HPLC ile Protein

Ayrımı ve Tayini

MEHMET KAPLAN
509211266
 İçerik
Proteinlerin
Protein Kromatografi HPLC
Özellikleri

Hidrofobik
Proteinlerin İyon Değişim Jel Filtrasyon
Etkileşim
Ayrımı Kromatografisi Kromatografisi
Kromatografisi

HPLC ile Protein Ayrılan

Afinite Kullanılan
Ayrımının Proteinlerin
Kromatografisi Dedektörler
Avantajları Tanımlanması
Protein
• Proteinler, amino asitlerin peptid (amid)
bağlarıyla bağlanmasından oluşan ve bir
veya birden fazla polipeptit zinciri içeren
makromoleküllerdir.
• Amino asitler hem asidik hem bazik grupları
içerirler. Karboksil (-COOH) grubu asidik,
amino (-NH2) grubu bazik özelliktedir.
Amino asitler içerdikleri bu iki grup
nedeniyle amfoter maddelerdir. Bu iki
grubu alkil kökü birbirine bağlar.
Proteinlerin Özellikleri
• Genellikle büyük moleküllerdir. Molekül ağırlıkları
çok farklıdır.
• Proteinler dayanıksız maddelerdir, bir takım dış
etkenlerle proteinlerin doğal özelliklerini
kaybetmelerine ve yeni özellikler kazanmasına
denatürasyon denir. Denatürasyon ile proteinlerin
birincil yapı dışındaki tüm yapıları bozulur, ikincil ve
üçüncül yapıdaki bağlar açılır, birincil yapıdaki peptit
bağları ise bozulmaz. Isı, UV ve X-ışınları, asit, alkali,
organik çözücüler denatüre edici ajanlardır.
• Proteinler hem bazik (-NH2) hem asidik gruplar
(-COOH) içerdikleri için amfolit (amfoter)
maddelerdir, izoelektrik noktaları vardır. Bu noktada
eşit negatif ve pozitif yük taşırlar.
• Proteinler; ısı, çeşitli tuzlar
(amonyum sülfat, magnezyum
sülfat, sodyum sülfat), organik
çözücüler, ısı, asid ve bazlarla
çöktürülebilir, ancak tuzlar
dışındakilerle yapılan çöktürme
proteinleri denatüre eder ve
proteinler bir daha doğal
şekillerine dönemez. Buna karşın
tuzlarla yapılan çöktürme
proteinleri denatüre etmez, yani
koruyucu çöktürmedir.
 Kromatografi
• Kromatografi bir karışımdaki bileşiklerin
birbiriyle karışmayan farklı iki faz
arasındaki dağılımlarıyla ayrılmalarını
sağlayan fiziksel bir ayırma yöntemidir.
• Bu fazlardan bir tanesi gözenekli bir
yatak, tabaka veya film şeklinde ve
genellikle hareketsiz olan sabit fazdır.
• Diğeri ise sabit faz boyunca bu fazın
üzerinden akan hareketli fazdır.
 • Yüksek Performanslı Sıvı Kromotografisi (HPLC) bir sıvıda
çözünmüş bileşenlerin, bir kolon içerisinde bulunan
genellikle katı bir destek üzerindeki sabit faz ile değişik
etkileşimlere girmesi, kolon içinde değişik hızlarla hareket
etmeleri sonucu, farklı zamanlarda bileşenlerin kolonu terk
ederek birbirlerinden ayrılması temeline dayanır.

HPLC
• HPLC, genellikle ayırma mekanizmasına veya durgun fazın
tipine göre sınıflandırılır. Bunlar arasında;
 dağılma ya da sıvı-sıvı kromatografi,
 adsorpsiyon yada katı-sıvı kromatografi,
 iyon-değişimi kromatografi,
 boyut ayırıcı kromatografi,
 afinite kromatografi,
 kiral kromatografiyi sayılabilir.
Proteinlerin Ayrımı
• Her tür proteini saflaştırmak için tek ya da basit bir yöntem
bulunmamaktadır.
• Proteinlerin çözünürlük, yük, boyut ve spesifik bağlanma gibi
özelliklerindeki farklılıklar başarılı bir şekilde diğer
proteinlerden ayrılabilmelerini sağlamaktadır.
• Proteinlerin yüzeyinde yer alan polar ve hidrofobik amino
asitler proteinlerin çözünürlüğünü etkilerken; yapısında
bulunan aspartik asit, glutamik asit, lizin, arginin ve histidin
amino asitleri proteinlerin yük özelliklerini etkilemektedir.
• Farklı yüke sahip proteinler için iyon değişim kromatografisi,
polar ve polar olmayan proteinler için hidrofobik etkileşim
kromatografisi, belirli bir bileşiğe afinite gösteren proteinler
için afinite kromatografisi ve farklı boyuttaki proteinler için de
jel filtrasyon kromatografisi (boyut ayırma kromatografisi)
başarılı bir şekilde ayrım sağlayabilmektedir.
 • İyon değişim kromatografisi proteinlerin ayrımında önemli rol oynayan
bir kromatografi çeşididir.
• Proteinler yapılarında yer alan amino asitlerin yan zincirlerinden dolayı
yüzeylerinde kendilerinin çözücülerle olan etkileşimini arttırıp
çözünürlüğünü etkileyen yüklü gruplara sahiptir.
• Fizyolojik pH değerlerinde bazı gruplar katyonik, (pozitif yüklü)

İyon Değişim diğerleri anyoniktir (negatif yüklü).

• Belirli bir proteinin net yükü kendisinin yapısından kaynaklanan bu

Kromatografisi gruplar arasındaki dengeye ve pH’sına bağlıdır.

• Bundan dolayı belli pH değerinde farklı proteinler farklı yüke sahip
olmaktadır ve mevcut olan yük farklılığı da proteinlerin ayrılmasını
sağlayan temel etkendir.
• İyon değişim kromatografisi ile proteinlerin ayrılması işlemi, yüklü
moleküller ve bu moleküllere zıt yüke sahip immobilize iyon değiştirici
gruplar arasındaki tersinir adsorpsiyon aracılığıyla gerçekleşmektedir.
• İyon değişim kromatografisi; yüksek ayrım kapasitesi, diğer tekniklere
göre düşük maliyeti gibi özellikleri ile proteinlerin saflaştırılmasında
tercih edilen bir yöntemdir. Bu yöntem ile küçük ve orta boyuttaki
proteinler verimli bir şekilde ayrılabilmektedir.
• İyon değişim kromatografisi içerdiği katyon ve anyon değiştirici
reçineler üzerinden ayrım gerçekleştirir.
• İyon değiştiricilerin matriks kısmı, alüminyum silikat, sentetik bir
reçine ya da bir polisakkarit türevi olabilir.
• Bir iyon değiştiricinin en önemli özelliği fonksiyonel gruplarından
ileri gelir.
• Bu grupların niteliği iyon değiştiricinin sınıfını ve kuvvetini
belirler. Bu grupların toplam sayısı ise iyon değiştiricinin
kapasitesi hakkında bilgi verir.
• Katyon değiştiricilerin fonksiyonel grupları, fenolik hidroksil,
karboksil ve sülfonik gruplardır.
• Anyon değiştiricilerde alifatik ya da aromatik amino grupları
bulunur.
• Sülfonik ve kuaterner amino grupları kuvvetli, ötekiler ise zayıf
iyon değiştiricileri meydana getirirler.
• İyon değiştiriciler, temas ettikleri çözeltideki bazı iyonları
bünyelerine alan ve onların yerine, aynı yükte, bir başka iyon
veren, yüksek polimerik yapıda maddeler olarak tanımlanabilir.
Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi

• Hidrofobisite, polar olmayan bileşiklerin su gibi polar özellikteki ortam ile arasındaki itme kuvveti olarak ifade edilebilir.
• Proteinlerin yüzeylerindeki hidrofobik amino asit miktarının farklılığına bağlı olarak proteinlerin farklı hidrofobisiteleri
vardır.
• Hidrofobik etkileşme kromatografisi, temelde proteinleri değişen hidrofobisitelerine göre ayırmayı hedefleyen bir
yöntemdir.
• Bu teknik genellikle iyon değişim ve jel filtrasyon kromatografisi ile birlikte kullanılmaktadır.
• Çözeltinin iyonik gücünün tuz ilavesiyle artırılması, proteinin hidrofobisitesini de beraberinde arttıran bir etki gösterir.
Tuz ilavesi, protein çevresindeki su moleküllerini çekerek proteinin çevresinde bulunan hidrofobik grupları açığa
çıkarmayı sağlar.
• Bu nedenle kromatografide proteinler yüksek iyonik güce sahip çözeltilerde çözündürülüp kolona uygulanırlar ve
kolondan geçerken hidrofobik etkileşmeyle kolona tutunurlar.
• En hidrofobik yapıya sahip protein kolona en güçlü bağlanma etkisini gösterir.
• Proteinler elüantın iyonik gücü düşürülerek kolondan elüe edilirler.
 • Jel filtrasyon kromatografisi de proteinlerin ayrımında
tercih edilen yöntemlerden bir diğeridir. Burada küçük
protein moleküllerinin jel partiküllerinin porlarının içine
girip yavaş ilerlemesi, büyük protein moleküllerinin
Jel Filtrasyon porlardan geçemeyip boşluklardan hızlı bir şekilde geçmesi
ile ayırma gerçekleşir.
Kromatografisi • Bu şekilde molekül büyüklüğü temelli bir ayırım sağlanmış
olur.
• Jel filtrasyon kromatografisinde başarılı bir şekilde ayrım;
kullanılan dolgu materyalinin gözenek çapına, kolon dolgu
materyaline ve kolon uzunluğuna bağlıdır.
• Bunlara ek olarak örnek hacmi, örnek hacminin kolon
hacmine oranı, partikül boyutu, akış hızı, örneğin ve
tampon çözeltinin viskozitesi de ayrıma için önemli etki
sağlayan faktörlerdendir.
Afinite Kromatografisi

• Afinite kromatografisi proteini özgün biyolojik aktivitesine göre ayrım sağladığı,

hızlı ve kullanımının kolaylığı bu yöntemi en etkin protein saflaştırma yöntemi
olarak belirtilebilir.
• Burada karışık bir homojenattan ilgilenilen protein seçimli olarak
ayrıştırılabilmektedir. Ayrılması hedeflenen proteine spesifik olarak bağlanan
ligandın kullanılması ile bu işlem gerçekleştirilir.
• Afinite kromatografisi hedef proteinin, çözünmeyen bir destek materyali üzerine
immobilize edilen ve hedef molekülü tamamlayıcı bağlanma uçları içeren ligandlar
tarafından spesifik ve geri dönüşümlü olarak adsorbe edilmesine dayanan bir
yöntemdir.
• Ligand ve hedef protein arasındaki etkileşmeler elektrostatik veya hidrofobik
ilişkiler, Van der Waals bağları veya hidrojen bağları aracılığıyla gerçekleşmektedir.
• Hedef molekülün ortamdan elüsyonu ise yarışmacı bir ligandın kullanımı veya
ortamın (mobil faz) pH, iyonik kuvvet veya polaritesindeki değişikler sonucu
sağlanmaktadır.
• Bileşiğin kolondan elüsyonu süresince kullanılan mobil fazın proteini denatüre
etmemesi ve proteinin spesifik aktivitesi veya fonksiyonunda herhangi bir
değişikliğe neden olmaması büyük önem arz etmektedir.
• Ligandın spesifikliği ve maliyeti bu yöntemi ise kısıtlayan etkenlerdendir.
Burada incelenen alt metotların tamamı proteinin HPLC’de hangi
ayrılma mekanizması ile ayrıldığına dayanmaktadır.

Kullanılacak hareketli faz ve sabit faz bu koşulları sağlayarak bu

metotların gerçekleşmesini sağlamaktadır.
HPLC ile Protein Ayrımının Avantajları

Eş zamanlı analiz

Doğruluk

Yüksek hassasiyet (ppm -ppb)

Küçük enjeksiyon hacmi

Geniş uygulama sahası

Zor olmayan analiz koşulları

Çok iyi tekrarlanabilirlik

Uygun sıcaklık sağlaması ve protein yapılarının bozulmasını önlemesi

Kısa analiz süresi

Kullanılan Dedektörler

ULTRAVİYOLE/GÖRÜN FOTODİYOT DİZİ FLORESANS DEDEKTÖR KONDÜKTİVİTE

ÜR ALAN DEDEKTÖRÜ DEDEKTÖRÜ (PDA) (RF) DEDEKTÖRÜ (CDD)
(UV/VIS)

KIRILMA İNDEKSİ ELEKTROKİMYASAL KÜTLE DEDEKTÖRÜ

DEDEKTÖRÜ (RID) DEDEKTÖR (ECD) (MS)
 Daha sonra kütle/yük (m/e) temelli
Kütle dedektöründe (MS) ilk olarak
ayrımın gerçekleştirildiği kütle analizörü
incelenecek numune gaz fazına
devreye girer. Burada proteomik
geçirildikten sonra MALDI veya ESI gibi
çalışmalarda başta TOF kütle analizörü
iyonlaştırıcıların kullanımıyla numune

Ayrılan
olmak üzere kuadrupol kütle analizörü de
iyonlaştırılır.
tercih edilmektedir.

Proteinlerin
Tanımlanması Kütle analizöründe m/e oranına bağlı
iyonların ayrımı gerçekleştirildikten sonra
bu iyonlar ince bir yarıktan geçirilerek
Kullanılan bu yöntem ile ayrımı sağlanan
elektroda çarptırılır ve sonucunda elde
proteinlerin teker teker kimliklendirilmesi
edilen küçük akım elektron çoğaltıcı veya
yapılmış olur.
foto-çoğaltıcı ile tayin edilebilen ve
kaydedilebilen bir hal olan kütle
spektrumu şeklinde elde edilir.
 • Kaplan, M., 2021, Proteom ve Proteomik Teknolojisi, Biyokimyasal
Uygulamaları, Tez (Lisans Bitirme), İstanbul Üniversitesi.
• https://byjus.com/chemistry/column-chromatography/
• https://www.thoughtco.com/protein-structure-373563
• https://www.youtube.com/watch?v=A8lTfhWdAwE
• Threadgill, G. J., Conrad, R. C., Cannon, M., Craven, G. R. 1987. A rapid and
preparative method for the separation of yeast ribosomal proteins by using
high-performance liquid chromatography. Biochemical journal, 244(3), 523-
532.

Kaynaklar • Akasawa, A., Hsieh, L. S., Martin, B. M., Liu, T., Lin, Y. 1996. A novel acidic
allergen, Hev b 5, in latex: purification, cloning and characterization. Journal of
Biological Chemistry, 271(41), 25389-25393.
• https://www.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-
purification-by-hplc
• http://biyokure.org/2011/10/09/hplc/
• https://kitam.omu.edu.tr/protein-kromatografi/
• Konak, Ü. İ., Turhan, İ., Certel, M. 2014. Proteinlerin kromatografik
yöntemlerle saflaştırılması. Akademik Gıda, 12(2), 79-87.
• Mitulović, G., Mechtler, K. 2006. HPLC techniques for proteomics analysis—a
short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics, 5(4),
249-260.
• https://www.agilent.com/cs/library/eseminars/Public/Column%20Choices%2
0for%20proteins_037214.pdf
• https://avesis.istanbul.edu.tr/resume/downloadfile/nakev?key=6b6c8248-
6601-4e7d-a806-52aced77999c
• Jadaun, G. P. S., Dixit, S., Saklani, V., Mendiratta, S., Jain, R., Singh, S. 2017.
HPLC for Peptides and Proteins: Principles, Methods and Applications.
Pharmaceutical Methods, 8(1).
• https://www.hplc.eu/Downloads/ACE_Guide_Peptides.pdf
• https://acikders.ankara.edu.tr/mod/resource/view.php?id=61487
• http://docs.neu.edu.tr/staff/serdar.susever/11%20HPLC_97.pdf
• https://docplayer.biz.tr/18054870-Protein-analiz-ve-saflastirma-yontemleri-
dr-ayhan-unlu.html
• Demiralp, D. Ö., İğci, N., Peker, S., Ayhan, B., 2014, Temel Proteomik Stratejiler,
Ankara Üniversitesi Yayınevi, Ankara, ISBN: 978-605-136-148-2.
• Danış, Ö., Ogan, A., 2019, Proteom, Biyokimyada Temel ve Özel Uygulamalar,
In: Yarat, A., Tunalı Akbay, T., Işık Alturfan, E. (ed.), Bölüm 14, Akademisyen
Kitabevi, Ankara, ISBN: 978-605-258-707-2, 231-255.
• Bal, S. H., Ferah, B., 2013, Genomik, Proteomik Kavramlarına Genel Bakış ve
Uygulama Alanları, Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, 39(1), 65-69.