với hai kênh A gồm H2O/ACN là 15:85 (thể tích/thể tích), kênh B là

20
ACN. Gradient từ 0 - 3 phút từ 0% kênh B, từ 3,0 - 6,5 phút tăng từ 0% B đến 100%
B, phút thứ 6,5 đến 19,5 phút chạy 100% kênh B. Tốc độ dòng 0,6 ml/phút, nhiệt độ
cột 300C, detector UV đặt ở bước sóng 225 nm. Kết quả cho thứ tự của các chất ra
khỏi cột là BB - BBP - DBP - DnHP - DEHP - DNOP - DINP và cuối cùng là
DIDP. Tổng thời gian chạy một mẫu là 22 phút.
Ting Wu và cộng sự đã tách 12 phthalate trên hai hệ UPLC và HPLC, để so
sánh hiệu quả tách của hai hệ máy trên [36]. Các phthalate được tách: DMGP, DPP,
DIBP, DMP, DEP, DBP, BBP, DCHP, DEHP, DNOP, DAP, DHP. Dung môi sử
dụng là metanol, các dung dịch chuẩn các phthalate cũng được pha trong dung môi
này, detector sử dụng là PDA đặt ở bước sóng 225 nm. Với hệ UPLC là một hệ có
hiệu quả tách cao, cỡ hạt nhỏ, cột ngắn, áp suất cao, đường kính nhỏ. Cột sử dụng là
cột phenyl 50 mm × 2,1 mm × 1,7 µm, nhiệt độ cột 450C, sử dụng hai dung môi
kênh A là MeOH, kênh B là Nước. Kênh A tăng trong 1,5 phút từ 50 - 78%, được
giữ trong một phút, sau đó tăng đều lên 100% trong vòng 1 phút, giữ trong vòng 1
phút ở tỷ lệ 100% kênh A trước khi đưa về trạng thái ban đầu và được giữ cân bằng
ở điều kiện đó 2 phút. Tổng thời gian chạy một mẫu là khoảng 7 phút, tốc độ pha
động 0,4 ml/phút. Còn đối với hệ HPLC của Agilent 1100, ghép nối với hệ bơm, bộ
phận tự động bơm mẫu và lò cột. Nhiệt độ cột đặt ở 250C, cột phenyl 250 mm × 4,6
mm × 5 µm. Pha động cũng gồm hai kênh MeOH (kênh A) và nước (kênh B). Chế
độ gradient kênh A tăng trong 5 phút từ 70 - 85%, sau đó tăng đều trong 4 phút tới
100%, giữ trong 4 phút trước khi trở về điều kiện đầu sau đó giữ cân bằng 4 phút.
Tổng thời gian 18 phút một mẫu. Tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Kết quả cho thấy đường
nền khi chạy trên thiết bị UPLC rất ổn định, thẳng đều, không bị trôi hay bị dâng
nền. Còn đối với thiết bị HPLC, nền bị dâng đều theo lượng MeOH, tuy rằng hiệu
quả tách đều tốt, độ phân giải giữa các pic đạt được tốt nhưng rõ ràng khi phân tích
mẫu thực hệ UPLC sẽ cho kết quả phân tích chính xác hơn, thời gian phân tích
nhanh hơn.
Một phương pháp sắc ký lỏng được áp dụng để tách và định lượng các
phthalate trong mẫu sơn móng tay. D. De Orsi và cộng sự [22] đã tách 07 phthalate:

21
DMP, DEP, DIBP, BBP, DBP, DEHP trên hệ HPLC - UV đặt ở bước sóng 254 nm.
Cột Zorbax Eclipse XDB C18 (Agilent) 150 mm × 4,6 mm × 3,5 µm. Chế độ
gradient bắt đầu với tỷ lệ 50:50 % thể tích etanol/nước, tăng dần đến 95% etanol
trong 30 phút. Thành phần này được giữ đến cuối cùng sau khi giữ cân bằng 10
phút, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, van bơm 10 µl, nhiệt độ cột 350C. Phương pháp này
thân thiện với môi trường bởi vì nó sử dụng dung môi etanol trong quá trình tách,
thay cho các dung môi thường dùng khác trong HPLC như: ACN hay MeOH... Các
phthalate cũng được tách ra khỏi nhau, tổng thời gian lưu một mẫu chạy là 40 phút.
Phthalate được chiết ra khỏi nền mẫu bằng hỗn hợp 90/10 % thể tích etanol/nước.
Phân tích mẫu thực có sử dụng chất nội chuẩn DPP, nồng độ 50 ppm.
Hyun Jung Koo và cộng sự đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp HPLC-
UV để xác định 04 phthalate (DEP, DBP, BBP, DEHP) trong các mẫu mỹ phẩm
[50]. Sử dụng hệ máy HPLC của Hitachi (model L-700, Tokyo), bộ phận bơm mẫu
tự động, cột Supecol LC - 18 5µm (250 mm×4,6 mm), nhiệt độ cột 200C ± 20C. Pha
động tỷ lệ 88:12 (88% ACN và 12% dung dịch đệm trietylamine 0,08%, pH 2,8
được điều chỉnh bằng axit photphoric 1mol/L). Tốc độ dòng 0,7 mL/phút, tổng thời
gian chạy là 50 phút. Đường chuẩn dựng từ 10 - 400 ppm, nội chuẩn DnHP. Kết
quả thu được, phát hiện 19/21 mẫu sơn móng tay và 11/42 mẫu nước hoa chứa
DBP, 24/42 mẫu nước hoa chứa DEP với hàm lượng khá cao. Trong nghiên cứu còn
chỉ ra mức nhiễm phthalates khi sử dụng mỹ phẩm hàng ngày dựa trên lượng các
phthalate phát hiện được trên các đối tượng mẫu.
Nhìn chung, việc áp dụng phương pháp phân tích phthalate tùy thuộc vào
từng đối tượng nền mẫu. Quy trình xử lý mẫu chứa PAEs bao gồm các bước: tách
chiết PAEs, làm sạch loại bỏ nhiễu nền, làm giàu mẫu trước khi đưa vào hệ phân
tích.

22
 Bảng 5. Một số phương pháp xác định PAEs tùy theo nền mẫu
Phƣơng
Nền Nghiên Đối tƣợng LOD (LOQ);
STT Xử lý mẫu Phƣơng pháp phân tích pháp định
mẫu cứu phân tích % độ thu hồi
lƣợng
DMP, DEP, Nội chuẩn 0,02 - 0,05
Dầu Rios vcs Siêu chiết pha Ion - trap (IT); MS; ZB - 5MS
1 DIBP, BBP, (benzyl mg/kg; %
oliu (2010) rắn (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
DEHP, DOP benzoat) RSD < 20%
0.001 μg/L
Dầu DMP, DEP, Chiết pha rắn
Xu vcs HPLC C18 (150 mm × 4.6 (nước); 0.020
2 ăn, BBP, DBP, với màng lọc Ngoại chuẩn
(2010) mm, 5 μm) μg/L (dầu
nước DEHP, DOP nylon – 6
ăn); <85,9%
DMP, DEP, HPLC - UV/VIS 230 nm; cột 0.02 - 0.15
Yang vcs
3 Dầu ăn DBP, DEHP, Chiết màng rắn sắc ký C18 (25 cm × 4.6 mm Ngoại chuẩn ng/mL; 85,92
(2013)
DOP × 5 μm) – 101,03%
Dầu TD - GC - MS, cột DB - 5(
Hosaka vcs Chiết Soxhlet
4 thực DMP, DEP 5% diphenyl, 95% dimethyl Ngoại chuẩn % RSD < 3%
(2015) với hexan
vật polysiloxane)

23
 Chiết với etanol;
Giấy,
Nerin vcs DEP, DIBP, Chiết lỏng lỏng GC - MS; SGL - 5 (60 m ×
5 màng Ngoại chuẩn
(2002) DBP, DEHP. siêu tới hạn 0,25 mm × 0,25 μm)
bọc
bằng khí CO2
Thanh khuấy từ
Serôdio và được phủ poly
DMP, DEP, LVI - GC - MS; TRB 5MS 3 – 40ng/L,;<
6 Nước Nogueira dimethyl siloxan
DBP, DEHP (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) 98,5%.
(2006) (PDMS) (20 ×
0.5 mm)
Chiết lỏng lỏng
dung môi DBP: GC-ECD; cột silica
MTBE để chiết DB-1 (30 m × 0.32 mm ×
Nước Leivadara
7 DBP, DEHP DBP, dung môi 0.25 μm), DEHP: GC-MS; cột Ngoại chuẩn
uống vcs (2008)
diclometan/ silica DB - 5MS (30 m × 0.32
metan để chiết mm × 1.8 μm)
DEHP

24
 GC-MS; Cột sắc ký Rtx-5MS
Amiridou DMP, DEP, Chiết lỏng lỏng,
Crossbond 5% diphenyl-95% Nội chuẩn 2- 30ng/L; 70
8 Nước và Voutsa DBP, BBP, dung môi
dimethyl polysiloxane (30 m DnOP – d4 – 94%
(2011) DEHP, DnOP diclometan
× 0.25 mm × 0.25 μm)
0.64–0.79
Yan vcs DMP, DEP, Siêu chiết lỏng HPLC-VWD; C-18
9 Nước Ngoại chuẩn ng/g; 93,2 –
(2011) DBP lỏng (ion lạnh) (250×4.6mm, 5 μm)
105,7%
DMP,DEP,D
Siêu chiết lỏng
Zhang và BP, GC-MS; DB-5MS (30m 8–25 ng/L;
10 Nước lỏng với dung Ngoại chuẩn
Lee (2013) BBP,DEHP,D ×0.25 mm × 0.25 73.5–106.6%
môi toluen
nOP
Nước Graphene/PVC
uống, nano composite
Amanzdvcs GC-FID; CP-Sil 8 CB (30 m 0,06 - 0,08
11 dầu DBP, DEHP fibre headspace Ngoại chuẩn
(2016) × 0.32 mm × 0.25 μm) μg/L.
thực solid - phase
vật microextraction

25
 ≥0.022 μg/L
DMP,DEP,D Rung siêu âm
Rượu Cinelli vcs GC-FID và IT/MS; SE – 54 (≥0.075
12 BP,BBP,DIB kết hợp siêu Nội chuẩn
vang (2013) (30m×0.25mm×0.25mm) μg/L); 85 –
P, DEHP chiết lỏng lỏng
100%
Chiết pha rắn
GC-MS; EI; HP-5MS (5%
Casajuana DMP, DEP, (C18), dung môi 0.06 –0.36
phenyl and 95% methyl Nội chuẩn
13 Sữa và Lacorte DBP, BBP, diclometan/hexa μg/kg; 73 –
polysiloxane) (30 m × 0.25 DEHP-d4
(2004) DEHP n 4:1 v/v, 119%
mm × 0.25 μm)
metanol, nước.
DMP,DEP,DI
BP,BBP, 0.09–0.36
Lin vcs Chiết với etyl GC-MS, cột DB-5
14 Sữa DBP, DCHP, Ngoại chuẩn ng/g; 79,1 –
(2015) acetat (30m×0.32mm×0.25 μm)
DEHP, 110,3%
DNOP
Sữa 0.013–0.022
He vcs DMP, DEP, Chiết pha rắn GC-MS; DB-
15 đậu Ngoại chuẩn μg/mL; 75,8
(2010) DBP, DNOP (MISPE) 5MS(30m×0.25mm×0.25 μm)
nành – 107,5%

26
 0.005–0.095
Thức
DiBP, DEHP, Chiết nhanh μg/g (0.016–
ăn cho Gärtner vcs GC-MS; EI; HP-
16 DOP, BBP, bằng dung môi Nội chuẩn 0.295 μg/g);
trẻ sơ (2009) 5MS(30m×0.25mm×0.25 μm)
DnBP iso-octan 88,7 –
sinh
105,2%
Chiết lỏng lỏng
Thực DMP, DBP, GC-FID và MS; cột sắc ký 0,4 (1,2)
Ostrovský với dung môi
17 phẩm DEP, DEHP, DB -5 MS (30 m × 0.25 mm × Ngoại chuẩn µg/g; %RSD
vcs (2011) clorofom/metan
béo etc. 0.25 μm) < 15%
ol 2:1 v/v, NaCl

27
 Chƣơng 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Thực phẩm chứa PAEs có thể do hai nguyên nhân, do thôi nhiễm từ vỏ bao bì
được làm bằng các loại nhựa hoặc do chúng được thêm vào trong quá trình sản xuất.
Thôi nhiễm từ bao bì thực phẩm có thể nhiều hoặc ít tùy thuộc loại thức ăn được chứa
hoặc cách bảo quản, chế biến thức ăn trong bao bì đó. Vì vậy đối tượng nghiên cứu
trong nghiên cứu này bao gồm:
- 10 phthalate: DMP, DEP, DPP, DiBP, DBP, DnHP, BzBP, DCHP, DEHP và
DnOP. Đây là các phthalate được sử dụng nhiều nhất.
- 18 mẫu dầu thực vật, phân loại thành 3 nhóm: dầu tổng hợp, dầu đậu nành và
dầu oliu. Các mẫu dầu tổng hợp và dầu đậu nành được đóng gói trong chai
nhựa, mẫu dầu oliu đựng trong chai thủy tinh.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát, lựa chọn các thông số của hệ sắc ký khí ghép nối hai lần khối phổ GC –
MS/MS phân tích đồng thời 10 phthalate (PAEs) trong dầu thực vật.
- Xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lòng - lỏng. Tối ưu quy trình xử lý mẫu.
- Đánh giá phương pháp phân tích trên thiết bị GC – MS/MS:
+ Xây dựng đường chuẩn.
+ Xác định giá trị phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp.
+ Đánh giá hiệu suất thu hồi, độ lặp lại của phương pháp.
- Áp dụng phân tích các mẫu dầu thực vật thực tế.
- Xử lý số liệu, thảo luận ý nghĩa các số liệu thu đươc.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Thiết bị sắc kí khí ghép nối hai lần khối phổ (GC – MS/MS)
- Hệ thống sắc ký khí – khối phổ của hãng Agilent Technologies, Mỹ.
- Phần sắc ký: GC System 7890B.
- Bộ phận bơm mẫu tự động: Autosample 7693.
- Phần khối phổ: Detector MS – 7890B, TSQ Thermo 8000 Evo, Trace 1310.
- Phần mềm xử lý số liệu Xcalibur – Thermo.

28
 - Thư viện nhận danh NIST (USA – 2008)
- Cột tách sắc ký mao quản hợp nhất silica DB - 5MS không phân cực (Agilent)
với các thông số: thành phần pha tĩnh 5% diphenyl, 95% dimethyl polysiloxan;
kích thước chiều dài cột 30m, đường kính trong 0,25 mm và độ dày màng pha
tĩnh 0,25 μm; khoảng nhiệt độ làm việc: -600C đến 3250C.

Hình 2. Hệ thiết bị GC - MS/MS

2.3.2. Chất chuẩn, chuẩn trung gian và dung dịch chuẩn làm việc.
Các chất chuẩn phthalate bao gồm: dimethyl phthalate (DMP), diethyl phthalate
(DEP), dipropyl phthalate (DPP), di iso butyl phthalate (DiBP), benzyl butyl phthalate
(BzBP), di - n - hexyl phthalate (DnHP), di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), di - n -
octyl phthalate (DnOP), dicyclohexyl phthalate (DCHP) và di - n - butyl phthalate
(DBP) với độ tinh khiết > 98% của hãng Sigma - Aldrich (USA). Ba chất chuẩn đồng
vị bao gồm dimethyl phthalate - 3,4,5,6 - d4 (DMP - d4), diisobutyl phthalate - 3,4,5,6 -
d4 (DiBP - d4) và di (2 - ethylhexyl) phthalate - 3,4,5,6 - d4 (DEHP - d4) với độ tinh
khiết lớn hơn 98% được mua từ hãng Sigma (St. Louis, MO).

29
 Các chất chuẩn gốc của 10 hợp chất phthalate và 3 chất chuẩn đồng vị được chuẩn
bị bằng cách hòa tan hợp chất trong n - hexan để thu được dung dịch gốc của từng hợp
chất có giá trị 1000 mg/L. Sau đó, các chất chuẩn này phối trộn và được pha loãng
bằng n-hexan để thu được chuẩn trung gian có giá trị là 10 mg/L. Chuẩn hỗn hợp làm
việc của 10 hợp chất phthalate được chuẩn bị bằng cách hòa tan. Tương tự như với
chất chuẩn đồng vị thu được dung dịch nội chuẩn đồng vị có giá trị 100 mg/L. Đường
chuẩn làm việc được chuẩn bị hàng ngày với giá trị điểm chuẩn như 0,1; 1,0; 5,0; 10,0;
20,0; 50,0 và 100,0 µg/L được pha loãng từ chuẩn hỗn hợp bằng n - hexan.

2.3.3. Hóa chất sử dụng

Các loại hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm diclometan, n -
hexan (Merck), metanol, acetonitrin (Thermo Fisher), Na2SO4, NACl, NAOH (Merck)
đều có độ tinh khiết > 95%. Nước siêu tinh khiết được sử dụng từ hệ thống Milli-Q®
Gradient A10 (Merck Millipore, USA).

2.3.4. Thiết bị, dụng cụ

 Máy lắc GFL - 3005 (Gesellschaft für Labortechnik, Đức), cân phân tích (Nhật
Bản), hệ thống cô quay chân không (Buchi, Thụy Điển), hệ thống thổi khí nitrogen
(Eyela, Nhật Bản).
 Dụng cụ: Ống ly tâm thủy tinh 50 ml. Micropipet các loại từ 0 – 1000µL. Bình
tam giác các loại, cốc thủy tinh các loại, phễu chiết, bình cầu 2L, vial dùng cho GC, …
 Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sau
đó tráng bằng metanol và để khô, sấy ở 1050C trong vòng 1 giờ, lấy ra để nguội. Trước
khi sử dụng tráng n - hexan (đã este hóa) 2 - 3 lần.

2.4. Định lƣợng phthalate trên nền mẫu dầu thực vật bằng GC - MS/MS
2.4.1. Xác định các thông số kỹ thuật cho hệ thống GC - MS/MS
Mỗi hợp chất phân tích đều có độ phân cực, khả năng hóa hơi, khả năng ion
hóa, độ phân hủy nhiệt khác nhau. Việc khảo sát và tối ưu hóa các thông số của hệ

30
thống GC - MS/MS có ý nghĩa quan trọng, ảnh hưởng lớn đến kết quả phân tích.
Chúng tôi tiến hành tối ưu hóa hệ thống để xác định PAEs như sau:
- Bơm hỗn hợp chuẩn phthalate 100 µg/L trên máy GC – MS/MS.
- Bơm các chất chuẩn đơn 100 µg/L để định tính các phthalate dựa vào thời
gian lưu.
- Chọn ion định lượng và ion xác nhận cho từng phthalate.
- Tối ưu hóa lại ở chế độ SIM.
- Xác định tỷ lệ ion xác nhận trên ion định lượng và khoảng dao động.

2.4.2. Thông số kỹ thuật ban đầu cho hệ thống GC

Việc tách những cấu tử trên cột mao quản phụ thuộc vào bản chất cấu tử, pha
tĩnh và ái lực của cấu tử với pha tĩnh. Lợi thế của MS là có thể xác nhận và định lượng
thông qua sắc đồ khối và khối phổ, nhưng việc xác nhận và định lượng sẽ trở nên cực
kỳ khó nếu vị trí và cường độ mũi sắc ký chịu ảnh hưởng của nền mẫu. Vì vậy, để tăng
độ nhạy, độ đúng, độ chính xác của phương pháp phân tích chúng ta phải tìm cách
khử ảnh hưởng nền ngay trên GC.
Tham khảo các nghiên cứu xác định phthalate bằng phương pháp GC, chúng tôi
lựa chọn chương trình nhiệt của lò như sau: từ 1000C, tăng 100C/phút đến 2800C. Tăng
50C/phút lên 3100C (giữ trong 5 phút). Tổng thời gian phân tích là 20 phút. Nhiệt độ
buồng bơm mẫu: 2900C. Chế độ tiêm mẫu không chia dòng, thời gian không chia
dòng: 1phút. Khí mang Heli, tốc độ dòng 1,0 mL/phút. Nhiệt độ bộ phận kết nối sắc ký
khí và khối phổ: 3100C, thể tích tiêm mẫu 1 μL. Kiểm tra tính phù hợp của thông số
GC thông qua sắc ký đồ của 10 phthalate.

2.4.3. Thông số kỹ thuật ban đầu cho hệ thống MS

Dựa vào trị số m/z tương ứng của ion sinh ra từ mỗi chất để nhận danh chúng.
Như vậy hai chất cùng thời gian lưu nhưng phân mảnh ion khác nhau vẫn có thể nhận
biết và định lượng được. Detector MS có tính chọn lọc hơn so với các detector khác
trong sắc ký khí, tránh được sự nhầm lẫn khi chỉ dựa vào thông số thời gian lưu làm
yếu tố nhận danh. Chúng tôi tiến hành khảo sát các thông số

31
của detector MS để tìm ra những thông số tối ưu nhất cho các hợp chất phthalate cần
nghiên cứu.
Điều kiện khảo sát của MS:
 Nhiệt độ ống chuyển ion 2500C; nhiệt độ nguồn ion 2000C.
 Thời gian cắt dung môi: 4 phút.
 Thế ion hoá: 70 eV.
 Dòng ion: 60 A.
 Thế detector: thế turning + 0,4 kV.
 Định danh các chất trong hỗn hợp ở chế độ full scan từ m/z=50 đến
m/z=500.
 Chế độ quan sát: chọn lọc ion (chế độ SIM), mỗi phthalate lấy 3 ion: 1
ion định lượng và 2 ion xác nhận theo quyết định Châu Âu 2002/657/EC.
 Kỹ thuật ion hóa bắn phá điện tử EI với năng lượng 70 eV.
 Thời gian lấy tín hiệu: 0 – 20 phút.
Trước khi tiến hành đo đạc, máy được đảm bảo vận hành tốt bằng cách turn
máy theo những điều kiện chỉ dẫn bởi nhà sản xuất.
Chế độ Auto - SRM, mỗi phthalate có mức năng lượng va chạm khác nhau.
Thời gian cắt dung môi: 4 phút. Nhiệt độ nguồn ion hóa: 2000C. Nhiệt độ phần kết nối
(interface): 2500C và nhiệt độ phần MS: 2800C.

2.4.4. Xử lý nhiễm bẩn trong quá trình phân tích phthalate

Việc xử lý nhiễm phthalate trong dụng cụ thủy tinh và dung môi trước khi thực
nghiệm là điều cần thiết, vì phthalate có mặt ở khắp nơi. Đối với dụng cụ thủy tinh
chúng tôi tiến hành sấy ở 1000C trong 1h. Trước khi dùng, dụng cụ được tráng bằng
dung môi n - hexan 3 lần. Nếu chưa dùng đến, dụng cụ được bịt kín bằng giấy nhôm
để tránh nhiễm bẩn phthalate từ môi trường.
Các dung môi dùng chiết đều của Merck. Riêng dung môi n - hexan luôn nhiễm
một lượng nhỏ DEHP, do đó chúng tôi tiến hành tinh chế bằng phương pháp chưng
cất. Chuyển hóa phthalate trong dung môi thành muối natri phthalate thông

32
qua phản ứng xà phòng hóa với NaOH, sau đó chưng cất n - hexan để loại bỏ
phthalate.
Tinh chế n - hexan: Lấy 2000,0 mL n - hexan vào bình cầu. Thêm 400,0 g
NaOH. Lắp bình cầu vào hệ thống chưng cất. Nâng nhiệt độ lên 500C, duy trì trong 30
phút. Tiếp tục nâng lên 780C. Bỏ đi 30,0 - 50,0mL n - hexan ban đầu chưng cất. Hứng
lấy 800,0 - 1000,0 mL n - hexan tiếp theo. Kiểm tra lại độ sạch của dung môi bằng GC
- MS/MS.

Hình 3. Dung môi n - hexan trước khi chưng cất

Hình 4. Dung môi n - hexan sau chưng cất, este hóa bằng NaOH
Kết quả sau khi đo cho thấy sau khi chưng cất, các peak sắc ký của PAEs đều
hạ thấp đáng kể, chứng tỏ việc este hóa n - hexan có hiệu quả, đã loại bỏ hầu hết

33
PAEs có trong dung môi. Vậy khi đó dung môi đủ độ tinh khiết để thực hiện các phép
phân tích phthalates tiếp theo.
2.4.5. Quy trình khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn
Pha dung dịch chuẩn gốc: chuyển 1,0 mL dung dịch chuẩn gốc mix 10 PAEs
nồng độ 1000,0 mg/L (ppm) vào bình định mức 100,0 mL, định mức đến vạch bằng
dung môi n - hexan được dung dịch chuẩn 10 PAEs 10,0 mg/L (ppm). Bảo quản dung
dịch trong bình định mức, bọc kín bằng giấy bạc và lưu trữ trong tủ lạnh âm sâu.
Đường chuẩn mix 10 PAEs được xây dựng gồm 7 điểm chuẩn ở các mức nồng
độ tăng dần từ 0,1 - 100,0 g/L (ppb), được pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc bằng
dung môi n - hexan đã tinh chế.

2.4.6. Tối ưu hóa phương pháp xử lý mẫu

2.4.6.1. Dung môi chiết
Khảo sát các loại dung môi chiết PAEs từ nền mẫu dầu ăn đã được trình bày
trong nhiều nghiên cứu. Kĩ thuật chiết lỏng lỏng mang lại khả năng phân tích cao khi
lựa chọn được dung môi chiết phù hợp. Dung môi được lựa chọn cho phương pháp cần
đáp ứng các điều kiện: có khả năng hòa tan tốt chất phân tích, có ái lực mạnh với chất
cần phân tích, hạn chế đồng chiết nền mẫu, dung môi chiết và nền mẫu có khả năng
tách hoàn toàn nhau. Theo tác giả Long Kai Shi (2016) [27], trong 4 dung môi thường
dùng để chiết PAEs là n - hexan, diclometan, acetonitril và metanol thì n - hexan là
dung môi chiết tối ưu nhất cho DMP, DEP, DBP và BBP. Đối với phân tử PAEs có
khối lượng phân tử lớn như DEHP thì ACN là dung môi chiết phù hợp nhất. Tuy nhiên
sự khác nhau giữa n - hexan và ACN khi chiết DEHP là không đáng kể. Trên cơ sở đó,
trong nội dung nghiên cứu này, chúng tôi cũng sử dụng dung môi n - hexan làm dung
môi chiết các PAEs trong nền mẫu dầu ăn.
2.4.6.2. Số lần chiết
Số lần chiết càng nhiều thì lượng PAEs được chiết ra trong dầu ăn càng tăng
đến cực đại. Tuy nhiên, chiết nhiều lần làm tăng thể tích dịch chiết dẫn đến thời gian
quá trình làm giàu mẫu sẽ kéo dài, dễ bị mất chất trong giai đoạn thổi khô và

34
cô quay. Do đó, chúng tôi tham khảo các quy trình xử lý mẫu trong các nghiên cứu
khác và lựa chọn số lần chiết là 2.
2.4.6.3. Phương pháp làm giàu mẫu
Hạn chế của kỹ thuật chiết lỏng lỏng là sau khi chiết mẫu, thể tích dung môi
chiết thường rất lớn. Do đó cần thiết phải áp dụng phương pháp làm bay hơi bớt dung
môi đồng thời không làm mất chất phân tích. Làm giàu mẫu trước khi đưa vào hệ GC -
MS/MS thông thường có 2 phương pháp: cô quay chân không giới hạn nhiệt độ và thổi
khô lạnh. Cô quay chân không có giới hạn nhiệt độ sẽ làm bay hơi dung môi khá
nhanh, tuy nhiên lượng chất phân tích cũng có thể bị mất theo. Còn phương pháp thổi
khô lạnh bằng khí có ưu điểm là lượng chất phân tích ít bị mất trong quá trình thổi
khô, nhưng thời gian thổi khô khá lâu nếu lượng dịch chiết lớn. Việc kết hợp hai
phương pháp giúp tiết kiệm thời gian phân tích, hạn chế khả năng làm bay hơi dung
môi cũng như hạn chế thời gian tiếp xúc giữa chất phân tích với môi trường không khí
xung quanh, từ đó làm tang hiệu suất thu hồi các phthalate khảo sát. Do đó. trong
nghiên cứu này, chúng tôi kết hợp cả hai phương pháp trên để tối ưu hóa giai đoạn làm
giàu mẫu.
2.6.4.4. Thiết kế thí nghiệm
Phương pháp mặt đáp ứng (Respond Surface Methods - RSM) là một trong
những phương pháp dùng để đánh giá tổng quát sự ảnh hưởng của các yếu tố độc lập
đến mục tiêu nào đó. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế thí nghiệm bao gồm 3
biến độc lập liên tục (Tỷ lệ thể tích dung môi/thể tích mẫu,nồng độ dung dịch NaCl và
thời gian chiết)được đưa vào hàm mục tiêu ( ) - hiệu suất chiết xuất phtalate trong
mẫu(1).Các biến X1, X2, X3 được bố trí thí nghiệm ở năm mức - α, -1, 0, +1 và +α. Số
thí nghiệm cần thực hiện là 20 (23 thí nghiệm tại mức gốc, 6 thí nghiệm tại điểm sao
và 6 thí nghiệm lặp lại tâm với một hàm mục tiêu là hiệu suất thu hồi PAEs). Phần
mềm MODDE 12.1 được sử dụng để thiết kế ma trận thí nghiệm, tính toán các giá trị
hồi quy và phân tích phương sai.
Bảng 6. Giá trị mã hóa các yếu tố thực nghiệm
Kí hiệu Biến số Mức thí nghiệm

35
 -α -1 0 +1 +α
X1 Vdm/Vmẫu 4,3 5,0 6,0 7,0 7,7
X2 NaCl (%) 6,6 8,0 10,0 12,0 13,4
X3 Thời gian chiết (phút) 1,6 5,0 10,0 15,0 18,4

Thiết kế thí nghiệm với các mức được mã hoá trong bảng 7
Bảng 7. Thiết kế thí nghiệm ở các mức
Số thí nghiệm V (dung môi)/V(mẫu) C% NaCl Thời gian chiết
1 -1 -1 -1
2 1 -1 -1
3 -1 1 -1
4 1 1 -1
5 -1 -1 1
6 1 -1 1
7 -1 1 1
8 1 1 1
9 -α 0 0
10 α 0 0
11 0 -α 0
12 0 α 0
13 0 0 -α
14 0 0 α
15 0 0 0
16 0 0 0
17 0 0 0
18 0 0 0
19 0 0 0
20 0 0 0

36
 Ảnh hưởng của các yếu tố cũng như sự tương tác giữa chúng với hàm mục tiêu
(hiệu suất chiết PAEs) được tiến hành xây dựng bởi hàm hồi quy bậc 2 cho hàm mục
tiêu như sau:
= β0 + βi∑xi + βii∑x2i + βi j∑xix j
Trong đó là hàm mục tiêu, β0 là hằng số; βi, βij, và βii lần lượt là hệ số tuyến
tính được xác định qua thực nghiệm.
2.4.6.5. Quy trình xử lý mẫu
Chiết PAEs từ nền mẫu dầu thực vật theo phương pháp chiết lỏng lỏng được
tham khảo. Sau khi tối ưu các yếu tố: dung môi chiết, tỉ lệ dung môi/mẫu, số lần chiết,
thời gian chiết, nồng độ dung dịch NaCl và phương pháp làm giàu mẫu, chúng tôi áp
dụng quy trình xử lý mẫu như sau:

Lấy 6,0 mL n - hexan vào bình tam giác chứa 1,0 mL mẫu dầu
thực vật, lắc đều, rung siêu âm 30 phút. Ly tâm 3000 vòng/phút
trong 5 phút. Hút lấy dịch trong, chuyển toàn bộ vào phễu chiết

Thêm 2,0 mL nước cất siêu sạch, 6,0 mL DCM vào phễu chứa
dịch trong, lắc 5 phút, để yên tách lớp, chiết lấy pha dưới

Thêm 6,0 mL n - hexan vào phễu chiết, lắc 5 phút, để yên tách
lớp và chiết lấy pha trên. Thêm 1mL dung dịch NaCl 10% để
phá nhũ tương.

Gộp dịch chiết, thêm 15,0 g muối Na2SO4, lắc kỹ. Cô quay
chân không đến khoảng 5,0 mL rồi thổi khô bằng N2 đến cạn.
Hòa cặn bằng 1,0 mL n – hexan và đem phân tích.

37
 Xác định mẫu trắng: mẫu dầu nành, dầu hỗn hợp và dầu oliu được thực hiện tất
cả các bước theo quy trình. Trên cơ sở đo kết quả GC - MS/MS tìm ra mẫu không phát
hiện phthalate để thực hiện các khảo sát tiếp theo.

2.4.7. Đánh giá phương pháp

2.4.7.1. Phân tích các dung dịch chuẩn tr n hệ thống GC - MS/MS
Tiêm lần lượt 1,0 μl các dung dịch chuẩn của 10 PAEs vào hệ thống GC-
MS/MS. Thu thập các thông tin sau đây từ phần mềm xử lí số liệu của thiết bị: sắc đồ
tổng ion (TIC), cửa sổ thời gian lưu cho từng cấu tử, thời gian lưu của từng cấu tử,
diện tích peak của mảnh ion định lượng của từng cấu tử.
2.4.7.2. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
a. Giới hạn của thiết bị (IDL, IQL)
IDL (Instrumental detection limit) là lượng chất nhỏ nhất đưa vào máy mà
detector có thể đo được và cho tín hiệu peak cao gấp 3 - 5 lần đường nền. IDL cho
phép đánh giá thiết bị hoạt động có ổn định không, nó bao gồm các loại nhiễu từ linh
kiện cơ - điện tử của thiết bị, điều kiện vận hành máy và điều kiện môi trường xung
quanh và thường được ước lượng qua các dung dịch chuẩn.
IQL (Instrumental quantification limit) là lượng chất nhỏ nhất đưa vào máy để
tạo tín hiệu của peak cao gấp khoảng 10 lần đường nền. Thông thường lấy IQL =
3IDL. IQL cho phép đánh giá thiết bị có đủ điều kiện để định lượng các cấu tử cần
phân tích hay không và cho biết nồng độ cấu tử khi bơm vào máy có đủ điều kiện để
định lượng hay không.
b. Giới hạn của phương pháp
Giới hạn phát hiện của phương pháp (method detection limit - viết tắt là MDL,
hoặc Limit of Detection - viết tắt là LOD) là giá trị nồng độ thấp nhất của một chất cần
phân tích có độ chính xác đến 99%, nồng độ chất cần phân tích lớn hơn 0 (Thông tư
21/2012/TT-BTNMT).
Trên cùng một phương pháp phân tích, các phòng thí nghiệm khác nhau sẽ công
bố các giới hạn phát hiện khác nhau tuỳ thuộc vào tay nghề của nhân viên, sự hoạt
động ổn định của máy móc thiết bị và chất lượng của các hoá chất/ chất chuẩn.

38
Trong trường hợp các yếu tố nêu trên không đảm bảo yêu cầu, giới hạn phát hiện của
phương pháp sẽ tăng lên nhiều lần so với khuyến nghị của phương pháp gốc. Do đó,
việc xác định và công bố giới hạn phát hiện của phương pháp sẽ thể hiện được năng
lực của phòng thí nghiệm.
Giới hạn định lượng của phương pháp (method quantification limit) - viết tắt là
MQL hoặc Limit of quantification - LOQ) là giới hạn thấp nhất của chất cần phân tích
có thể định lượng được bằng cách phân tích đáp ứng được yêu cầu về độ chính xác.
Giới hạn định lượng thường lớn hơn giới hạn phát hiện của phương pháp.
Giới hạn phát hiện (MDL) của một phương pháp phải được tính trên nền thật
của mẫu và trải qua toàn bộ các bước xử lí mẫu. Do đó giá trị này chính xác nhất cho
việc đánh giá một phương pháp phân tích. Có nhiều cách để xác định giới hạn phát
hiện của phương pháp. Với nền mẫu phức tạp, việc xác định giới hạn của phương pháp
(MDL, MQL) dựa trên tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu (S/N: signal/noise). Do đó, MDL = nồng độ
thêm chuẩn nhỏ nhất vào nền mẫu tại đó có tỉ lệ S/N = 3; MQL = nồng độ thêm chuẩn
nhỏ nhất vào nền mẫu tại đó có tỉ lệ S/N = 10.

2.4.7.3. Xác định hàm lượng PAEs trong mẫu

Các PAEs được định lượng bằng phương pháp đường chuẩn, khoảng tuyến tính
xây dựng từ 0,1 - 100,0 µg/L. Hệ số tương quan R2 > 0,995. Hàm lượng 10 PAEs trong
mẫu được tính toán theo công thức:

Trong đó: X: hàm lượng PAEs (µg/kg hoặc µg/L)

m: lượng mẫu (gam hoặc ml)
V: thể tích sau khi hòa cặn trước khi phân tích trên GC – MS/MS (mL)
k: hệ số pha loãng nếu có
Cm: nồng độ dung dịch chiết mẫu phân tích tính theo đường chuẩn (ppb)

39
2.4.7.4. Hiệu suất thu hồi
Xác định độ thu hồi: xác định PAEs trong nền mẫu thực có thêm chuẩn. Dựa
vào đường chuẩn để tính toán nồng độ thu được, từ đó xác định độ thu hồi của phương
pháp nghiên cứu.
Dựa vào việc thêm chuẩnvào mẫu thử, cùng với việc tiến hành làm mẫu thực
không có thêm chuẩn, hiệu suất thu hồi được tính theo công thức sau:

Trong đó: %H: hiệu suất thu hồi

CS+mẫu : nồng độ chuẩn IS thêm vào và mẫu thực có đo được.
Cmẫu: nồng độ thực đo được.
CSo: nồng độ chuẩn biết trước

40
 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu trên thiết bị
Định danh các phthalate trong hỗn hợp ở chế độ full scan. Dựa vào kết quả đo
hỗn hợp 10 phthalate nồng độ 100 ppb ở chế độ full scan sau đó định danh từ thư viện
chuẩn khối phổ NIST trên máy để xác nhận từng phthalate thông qua thời gian lưu và
các mảnh ion tạo thành tương ứng. Dựa vào phổ full scan của hỗn hợp chúng tôi nhận
thấy các đỉnh peak đều cao và rõ nét so với nền. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng
tôi giữ nguyên điều kiện GC. Thông số 10 phthalate (bao gồm cả 3 chất nội chuẩn)
được trình bày ở hình 5 và bảng 8.

Bảng 8. Thời gian lưu, mảnh ion và năng lượng bắn phá (CE) của các phthalates

Thời gian
Thời gian
Tên (STT Mảnh CE(eV) Tên (STT lƣu Mảnh CE(eV)
lƣu
peak) con Q/C peak) (mảnh con Q/C
(mảnh mẹ)
mẹ)

77,1 20 (Q) 15,42 65,0 22 (Q)

DMP (1) DnHP (6)
6,58 51,1 14 (C) (149) 93,0 16 (C)

(163) 81,1 20 (Q) 15,52 149,1 8 (Q)

d4 - DMP BzBP (7)
139,1 10 (C) (206) 93,0 16 (C)

8,16 149,0 8 (Q) 16,90 149,1 8 (Q)

DEP (2) DCHP (8)
(177) 65,1 20 (C) (167) 105,1 14 (C)

10,12 65,1 20 (Q) 149,0 6 (Q)

DPP (3) DEHP (9) 17,02
(149) 121,0 12 (C) 65,1 22 (C)
(167)
65,1 22 (Q) 69,1 25 (Q)
DiBP (4) d4 - DEHP (153)
12,00 121,0 12 (C) 125,1 15 (C)

(149) 69,1 20 (Q)

d4 - DiBP 66,1 22 (Q)
97,1 15 (C) 18,42
DnOP (10)
12,33 (150)
DBP (5) 65,0 20 (Q) 93,0 16 (C)
(149)

41
 Hình 5. Sắc ký đồ hỗn hợp 10 PAEs

Mỗi một peak trong sắc đồ trên ứng với cả chất chuẩn thường và chất chuẩn
đánh dấu đồng vị của nó. Từ sắc đồ này chúng tôi thấy các peak tách khỏi nhau đạt
đến độ phân giải đường nền, tuy rằng với chế độ quan sát chọn lọc ion thì vẫn có thể
định lượng một cách chính xác ngay cả khi các peak sắc ký không tách khỏi nhau hoàn
toàn. Thời gian lưu của 10 PAEs và 3 chất nội chuẩn đã được đưa ra ở bảng 8.

3.2. Đánh giá độ lặp của thiết bị

Với một hệ máy có độ nhạy cao thì sự ổn định và lặp lại đóng vai trò quan trọng
trong phân tích. Lặp lại tốt mới có thể cho độ chính xác tốt, trong một phạm vi cho
phép. Dung dịch chuẩn các phthalate để khảo sát độ lặp có nồng độ 100 µg/L.

Bảng 9. Độ lặp lại thời gian lưu của các phthalate.

Bơm lần Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Trung

PAEs % RSD
1 (phút) (phút) (phút) (phút) (phút) bình
DMP 6,78 6,79 6,78 6,60 6,56 6,70 1,68
DEP 8,39 8,39 8,39 8,19 8,14 8,3 1,50
DPP 10,36 10,35 10,36 10,14 10,08 10,26 1,33
DiBP 11,31 11,31 11,31 11,10 11,03 11,21 1,22
DBP 12,24 12,24 12,24 12,03 11,96 12,14 1,12

42
 DnHP 15,67 15,66 15,67 15,45 15,37 15,56 0,92
BzBP 15,77 15,76 15,77 15,56 15,49 15,67 0,86
DCHP 17,16 17,15 17,16 16,96 16,86 17,08 0,75
DEHP 17,28 17,27 17,28 17,06 16,98 17,17 0,84
DnOP 18,68 18,67 18,68 18,22 18,38 18,53 1,15

Kết quả ở bảng trên cho thấy % RSD thời gian lưu trung bình của các lần lặp lại
đều dưới 5% phù hợp với tiêu chuẩn được quốc tế công nhận (thấp hơn tiêu chuẩn của
US – EPA là 15%). Vậy thiết bị phân tích có độ ổn định cao, phù hợp để xác định 10
PAEs trong nghiên cứu này.

3.3. Đƣờng chuẩn hỗn hợp xác định 10 phthalate.

Dung dịch dựng đường chuẩn được pha từ các dung dịch chuẩn gốc. Các dung
dịch được pha loãng sử dụng pipetman, định mức 1mL bằng n - hexan thành dãy nồng
độ 0,1; 1,0; 5,0; 10,0; 20,0; 50,0 và 100,0 µg/kg. Mỗi dung dịch được bơm trên hệ sắc
ký 3 lần, diện tích pic trung bình thu được sẽ là số liệu để dựng đường chuẩn sự phụ
thuộc của diện tích pic vào nồng độ.

Bảng 10. Phương trình đường chuẩn của 10 chất chuẩn phthalate và 3 nội chuẩn d4

PAEs Phương trình đường chuẩn Hệ số R2

DMP Y = 6,495e5X –2,982e4 0,998(0)

DMP – d4 Y = 4,468e4X +6,377e4 0,996(6)

DEP Y = 6,647e5X –3,653e4 0,998(5)

DPP Y = 7,824e5X +3,561e3 0,999(1)

DiBP Y = 6,946e5X -4,626e4 0,998(6)

DiBP – d4 Y = 7,328e4X +1,291e4=5 0,999(7)

43
 DBP Y = 8,467e5X +2,875e5 0,998(7)

DnHP Y = 5,295e5X -1,327e5 0,996(3)

BzBP Y = 2,664e5X - 6,089e4 0,995(5)

DCHP Y = 8,918e5X – 1,981e5 0,995(6)

DEHP Y = 3,559e5X +3,353e5 0,995(9)

DEHP – d4 Y = 6,644e4X +1,816e5 0,998(2)

DnOP Y = 3,929e3X – 3,626e2 0,996(0)

Kết quả đường chuẩn với hệ số tương quan R2 > 0,995(0) cho thấy có sự phụ
thuộc tuyến tính của diện tích peak vào nồng độ của 10 PAEs trong khoảng nồng độ từ
0,1 – 100,0 µg/kg.

3.4. Tối ƣu hóa phƣơng pháp xử lý mẫu

Quy hoạch thực nghiệm và kết quả thực nghiệm được trình bày ở bảng 11. Dựa
vào kết quả bảng 11, sử dụng phương pháp bình phương nhỏ nhất để xác định các hệ
số hồi quy và đánh giá sự ảnh hưởng của các biến đến hàm mục tiêu.

Bảng 11. Kết quả thực nghiệm và dự đoán mô hình

Tỉ lệ V (dung Nồng độ Thời gian % H thực % H mô hình

STT
môi)/V(mẫu) NaCl (%) chiết (phút) nghiệm(%) (%)
N1 5,0 8,0 5,0 70,1 68,2
N2 7,0 8,0 5,0 76,3 76,9
N3 5,0 12,0 5,0 75,7 71,8
N4 7,0 12,0 5,0 82,1 80,6
N5 5,0 8,0 15,0 80,7 81,2
N6 7,0 8,0 15,0 89,1 90,0

44
N7 5,0 12,0 15,0 84,5 84,9
N8 7,0 12,0 15,0 90,1 93,6
N9 4,3 10,0 10,0 73,4 76,1
N10 7,7 10,0 10,0 93,1 90,8
N11 6,0 6,6 10,0 85,1 84,8
N12 6,0 13,4 10,0 90,1 90,8
N13 6,0 10,0 1,6 58,8 62,6
N14 6,0 10,0 18,4 87,8 84,5
N15 6,0 10,0 10,0 93,1 92,9
N16 6,0 10,0 10,0 92,7 92,9
N17 6,0 10,0 10,0 94,5 92,9
N18 6,0 10,0 10,0 90,2 92,9
N19 6,0 10,0 10,0 94,6 92,9
N20 6,0 10,0 10,0 92,4 92,9

Hình 6. Sự phù hợp của hiệu suất thu hồi theo mô hình và thực nghiệm

45
3.4.1. Hồi quy và phân tích phương sai
Sau khi loại trừ các tương tác không có ý nghĩa (P > 0,05), kết quả phân tích hồi
quy được trình bày ở bảng 12 cho thấy các biến tỉ lệ thể tích dung môi/mẫu và thời
gian chiết rất có ý nghĩa về mặt thống kê (P << 0,05). Ngoài sự ảnh hưởng của từng
yếu tố đến hàm mục tiêu là hiệu suất thu hồi PAEs thì sự tương tác giữa chúng cũng có
ý nghĩa về mặt thống kê. Sau khi loại bỏ các hệ số không có ý nghĩa, hàm mục tiêu Y
thu được là:
Y = 92,904 + 4,374X1 + 1,802X2+ 6,515X3 – 3,335 X12 – 1,797X22 – 6,852X32.

Các giá trị dự đoán của mô hình rất phù hợp với thực nghiệm (R2 = 0,951; R2
adj. =0,928). Tính phù hợp của mô hình còn được thể hiện ở giá trị P và kiểm tra bằng
chuẩn Fisher trong phân tích phương sai (ANOVA) (bảng 13). Giá trị P (hồi quy) =
0,000 (< 0,05) và P(tính không phù hợp) = 0,092 (> 0,005) chứng tỏ mô hình phù hợp
với thực nghiệm. Ftính = 3,591 (< F(0,95; 8, 5) = 6,041) cũng cho kết quả phù hợp.

Bảng 12. Kết quả phân tích hồi quy

Sai số Khoảng tin cậy

Hiệu suất thu hồi Hệ số P
chuẩn (± %)

Hằng số 92,904 1,051 1,849e-19 2,270

V (dung môi)/V(mẫu) 4,374 0,697 2,856e-05 1,506

Nồng độ NaCl 1,802 0,697 0,023 1,506

Thời gian chiết 6,515 0,697 3,916e-07 1,506

X1*X1 -3,335 0,678 2,820e-5 1,466

X2*X3 -1,797 0,678 0,020 1,465

X3*X3 -6,852 0,678 1,603e-07 1,466

N = 20 Q2 =0,808 F tính =3,591

46
 DF = 13 R2 =0,951 RSD =2,576

R2 adj. =0,928 Độ tin cậy =0,95%

Bảng 13. Phân tích phương sai ANOVA

Hiệu suất Bậc tự Tổng bình Trung bình Chuẩn p Độ lệch

thu hồi do phương bình phương Fisher chuẩn

Tổng 20 145312,0 7265,59

Hằng số 1 143550,0 143550,0

Tổng đúng 19 1762,17 92,746 9,630

Hồi quy 6 1675,92 279,32 42,099 0,000 16,713

Phần dư 13 86,253 6,635 2,575

Tính không 8 73,185 9,148 3,500 0,092 3,025

phù hợp

Lỗi lặp lại 5 13,068 2,614 1,617

3.4.2. Mặt đáp ứng ba chiều và các yếu tố ảnh hưởng

Mặt đáp ứng không gian 3 chiều và % ảnh hưởng của từng yếu tố đến hiệu suất
thu hồi phtalate được thể hiện ở hình 7. Mặt đáp ứng không gian 3 chiều thể hiện sự
ảnh hưởng, tương tác của 2 yếu tố đến hàm mục tiêu, hình a thể hiện sự ảnh hưởng kết
hợp của tỷ lệ dung môi/mẫu và nồng độ NaCl, hình b cho thấy ảnh hưởng của nồng độ
NaCl và thời gian chiết, tương tác của của tỷ lệ dung môi/mẫu và thời gian chiết được
chỉ ra ở hình c. Nhìn chung, khi tăng giá trị của các biến thì hiệu suất quá trình chiết
phtalate tăng và cuối cùng đạt đến trạng thái cân bằng.

47
a. b.

c. d.
Hình 7. Mô hình tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết phthalate

Phần trăm ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất chiết được thể hiện ở hình d.
Kết quá cho thấy, sự ảnh hưởng của thời gian chiết là lớn nhất (57,2%), kế tiếp là tỉ lệ
V dung môi/V mẫu (27,8%) và cuối cùng là nồng độ NaCl (15,0%).
Việc sử dụng RSM ngoài mục đích là đánh giá sự ảnh hưởng của các biến độc
lập và sự tương tác của chúng đến hàm mục tiêu, bên cạnh đó là tìm ra điều kiện tối
ưu cho quá trình xử lý mẫu. Kết quả được chỉ ra ở bảng 14. Thực hiện thí nghiệm tại
điều kiện tối ưu, kết quả hiệu suất thu được là 91,1% (nằm trong khoảng tin cậy 95%
của hiệu suất dự đoán). Điều này chứng tỏ mô hình có ý nghĩa rất cao, cho phép dự
đoán kết quả thực nghiệm tốt.

48
 Bảng 14. Tối ưu hóa điều kiện chiết phtalate

T lệ Thời gian % độ thu hồi

Số lần Dung Phƣơng pháp
Vdung C%NaCl chiết Dự Thực
chiết môi làm giàu mẫu
môi/Vmẫu (ph t) đoán nghiệm

Cô quay kết
N-
6.5 2 10 hợp thổi khô 12 - 14 90,7 91,1
hexan
bằng N2

3.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp
Tiến hành xác định giá trị MDL, MQL bằng cách: thêm chuẩn mix 10 PAEs ở
các nồng độ giảm dần vào mẫu thực, tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã tối ưu và
phân tích trên hệ GC - MS/MS. Kết quả MDL, MQL được trình bày ở bảng 15.
Bảng 15. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của 10 PAEs (µg/kg)

PAEs MDL MQL PAEs MDL MQL

DMP 0,05 0,15 DnHP 0,02 0,06

DEP 0,01 0,03 BzBP 0,02 0,06

DPP 0,02 0,06 DCHP 0,01 0,03

DiBP 0,01 0,03 DEHP 0,01 0,03

DBP 0,01 0,03 DnOP 0,02 0,06

So sánh với các giá trị MDL được công bố trong các nghiên cứu dùng detector
MS, detector FID hay detector UV/VIS (MDL = 0,02 - 0,80 µg/kg) cho thấy giới hạn
phát hiện (MDL = 0,01 – 0,05 µg/kg) và định lượng (MQL = 0,03 – 0,15 µg/kg) của
phương pháp trong nghiên cứu này rất nhỏ, chứng tỏ phương pháp có độ nhạy rất tốt,
cho phép phân tích 10 PAEs lượng siêu vết trong nền mẫu phức tạp như dầu ăn.

49
3.6. Đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp
Độ lặp lại của quá trình xử lý mẫu được thực hiện bằng cách xử lý 3 mẫu dầu
ăn đồng thời theo quy trình trong 3 ngày liên tiếp. Kết quả (bảng 16) cho thấy % RSD
< 5% vậy phương pháp phù hợp để xác định 10 phthalate.
Bảng 16. Kết quả tính độ lặp lại của phương pháp

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

PAEs % RSD
(µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg)

DMP 2,570 2,424 2,104 2,366 0,195

DEP 0,287 0,201 0,346 0,278 0,060

DPP 2,671 2,498 2,740 2,636 0,102

DiBP 2,357 2,127 2,249 2,244 0,094

DBP 0,931 0,884 0,786 0,867 0,060

DnHP 1,334 1,381 1,574 1,430 0,104

BzBP 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

DCHP 3,207 3,337 2,826 3,123 0,217

DEHP 2,350 2,546 2,481 2,459 0,082

DnOP 0,317 0,312 0,263 0,297 0,024

3.7. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp
Hiệu suất thu hồi của phương pháp xử lý mẫu là một trong những đại lượng
quan trọng để đánh giá hiệu quả của phương pháp. Nó cho biết lượng chất bị mất đi
trong quá trình phá mẫu. Đánh giá hiệu suất thu hồi là đánh giá độ tin cậy của phương
pháp xử lý mẫu đã chọn.
PAEs có mặt ở mọi mẫu phân tích, do vậy chúng tôi tiến hành phân tích mẫu
được dự đoán có hàm lượng PAEs thấp nhất, sau đó trừ nền và xác định độ thu hồi.

50
Mẫu được chọn là mẫu dầu oliu, thêm nội chuẩn (d4 - DMP, d4 - DiBP và d4 - DEHP)
ở 3 mức 2, 4 và 5µg/kg. Kết quả độ thu hồi trung bình thể hiện ở hình 8.

Bảng 17. Hiệu suất thu hồi với 3 mức thêm nội chuẩn

Hiệu suất thu hồi (%) Hiệu suất thu hồi

Nội chuẩn
2ppb 4ppb 5ppb trung bình (%)

d4 - DMP 95,7 88,9 85,2 89,9 ± 5,16

d4 - DiBP 98,0 79,7 76,9 84,9 ± 11,17

d4 - DEHP 90,5 105,7 82,8 93,0 ± 11,34

Hình 8. Hiệu suất thu hồi trung bình (%) của 3 d4 - PAEs.

Độ thu hồi PAEs tính theo phương pháp nội chuẩn cho kết quả trong khoảng
79% - 106%, phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế AOAC 2007.01 (H% = 70 – 120%). So
sánh với một số nghiên cứu khác ở cùng nền mẫu dầu thực vật như xác định 6 PAEs
[24] hay 2 PAEs [44] có độ thu hồi từ 87 – 112% (RSD < 15%). Với kết quả độ thu
hồi trung bình > 80%, RSD < 12% chứng tỏ phương pháp GC – MS/MS phù hợp để
định lượng PAEs.

51
3.8. Phân tích mẫu thực tế
Ba nhóm dầu ăn phổ biến trên thị trường được thu thập, xử lý và xác định đồng
thời 10 PAEs bằng phương pháp GC - MS/MS. Kết quả phân tích hàm lượng 10
phthalate được trình bày ở bảng 19 và hình 9, 10.
Bảng 18. Thông tin mẫu phân tích phthalate

STT Loại mẫu (số lượng) Kí hiệu Vật liệu chứa

1 Dầu thực vật hỗn hợp (9) VT Nhựa

2 Dầu nành (10) NT Nhựa

3 Dầu oliu (9) OL Thủy tinh

Bảng 19. Kết quả phân tích PAEs trong3 nhóm dầu thực vật (µg/kg)

Nhóm dầu
OL NT VT Tổng (µg/kg)
PAEs

DMP 0,280 0,834 3,494 4,607

DEP 0,253 0,686 3,548 4,487

DPP 0,913 0,537 3,581 5,031

DiBP 0,455 0,641 3,565 4,661

DBP 0,340 0,580 3,429 4,349

DnHP 0,344 0,957 3,465 4,766

BzBP 0,253 1,010 3,857 5,120

DCHP 0,562 1,266 3,695 5,523

DEHP 0,597 4,158 3,552 8,307

DnOP 0,654 1,683 1,773 4,110

Tổng 10 PAEs (µg/kg) 3,462 6,932 23,429

52
 Hình 9. Hàm lượng 10 PAEs trong 3 nhóm dầu thực vật
Tổng hàm lượng 10 PAEs ở 3 nhóm mẫu từ 4,652 - 33,959 µg/kg. Hàm lượng
PAEs trong dầu oliu thấp nhất (0,253 - 0,913 µg/kg, trung bình 0,465µg/kg), tiếp đến
nhóm dầu nành (0,537 - 4,158 µg/kg, trung bình 1,235µg/kg) và cao nhất ở nhóm dầu
hỗn hợp (1,773 - 3,857µg/kg, trung bình 3,396µg/kg). Trong nghiên cứu của tác giả
Shi và cộng sự (2015), với cùng vật liệu chứa là nhựa PET cho thấy tổng PAEs ở dầu
oliu và dầu nành tương đương nhau [27, 28]. Do vậy sự chênh lệch tổng hàm lượng
PAEs trong nghiên cứu này có thể xuất phát từ nguồn bao bì chứa mẫu: vật liệu làm
bao bì là nhựa (nhựa PET - 01) có sự thôi nhiễm PAEs ra nền mẫu [23], trong khi bao
bì vật liệu là thủy tinh hầu như không có [23, 40]. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu
của nhóm tác giả Sungur công bố năm 2015 [28] về ảnh hưởng của các loại dầu và vật
liệu chứa (nhôm, thủy tinh, nhựa PET) đến sự thôi nhiễm của PAEs. Ngoài ra, PAEs
trong dầu thực vật có thể xuất phát từ nhiều nguồn như môi trường, khâu đóng gói hay
vận chuyển.
Cùng loại vật liệu chứa là nhựa nhưng nhóm dầu thực vật tổng hợp có hàm
lượng PAEs trung bình cao hơn 2,7 lần so với nhóm dầu đậu nành. Tại Việt Nam, dầu
thực vật trên thị trường là hỗn hợp dầu cọ, dầu bắp, dầu nành và dầu hoa hướng
dương. Việc bảo quản, pha trộn và đóng gói mất nhiều công đoạn hơn so với quá

53
trình sản xuất đơn lẻ một loại dầu đậu nành. Vì thế, lượng PAEs trong hỗn hợp dầu
cũng sẽ cao hơn.

Hình 10. Tỉ lệ giữa nhóm (DEP, DEHP, DBP) và 7 PAEs còn lại
Tỷ lệ hàm lượng của nhóm PAEs phổ biến nhất (DEP, DEHP và DBP) so với 7
PAEs còn lại cũng là một thông số cần quan tâm. DEHP, DEP và DBP được quan tâm
hơn các phthalate khác vì lý do độc tính của chúng đến sức khỏe. Nhiều nghiên cứu đã
xác định 3 PAEs này trên nhiều nền mẫu: nước, sữa, thực phẩm béo, bao bì, không
khí, trầm tích,... Phân tích 3 nhóm dầu thực vật cho thấy nhóm mẫu đựng trong chai
nhựa có tổng (DEP + DBP + DEHP), cao hơn nhiều so với nhóm mẫu đựng trong chai
thủy tinh. Điều này chứng minh việc thôi nhiễm PAEs ở dầu ăn có liên quan đến vật
liệu chứa.
DEHP là một trong số các phthalate phổ biến nhất, cũng là một phthalate có độc
tính cao nhất. DEHP đã được phát hiện trong nhiều loại dầu thực vật như dầu nành,
dầu lạc, dầu vừng, dầu oliu, dầu hành nhân,… ở lượng vết hoặc siêu vết [1, 44, 46]
Phân tích 3 nhóm mẫu dầu thực vật cho thấy hàm lượng DEHP từ 0,597 - 4,158µg/kg.
Hàm lượng này thấp hơn giới hạn cho phép theo quyết định 2204/QĐ - B T năm
2011 về mức giới hạn nhiễm chéo DEHP trong thực phẩm.

54
 KẾT LUẬN
Trong luận văn này, chúng tôi đã thu được các kết quả như sau:
 Đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời 10 phthalate: DMP, DEP, DPP, DBP,
DiBP, DCHP, BzBP, DnHP, DEHP và DnOP trong mẫu dầu thực vật bằng phương
pháp sắc kí khí ghép nối 2 lần khối phổ.
 Điều kiện GC – MS/MS như sau: pha tĩnh là cột sắc ký mao quản hợp nhất
silica không phân cực, chương trình nhiệt tối ưu cho phân tích PAEs; chế độ
tiêm mẫu không chia dòng trong 1phút; khí mang Heli; nhiệt độ bộ phận kết
nối sắc ký khí và khối phổ: 3100C, thể tích tiêm mẫu 1 μL; kỹ thuật ion hóa
bắn phá điện tử EI 70 eV. Thời gian lấy tín hiệu: 0 – 20 phút.
 Quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng lỏng với dung môi n -
hexan, tỉ lệ thể tích dung môi/mẫu = 6, số lần chiết = 2, thời gian chiết 10
phút sử dụng dung dịch NaCl 10% để phá nhũ tương và giai đoạn làm giàu
mẫu bằng cô quay chân không + thổi khô bằng khí N2.
 Đánh giá phương pháp: giới hạn phát hiện (MDL) 0,01 – 0,05 µg/kg, giới
hạn định lượng (MQL): 0,03 - 0,15 µg/kg, độ thu hồi trung bình > 80% (với
% RSD < 12%); độ lặp có % RSD < 5% chứng tỏ phương pháp có độ nhạy
và độ chính xác tốt, phù hợp để phân tích 10 PAEs trong nền mẫu dầu thực
vật.
 Xác định hàm lượng các phthalates trong dầu thực vật hỗn hợp, dầu đậu nành và
dầu oliu (n = 28). Kết quả cho thấy: tổng hàm lượng 10 PAEs ở 3 nhóm mẫu dao
động từ 4,65 - 33,96 µg/kg. Hàm lượng PAEs trong dầu oliu thấp nhất (0,25 - 0,91
µg/kg, trung bình 0,47µg/kg), tiếp đến nhóm dầu nành (0,54 - 4,16 µg/kg, trung
bình 1,24 µg/kg) và cao nhất ở nhóm dầu hỗn hợp (1,77 - 3,86 µg/kg, trung bình
3,4 µg/kg). Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu đã công bố khi xét đến lý do
sự có mặt của PAEs trong dầu thực vật xuất phát từ vật liệu chứa (chủ yếu), từ môi
trường, phương pháp bảo quản,… Hàm lượng DEHP trong các mẫu nhỏ hơn giới
hạn cho phép theo quyết định 2204/QĐ - B T năm 2011.

55
 TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Barp, Laura, et al. (2015), "Determination of phthalate esters in vegetable oils

using direct immersion solid-phase microextraction and fast gas
chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry", Analytica
Chimica Acta. 887, pp. 237-244.
2. Bell, F. P. (1982), "Effects of phthalate esters on lipid metabolism in various
tissues, cells and organelles in mammals", Environmental Health Perspectives.
45, pp. 41-50.
3. Blount, B. C., et al. (2000), "Levels of seven urinary phthalate metabolites in a
human reference population", Environmental Health Perspectives. 108(10), pp.
979-982.
4. Bornehag, Carl-Gustaf, et al. (2015), "Prenatal Phthalate Exposures and
Anogenital Distance in Swedish Boys", Environmental Health Perspectives.
123(1), pp. 101-107.
5. Bornehag, Carl-Gustaf, et al. (2004), "The Association between Asthma and
Allergic Symptoms in Children and Phthalates in House Dust: A Nested Case–
Control Study", Environmental Health Perspectives. 112(14), pp. 1393-1397.
6. Botelho, Giuliana G. K., et al. (2009), "Reproductive Effects of Di(2-
ethylhexyl)phthalate in Immature Male Rats and Its Relation to Cholesterol,
Testosterone, and Thyroxin Levels", Archives of Environmental Contamination
and Toxicology. 57(4), pp. 777-784.
7. Chou, Karen and Wright, Robert O. (2006), "Phthalates in food and medical
devices", Journal of Medical Toxicology. 2(3), pp. 126-135.
8. Culty, Martine, et al. (2008), "In Utero Exposure to Di-(2-ethylhexyl) Phthalate
Exerts Both Short-Term and Long-Lasting Suppressive Effects on Testosterone
Production in the Rat1", Biology of Reproduction. 78(6), pp. 1018-1028.
9. Duty, Susan M., et al. (2003), "The relationship between environmental
exposures to phthalates and DNA damage in human sperm using the neutral
comet assay", Environmental Health Perspectives. 111(9), pp. 1164-1169.
10. Ema, M., Amano, H., and Ogawa, Y. (1994), "Characterization of the
developmental toxicity of di-n-butyl phthalate in rats", Toxicology. 86(3), pp.
163-74.
11. Fan, Yingying, et al. (2017), "Analysis of phthalate esters in dairy products—a
brief review", Analytical Methods. 9(3), pp. 370-380.
12. Foster, Melanie, et al. (2009), Reproductive Toxicity and Pharmacokinetics of
di-n-butyl Phthalate (DBP) Following Dietary Exposure of Pregnant Rats, Vol.
86, 345-54.

56
13. Gray, Jr L. Earl, et al. (2000), "Perinatal Exposure to the Phthalates DEHP,
BBP, and DINP, but Not DEP, DMP, or DOTP, Alters Sexual Differentiation
of the Male Rat", Toxicological Sciences. 58(2), pp. 350-365.
14. Guo, Ying, et al. (2011), "Occurrence of Phthalate Metabolites in Human Urine
from Several Asian Countries", Environmental Science & Technology. 45(7),
pp. 3138-3144.
15. Guo, Ying, Wang, Lei, and Kannan, Kurunthachalam (2013), Phthalates and
Parabens in Personal Care Products From China: Concentrations and Human
Exposure, Vol. 66.
16. Holadová, K. and Hajšlová, J. (1995), "A Comparison of Different Ways of
Sample Preparation for the Determination of Phthalic Acid Esters in Water and
Plant Matrices", International Journal of Environmental Analytical Chemistry.
59(1), pp. 43-57.
17. Huang, Po-Chin, et al. (2009), "Association between prenatal exposure to
phthalates and the health of newborns", Environ Int. 35(1), pp. 14-20.
18. Klaunig, James E., et al. (2003), "PPARα Agonist-Induced Rodent Tumors:
Modes of Action and Human Relevance", Critical Reviews in Toxicology.
33(6), pp. 655-780.
19. Knauer (2011), "Determination of Phthalates", Applications Journal, p. 32.
20. Mortensen, Gerda K., et al. (2005), "Determination of phthalate monoesters in
human milk, consumer milk, and infant formula by tandem mass spectrometry
(LC–MS–MS)", Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382(4), pp. 1084-
1092.
21. Nazir, Sadia, et al. (2018), "Women Diagnosed with Endometriosis Show High
Serum Levels of Diethyl Hexyl Phthalate", Journal of human reproductive
sciences. 11(2), pp. 131-136.
22. Orsi, D. De, et al. (2006), "A environmentally friendly reversed-phase liquid
chromatography method for phthalates determination in nail cosmetics",
Analytica Chimica Acta. 555(2), pp. 238-241.
23. Rastkari, Noushin, et al. (2017), "The Effect of Storage Time, Temperature and
Type of Packaging on the Release of Phthalate Esters into Packed
Acidic
Liquids", Food Technology and Biotechnology. 55(4), pp. 562-569.
24. Rios, J. J., Morales, A., and Márquez-Ruiz, G. (2010), "Headspace solid-phase
microextraction of oil matrices heated at high temperature and phthalate esters
determination by gas chromatography multistage mass spectrometry", Talanta.
80(5), pp. 2076-2082.
25. Russo, Mario Vincenzo (2015), "Extraction and GC-MS analysis of phthalate
esters in food matrices: a review", Royal Society of chemistry. 5.

57
26. Sathyanarayana, S. (2008), "Phthalates and children's health", Curr Probl
Pediatr Adolesc Health Care. 38(2), pp. 34-49.
27. Shi, Long-Kai, Zhang, Ming-Ming, and Liu, Yu-Lan (2016), Concentration and
survey of phthalic acid esters in edible vegetable oils and oilseeds by gas
chromatography-mass spectrometry in China, Vol. 68.
28. Sungur, Sana, et al. (2015), "Migrated phthalate levels into edible oils", Food
Additives & Contaminants: Part B. 8(3), pp. 190-194.
29. Swaen, Gerard M. H. and Otter, Rainer (2016), "Letter to the Editor: Phthalates
and Endometriosis", The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism.
101(11), pp. L108-L109.
30. Swan, Shanna H., et al. (2005), "Decrease in anogenital distance among male
infants with prenatal phthalate exposure", Environmental Health Perspectives.
113(8), pp. 1056-1061.
31. Upson, Kristen, et al. (2013), "Phthalates and risk of endometriosis",
Environmental Research. 126, pp. 91-97.
32. van Wezel, A. P., et al. (2000), "Environmental Risk Limits for Two Phthalates,
with Special Emphasis on Endocrine Disruptive Properties", Ecotoxicology and
Environmental Safety. 46(3), pp. 305-321.
33. Wenzl, Thomas (2009), "Methods for the determination of phthalates in food",
Outcome of a survey conducted among European food control laboratories.

34. Wormuth, M., et al. (2006), "What are the sources of exposure to eight
frequently used phthalic acid esters in Europeans?", Risk Anal. 26(3), pp. 803-
24.
35. Yadav, Sapna, et al. (2017), "Determination of pesticide and phthalate residues
in tea by QuEChERS method and their fate in processing", Environmental
Science and Pollution Research. 24(3), pp. 3074-3083.
36. Yan, Hongyuan, Cheng, Xiaoling, and Liu, Baomi (2011), "Simultaneous
determination of six phthalate esters in bottled milks using ultrasound-assisted
dispersive liquid–liquid microextraction coupled with gas chromatography",
Journal of Chromatography B. 879(25), pp. 2507-2512.
37. Yen, Tzung-Hai, Lin-Tan, Dan-Tzu, and Lin, Ja-Liang (2011), "Food safety
involving ingestion of foods and beverages prepared with phthalate-plasticizer-
containing clouding agents", Journal of the Formosan Medical Association.
110(11), pp. 671-684.
38. Yin, Peng, et al. (2014), "Determination of 16 phthalate esters in tea samples
using a modified QuEChERS sample preparation method combined with GC-
MS/MS", Food Additives & Contaminants: Part A. 31(8), pp. 1406-1413.

58
39. Zaater, Mohammed, Tahboub, Yahya, and N Al Sayyed, Ayman (2013),
Determination of Phthalates in Jordanian Bottled Water using GC-MS and
HPLC-UV: Environmental Study, Vol. 52.
40. Zare Jeddi, Maryam, et al. (2015), Concentrations of phthalates in bottled
water under common storage conditions: Do they pose a health risk to
children?, Vol. 69, 256-265.
41. G, Latini, Verrotti A Fau - De Felice, Claudio, and C, De Felice (2004), "- DI-
2-ethylhexyl phthalate and endocrine disruption: a review", Curr Drug Targets
Immune Endocr Metabol Disord. 4(1), pp. 37-40.
42. JM, Peters, Cheung C Fau - Gonzalez, Frank J., and FJ, Gonzalez (2005), "-
Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha and liver cancer: where do we
stand?", J Mol Med. 83(10), pp. 774-85.
43. Zheng, X., et al. (2012), "Determination of 23 phthalate esters in food by solid-
phase extraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry", Se Pu.
30(1), pp. 27-32.
44. Amanzadeh, H., et al. (2016), "Determination of phthalate esters in drinking
water and edible vegetable oil samples by headspace solid phase
microextraction using graphene/polyvinylchloride nanocomposite coated fiber
coupled to gas chromatography-flame ionization detector", J Chromatogr A.
1465, pp. 38-46.
45. Castle, L., Gilbert, J., and Eklund, T. (1990), "Migration of plasticizer from
poly(vinyl chloride) milk tubing", Food Addit Contam. 7(5), pp. 591-6.
46. Cavaliere, B., et al. (2008), "Tandem mass spectrometry in food safety
assessment: the determination of phthalates in oliu oil", J Chromatogr A.
1205(1-2), pp. 137-43.
47. Doull, J., et al. (1999), "A cancer risk assessment of di(2-ethylhexyl)phthalate:
application of the new U.S. EPA Risk Assessment Guidelines", Regul Toxicol
Pharmacol. 29(3), pp. 327-57.
48. Foster, P. M., Cattley, R. C., and Mylchreest, E. (2000), "Effects of di-n-butyl
phthalate (DBP) on male reproductive development in the rat: implications for
human risk assessment", Food Chem Toxicol. 38(1 Suppl), pp. S97-9.
49. Heudorf, U., Mersch-Sundermann, V., and Angerer, J. (2007), "Phthalates:
toxicology and exposure", Int J Hyg Environ Health. 210(5), pp. 623-34.
50. Koo, H. J. and Lee, B. M. (2004), "Estimated exposure to phthalates in
cosmetics and risk assessment", J Toxicol Environ Health A. 67(23-24), pp.
1901-14.
51. Lehmann, K. P., et al. (2004), "Dose-dependent alterations in gene expression
and testosterone synthesis in the fetal testes of male rats exposed to di (n-butyl)
phthalate", Toxicol Sci. 81(1), pp. 60-8.

59
52. Page, B. D. and Lacroix, G. M. (1995), "The occurrence of phthalate ester and
di-2-ethylhexyl adipate plasticizers in Canadian packaging and food sampled in
1985-1989: a survey", Food Addit Contam. 12(1), pp. 129-51.
53. Petersen, J. H. (1991), "Survey of di-(2-ethylhexyl)phthalate plasticizer
contamination of retail Danish milks", Food Addit Contam. 8(6), pp. 701-5.
54. Schettler, T. (2006), "Human exposure to phthalates via consumer products",
Int J Androl. 29(1), pp. 134-9; discussion 181-5.
55. Shen, H. Y., et al. (2007), "Simultaneous determination of seven phthalates and
four parabens in cosmetic products using HPLC-DAD and GC-MS methods", J
Sep Sci. 30(1), pp. 48-54.
56. Skinner, M. K. (2016), "Endocrine disruptors in 2015: Epigenetic
transgenerational inheritance", Nat Rev Endocrinol. 12(2), pp. 68-70.
57. Startin, J. R., et al. (1987), "Migration from plasticized films into foods. 1.
Migration of di-(2-ethylhexyl)adipate from PVC films during home-use and
microwave cooking", Food Addit Contam. 4(4), pp. 385-98.
58. Tsumura, Y., et al. (2001), "Eleven phthalate esters and di(2-ethylhexyl) adipate
in one-week duplicate diet samples obtained from hospitals and their estimated
daily intake", Food Addit Contam. 18(5), pp. 449-60.

60
 PHỤ LỤC
1. Đường chuẩn 10 phthalate trong nghiên cứu

61
2. Đường chuẩn 3 chất nội chuẩn phthalate

3. Phân mảnh PAEs trong hệ GC- MS/MS

62
63
64
4. Sắc ký đồ một số mẫu dầu ăn xác định 10 PAEs
a. Mẫu dầu oliu

b. Mẫu dầu hỗn hợp

65
4.3. Mẫu dầu nành

4.4. Xác định DEHP thông qua ion định lượng và ion xác nhận.

66
5. Quy định Châu Âu 2002/657/EC về tỉ lệ cường độ ion xác nhận so với ion định
lượng với từng phương pháp phân tích.

Tỉ lệ cường độ CI – GC – MS, GC – MSn,

EI – GC – MS
ion (%) LC – MS, LC – MSn,
>50% ± 10% ± 20%
> 20% - 50% ± 15% ± 25%
> 10% - 20% ± 20% ± 30%
< = 10% ± 50% ± 50%

6. So sánh giữa các hệ thống sắc ký khí ghép nối detector khối phổ

Các thông số cần Hệ GC – MS Hệ GC – MS bẫy Hệ GC – MS/MS

quan tâm (single quad) ion (ion trap)

Độ chọn lọc √ √√ √√√

Độ nhạy √√√ √√ √√√

Phân tích đa mục

√√√ √√ √√√
tiêu

Dễ sử dụng √√√ √√ √√

Chất lượng quét

√√√ √√ √
phổ toàn dải

Độ linh hoạt khi

√√ √√√ √√
phân tích

Giá thành thiết bị √ √ √√√

7. Tiêu chuẩn RoHS2

RoHS2: là chỉ thị 2011/65/EU được thông qua vào ngày 21/7/2011. Chỉ thị này
là bản sửa đổi của Chỉ thị Hạn chế các chất độc hại trong các thiết bị điện và điện tử
(RoHS 1). Giới hạn 4 Phthalates và ngày hiệu lực:

67
Chất bị Giới hạn Danh mục sản phẩm Ngày hiệu
hạn chế lực

DEHP 0,1% khối Đồ gia dụng lớn 22/07/2019

lượng
trong vật Đồ gia dụng nhỏ
liệu đồng
nhất Thiết bị CNTT và viễn thông

DBP Thiết bị tiêu dùng

Thiết bị chiếu sáng

Dụng cụ điện và điện tử

BBP Đồ chơi, thiết bị giải trí và thể thao

Thiết bị y tế 22/07/2021

Công cụ giám sát công nghiệp

DIBP Thiết bị phân phối tự động 22/07/2019

Các thiết bị khác không nằm trong danh

mục trên

68
 MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 0
Chương 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3
1.1. Giới thiệu về các phthalate ................................................................................ 3
1.1.1. Cấu trúc, phân loại các phthalate ................................................................ 3
1.1.2. Tính chất lý hóa của các phthalate .............................................................. 3
1.1.3. Ứng dụng của các phthalate và nguồn gốc phát tán vào thực phẩm. ............ 5
1.1.4. Độc tính của các phthalate .......................................................................... 9
1.2. Mục tiêu nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu ................................................. 12
1.3. Các phương pháp xác định phthalates ............................................................. 13
1.3.1. Xử lý mẫu trong phân tích phthalates ....................................................... 14
1.3.2. Phương pháp phân tích phthalates trên hệ sắc ký ...................................... 15
Chương 2. THỰC NGHIỆM ...................................................................................... 28
2.1. Đối tượng nghiên cứu...................................................................................... 28
2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 28
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 28
2.3.1. Thiết bị sắc kí khí ghép nối hai lần khối phổ (GC - MS/MS) .................... 28
2.3.2. Chất chuẩn, chuẩn trung gian và dung dịch chuẩn làm việc. ..................... 29
2.3.4. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm ..................................................................... 30
2.4. Định lượng phthalates trên nền mẫu dầu thực vật bằng GC - MS/MS .............. 30
2.4.1. Xác định các thông số kỹ thuật cho hệ thống GC - MS/MS ...................... 30
2.4.2. Thông số kỹ thuật ban đầu cho hệ thống GC ............................................ 31
2.4.3. Thông số kỹ thuật ban đầu cho hệ thống MS ............................................ 31
2.4.4. Xử lý nhiễm bẩn trong quá trình phân tích phthalate ................................ 32
2.4.5. Quy trình khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn .............. 34
2.4.6. Tối ưu hóa phương pháp xử lý mẫu .......................................................... 34
2.4.7. Đánh giá phương pháp phân tích .............................................................. 38
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 41
3.1. Kết quả nghiên cứu trên thiết bị ...................................................................... 41
3.2. Đánh giá độ lặp của thiết bị ............................................................................. 42

69
 3.3. Đường chuẩn các phthalate. ............................................................................ 43
3.4. Tối ưu hóa phương pháp xử lý mẫu ................................................................. 44
3.4.1. Hồi quy và phân tích phương sai .............................................................. 46
3.4.2. Mặt đáp ứng ba chiều và các yếu tố ảnh hưởng ........................................ 47
3.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp ........................... 49
3.6. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp............................................................... 50
3.7. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp ................................................... 50
3.8. Phân tích mẫu thực tế ...................................................................................... 52
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................ 556
PHỤ LỤC .................................................................................................................. 61

70
 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt Tên đầy đủ
GC - MS Gas chromatography mass spectrometry: sắc ký khí ghép nối khối phổ
GC- Gas chromatography tandem mass spectrometry: sắc ký khí ghép nối
MS/MS hai lần khối phổ
HPLC High performance liquid chromatography: sắc ký lỏng hiệu năng cao
KLPT Khối lượng phân tử
MeOH Metanol
MDL Method detection limit
MQL Method quantitation limit
PAEs Các hợp chất phthalate (este axit phthalic)
ppb Part per billion: phần tỉ
PVC Polyvinyl clorua
% RSD % Relative Standard Deviation: % độ lệch chuẩn tương đối

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1. Cấu trúc hóa học chung của phthalate .........................................................3

Hình 2. Hệ thiết bị GC - MS/MS............................................................................ 29
Hình 3. Dung môi n - hexan trước khi chưng cất.................................................... 33
Hình 4. Dung môi n - hexan sau chưng cất, este hóa bằng NaOH .......................... 33
Hình 5. Sắc ký đồ hỗn hợp 10 PAEs ......................................................................42
Hình 6. Sự phù hợp của hiệu suất thu hồi theo mô hình và thực nghiệm ................ 45
Hình 7. Mô hình tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết phthalate .....48
Hình 8. Hiệu suất thu hồi trung bình (%) của 3 d4 - PAEs. .....................................51
Hình 9. Hàm lượng 10 PAEs trong 3 nhóm dầu thực vật .......................................53
Hình 10. Tỉ lệ giữa nhóm (DEP, DEHP, DBP) và 7 PAEs còn lại .......................... 54

71
 DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1. Tên gọi, cấu tạo và tính chất của một số PAEs điển hình ............................4
Bảng 2. Ứng dụng của các phthalate điển hình trong cuộc sống ...............................6
Bảng 3. Các cấp độ rủi ro do phơi nhiễm PAEs theo thống kê của Heudorf [49] ....10
Bảng 4. Một số nghiên cứu PAEs bằng sắc ký khí ghép nối detector khối phổ .......16
Bảng 5. Một số phương pháp xác định PAEs tùy theo nền mẫu ............................. 23
Bảng 6. Giá trị mã hóa các yếu tố thực nghiệm ...................................................... 35
Bảng 7. Thiết kế thí nghiệm ở các mức ..................................................................36
Bảng 8. Thời gian lưu, mảnh ion và năng lượng bắn phá (CE) của các phthalates ..41
Bảng 9. Độ lặp lại thời gian lưu của các phthalate.................................................. 42
Bảng 10. Phương trình đường chuẩn của 10 phthalate và 3 nội chuẩn .................... 43
Bảng 11. Kết quả thực nghiệm và dự đoán mô hình ............................................... 44
Bảng 12. Kết quả phân tích hồi quy .......................................................................46
Bảng 13. Phân tích phương sai ANOVA ................................................................ 47
Bảng 14. Tối ưu hóa điều kiện chiết phthalates ...................................................... 49
Bảng 15. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của 10 PAEs (µg/kg) ............. 49
Bảng 16. Kết quả tính độ lặp lại của phương pháp ................................................. 50
Bảng 17. Hiệu suất thu hồi với 3 mức thêm nội chuẩn ........................................... 51
Bảng 18. Thông tin mẫu phân tích phthalates ......................................................... 52
Bảng 19. Kết quả phân tích PAEs trong 3 nhóm dầu thực vật (µg/kg) .................... 52

72
 LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan Luận văn thạc sỹ khoa học với đề tài: ―Xác định hàm lượng
phthalates trong dầu ăn bằng phương pháp sắc kí khí ghép nối hai lần khối phổ GC -
MS/MS‖ là công trình nghiên cứu của bản thân. Các thông tin tham khảo dùng trong
luận văn được lấy từ các công trình nghiên cứu có liên quan và được nêu rõ nguồn gốc
trong danh mục tài liệu tham khảo. Các kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung
thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác.

Hà Nội, tháng 12 năm 2018

Học viên

Mai Thị Ngọc Anh

73
 LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc
gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 104.04-2017.310
Em xin chân thành cám ơn Bộ môn Hoá học Phân tích, Ban chủ nhiệm khoa
Hoá học, Ban giám hiệu trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
đã tạo mọi điều kiện thủ tục cho em hoàn thành luận văn.
Để có được Luận văn hoàn thiện ngày hôm nay, với lòng biết ơn sâu sắc, em
xin chân thành cám ơn PGS. TS. Từ Bình Minh đã tin tưởng giao đề tài, định hướng
nghiên cứu, dành thời gian hướng dẫn và tạo những điều kiện tốt nhất cho em!
Em xin chân thành cám ơn TS. Đào Hải Yến, TS. Trần Mạnh Trí đã tận tình chỉ
bảo, hướng dẫn chi tiết cho em trong khi thực hiện luận văn này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô, cán bộ, kỹ thuật viên của
Viện Hoá học đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi giúp em thực hiện Luận văn và cho
em nhiều lời khuyên giá trị.
Em cũng xin gửi lời cám ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan
tâm, giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Mặc dù có nhiều cố gắng nhưng do kiến thức còn hạn chế nên luận văn của em
khó tránh khỏi nhiều thiếu sót. Vì vậy em rất mong nhận được sự góp ý của Quý Thầy
Cô và các bạn để luận văn được hoàn thiện hơn.

Hà Nội, tháng 12 năm 2018

Mai Thị Ngọc Anh

74