TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.

HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI TẬP CUỐI KỲ HỌC PHẦN HÓA SINH HỌC THỰC PHẨM

NGUỒN GỐC VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME

POLYPHENOL OXIDASE TỪ LÁ TRÀ XANH

SVTH: NHÓM 20
NGUYỄN THỊ NGỌC NHỚ MSSV: 2005202105 LỚP: 11DHTP9
LÊ THỊ BẢO TRÂN MSSV: 2005202170 LỚP: 11DHTP9

TP HỒ CHÍ MINH, 2022

 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI TẬP CUỐI KỲ HỌC PHẦN HÓA SINH HỌC THỰC PHẨM

NGUỒN GỐC VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME

POLYPHENOL OXIDASE TỪ LÁ TRÀ XANH

SVTH: NHÓM 20

NGUYỄN THỊ NGỌC NHỚ MSSV: 2005202105 LỚP: 11DHTP9

LÊ THỊ BẢO TRÂN MSSV: 2005202170 LỚP: 11DHTP9

TP HỒ CHÍ MINH, 2022

 LỜI CAM ĐOAN

Chúng tôi cam đoan “Bài tập cuối kỳ học phần Hóa sinh học thực phẩm” này là do chính
chúng tôi thực hiện.

Các nội dung trình bày trong bài tập là trung thực, không sao chép. Các tài liệu tham
khảo sử dụng trong bài được trích dẫn nguồn và chú thích rõ ràng.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 1 năm 2022

SINH VIÊN THỰC HIỆN

Nhớ

Nguyễn Thị Ngọc Nhớ

Trân

Lê Thị Bảo Trân

 TÓM TẮT

Nguồn gốc và phương pháp thu nhận của Polyphenol Oxidase từ lá trà xanh được tập
trung nghiên cứu. Phương pháp chiết tách enzyme dựa vào tính hòa tan trong dịch chiết
để tham gia sản xuất trà thành phẩm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự khác biệt giữa các
kết quả nghiên cứu do nguồn nguyên liệu, phương pháp tách chiết khác nhau dẫn đến chế

phẩm enzyme thu được khác nhau. Hiệu suất chiết Polyphenol Oxydase phụ thuộc vào
kích thước nguyên liệu, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian và nhiệt độ trích ly thu
nhận.
MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH ẢNH
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
 MỞ ĐẦU

1. Mục tiêu nghiên cứu

Polyphenol oxidase (PPO) là enzyme phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có nhiều trong các
loài thực vật, động vật và vi sinh vật, xúc tác quá trình oxi hóa hợp chất phenol thành
quinon với sự tham gia của oxi nguyên tử. Hiện nay có rất nhiều công trình nghiên cứu
trong và ngoài nước về PPO, các kết quả nghiên cứu cho thấy PPO thu nhận từ các nguồn
khác nhau có nhiều tính chất khác nhau. Tốc độ hóa nâu của enzym được phản ánh bởi
lượng polyphenol oxidase hoạt động có trong thực phẩm đã tác động trực tiếp đến giá trị
cảm quan, chất lượng của trái cây, rau củ. Hầu hết các nghiên cứu điều tra phương pháp
để ức chế sự hóa nâu của enzym đều tập trung vào việc cản trở hoạt động của polyphenol
oxidase mà dần quên những tác động có lợi của enzyme này trong công nghiệp thực
phẩm nói chung và trong quy trình chế biến, sản xuất trà nói riêng. Ở Việt Nam cũng
chưa có công trình nghiên cứu về phương pháp thu nhận PPO từ lá trà xanh.

Xuất phát từ thực tiễn trên, nhóm chúng em tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài:
“Nguồn gốc và phương pháp thu nhận enzyme Polyphenol Oxidase từ lá trà xanh” từ
đó làm tiền đề khảo sát các hoạt tính của PPO trên cơ sở ứng dụng tính chất có lợi của
enzyme trong tạo màu cho thực phẩm, đồng thời kiềm chế tác hại của enzyme gây hiện
tượng sẫm màu ở rau quả.

2. Nội dung đề tài

Nội dung nghiên cứu bao gồm:

- Khái quát chung, thành phần và công dụng của cây trà
- Đặc điểm, phân loại và ứng dụng của enzyme PPO
- Nguồn thu nhận enzyme PPO
- Phương pháp thu nhận và các lưu ý trong trích ly chế phẩm enzyme.
3. Bố cục báo cáo

Bài tập lớn được chia thành 3 mục chính:

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Nguồn gốc enzyme

Chương 3: Phương pháp thu nhận enzyme

 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Cây trà
1.1.1. Giới thiệu chung

Cây trà có tên khoa học là Camellia sinensis, có nguồn gốc phát sinh ở miền
núi phía Nam Trung Quốc, Bắc Ấn Độ, miền Bắc Việt Nam. Ngày nay, cây trà
được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới, trong các khu vực nhiệt đới và cận
nhiệt đới. Trà là loại cây xanh lưu niên mọc thành bụi hoặc các cây nhỏ, thông
thường được xén tỉa để chiều cao thấp hơn 2 mét khi được trồng để lấy lá. Hoa của
cây trà màu trắng ánh vàng, đường kính từ 2,5 – 4 cm, với 7 – 8 cánh hoa. (1)

Hình 1.1. Lá trà tươi

1.1.2. Thành phần hóa học

Cây trà là cây công nghiệp có giá trị, thường từ khi trồng đến khi thu hoạch
búp trà và lá trà non là 3-5 năm và thời gian khai thác có thể lên đến 30 năm.
Những thành phần chính ảnh hưởng đến các thông số công nghệ và chất lượng của
trà thành phẩm gồm độ ẩm, lượng caffein, polyphenol, các hợp chất nitơ, các sắc
tố, đặc biệt là hệ enzyme oxi hóa khử trong lá trà. Trong lá trà tươi hàm lượng ẩm
thường chiếm tỉ lệ 75 – 80% tùy thuộc vào độ non của lá trà. (2; 3)
Trong lá trà có hai nhóm enzyme quan trọng trong quá trình sinh trưởng và
chế biến trà là nhóm enzyme oxi hóa khử và nhóm enzyme thủy phân. Nhóm
enzyme thủy phân giữ vai trò quan trọng trong sự phân giải các hợp chất phức tạp,
đa phân tử, không hòa tan thành các chất có phân tử thấp và hòa tan góp phần làm
tăng chất hòa tan trong trà và các chất này là tiền chất cho sự tạo thành các chất
mới tạo hương vị đặc trưng cho trà. Nhóm enzyme oxi hóa khử gồm 2 enzyme là
 polyphenol oxydase và peroxidase có vai trò đặc biệt trong chế biến trà, cơ chất
đặc hiệu của 2 enzyme này là polyphenol và tanin, ngoài ra chúng còn oxi hóa
được purogallon, axit galic, purocathesol. Sản phẩm của quá trình oxi hóa bởi
polyphenol oxidase là theaflalin, thearubigin và các cấu tử tạo màu sắc và hương
vị nước trà, sản phẩm của quá trình oxi hóa bởi peroxidase là cathesol sẽ ngưng tụ
với nhau theo từng cặp tạo hương vị cho trà. (3)

1.1.3. Công dụng của sản phẩm từ trà

Quá trình chế biến trà là sự vận dụng một cách tài tình phản ứng oxi hóa khử
nhờ hệ enzyme oxi hóa có sẵn trong lá trà như polyphenol oxidase. Dựa vào mức
độ oxi hóa các polyphenol trong nguyên liệu khi lên men, sản phẩm trà được chia
thành trà trắng, trà xanh, trà vàng, trà đỏ và trà đen. Mức độ oxi hóa càng cao,
nước trà càng mất màu xanh và tăng dần màu vàng rồi đến đỏ nâu, vị chát và đắng
giảm, vị ngọt tăng, mùi hăng của lá tươi giảm và xuất hiện các hương thơm mới,
gần giống hương hoa tươi, quả chín. (2; 3)
Nhiều quan sát dịch tễ học nghiên cứu về việc tiêu thụ trà xanh có tác động
đáng kể đến các bệnh ung thư ở người. Theo đánh giá của Carmen Cabrera và
cộng sự về việc sử dụng trà xanh ngăn ngừa các bệnh ung thư như sau: ung thư
đường tiêu hóa, tuyến tụy ở Nhật Bản, ung thư buồng trứng ở Trung Quốc; ung
thư miệng, họng và thanh quản ở phía bắc Italy, Thượng Hải; ung thư dạ dày, ở
Nhật Bản, phía nam Thổ Nhĩ Kỳ và Thụy Điển. Tại Nhật Bản cũng đã nghiên cứu,
những người tiêu thụ hơn 10 tách trà mỗi ngày sẽ giảm thiểu được các nguy cơ về
ung thư phổi, gan, ruột kết, ung thư vú ở phụ nữ và ung thư tuyến tiền liệt ở nam
giới (4).
 Hình 1.2. Các loại trà thông dụng hiện nay

1.2. Enzyme Polyphenol Oxidase (PPO)

1.2.1. Đặc điểm

Polyphenol oxidase (PPO) là một metalloprotein có chứa nguyên tố đồng và
thuộc nhóm enzyme oxi hóa khử, xúc tác phản ứng oxi hóa hợp chất phenolic tạo sản
phẩm quinone, hình thành màu nâu trong trái cây và rau củ bị tổn thương. (5)
PPO có liên quan đến sự hình thành các sắc tố, sự loại phân tử oxy và cơ chế
phòng thủ chống lại các tác nhân gây bệnh và côn trùng ở thực vật. Vì cơ chất
phenolic của PPO là những tiền chất quan trọng hình thành nên rào cản vật lý, hạn
chế sự lây lan mầm bệnh. Ngoài ra, các hợp chất quinone hình thành sau xúc tác
của PPO có thể liên kết với các protein thực vật, làm giảm sự tiêu hóa protein từ
đó làm giảm giá trị dinh dưỡng của các loại động vật ăn cỏ.
1.2.2. Tính chất:
PPO có trọng lượng phân tử khác nhau phụ thuộc vào nguồn enzyme,
phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme (6). Trọng lượng phân tử chung của
PPO từ thực vật được chấp nhận khoảng 144,000 Da ; của nấm lớn khoảng
128,000 Da. Trong khi đó một số loại nấm khác có trọng lượng phân tử vào
khoảng 46,000 – 88,000 Da. Ở động vật có vú rất ít tương đồng về trọng lượng
phân tử của PPO. (7) pH tối ưu cho hoạt động của PPO tùy thuộc vào nguồn của
enzyme có giá trị thay đổi từ 4 – 8. Nhiều thông số ảnh hưởng đến giá trị pH tối
ưu bao gồm : dung dịch đệm, độ tinh sạch enzyme, các giai đoạn phát triển và
nguồn gốc của trái cây và rau củ. Nghiên cứu pH tối ưu cho hoạt động của PPO có
thể cung cấp những thông tin cho việc nhận biết sự hoạt hóa và các gốc ion quan
 trọng cho sự ngưng kết cơ chất và biến dưỡng (Kuby, 1991). Sự thay đổi pH trong
dung dịch phản ứng gây bất hoạt PPO do sự thay đổi trong trạng thái ion của chuỗi
amino acid liên quan trong phản ứng xúc tác, sự thay đổi trạng thái ion của cơ
chất, sự thay đổi trạng thái cân bằng của phản ứng liên quan đến H + hay OH- (8)
PPO thu nhận từ các nguồn khác nhau được nghiên cứu về pH tối ưu, nhiệt độ tối
ưu, trọng lượng phân tử, điểm đẳng điện và đặc tính động học của enzyme. (9)

1.2.3. Phân loại

PPO có 3 dạng chính tùy thuộc vào cơ chất đặc hiệu và cơ chế phản ứng của
enzyme bao gồm tyrosinase, catechol oxidase và laccase. (10).
Tyrosinase (E.C.1.14.18.1) là enzyme monooxygenase có chứa nguyên tố
đồng, xúc tác 2 phản ứng khác nhau với sự có mặt phân tử oxy: o-hydroxyl hóa cơ
chất monophenol thành o-diphenol (hoạt tính monophenolase hoặc cresolase) và
quá trình oxy hóa tiếp theo chuyển o-diphenol thành o-quinone nhờ enzyme
diphenolase hay catecholase. (8)

Hình 1.3. Cơ chế phản ứng của tyrosinase

Catechol oxidase (E.C.1.10.3.1) được biết với tên khác là o-diphenol
oxidase, xúc tác phản ứng oxy hóa o - diphenol thành o-quinone tương ứng với sự
tham gia phân tử oxy. Tương tự như enyzme tyrosinase, vị trí tâm xúc tác của
enzyme catechol oxidase cũng gồm cặp ion Cu (CuA và CuB). Chính đặc điểm đó
nên enzyme catechol oxidase được xếp vào nhóm protein đồng “type-3” bao gồm
cả tyrosinase và heamocyanin. Tuy nhiên không giống như tyrosinase, enzyme
catechol oxidase thiếu hoạt tính hydroxylase nên vì thế không sử dụng
monophenol làm cơ chất (8).
 Hình 1.4. Cơ chế phản ứng catechol oxidase
Laccase (E.C.1.10.3.2) thuộc nhóm enzyme oxidase có phổ cơ chất rất đa
dạng, xúc tác loại bỏ hydro từ nhóm hydroxil của monophenol, diphenol,
polyphenol, dẫn xuất phenol, hợp chất phi phenol.

Hình 1.5. Cơ chế phản ứng

laccase
Phân tử laccase là một glycoprotein (dimeric hay tetradimeric), mỗi monomer
chứa khoảng 500 aminoacid và có trọng lượng phân tử khoảng 50-100 kDa. Laccase
có chứa 4 nguyên tử đồng ở trung tâm hoạt động có vai trò quan trọng trong hoạt
động xúc tác, các nguyên tử đồng được chia làm ba nhóm thành ba vùng oxi hóa khử

là vùng nguyên tử đồng T1, T2, T3. Vùng nguyên tử đồng T1 tham gia chủ yếu trong

việc nhận điện tử và truyền đến các vị trí khác. Vùng nguyên tử đồng T 2, T3 hình
thành trung tâm gồm 3 nguyên tử đồng làm nhiệm vụ kích hoạt liên kết và chuyển

điện tử với O2 tạo thành nước. (8)

1.2.4. Chức năng sinh học

Ở động vật, tyrosinase có vai trò trong tạo sắc tố của da, tóc, mắt bởi sự tổng
hợp melanin. Ở người PPO hoạt động quá nhiều hay quá ít là nguyên nhân của các
bệnh quan trọng như bệnh bạch tạng, bệnh đốm lang trắng hay khối u ác tính. (10)
Ở côn trùng sự hóa cứng của biểu bì là quá trình quan trọng trong mỗi giai đoạn phát
triển để làm cứng và ổn định bộ xương ngoài. Hoạt động laccase xúc tác cho sự oxi hóa
các hợp chất catechol với các protein màng đóng vai trò quan trọng trong hình thành bộ
xương ngoài. (10)
Ở thực vật bị tổn thương, enzyme oxi hóa hợp chất phenolic hình thành cấu
trúc polymer bảo vệ thực vật chống lại côn trùng và vi sinh vật là nguyên nhân tạo
màu nâu của trái cây và rau củ làm giảm chất lượng của thực phẩm. Ngoài
tyrosinase, laccase có vai trò quan trọng ở thực vật, chúng tham gia vào quá trình
 hóa gỗ của vách tế bào thực vật nhờ liên kết các monomer phenolic làm tăng độ
cứng của thân và các bộ phận khác của thực vật. (10)
Ở nấm, PPO mà đặc biệt là laccase có vai trò quan trọng trong sự phân giải
lignin, hình thành bào tử và sắc tố nấm, phân giải chất độc, …. (10)
Ở vi khuẩn, PPO có vai trò quan trọng trong hình thành melanin. Melanin,
một sắc tố polyphenolic, có tác dụng bảo vệ bào tử và tế bào vi khuẩn chống lại sự
oxi hóa, các gốc tự do và tia UV. (10)

1.2.5. Ứng dụng

PPO có khả năng oxi hóa các hợp chất thơm nên enzyme này được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp giấy và bột giấy, công nghiệp dệt
may, công nghệ y học, mỹ phẩm và môi trường. Sự quan tâm gần đây tập trung
vào sử dụng peroxidase và PPO trong việc loại bỏ hợp chất phenolic từ nước thải
công nghiệp. Laccase cố định có khả năng loại bỏ các chất ô nhiễm phenol và
chlorophenol. PPO được sử dụng trong điều trị bệnh Parkinson do PPO xúc tác
phản ứng cung cấp đủ lượng dopamine cho bệnh nhân mắc bệnh Parkinson. (11;
10)

CHƯƠNG 2: NGUỒN GỐC ENZYME PPO

2.1. Từ thực vật

PPO được tìm thấy trong phần lớn các mô của thực vật như táo (Harel et al.,
1964), nho (Ivanov, 1966), lê (Rivas and Wtaker, 1973), khoai tây (Craft, 1966),
trà (Zawistoski et al., 1991), hạt cacao, cà phê… ; trong vi sinh vật bao gồm vi
khuẩn và nấm (Vamas-Vigyazo, 1981) ; trong động vật như côn trùng
(Sugumaran, 1988; 1990), động vật chân khớp, động vật có vú và người (Witkop,
1985). Vị trí của PPO trong tế bào thực vật phụ thuộc vào loài, độ tuổi và độ chín
của trái cây và rau củ (12). Trong thực vật PPO là enzyme nằm trong thể hạt, tuy
nhiên khi trái cây, rau củ bị tổn thương hay lão hóa PPO ở dạng tự do trong tế bào
chất. Nhiều nghiên cứu cho biết gen mã hóa cho PPO có mức độ biểu hiện cao
trong các cơ quan khi còn non và không biểu hiện trong mô trưởng thành. PPO có
thể tìm thấy trong nhiều dạng thể hạt khác nhau như hạt bột (khoai tây), thể hạt
trong biểu bì, thể hạt trong rễ, lục lạp của lá. (8)
2.2. Từ động vật
 Trong động vật như côn trùng (Sugumaran, 1988; 1990) , động vật chân
khớp, động vật có vú và người (Witkop, 1985).
Ở động vật PPO được tìm thấy trong ti thể của tế bào biểu bì tạo sắc tố, trong tôn hùm
PPO được tách chiết từ lớp da nằm giữa cơ và xương ngoài. (8)
2.3. Vi sinh vật
Trong vi sinh vật bao gồm vi khuẩn và nấm (Vamas-Vigyazo, 1981)

2.4. Từ lá trà xanh (13)

Trong trà có rất nhiều loại enzyme khác nhau, nhưng quan trọng nhất là
Polyphenol oxidase và peroxidase. Hai loại enzyme còn gọi là enzyme hoá nâu
(browning enzyme), chịu trách nhiệm cho việc hoá nâu của thực phẩm khi tiếp xúc
với không khí. Polyphenols chiếm tới 30-40% trong lá trà mới hái và tồn tại ở thể
rắn. Polyphenols có nguồn gốc từ axit amin và được chuyển hóa nhờ ánh sáng mặt
trời do đó trà trồng trong bóng dâm có nồng độ polyphenols nhỏ và nồng độ axit
amin cao hơn. Búp và lá đầu tiên của trà có nồng độ polyphenols cao nhất và giảm
dần ở các lá dưới. Ước tính có khoảng 30.000 hợp chất polyphenolic trong trà.
Khi thành tế bào trong lá trà bị phá vỡ, hai enzyme này làm xúc tác cho quá trình
polyphenol oxy hóa với oxy trong không khí, khiến lá trà chuyển sang màu nâu.
Polyphenol oxidase và polyphenol có trong lá chè nên khi bị dập, cắt, thái,...
thì sự phối hợp giữa các giai đoạn oxi hóa và khử của sự hô hấp bị phá vỡ, các o-
quinon được tạo thành do sự õi hóa các polyphenol có thể trùng hợp với axitamin,
amin để hình thành các sản phẩm cos màu, đây là nguyên nhân gây hiện tượng
thâm đen khi vò lá chè.
Việc này xảy ra với hầu hết các loại thực phẩm tự nhiên, trong đó có trà. Tuy
nhiên, người làm trà từ ngàn xưa đã biết lợi dụng việc này để làm ra các loại trà
lên men như trà đen chẳng hạn. Trà đen là loại trà được lên men hoàn toàn, người
làm trà sau khi hái sẽ để lá trà lên men tự nhiên bằng cách ủ để thúc đẩy quá trình
này. Các enzyme hoá nâu hoạt động mạnh nên lá trà dần chuyển từ xanh sang nâu,
màu nâu đỏ đặc trưng của trà đen chính là được “nhuộm” từ hai enzyme này.
Tương tự như các enzym khác làm xúc tác khiến táo, khoai tây, bơ và chuối
chuyển sang màu nâu. Polyphenol oxidase và Peroxidase có thể bị biến tính hoặc
khử hoạt tính bằng cách sử dụng nhiệt để không thể xảy ra hiện tượng hóa nâu.
 Trong thực tế, đây là một trong những bước đầu tiên trong sản xuất trà xanh;
đó là lý do tại sao lá trà xanh thành phẩm vẫn giữ được màu xanh lá cây (và cũng
là lí do tại sao táo hoặc khoai tây khi được nấu chín vẫn giữ được màu trắng). Hai
loại Enzyme: Polyphenol oxidase và Peroxidase dễ bị vô hiệu hóa ở khoảng 150 oF
(65,5oC). Các enzyme cũng có thể bị vô hiệu hóa bằng cách đơn giản là làm mất
độ ẩm của lá trà trong một khoảng thời gian. Đây cũng là những gì xảy ra trong
quá trình làm héo khi sản xuất.

2.5. Ưu và nhược điểm của enzyme

Qua những đặc điểm, tính chất và chức năng sinh học của Polyphenol oxidase
(PPO), ta có thể rút ra được những ưu, nhược điểm để tối ưu quá trình thu nhận và ứng
dụng hiệu quả enzyme PPO trong công nghiệp thực phẩm. PPO được coi là một enzyme
quan trọng, đã và đang được nghiên cứu rất nhiều trong một số loài thực vật. Sự oxy hóa
các hợp chất phenol là nguyên nhân chính gây ra sự nâu hóa ở nhiều loại trái cây và rau
quả trong quá trình chín, thu hoạch, bảo quản và vận chuyển (13; 14). Điều này làm ảnh
hưởng đến giá trị cảm quan, chất lượng dinh dưỡng, làm giảm sức mua người tiêu dùng
và ảnh hưởng đến ngành công nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm.
Ức chế PPO gây hiện tượng hóa nâu trong phần lớn các sản phẩm thực phẩm tươi là
mục tiêu của nhiều ngành công nghiệp thực phẩm. Có nhiều phương pháp để ức chế
enzyme hóa nâu, tuy nhiên việc lựa chọn phương pháp phù hợp tùy thuộc vào nguồn gốc
của PPO, rút ngắn quy trình sản xuất, phụ thuộc vào giá thành của phương pháp và sự
chấp nhận của người tiêu dùng đối với phương pháp lựa chọn. (8)
Tuy nhiên, trong ngành công nghiệp chế biến trà – đặt biệt là trà Oolong, enzyme
PPO đã được sử dụng trong nghiên cứu này để thu dịch trích enzyme từ lá trà nguyên.
PPO lại đóng vai trò hết sức quan trọng. PPO xúc tác oxy hóa thành phần tannin đến sản
phẩm cuối là theaflavin và thearubigin, là các cấu tử tạo ra màu vàng và màu đỏ và
hương vị của nước pha trà.
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME
3.1. Quy trình thu nhận enzyme từ thực vật
3.1.1. Sơ đồ quy trình thu nhận enyzme từ thực vật

Nguyên liệu

Phá vỡ tế bào
 Thu dịch enzyme

Tách enzyme

Chế phẩm
enzyme

Hình 3.1. Sơ đồ quy trình thu nhận enzyme từ thực vật

a. Phá vỡ tế bào:

Mục đích: để chiết rút các enzym nội bào, trước hết cần phải phá vỡ cấu
trúc của các tế bào. Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện pháp:

 Xay nhuyễn
 Nghiền
 Đồng hóa
 Sử dụng sóng siêu âm.
 Sử dụng dung môi hữu cơ: rượu butylic, aceton, glycerine...

a. Thu dịch enzym thô

Sau khi đã phá vỡ cấu trúc tế bào, enzym được chiết bằng nước, bằng các
dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính. Có thể sử dụng các
phương pháp lắng, lọc, ly tâm, trích ly.
b. Tách enzym
Có thể sử dụng nhiều phương pháp như:

 Phương pháp kết tủa enzyme:

Mục tiêu: cần phá vỡ lớp nước xung quanh gây cản trợ sự kết tủa của protein bằng
cách bổ sung vào dung dịch enzyme các dung môi hoặc hóa chất ưa nước, có ái lực với
nước mạnh hơn protein để kéo phân tử nước ra khỏi phân tử protein, giúo cho protein
kết tủa.Các dung môi thường sử dụng là acetone, ethanol, các muối trung tính ở nồng
 độ cao như ammonium sulphate.

 Phương pháp siêu lọc: Sử dụng phương pháp lọc để loại trừ các chất bẩn trong
dịch chiết enzyme thu được từ nguyên liệu thực vật. Sau đó dùng phương pháp siêu
lọc (màng siêu lọc) để loại bỏ các chất có phân tử lượng thấp hơn protein enzyme
đồng thời cô đặc enzyme. Các hệ thống siêu lọc phổ biến: kiểu một bước, kiểu lô,
kiểu thể tích không đổi.
 Phương pháp hấp phụ: Hấp phụ trong thể tích (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào
trong dịch enzyme) hoặc trên cột (sắc kí hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc
tách và làm sạch enzyme. Quá trình hấp phụ thường được tiến hành ở 0°C, enzyme
được chiết bằng các dung môi thích hợp.

3.1.2. Thu nhận Polyphenol Oxidase

Thu nhận enzyme PPO đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu từ lâu,
hướng nghiên cứu chính là tìm ra phương pháp nhằm tối ưu hóa quá trình thu
nhận PPO, từ đó xác định được hoạt tính enzyme, chỉ số pH, nhiệt độ tối ưu,
nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng cũng như sự ức chế enzyme PPO tìm thấy
trong trái cây, rau củ đa dạng. Nghiên cứu của tác giả Thomas C.Wrong và
cộng sự (1970) trích ly PPO từ quả Clingstone Peach bằng dung môi acetone
có bổ sung polyethylen glycol (PEG) trong môi trường trích ly, M. Umit và
cộng sự (2011) cũng sử dụng dung môi acetone để trích ly PPO từ lá trà. Pradip
K. Mahanta (1993) thì sử dụng đệm phosphate pH 7,0 để trích ly enzyme PPO
từ cacao. Peigen Zhou và cộng sự (1973) sử dụng dung môi trích ly đệm
phosphate pH 6,0 có bổ sung Triton X-100 và PVPP (polyvinylpyrrolidone),
các tác giả Harel et al (1965); Stezig et al (1965) thì bổ sung Tween-80 vào
môi trường trích ly (5)… Nhìn chung, các nghiên cứu đã sử dụng các dung môi
trích là đệm, acetone và bổ sung thêm một số chất trong dung môi trích như
PEG, PVPP (hoặc PVP), Triton, Tween 80 cho bước đầu của việc thu nhận
enzyme PPO.
Vấn đề khó khăn nhất để thu được dịch enzyme PPO là cần hạn chế sự
oxy hóa hợp chất polyphenol và quá trình hình thành các hợp chất màu trong
dịch tách chiết. Trong quá trình tách chiết, các phenol nội bào bị oxy hóa
nhanh, hình thành nên các hợp chất quinone, tannin ngưng tụ và các hợp chất
 màu (hóa nâu). Vì trong quá trình thu nhận, việc phá vỡ tế bào làm cho enzyme
PPO thoát ra (từ sắc lạp) và xúc tác phản ứng. Các hợp chất phenol và các sản
phẩm bị oxy hóa của nó (quinone) phản ứng rất nhanh với protein (trong đó có
enzyme). Chúng loại bỏ liên kết H với protein và thêm vào đó các nhóm chất
vào liên kết peptide. Vì thế, trung tâm hoạt động của PPO ít nhiều bị thay đổi
và dẫn đến enzyme bị mất hoạt tính. Nhiều nghiên cứu của Loomis và Battile
(1965); Hulme và cộng sự (1964) và Sanderson và cộng sự (1965) đã đề nghị
ba cách sau nhằm ngăn chặn phản ứng của protein với hợp chất phenolic hoặc
sản phầm từ sự oxi hóa từ chúng (15) (16).

 Loại bỏ các hợp chất phenolic: VD: sử dụng phương pháp hấp thu
 Ức chế hoạt tính enzyme PPO: xào bất hoạt enzyme trong sản xuất trà đen, trà
Oolong,…
 Loại bỏ quinone (hình thành sau phản ứng oxi hóa hợp chất phenol) bằng cách
khử quinone lại thành o-diphenol hoặc quinone có thể được loại bỏ bằng cách
cho ngưng tụ với một hợp chất khác để hình thành sản phẩm không phản ứng với
protein.

Để tối ưu hóa việc thu nhận enzyme PPO thì các bước trích ly phải được tiến
hành lạnh (nếu có điều kiện nên tiến hành từ -20oC đến -30oC) (17), hạn chế ánh sáng tự
nhiên và phải nghiền và đồng nhất mẫu trong nitơ lỏng hoặc trong môi trường nitơ không
khí. Ngoài ra, một số tác giả còn đề nghị sử dụng phương pháp lạnh đông trong bước đầu
của việc trích ly. Các yếu tố khác như: pH, tính trương, lực ion và hàm lượng các tác chất
bổ sung vào môi trường trích ly cũng phải được quan tâm và chú ý đến (5).
3.2. Phương pháp thu nhận enzyme Polyphenol Oxidase từ lá trà nguyên liệu
3.2.1. Sơ đồ quy trình xử lý nguyên liệu

Lá trà tươi

Lựa chọn

Rửa sạch

Để ráo

Sấy khô
 Xay nghiền

Bảo quản

Hình 3.1. Sơ đồ quy trình xử lý lá trà nguyên liệu

 Thuyết minh quy trình: (18)
 Nguyên liệu lá trà tươi: lá trà được thu hái trực tiếp tại các vùng trồng trà ở Việt
Nam.
 Lựa chọn: Lá trà sau khi hái được sơ chế và lựa chọn ra những lá tươi non, nguyên,
không bị dập nát, không bị hư, không sâu bệnh, màu đạt chuẩn.
 Rửa sạch: Lá trà được mang đi rửa sơ bộ với nước sạch để loại bỏ bùn đất và tạp
chất bám trên thân lá cũng như những loại vi sinh vật có trên lá trà nguyên liệu.
 Để ráo: Nhằm loại bỏ bớt nước trên bề mặt, nguyên liệu được đem ra sàng và để ráo
tự nhiên, từ đó có thể tiến hành khảo sát các chỉ tiêu như: độ ẩm, hàm lượng tro,…
 Sấy khô: sấy bằng không khí nóng nhằm giảm độ ẩm của lá trà để đảm bảo điều
kiện thuận lợi cho việc bảo quản trong suốt quá trình nghiên cứu, khảo sát đề tài.
Bên cạnh giúp hạn chế sự phát triển của nấm mốc, giúp cho quá trình thu nhận đạt
hiệu suất cao.
 Xay nghiền: sau khi sấy, nguyên liệu được đem qua máy xay nghiền nhằm phá vỡ
cấu trúc tế bào, khiến quá trình thu nhận diễn ra thuận lợi hơn. Kích thước nguyên
liệu được kiểm tra qua việc sàng qua rây d = 1mm.
 Bảo quản: Nguyên liệu qua rây được đóng gói, hút chân không và bảo quản ở nhiệt
độ phòng trong bóng tối để tiến hành nghiên cứu thu nhận.
3.2.2. Sơ đồ quy trình thu nhận enzyme PPO
 Lá trà tươi

Xử lý

Đệm phosphate
pH=7
Trích ly

PVP

Lọc Dịch lọc

Ly tâm lần 1 Dịch nổi chứa PPO

Ethanol 90° lạnh Tủa enzyme

Ly tâm lần 2
Tinh bột

Phối trộn
Dung dịch
PPO thô
Sấy khô

Chế phẩm
PPO thô
Hình 3.2. Sơ đồ quy trình thu nhận enzyme PPO

Thuyết minh quy trình: (13) (20)

o Chuẩn bị nguyên liệu: Lá trà tươi sau xử lý được nghiền nhỏ và bảo quản để tiến
hành quy trình tách chiết enzyme.
o Trích ly: Cân 40 gram mẫu được nghiền nhỏ đem chiết với 100ml dung dịch đệm
 phosphate có pH = 7 và 15mg/ml PVP (polyvinyl pyrolidone).
o Dịch sau khi trích ly được đem đi lọc qua vải thường để loại bỏ các tạp chất, những
cặn của bã lọc. Lúc này có thể xác định hoạt tính enzyme PPO chứa trong dịch lọc.
o Ly tâm lần 1: Dịch lọc thu dược đem qua máy ly tâm để ly tâm với tốc độ 12.000
vòng trong 10 phút ở nhiệt độ 4°C nhằm loại bỏ phần lắng cô đặc phía dưới, thu
dịch nổi chứa PPO bên trên.
o Tủa enzyme: Dịch nổi đem tủa với ethanol 90°C lạnh với tỉ lệ V dung dịch E/Vethanol là
1:3. Khi tủa cần cho từ từ ethanol lạnh vào dung dịch enzyme và vừa cho ethanol
vừa khuấy đều hỗn hợp, bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh trong 1 giờ, nhiệt độ
khoảng 10°C để tủa enzyme.
o Ly tâm lần 2:

+ Tủa được hòa tan trong 20ml dung dịch đệm phosphate pH = 7 thu được dung
dịch PPO dùng để xác định hoạt độ của enzyme và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng
đến hoạt độ enzyme.

+ Tủa được trộn với tinh bột tỉ lệ 1:1, sau đó sấy khô hỗn hợp ở nhiệt độ 40 – 42°C,
thu chế phẩm enzyme thô, bảo quản ở nhiệt độ 0 – 4 oC dùng để xác định hoạt độ
chung và hoạt độ riêng của chế phẩm PPO thô. Chế phẩm PPO có hoạt độ riêng
thấp hơn so với hoạt độ riêng của PPO trong nguyên liệu do PPO là enzyme oxi hóa
khử dễ bị giảm hoạt độ trong quá trình tách chiết và sấy khô để tạo chế phẩm
enzyme thô.

3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly thu nhận enzyme (18; 9)

Quá trình trích ly dịch chiết trà hiện nay chủ yếu áp dụng pp trích ly bằng dung
môi. Nguyên tắc của TL bằng DM là dựa vào sự thẩm thấu dung môi vào tế bào, chất
cần trích ly hòa tan vào dung môi và khuếch tán ra khỏi tế bào. Quá trình TL kết thúc
khi chất cần trích đạt nồng độ cân bằng trong và ngoài tế bào. Quá trình trích ly có ưu
điểm là thiết bị đơn giản, có thể xử lý một lượng rất lớn nguyên liệu và có thể thực
hiện quy trình liên tục. Các yếu tố chính cần lưu ý khi thực hiện:

̶ Lựa chọn dung môi trích ly: chủ yếu dung môi phân cực như nước, ethanol,
methanol, aceton,... Phần lớn các tài liệu công bố đều sử dụng dd ethanol hoặc
methanol có nồng độ 40 - 70%,... hoặc aceton 50%, khi dùng dưới hoặc trên nồng độ
này hiệu quả trích ly thường thấp.
 ̶ Kích thước của nguyên liệu: càng nhỏ thì diện tích tiếp xúc bề mặt giữa
nguyên liệu và dung môi sẽ càng lớn. Việc xay nghiền nguyên liệu thành bột làm phá
vỡ tế bào, tăng diện tích tiếp xúc nên các chất cần trích ly được giải phóng vào dung
môi một cách dễ dàng hơn. Tuy nếu nguyên liệu quá mịn sẽ bị lắng đọng lên lớp
màng, tắc các ống mao dẫn hoặc bị dòng dung môi cuốn vào các chất cần trích ly sẽ
làm cho dung dịch chứa nhiều cặn và làm phức tạp cho quá trình xử lý tiếp theo
(Aguilera và ctv, 2003).

̶ Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi: Với cùng một lượng nguyên liệu, nếu ta tăng
lượng dung môi sử dụng thì hiệu suất trích ly sẽ tăng theo. Đó là do sự chênh lệch
nồng độ của hợp chất cần trích ly trong nguyên liệu và trong dung môi sẽ càng lớn.
Tuy nhiên nếu lượng dung môi sử dụng quá lớn thì sẽ làm loãng dịch trích ly và tốn
thời gian cho các quá trình xử lý tiếp theo. Cho nên cần phải chọn tỉ lệ giữa nguyên
liệu và dung môi cho thích hợp.

̶ Nhiệt độ trích ly: Khi tăng nhiệt độ các hợp chất sẽ chuyển động nhanh hơn,
do đó sự hòa tan và khuếch tán của hợp chất từ nguyên liệu vào dung môi sẽ được tăng
cường, đồng thời độ nhớt của dung môi giảm, dung môi dễ dàng xuyên qua lớp
nguyên liệu và làm cho diện tích tiếp xúc bề mặt giữa nguyên liệu và dung môi càng
lớn. Tuy nhiên nhiệt độ quá cao thì có thể xảy ra một số phản ứng hóa học không
mong muốn trong dịch trích và sự tổn thất các cấu tử hương sẽ gia tăng, cho nên nhiệt
độ là yếu tố có giới hạn, cần phải lựa chọn nhiệt độ thích hợp trong quá trình trích ly.
Trong toàn bộ quá trình trích ly, nhiệt độ không nên vượt quá 80oC, tuy nhiên cũng có
một số quy trình

thực hiện ở nhiệt độ thấp 5 – 10oC, 40 – 50oC, thậm chí 100oC (Yuko và ctv, 1999;
Yukihiko và ctv, 1986).

̶ Thời gian trích ly: Khi tăng thời gian trích ly thì hiệu suất thu hồi dịch chiết
sẽ tăng. Tuy nhiên nếu kéo dài thời gian trích ly quá lâu thì hiệu suất thu hồi dịch chiết
sẽ không tăng đáng kể và gây bất lợi về mặt năng lượng (Bombardelli và ctv, 2000;
Yuko và ctv, 1999).

̶ Độ ẩm của nguyên liệu: Độ ẩm của nguyên liệu giảm thì tốc độ trích ly tăng,
vì độ ẩm cao sẽ gây ra sự kết dính giữa các phân tử. Nước còn lại trong nguyên liệu sẽ
liện kết với các protein và các chất háo nước khác, ngăn cản sự dịch chuyển của dung
môi thẩm sâu vào trong nguyên liệu sẽ làm chậm quá trình khuếch tán, đồng thời cũng
làm ảnh hưởng cho quá trình tiếp theo (Aguilera và ctv, 2003).
 KẾT LUẬN

Error: Reference source not foundTóm lại, hàm lượng Polyphenol Oxidase tập trung
nhiều ở lá trà tươi đa dạng về hoạt tính hóa học, thể hiện qua mức độ tan trong các
dung môi khác nhau. Lựa chọn chính xác loại dung môi cũng như chế độ trích ly phù
hợp sẽ quyết định số lượng và chất lượng chế phẩm enzyme. Phương pháp trích ly
bằng dung môi được sử dụng phổ biến trong chế biến trà truyền thống. Dung dịch và
chế phẩm thô thu nhận sẽ tiếp tục nghiên cứu khả năng ức chế và bất hoạt enzyme dựa
theo mục đích sản xuất. Qua đó ta ứng dụng hiệu quả các tác động có lợi của enzyme
nhằm đem lại chất lượng cho sản phẩm cũng như hạn chế hiện tượng hóa nâu trên rau
quả. Cần khuyến khích nghiên cứu chuyên sâu, khảo sát, phân tích số liệu và các yếu
tố ảnh hưởng liên quan đến enzyme PPO từ đa dạng nguồn thu nhận, nhằm để khám
phá và tận dụng hiệu quả enzyme oxy hóa khử trong tương lai. Error: Reference source
not found
 TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Chè (thực vật). [Online] 21/1/2022. [Cited:13/1/2022.]

https://www.duhoctrungquoc.vn/wiki/vi/Ch%C3%A8_(th%E1%BB%B1c_v%E1%BA
%ADt).

2. Lê Văn Việt Mẫn (chủ biên), Lại Quốc Đạt, Nguyễn Thị Hiền, Tôn Nữ Minh
Nguyệt, Trần Thị Thu Trà. Công nghệ chế biến thực phẩm. TP.HCM : Nhà xuất bản
Đại học Quốc Gia, 2010.

3. Thu, Đồng Thị Thanh. Hóa sinh ứng dụng. TP.HCM : Nhà xuất bản Đại học Khoa
học Tự nhiên, 2008.

4. Beneficial Effects of Green Tea—A Review. Cabrera, Carmen, Artacho, Reyes and
Giménez, Rafael. 2006, Journal of the American College of Nutrition, Vol. 25, pp. 79-
99.

5. Polyphenol oxidase and Peroxidase in fruits and Vegetables. Vigyázó, Lilly Vámos.
1981, CRC Critical Review in Food Science and Nutrition, Vol. 15, pp. 49-127.

6. Isolation and characterization of a mung bean leaf polyphenol oxydase. Ron Shin,
Tim Froderman and William H. Flurkey. 1996, Phytochemistry, Vol. 45, pp. 15-21.

7. Astarci, Erhan. Production and biochemical characterization of polyphenol oxidase

from Thermomyces Lanuginosus. s.l. : A thesis submitted to the graduate school of
natural and applied sciences of the Middle East Technical University, In partial
fulfillment of the requirements for degree of master of science in the department of
biotechnology, 2003.

8. Barthet, Véronique J. Polyphenol oxidase from cassava (Manihot Esculenta C.)

Root : Extraction, Purification and Characterization. Canada : A Thais submitted to
the Faculty of Graduate Studies and Research in partial rulfillment of the requirements
for the degree of Doctor of Philosophy, Department or Food Science and Agricultural
Chemistry Univenity McGiU (Macdonald Campus) Montreal, PQ, 1997.

9. Sutay, Didem. Isolation, characterization and immobilization of polyphenol oxidase

from Muberry (morus alba) leaf tissues. s.l. : A thesis submitted to the graduate school
of natural and applied sciences of the Middle East Technical University, In partial
fulfillment of the requirements for degree of master of science in the department of
chemical engineering, 2003.

10. Guray, Melda Zeynep. Partial purfication and characterization of polyphenol

oxidase from thermophilic bacillus sp. s.l. : A thesis submitted to the graduate of
engineering and sciences of Izmir Institute of Technology in Partial Fulfillment of
requirements for degree of master of science in biotechnology, 2009.

11. Adinarayana Kunamneni, Antonio Ballesteros, Francisco J. Plou and Miguel

Alcalde. Fungal laccase – a versatile enzyme for biotechnological applications.
Spain : Departamento de Biocatalisis, Instituto de Catalisis y Petroleoquimica, CSIC,
28049 – Madrid, 2007.

12. Crumière, Fabienne. Inhibition of enzymatic browning in food products using bio-
ingredients. Québec : A thesis submitted to the graduate studies and research in partial
fulfillment of the requirement of the degree of Master of Science, McGill University
Montreal, 2000.

13. Thư, Nguyễn Hồ. Nghiên cứu các đặc tính, ứng dụng và biện pháp kiềm chế tác
hại của enzyme Polyphenol oxidase từ thực vật. TP.HCM : Luận án Thạc sĩ Sinh học,
Đại học Khoa học Tự nhiên, 2012.

14. Purification and properties of polyphenoloxidase of mango peel (Mangifera

indica). Patwardhan, T. N. Prabha and M. V. 1982, J. Biosci, Vols. 4, No 1, pp. 69-78.

15. Some Biochemical Properties of Polyphenoloxidase from Spearmint (Mentha

arvensis). Valdir Augusto Neves, Douglas Gatte Picchi and Maraiza Aparecida da
Silva. 2009, An internation Journal Brazilian Archives Of Biology and Technology,
Vols. 52, No 4, pp. 1001-1010.

16. Review Article: Extraction of enzyme and subcellular organelles from plant tisues.
Anderson, J.W. 1968, Phytochemistry, Vol. 7, pp. 1973-1988.

17. Plant phenolic compounds and The isolation of plant enzyme. W.D. Loomis, J.
Battaile. 1966, Phytochemistry, Vol. 5, pp. 423-438.

18. Survey of Catechin, Gallic Acid, and Methylxanthines in Green,Oolong, Pu-erh,

and Black Teas. Jen-Kun Lin, Chih-Li Lin, Yu-Chih Liang, Shoei-Yn Lin-Shiau, I-
Ming Juan. 2006, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 46, pp. 3635-
3642.
19. Nguyễn Thị Hạnh, Vũ Thị Linh, Lê Thị Thanh Trúc. Nghiên cứu quy trình tách
chiết hợp chất flavonoid trong lá sen và thử hoạt tính chống oxy hóa. TP.HCM : Báo
cáo Đồ án, Đại học Công ngiệp, 2016.

20. Trâm, Hồ Thị Ngọc. Nghiên cứu ứng dụng sóng siêu âm cải thiện quá trình trích
ly polyphenol từ phụ phẩm trà Oolong. TP.HCM : Luận văn Thạc sĩ Khoa học Công
nghệ thực phẩm, Đại học Nông Lâm , 2014.

21. Hồng, Phạm Thị Ánh. Kỹ thuật sinh hóa. TP.HCM : Nhà xuất bản Đại học Quốc
Gia, 2003.

22. Sutay, Didem. Isolation, characterization and immobilization of polyphenol

oxidase from Muberry (morus alba) leaf tissues. s.l. : A thesis submitted to the
graduate school of natural and applied sciences of the Middle East Technical
University, In partial fulfillment of the requirements for degree of master of science in
the department of chemical engineering, 2003.

23. Purification and properties of polyphenoloxidase of mango peel (Mangifera

indica). Patwardhan, T. N. Prabha and M. V. 1982, J. Biosci, Vols. 4, Number 1, pp.
69-78.

24. Polyphenol oxidase and Peroxidase in fruits and Vegetables. Vigyázó, Lilly
Vámos. 1981, CRC Critical Review in Food Science and Nutrition, Vol. 15, pp. 49-
127.