BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Bài 2: Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry
Mục đích thí nghiệm
- Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry
- Phương pháp này được dùng rộng rãi để xác định nhiều loại protein khác
nhau, có độ nhạy cao, cho phép phát hiện được protein trong dung dịch ở
nồng độ nhỏ 1 g/ml.
- Dùng để xác định hàm lượng protetin trrong các loại thực phẩm để cân bằng
độ dinh dưỡng vì dụ xác định protein trong sữa ,trong thịt , trong các loại
thực phẩm khác ...
Hóa chất cần dùng:
- Thuốc thử Folin
- 0,3g đậu phụ
- Dung dịch A: dung dịch Na,CO, 2% pha trong NaOH 0, IN
- Dung dịch B: dung dịch CuSO.5H,O ( 0,5% pha trong dung dịch natri xitrat
1% hoặc pha trong dung dịch kali-natri tartrat 1% ). Dung dịch pha trong
natri xitrat sẽ bền hơn pha trong kali-natri tartrat)
- Dung dịch C: hỗn hợp của hai dung dịch A và B pha theo tỷ lệ 50:1 trước
khi dùng.
- Giấy chỉ thị pH
Nguyên tắc phương pháp lowry
- Phương pháp này chỉ có tác dụng với các protein hòa tan trong dung dịch.
- Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa protein sau khi xảy ra
phản ứng biure và thuôc thử folin. Cường độ màu của hỗn  hợp phản ứng tỷ
lệ thuận với  nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Sau khi biết được
mật độ quang của dung dịch protein nghiên cứu với thuốc thử folin, dựa vào
đường chuẩn của protein tinh khiết với thuốc thử này, có thể dễ dàng tính
được lượng protein của mẫu vật nghiên cứu.

a. Phản ứng biure 

- Giai đoạn 1: Phản ứng biure là phản ứng đặc trưng để phát hiện liên kết
peptit trong dung dịch. 
- Giai đoạn 2: Phức Cu2+ sẽ bị oxi hóa bởi axit amin có tính khử là Tyrosin
và Triptophan trong môi trường OH- để tạo phức Cu1+ màu xanh tím.
 b. Phản ứng với folin
Cu+ + Folin (W+6/Mo+6) → Cu2+ + Wx/Moy (x,y<6)   màu xanh đậm, hấp thụ
ánh sáng có bước sóng 750nm
c. Đo mật độ quang OD
Định luật Lambert-Beer: A= OD=- log(I0/I) =ɛ.L.C
Trong đó: C: nồng độ chất; L: chiều dày lớp dung dịch; ɛ: hằng số tỷ lệ.
Từ đó ta có: OD= ɛ.L.C= k.C (k=ɛ.L= const).

Phần 1: Xây dựng đường chuẩn Albumin cho phương pháp Lowry
 Dung dịch gốc protein chuẩn: Albumin huyết thanh bò (BSA): 0,5mg/ml
 Tiến hành: chuẩn bị một dãy 6 ống nghiệm sạch, hòa lần lượt các hóa chất
với lượng tương ứng theo bảng:
Dung dịch BSA gốc (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Nước cất (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Nồng độ BSA Ci (mg/ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Trộn đều bằng vortex
Dung dịch BSA làm việc Ci 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
mg/ml (ml)
Dung dịch C (ml) 5 5 5 5 5 5
Trộn đều để yên 10’
Dung dịch Folin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Trộn đều bằng Vortex, để yên 30’ rồi đo độ hấp thụ tại bước sóng 750nm với mẫu
đối sánh là mẫu Ci=0 (mg/ml).
OD750 nm 0 0.122 0.187 0.267 0.382 0.451

Hầu hết các protein đều chứa tyrosin và tryptophan, hàm lượng các axit
amin này phụ thuộc vào loại protein. Trong phương pháp lowry, các axit amin này
sau khi tạo phản ứng biure và tác dụng với thuốc thử folin sẽ tạo thành một phức
chất có màu mà cường độ màu tỉ lệ với hàm lượng tyrosin và tryptophan. Vì thế
nên đối với những loại protein khác nhau thì sẽ có cường độ màu khác nhau, tuy
nhiên thì tất cả đều sẽ đo được mật độ quang ở bước sóng 750nm → có thể dùng
bất kỳ lọai protein nào để xây dựng đường chuẩn nhưng người ta thường chọn
những loại protein tinh khiết để làm đường chuẩn. Albumin huyết thanh bò là một
loại protein tan trong nước và có độ tinh khiết lên tới 99% → giảm sai số trong quá
trình phản ứng màu biure và đo mật độ quang đối với các tạp chất trong dung dịch
protein hòa tan.
 Xây dựng đồ thị đường chuẩn:
0.5
0.45
f(x) = 0.449285714285714 x + 0.00519047619047616
0.4 R² = 0.998540874771823
0.35
OD 750nm

0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Nồng độ Protein (mg/ml)

Phần 2: Phân tích mẫu

1. Chuẩn bị dịch protein phân tích
- Dùng ống đong chuẩn bị 20 ml NaOH 0,1N vào trong cốc dung tích 100 ml
- Cân chính xác 0,3 g mẫu; chuyển mẫu vào cối, cho một ít dung dịch NaOH
0,1N từ cốc vào để làm ẩm
- Nghiền nhuyễn mẫu; chuyển toàn bộ mẫu vào bình tam giác dung tích 100
ml.
- Tráng sạch cối chày bằng dung dịch NaOH 0,1N còn lại
- Đặt bình mẫu vào nồi đun cách thuỷ để chiết protein trong 15 phút
- Lấy mẫu ra, làm nguội, trung hoà (tới pH 7) bằng HCl 0,1N (dùng đũa thủy
tinh chấm dịch lên miếng giấy thử pH và so với dải màu chuẩn).
- Chuyển mẫu sang bình định mức 100 ml, định mức bằng nước cất tới vạch.
Trộn đều.
- Lọc trong, thu dịch lọc protein phân tích.
2. Tiến hành phản ứng và đo độ hấp thụ
Mẫu thí nghiệm:
- Lấy vào ống nghiệm (khô, sạch):
  0,5 ml dịch lọc protein (dùng micropipet)
 5 ml dung dịch C (hỗn hợp dung dịch A:B=50:1 mới pha) (dùng
micropipet)
- Trộn đều. Để yên 10 phút.
- Cho tiếp 0,5 ml dung dịch Folin. Trộn đều (bằng tay hoặc bằng máy trộn
Voltex)
- Để phản ứng 20 phút.
Mẫu kiểm chứng (làm song song với mẫu thí nghiệm ):
- Lấy vào ống nghiệm(khô,sạch):
 0,5 ml H2O (dùng micropipet)
 5 ml dung dịch C (dùng micropipet)
- Trộn đều. Để yên 10 phút.
- Cho tiếp 0,5 ml dung dịch Folin. Trộn đều (bằng tay hoặc bằng máy trộn
Voltex)
- Để phản ứng 20 phút.
Đo độ hấp thụ ánh sáng
- Đọc kỹ Hướng dẫn sử dụng máy đo quang tại PTN, SV đề nghị Kỹ thuật
viên của PTN hướng dẫn sử dụng máy.
- Đo độ hấp thụ của dung dịch màu của các ống thí nghiệm ở bước sóng 750
nm, với dung dịch đối sánh là mẫu kiểm chứng. Ghi kết quả.
Sử dụng đường chuẩn protein để tính hàm lượng protein của dung dịch
nghiên cứu.

3. Các chú ý
 Khi chuẩn bị mẫu protein để phân tích, trước tiên phải nghiền mẫu và chiết
bằng NaOH vì protein tồn tại trong gian bào của một tế bào, được bao quanh
bởi màng là một lớp lipit. Khi dùng NaOH nghiền và chiết ở 70 oC-80oC thì
đã xảy ra phản ứng xà phòng hóa và phá vỡ lớp màng lipit, giúp protein
thoát ra để có thể tiếp tục những phản ứng tiếp theo. Chú ý chỉ dùng dung
 dịch kiềm loãng sẽ giúp protein phân ly tốt hơn, tan tốt và tham gia phản
ứng tốt. Nhiệt độ chiết Protein không được quá cao vì sẽ làm biến tính
protein và cũng phải đủ nóng để phản ứng chiết xảy ra với hiệu suất cao.
 Sau khi chiết protein xong phải trung hòa dung dịch bằng HCl loãng đến
pH=7 vì phản ứng biure diễn ra mạnh trong môi trường kiềm, phụ thuộc vào
pH → phải đưa môi trường dung dịch về bão hòa để ko làm ảnh hưởng đến
hiệu suất của phản ứng biure.
 Dùng giấy pH làm chỉ thị kiểm tra môi trường trong dung dịch chứ không
dùng phenolphthalein vì phenolphthalein sẽ làm ảnh hưởng đến màu sắc của
dung dịch sau phản ứng biure → mật độ quang đo được sẽ bị ảnh hưởng.
 Dung dịch trước khi đưa vào máy đo quang phổ phải được lọc kỹ, trong và
không có những hạt lơ lửng vì sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả đo

Xử lý số liệu:

- Lượng mẫu lấy được : 0,3g

- Đường chuẩn Albumin:
y = 0.4493x + 0.0052 => x= (y-0.0052)/0.4493
y: Độ hấp phụ ánh sáng đo được tại bước sóng 750nm
x: Hàm lượng protein trong mẫu (mg/ml)

Lần đo Kết quả đo OD

(y)
1 0.291
2 0.270
Giá trị trung 0.2805
bình

OD= y=0.2805⇒ x =0.613(mg/ml)

Trong 1ml mẫu có 0.613mg = 0.000613g Protein

 Trong 100ml có 0.0613g Protein

 Hàm lượng Protein trong mẫu là:
 0.0613
. 100=20.43 %
0.3

Một số câu hỏi được đặt ra

1. Tác dụng của Na2CO3? – Na2CO3 trong thí nghiệm này có tác dụng làm dung
dịch đệm, giúp ổn định pH của môi trường.

2. Có thể sử dụng dung dịch khác ngoài BSA không? - Có thể sử dụng, tuy nhiên
nên chọn BSA vì độ tinh khiết cao.

3. Tại sao phải làm ẩm khi nghiền mẫu? – Nếu nghiền khô có thể gây ra ma sát, từ
đó làm tăng nhiệt độ khi nghiền.

4. Tại sao đo ở bước sóng 750 nm? – Đo ở bước sóng này sẽ cho đường chuẩn
thẳng hơn, phạm vi đường chuẩn dài hơn.

5. Tại sao dùng NaOH để làm ẩm mẫu? – Dùng NaOH để phá vỡ lớp màng lipit
của tế bào bằng phản ứng xà phòng hóa, giúp protein bên trong thoát ra.

6. Đun sôi ở 100 độ C được không? – Không nên vì nếu đun ở nhiệt độ quá cao có
thể làm biến tính protein.