Praca z wynikami doświadczalnymi

Temat: „Fluorestencja modulowana”

Autorzy:

Borowicz Wiktoria

Broźny Józef

Godzina Sandra

Kubik Karolina

Opiekun projektu

dr Aleksandra Orzechowska

Kierunek Studiów i Uczelnia:

Bioinżynieria Zwierząt, Uniwersytet Rolniczy im.H.Kołłątaja w Krakowie!

Cel ćwiczenia:

Pomiar i analiza widm uorestencji modulowanej chloro lu a w systemie PAM (ang. Pulse-
amplitude-modulation).

Charakterystyka ogólna fotosyntezy

Fotosynteza zachodzi u roślin, protistów roślinopodobnych i niektórych bakterii. Polega

na wytworzeniu złożonych związków organicznych z prostych substratów
nieorganicznych przy udziale energii słonecznej.

Zachodzi ona w obrębie chloroplastów lub u prokariotów w tylakoidach.

Proces fotosyntezy możemy podzielić na dwie fazy. Pierwsza z nich to faza jasna
zachodząca w tylakoidach. W tej fazie główną rolę odgrywa światło słoneczne. Chloro l a
absorbuje światło czerwone i niebieskie o długości fal od 400 nm do 700 nm i w tym
czasie dochodzi do stanu wzbudzenia, podczas którego zostają wybijane elektrony.
Karotenoidy znajdujące się w tylakoidach (karoten, ksanto l, likopen) wspomagają
absorbację światła w innych długościach fal.

Gdy roślina ma wody pod dostatkiem zachodzi fosforylacja niecykliczna. Zaczynając od

fotosystemu II i I pod wpływem działania promieni słonecznych dochodzi do wytrącenia
elektronów, które wędrują w poprzek błony. Elektrony, które opuściły fotosystem II
spowodowały lukę elektronową. Następnie dochodzi w nim do fotolizy, gdzie woda ulega
rozpadowi, podczas którego powstaje wodór, elektorony oraz tlen, który jest składnikiem
ubocznym fotosyntezy i zostaje on uwolniony do atmosfery przez aparaty szparkowe.
Elektrony, które powstają uzupełniają lukę elektronową w fotosystemie II. Natomiast H+
pogłębiają gradient elektronowy.

W poprzek błony tylakoidów transportowane są elektrony - reakcje redoks, z uwolnieniem

energii. Dzięki temu, że została uwolniona energia to jony H+, mogą być aktywnie
przetransportowane, ze stromy do wnętrza tylakoidu, w celu powiększenia gradientu
stężeń, który jest siłą napędową do Syntazy ATP, przez którą zgodnie z gradientem stężeń
z wnętrza tylakoidów do stromy mogą przepłynąć jony wodoru i dochodzi do syntezy ATP,
czyli pierwszego składnika siły asymilacyjnej. Drugi ze składników asymilacyjnych jest
utworzony poprzez przyjęcie ładunku przez utlenowaną formę NADP+ i powstaje
zredukowana forma przenośników NADP+H+.

Podczas suszy dochodzi do fosforylacji niecyklicznej, podczas której zostaje wykreślony

z użycia fotosystem II, przeprowadzający fotolizę wody. Podczas tego procesu chloro l
zawarty w fotosystemie I absorbuje światło i zostają wybijane elektrony na przenośniki, a
następnie na NADP+. Ponieważ, w fotosystemie I robi się luka elektronowa, to elektrony
wracają z NADPH+H+ i dochodzi do cyklicznej wymiany elektronów, efektem czego jest
brak możliwości utworzenia jednego ze składników siły asymilacyjnej, ale dzięki
transportowi elektronów w poprzek błony, możliwe jest utworzenie gradientu
protonowego, który jest siłą napędową dla syntazy ATP i dochodzi do syntezy ATP. Nie
dochodzi do utworzenia pełnej siły asymilacyjnej i nie może dojść do drugiego etapu
fotosyntezy.

Druga faza fotosyntezy to faza niezależna od światła (ciemna) i zachodzi w stromie.

Składa się z 3 etapów:

1 etap: Karboksylacja, czyli asymilacja dwutlenku węgla, którego akceptorem jest

rybulozo-1,5-difosforan, a enzymem przeprowadzającym tą reakcje jest RuBisCo.

fl
fi
fi
fi
fi
 2 etap: redukcji, W tym etapie wykorzystujemy siłę asymilacyjną (ATP i NADPH+H+).
Powstaje pierwotny produkt fotosyntezy: Aldehyd-3-fosfoglicerynowy, który jest prostym
związkiem wyjściowym do syntezy bardziej złożonych związków, jak glukoza, a następnie
nieredekujący się cukier sacharoza, dzięki czemu może być ona przetransportowana w
niezmienionej formie przez łyko.

3 etap: regeneracja, W tym etapie dochodzi do odtworzenia pierwotnego produktu, czyli

rybulozo-1,5-difosforan. Podczas tego etapu wykorzystywany jest ATP.

Najważniejsze czynniki wpływające na intensywność fotosyntezy:

- Światło- niezbędne do wybijania elektronów, podczas fazy jasnej.

- Temperatura- stymuluje fotosyntezę do pewnego momentu, ponieważ jeśli jest zbyt

duża to dochodzi do zamknięcia aparatów szparkowych, w celu zahamowania
parowania wody i nie może dojść do wymiany gazowej.

- Woda- jest niezbędna ponieważ elektrony z hydrolizy wody uzupełniają lukę

elektronową.

- CO2- jest substratem w fazie ciemnej

Rozmieszczenie chloroplastów zgodnie z intensywnością światła

Silne światło Umiarkowane światło W słabym świetle

Przy ścianach Rozkładają się Przy ścianach

równoległych do równomiernie. prostopadłych do
kierunku padania kierunku padania
promieni świetlnych promieni świetlnych.

Diagram Jabłońskiego
Możemy na nim śledzić przejścia
energetyczne związane z
uorestencją. Na diagramie
występują 3 stany elektronowe:
singletowy stan podstawowy, S0;
singletowy stan wzbudzony, S1; oraz
wzbudzony stan tripletowy, T 1 .
Strzałki ciągłe pokazują przejścia
promieniste, a strzałki przerywane
przejścia bezpromieniste.

fl
Krzywa indukcji chloro lu

obserwuje się

Układ Pomiarowy:

Spektrometr uorestencyjny o podwójnej modulacji FL3000 Foton Systems Instruments

(1 optyczna głowica kontrolna i zestaw kuwet); Spektrometr Carypro (Varian);
Spektrometry Przenośne: FluorPen i AqaPen Foton Systems Instruments

fl
fi
Sprzęt labolatoryjny:

Wirówka laboratoryjna, pipety automatyczne, moździeż, szkło labolatoryjne, pipeta

Pasteura

Odczynniki:

Metanol, bufor Hepes (pH 6,5), Diuron (DCU)

Przebieg ćwiczenia:
Analiza danych

1. Stężenie chloro lu

C (a+b)[1,44x 0,19 + 24,93x0,115]x51= 160,168 [ug/ml]

2. Stężenie karotenoidów

Ca= [16,72x0,19] - 9,16x0,115= 2,123 [ug/ml]

Cb= [34,09x0,115]- 15,28x0,19= 1,017[ug/ml]

CCar=[(1000x0,202 - 1,63 x 2,123 - 104,96 x1,0171):221]x20 = 21,180 [ug/ml]

fi
4. Do 5 prób zmierzono wydajność układu PS II w sposób nieinwazyjny. Otrzymano
następujące wartości:

I 0,73

II 0,76

III 0,76

IV 0,78

V 0,71

Średnia 75%

Niepewność szacowana przez producenta wynosi 1%

5. Stężenie DCMU w kuwecie

Próbki w kuwecie ( w stężeniu z DCMU)

0,015g/5ml DCMU

5000 µl- 0,015g

5µl-x

x= 0,000015/0,000005= 3 mol/l

Próba badawcza ze spektrometru stacjonarnego

I 0,153

II 0,156

III 0,157

IV 0,155

Średnia wartość wyniosła 0,155

Widmo przedstawiające uorescencje z dodatkiem DCMU

Wnioski i dyskusja

Wydajność mierzona w sposób nieinwazyjny spektrometrem przenośnym w stosunku do

pomiarów mierzoznych uorymetrem była obniżona o 2,8 %

Ta obniżona wartość świadczy o tym ze może to być spowodowane wyizolowaniem

chloroplastów.

Obniżenie uorescencji jest efektem, podczas którego dochodzi do zredukowania

wszystkich form przenośników, pomimo docierania dużej ilości światła, nie zachodzi
fotosynteza. Czas adaptacji ciemności zależy od intensywności światła i czasu
naświetlenia. Zaciemniamy próbkę w celu ponownego utlenienia przenośników oraz
zwiększenia dostępności akceptorów wodoru i elektronów dla światła.

Różnice fotosyntetyczne dla próbki numer 1 i probki numer 2 mogą być wynikiem
zastosowania adaptacji ciemnosciowej.

Adaptacja ciemnościowama na celu, jak wspomniano wyżej, ponownego utlenienia

przenośników oraz zwiększenia dostępności akceptorów elektronów dla światła zatem
fl
fl
fl
podwyższony wynik wydajności fotosyntetycznej dla próbki numer jest wywołany
wydłużonym czasem adaptacji ciemnościowej, a co za tym idzie zwiększeniem
dostępności puli akceptorów elektronowych

DCMU obniża wydajność fotosyntetyczną. obniżona wydajność fotosyntetyczna w

próbce traktowanej dcmu może wynikać z hamowania przez niego przepływ elektronów
powoduje że transfer w tym miejscu nie zachodzi dlatego obniżona jest znacznie
wydajność fotosyntetyczna. Wynika z tego ze dcmu w sposób bardzo szybki i przy
bardzo małych stężeniach działa destrukcyjnie na transfer energii w układach
biologicznych. Stężenie chloro lów (a+b) wyniosło 160,168 [ug/ml]. Stężenie
karotenoidów dla chloro lu 2,123 [ug/ml], a chloro li b wyniosło 1,017 [ug/ml].

fi
fi
fi