Tăng cường khả năng hấp phụ protein và tổng hợp sinh học

của khung mô phỏng sinh học 3D chitosan/hydroxyapatite

được áp dụng cho kỹ thuật tạo mô xương
Công trình này trình bày khả năng hấp phụ protein và tổng hợp sinh học nâng cao của khung
định dạng mô phỏng sinh học 3D chitosan/hydroxyapatite (CS/ HAp) được tổng hợp từ các
nguồn tự nhiên áp dụng cho kỹ thuật tạo mô xương (BTE). Các khung định dạng được chuẩn
bị bằng phương pháp đông khô, sau đó được phân tích đặc trưng bởi nhiễu xạ tia X, SEM,
phương pháp chuyển chất lỏng để đánh giá độ xốp, tính chất trương nở và độ bền cơ học. Phổ
hồng ngoại (FT-IR) cũng được thực hiện để khảo sát sự tương tác giữa chitosan (CS) và
hydroxyapatite (HAp). Khả năng phân hủy sinh học, tổng hợp sinh học và khả năng hấp thụ
protein của khung định dạng được đánh giá thông qua các thử nghiệm trong ống nghiệm. Kết
quả cho thấy khung 3D CS/HAp thể hiện cấu trúc có độ xốp cao với kích thước lỗ trung bình
là 265 μm, và tương ứng độ xốp trung bình là 75,01%; độ bền cơ học của khung định dạng là
2,45 Mpa, tương thích tốt với độ bền của xương. Việc bổ sung HAp vào CS matrix làm giảm
hiệu quả tỷ lệ trương nở của khung định dạng CS/HAp và giữ lại độ phân hủy thích hợp của
khung định dạng composite; tỷ lệ phân hủy của khung CS/HAp là 46,37% sau 28 ngày ngâm
trong dung dịch sinh lý (PBS). Khung CS/HAp đã chứng minh khả năng tổng hợp sinh học
cao hơn so với khung CS, giải phóng một lớp apatite như xương trên bề mặt của chúng sau
15 ngày nuôi cấy trong dịch mô phỏng dịch bào. Sự hiện diện của HAp bắt trước apatite sinh
học trong khung composite tạo điều kiện cho khả năng hấp phụ protein cao hơn, so với của
CS. Các kết quả thu được cho thấy khung định dạng CS/HAp có tiềm năng to lớn như là vật
liệu tương thích sinh học cho các ứng dụng BTE.

1. Giới thiệu
Tái tạo mô dựa trên khung định dạng đã trở thành một chiến lược quan trọng trong kỹ thuật
tạo mô xương (BTE) vào những năm gần đây, trong đó một chất nền có khả năng phân hủy
sinh học (scaffold) được kết hợp với các tế bào sống và/ hoặc các phân tử hoạt động sinh học
để tạo ra quá trình sửa chữa và tái tạo mô xương. Kỹ thuật này là một phương pháp điều trị
vàng cho tiếp cận cấy ghép thông thường, giúp giảm bớt bệnh tật và đau đớn cho bệnh nhân.
Khung định dạng phân hủy sinh học hoạt động như một khuôn mẫu quan trọng để hỗ trợ sự
tích tụ (bám dính) của tế bào và định hướng sự phát triển của chúng theo không gian ba chiều
và phân hủy thành các sản phẩm phụ tương thích sinh học theo thời gian. Về vấn đề này, các
khung định dạng phải có tính tương thích sinh học, có khả năng phân hủy sinh học và không
độc hại. Chúng phải sở hữu một số đặc điểm, chẳng hạn như cấu trúc vi mô thích hợp (ví dụ,
độ xốp và kích thước lỗ) và hoạt động hóa học bề mặt, để hỗ trợ quá trình trao đổi chất của tế
bào, kết dính tế bào trong ống nghiệm, tăng trưởng và bảo tồn kiểu hình, do đó cung cấp
không gian cần thiết cho quá trình tân sinh mạch trong ống nghiệm. Hiện nay, nhiều vật liệu
đã được sử dụng để chuẩn bị khung định dạng cho kỹ thuật tạo mô xương; ba loại vật liệu
chính đã được phân loại, bao gồm polymers, bioceramics (gốm sinh học), và composite (vật
liệu tổng hợp).
Xương tự nhiên thể hiện cấu trúc phân cấp bao gồm các bó sợi collagen, và các tinh thể
hydroxyapatite (nHAp), tương ứng là các thành phần hữu cơ và vô cơ. Trong những năm qua,
sự phát triển của các khung định dạng thẩm mỹ mô phỏng xương thật về cấu trúc phức tạp đã
thu hút các nhà khoa học trong lĩnh vực BTE. Các loại polymer tổng hợp và tự nhiên khác
nhau đã được kết hợp với nHap làm khung mô phỏng sinh học cho các ứng dụng BTE.
Chitosan (CS) là một polysaccharide tự nhiên mạch thẳng bao gồm các đơn vị D-
glucosamine và N-acetyl glucosamine được nối với nhau thông qua liên kết β- (1-4)
glycosidic; nó có nguồn gốc từ quá trình deacetyl (quá trình khử) chitin được tìm thấy trong
vỏ của các loài giáp xác biển. Sự tương tự trong cấu trúc của CS với glycosaminoglycans, là
thành phần của chất nền ngoại bào (ECM) của xương, đóng một vai trò quan trọng trong việc
kết dính tế bào bằng cách tương tác với các sợi collagen, do đó làm cho CS trở thành một
trong những polymer tự nhiên hấp dẫn nhất được sử dụng cho BTE. CS scaffolds có tác dụng
tạo xương, tăng cường sự hình thành xương dưới điều kiện in vitro và in vivo. Tuy nhiên,
việc thiếu hoạt tính sinh học liên kết xương, độ bền cơ học kém và không có khả năng duy trì
hình dạng đã định trước đã hạn chế việc sử dụng chúng trong BTE. CS đã được kết hợp với
các polymer tự nhiên khác, chẳng hạn như alginate và gelatin, cũng như gốm sứ sinh học,
chẳng hạn như HAp, tricalcium phosphate và nano SiO 2, để cải thiện các đặc tính sinh học và
cơ học của khung định dạng CS. Sự kết hợp của CS với nHAp như thành phần khoáng chất
của xương thường dựa trên việc chế tạo khung định dạng composite mô phỏng sinh học, kết
hợp các đặc tính vốn có của cả CS và HAp cho BTE. Một số kỹ thuật đã được sử dụng để
chuẩn bị scaffolds dựa trên CS/HAp, chẳng hạn như electrospinning, sấy đông khô, và sấy
phun. Hơn nữa, việc lựa chọn một kỹ thuật phù hợp đóng một vai trò quan trọng trong việc
chế tạo scaffolds tương thích sinh học, đặc biệt là đối với các cấu trúc ba chiều (3D). Nghiên
cứu này nhằm mục đích chuẩn bị khung định dạng 3D mô phỏng sinh học CS/HAp từ các
nguồn tự nhiên sử dụng kỹ thuật đông khô để tăng cường khả năng hấp phụ protein và
khoáng hóa sinh học cho các ứng dụng BTE. Các hạt nano HAp, thu được bằng cách sử dụng
nguồn calcium sinh học chiết xuất từ vỏ trứng, theo nguyên tắc nghiên cứu trước đây của
chúng tôi, đã được sử dụng làm thành phần vô cơ của khung định dạng mô phỏng sinh học.
CS chiết xuất từ vỏ tôm được sử dụng làm giai đoạn polymer của scaffolds. Các scaffold thu
được, được phân tích đặc trưng bởi các phương pháp hóa lý khác nhau. Ngược lại, khả năng
phân hủy sinh học, khả năng khoáng hóa sinh học và khả năng hấp thụ protein của chúng
được đánh giá thông qua các thử nghiệm in vitro tương ứng trong dung dịch đệm PBS, dung
dịch mô phỏng dịch bào (SBF) và huyết thanh bào thai bò (FBS).

2. Thực nghiệm
2.1. Vật liệu
Tất cả các thuốc thử đều thuộc loại phân tích và được sử dụng mà không cần tinh chế thêm.
Các sản phẩm CS thể hiện mức độ deacetyl hóa 85% và trọng lượng phân tử thấp được mua
từ Viện Thủy sản Nha Trang (Việt Nam). Vỏ trứng gà đã qua xử lý trước được sử dụng làm
tiền chất canxi để điều chế các hạt nano HAp. Natri hydroxit (NaOH), acid chlohydric, dung
dịch đệm (pH 4, 7 và 9), acid acetic và ethanol (C 2H5OH) được mua từ Merck (Đức). Canxi
chlorua dihydrate (CaCl2.H2O), natri monophosphate dihydrate (NaHPO4.2H2O), NaCl,
NaHCO3, KCl, K2HPO4.3H2O, MgCl2.6H2O, Na2.SO4, trishydroxylmethyl aminomethane
((HOCH2)3-CNH2), cetyltrimethylamonium bromide (CTAB), dung dịch đệm PBS và natri
dodecyl sulfate (SDS) được mua từ Sigma-Aldrich. Huyết thanh bò (FBS) và môi trường
thiết yếu tối thiểu (MEM) được lấy từ Gibco, Hoa Kỳ. Tất cả các dung dịch và thuốc thử
được chuẩn bị trong nước deion (DI).
2.2. Phương pháp
2.2.1. Tổng hợp khung định dạng 3D
Các hạt nano bắt chước apatite sinh học đã được sử dụng như một thành phần vô cơ để chế
tạo scaffolds phân hủy sinh học CS/HAp. Chúng được điều chế bằng cách sử dụng nguồn
canxi sinh học chiết xuất từ vỏ trứng bằng phương pháp thủy nhiệt. Quá trình tổng hợp và
hoạt hóa của HAp được tiến hành theo công việc trước đây của chúng tôi. Scaffolds CS và
CS/HAp được tổng hợp bằng phương pháp đông khô. Trong một thí nghiệm điển hình, 1,92 g
CS được hòa tan trong 96 mL acid acetic 2% (v/v) trong 3 giờ để thu được dung dịch CS 2%
(m/v). Đối với scaffolds composite, một cột treo chứa 0,384 g HAp được thêm từng giọt một
vào dung dịch CS.
Hỗn hợp thu được (CS hoặc CS/HAp trong acid acetic) sau đó được khuấy từ ở tốc độ 500
vòng/phút (rpm) trong 2 giờ nữa để thu được sự đồng nhất. Hỗn hợp đồng nhất được đổ vào
khuôn và sau đó được đông lạnh ở 20°C trong 40 giờ. Các vật liệu đã đông lạnh sau đó ngâm
trong dung dịch NaOH 3M trong 2 ngày rồi rửa nhiều lần bằng nước DI đến trung tính. Ở
bước cuối cùng, scaffolds thu được giữ ở 2-4°C để loại bỏ dung môi còn lại và sau đó được
đông khô. Cuối cùng, hai khung định dạng CS và CS/HAp có đường kính 40mm và 20mm đã
thu được.
2.2.2. Đặc điểm của khung định dạng
Các kỹ thuật khác nhau đã được sử dụng để kiểm tra cấu trúc, hình thái, các nhóm chức năng,
độ xốp và tỷ lệ trương nở của các scaffolds tổng hợp CS và CS/HAp.
Các mẫu nhiễu xạ tia X (XRD) của scaffolds CS và CS/HAp được ghi lại trên máy đo nhiễu
xạ Siemens D5005 ở phạm vi (góc quét) 2θ (20-70°) với tốc độ quét 0,02° s-1 sử dụng bức xạ
Cu Kα (λ = 0.15406 nm). Kính hiển vi điện tử quét (SEM, S4800, Hitachi, Nhật Bản) được sử
dụng để quan sát hình thái của scafolds. Trước khi đo, các mẫu scaffold được gắn trên một
cái cọc và sau đó được phủ một lớp vàng mỏng (Bộ phun Ion E-1045, Hitachi). Đường kính
lỗ trung bình của scaffolds sau đó được tính toán thông qua phần mềm ImageJ. Quang phổ
hồng ngoại biến đổi Fourier (Nicolet iS10, Thermo Scientific) với phương pháp đo phản xạ
toàn phần được tiến hành để khảo sát các nhóm chức dự kiến, ghi lại trong vùng 500-4000
cm-1.
Độ xốp của scaffolds CS và CS/HAp đã được xác định bởi phương pháp chuyển chất lỏng, đã
được mô tả trước đó. Nước DI được sử dụng làm chất lỏng chuyển vị vì nó có thể dễ dàng di
chuyển vào các lỗ xốp mà không làm hòa tan mẫu vật liệu. Tóm lại, một mẫu khô của mỗi
loại scaffolds được cân (W1), sau đó mẫu được ngâm trong một thể tích đã biết (V1) của nước
DI chứa trong buret trong 1 giờ để nước thấm vào các lỗ của scaffold. Tổng thể tích của nước
và scaffold thấm nước được ghi là V2. Sự khác biệt (V2 - V1) đại diện cho phần khối lượng
khung scaffold (không tính phần lỗ rỗng bên trong). Scaffold đã ngấm nước được lấy ra khỏi
buret và cân (W2), thể tích nước còn lại được xác định là V3. Tổng thể tích của scaffold được
tính bởi công thức V = (V2 – V1) + (V1 – V3) = V1 – V3. Số lượng lỗ của scaffold được tính
theo công thức (1), như sau:
(W2 – W1)/ρH O
2 (1)
Độ xốp của scaffold được xác định bằng cách sử dụng phương trình sau:
(W 2−W 1)
Porosity = ρH 2 O (2)
(V 2−V 3)
Mười phép đo đã được thực hiện cho mỗi scaffold, và kết quả là giá trị trung bình của 10
phép đo.
Khả năng trương nở của scaffolds CS và CS/HAp được xác định bằng cách nhúng mẫu vào
PBS. Trước khi thí nghiệm, scaffolds được cắt thành miếng nhỏ có kích thước bằng nhau
(đường kính 10 mm). Một mẫu khô của mỗi khung định dạng có trọng lượng đã biết (Wd)
được ngâm trong PBS ở 37°C trong 24 giờ.
Sau khi ngâm, mẫu được nhẹ nhàng lấy ra và thấm lên giấy lọc để loại bỏ nước trên bề mặt.
Trọng lượng ướt của mẫu trương nở được ghi lại (Ww). Thí nghiệm được lặp lại 5 lần cho mỗi
scafold. Tỷ lệ trương nở của scaffolds được tính theo công thức sau:
Ww−Wd
S (%) = ×100 (3)
Wd
Các đặc tính cơ học của scaffolds về Young’s modulus và độ bền kéo (sức căng) được xác
định bằng cách sử dụng máy thử nghiệm Zwick Tensiler Z 2.5 ở tốc độ cắt đầu 1mm min -1.
Trước khi đo, các mẫu scaffold được tạo thành các màng mỏng, sau đó được cắt thành hình
quả tạ với kích thước theo tiêu chuẩn ASTM D882.
2.2.3. Đánh giá độ phân hủy sinh học in vitro
Khả năng phân hủy sinh học của scaffolds được đánh giá bằng cách sử dụng thí nghiệm phân
hủy lysozyme. Trước khi thí nghiệm, các scaffold được cắt thành các miếng nhỏ (10mm ×
10mm) và khối lượng (W0), chúng sau đó được khử trùng trong C 2H5OH 70% trong 1 giờ,
tiếp theo được làm khô tự nhiên trong tủ hút sinh học. Mỗi mẫu scaffold được ủ trong 10 mL
PBS chứa 0.1 mg.mL-1 lysozyme (pH = 7.4 ở 37°C) trong ống facon, và 3 bản sao được sử
dụng cho mỗi mẫu scaffold. Các ống facon sau đó được đặt trong một tủ ấp ở 37°C. dung
dịch PBS có chứa lysozyme được thay 3 ngày 1 lần. Sau khoảng thời gian ủ được xác định
trước (2, 7, 14, 21 và 28 ngày), scaffolds được lấy ra khỏi môi trường phân hủy, rửa kỹ bằng
nước DI, làm khô và cân (Wt). Sự phân hủy của scaffolds được xác định bằng phần trăm
chênh lệch khối lượng của scaffold trước và sau khi thủy phân bằng dung dịch lysozyme theo
công thức sau:
W 0−Wt
D (%) = × 100 (4)
W0
Sự thay đổi pH của dung dịch PBS cũng được đo trong thời gian thử nghiệm bằng máy đo pH
(HI 2211, Hanna Instruments, USA).
2.2.4. Kiểm tra khả năng tổng hợp sinh học in vitro
Khả năng khoáng hóa sinh học của scaffolds được đánh giá thông qua các thử nghiệm in
vitro trong dung dịch SBF. SBF được chuẩn bị với sự tham khảo giao thức của Kokubo.
Trước khi thử nghiệm, dung dịch SBF được lọc qua ống đong 0,22 μm Milipore, và tất cả
dụng cụ đã được khử trùng trong máy khử trùng ở 120°C trong 3 h để loại bỏ nhiễm khuẩn vi
khuẩn. Các scaffold đã bị cắt thành các mảnh nhỏ có đường kính 10mm, được khử trùng
trong ethanol 70% ở 4°C trong 2 h, và làm khô dưới tủ hút sinh học. Ba mảnh của mỗi mẫu
được ngâm trong 35 mL SBF trong các thùng polyethylene đậy kín ở 37°C. Sau khi được
ngâm SBF trong 10 và 15 ngày, các mẫu được lấy ra, rửa nhẹ bằng nước DI để loại bỏ các
ion khoáng kết dính, và cuối cùng được làm khô ở 37°C. Quá trình khoáng hóa sinh học của
scaffolds được xác định bằng cách đánh giá sự hình thành apatite trên bề mặt của scaffolds.
Kết quả được quan sát thông qua SEM và phân tích quang phổ năng lượng tán xạ tia X
(EDX).
2.2.5. Khảo sát sự hấp phụ protein
Nghiên cứu hấp phụ protein được thực hiện bằng cách ủ giá thể trong MEM có bổ sung FBS.
Đầu tiên các scaffold được cắt thành các miếng nhỏ có đường kính 10 mm và dày 2mm. Các
miếng này sau đó được đặt trên các đĩa 24 giếng và được khử trùng dưới đèn UV trong 1 h.
Sau đó, các mẫu được ủ trong 1 mL MEM chứa 10% (v/v) FBS ở 37°C trong 2, 4, 6 và 24 h.
Sau mỗi lần ủ, scaffolds được lấy ra và rửa nhẹ nhàng bằng PBS ba lần để loại bỏ các protein
không kết dính. Sau đó, chúng được làm khô ở 37°C trong 1 h. Tất cả các protein được hấp
phụ trên các mẫu scaffold được rửa giải bẳng cách ủ mẫu trong dung dịch SDS 1% trong 30
phút (thao tác này được tiến hành 2 lần). Số lượng protein được hấp phụ trên bề mặt của
scaffolds và khoảng trống mà không có mẫu (trước khi hấp phụ) được đo ở bước sóng 260 và
280 nm sử dụng máy quang phổ Biochrom GeneQuant 1300.
2.2.6. Số liệu thống kê
Tất cả các dữ liệu được thu thập và biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn trung bình. Các phân
tích thống kê được thực hiện bằng one-way ANOVA. Tín hiệu được xác định ở p < 0.05.

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Mô tả khung định dạng 3D
Scaffolds 3D được tổng hợp bằng phương pháp đông khô với một scaffold chỉ chứa CS và
mẫu còn lại bao gồm CS và HAp. Một số đặc điểm của khung định dạng tổng hợp được tóm
tắt trong Bảng 1. Hình ảnh chụp kỹ thuật số của scaffolds được thể hiện trong Hình. 1A, cho
thấy sự hình thành của scaffolds CS và CS/HAp có đường kính 40 mm và chiều cao 20 mm.
Các mẫu XRD của scaffolds được đo để xác định pha cấu trúc của chúng. Các mẫu XRD của
scaffolds CS và CS/HAp và mẫu của các hạt nano HAp để so sánh được thể hiện trong Hình
1B. Một phổ phản xạ rộng (peak) quanh góc quay 2θ = 20° được quan sát thấy trong các mẫu
XRD của scaffolds CS [Hình. 1B(a)] và CS/HAp [Hình. 1B(b)], được ấn định cho sự hiện
diện của CS như một pha vô định hình trong cả hai scaffold. Ngoài peak của CS, các peak
đặc trưng tại góc quay 2θ = 26.09°, 31.68°, 32.27°, 34.13°, 39.67°, 46.64°, 49.52°, và 53.54°
có thể nhìn thấy trong mẫu XRD của scaffold CS/HAp, phù hợp tốt với JCPDS file no.09-423
của HAp và tương ứng với các mặt phẳng (002), (211), (112), (202), (310), (222), (213), và
(004). Các quan sát đã xác định sự hiện diện của pha tinh thể HAp trong composite CS/HAp
scaffolds. Mẫu XRD của các hạt nano HAp tinh khiết [Hình. 1B(c)] cho thấy các peak đặc
trưng tinh thể với cường độ cao, nằm ở 2θ = 25.85°, 31.67°, 32.15°, 33.98°, 39.65°, 46.61°,
49.43°, và 53.24°. Liên quan đến các phản xạ đặc trưng của HAp trong CS/HAp scaffolds,
các giá trị này ở scaffolds composite được chuyển lên cao hơn một chút so với giá trị của
HAp tinh khiết. Cường độ của các peak HAp giảm đi đáng kể trong scaffolds composite.
Hình SEM với các độ phóng đại khác nhau cho thấy cả hai khung định dạng đều có cấu trúc
xốp cao. Các hình ảnh có độ phân giải cao chỉ ra rằng hình thái bề mặt nhẵn được quan sát
thấy ở scaffolds CS (Hình. 2b), trong khi hình thái bề mặt thô được tạo ra ở scaffolds
CS/HAp (Hình. 2e) do có sự bổ sung HAp vào matrix polymer. Hình ảnh SEM có độ phân
giải cao nhất của scaffolds CS/HAp (Hình. 2f) cho thấy các hạt nano HAp phân bố đồng nhất
và chặt chẽ trong matrix CS, và không có bề mặt phân cách giữa các pha HAp và CS được
quan sát, do đó xác định rằng các hạt nano HAp thể hiện ái lực cao với matrix CS. Các thành
lỗ của scafolds CS/HAp được quan sát thấy dày hơn so với thành lỗ của CS scaffolds (Hình.
2c và f) vì sự tích hợp của HAp vào matrix CS. Các tính toán sâu hơn dựa trên hình ảnh SEM
sử dụng phần mềm ImageJ cho thấy kích thước lỗ trung bình của scaffolds CS và CS/HAp là
330 và 265 μm, dao động từ 230-457 μm đến 133-420 μm (Bảng. 1 và Hình. 3).
Các phân tích thống kê đã chứng minh rằng kích thước lỗ của scaffolds CS/HAp nhỏ hơn
đáng kể so với CS scaffolds (p < 0.001, Hình. 3). Lỗ xốp đóng một vai trò quan trọng trong
sự phát triển của mô xương. Lỗ xốp đủ lớn (> 100 μm) có thể hỗ trợ các tế bào nguyên bào
xương với kích thước điển hình là 10-30 μm di chuyển và sinh sôi.
So sánh (Hình. 3) cho thấy rằng độ xốp của scaffolds CS/HAp thấp hơn đáng kể so với
scaffolds CS (p* < 0.001) do lực tương tác của các hạt nano HAp vào matrix CS. Một
scaffolds độ xốp phải đạt ít nhất 90% để có diện tích bề mặt cao cho các tương tác tế bào-
polymer, để có đủ không gian để hình thành ECM và để có được sự khuếch tán tối thiểu trong
khi tế bào trao đổi chất. Tuy nhiên, một sự thỏa hiệp giữa độ xốp và các đặc tính cơ học của
scaffolds đã đc tạo ra. Độ xốp cao (Ví dụ: 90%) có thể làm giảm thuộc tính cơ học của
scaffolds. Scaffolds với độ xốp ở mức trung bình 60-75% đã được sử dụng để phát triển
xương vì làm tăng tính cơ học ở độ xốp đó. Scaffolds CS/HAp thể hiện độ xốp tối ưu khiến
nó trở thành ứng cử viên tốt để sử dụng làm khung định dạng cho xương.

Các phân tích phổ FTIR được thực hiện để kiểm tra tương tác giữa polymer-HAp (Hình. 4 và
Bảng. 2). So sánh phổ IR của scaffolds CS/HAp với CS, tất cả các dải đặc trưng (band) của
CS đều có trong scaffolds composite. Tuy nhiên, các band của CS/HAp được chuyển đến giá
trị cao hơn một chút so với các giá trị của scaffolds CS (Bảng. 2).

Tỷ lệ trương nở đóng vai trò là một trong những đặc điểm chính của vật liệu sinh học trong
BTE. Khi scaffolds được cấy vào một vị trí khiếm khuyết, chúng tiếp xúc với dịch trong cơ
thể và có thể bị sưng lên. Sự trương nở đặc trưng cho khả năng hấp thu dịch cơ thể bởi các
scaffolds trong điều kiện sinh lý. Sưng tấy có thể ảnh hưởng đến hình dạng và độ ổn định cơ
học của scaffolds trong mọi thời điểm. Ví dụ, trong quá trình trao đổi chất tế bào, kết quả
sưng tấy trong việc tăng kích thước lỗ, tạo điều kiện dễ dàng để khuếch tán các chất dinh
dưỡng, tăng cường sự xâm nhập tế bào và sự kết dính. Tuy nhiên sự trương nở quá mức sẽ
làm giảm độ bền cơ học, do đó làm nó không phù hợp trong các ứng dụng mô xương. Tính
chất trương nở của scaffolds được nghiên cứu bằng cách nhúng chúng vào PBS trong 24 h, và
kết quả thu được thể hiện ở Hình. 4B. Như trong Hình. 4B, tỷ lệ trương nở của scaffolds CS
là 71.03% ± 6.21%, trong khi đó của scaffolds CS/HAp là 55.40% ± 5.61%. Nhìn chung, sự
hấp thu (uptake) của scaffolds CS là cao hơn đáng kể so với CS/HAp (p** < 0.01). CS là một
polymer tự nhiên có tỷ lệ trương nở cao, giới hạn nó trong các ứng dụng tổng hợp khung định
dạng BTE. Bổ sung các hạt nano HAp vào matrix CS rất hiệu quả trong việc giảm tỷ lệ
trương nở của scaffolds composite CS/HAp.
Các đặc tính cơ học của scaffolds CS và CS/HAp được thể hiện trong Bảng. 1. Người ta quan
sát thấy rằng Young’s modulus của scaffolds CS/HAp (12.74 MPa). Tuy nhiên, độ bền kéo
của scaffolds CS/HAp cao gấp đôi scaffolds CS (tương ứng là 2.45 MPa và 1.21 MPa). Ứng
suất tối đa mà scaffolds CS/HAp có thể chịu được trước khi bị gãy đã được cải thiện rất nhiều
so với của CS. Kết quả cho thấy rằng sự tích hợp của các hạt nano HAp trong matrix CS hầu
như không thay đổi độ đàn hồi, nhưng tăng đáng kể độ bền kéo của scaffolds composite.
Theo các báo cáo đã có, độ bền kéo của xương xốp (cancellous bone) trong khoảng từ 1 đến 5
MPa. Do đó, độ bền kéo của scaffolds CS/HAp có thể tương thích rất tốt với độ bền kéo của
xương xốp. Vì vậy, scaffolds CS/HAp là vật liệu sinh học thích hợp trong các ứng dụng BTE.

3.2. Kiểm tra phân hủy sinh học in vitro

Sự phân hủy sinh học của khung định dạng có vai trò quan trọng trong hiệu suất dài hạn của
vật liệu chế tạo mô bởi vì nó cung cấp không gian cho sự phát triển cảu mô và sự lắng đọng
chất nền. Một scaffold lý tưởng phải có tốc độ phân hủy sinh học phù hợp với tốc độ tái tạo
mô được sử dụng trong BTE. Do đó, các nghiên cứu về tốc độ phân hủy vật liệu sinh học rất
quan trọng đối với các ứng dụng sau này của chúng.
Trong nghiên cứu này, các thử nghiệm phân hủy sinh học được thực hiện trong lysozyme
chứa trong dung dịch PBS và kết quả được thể hiện trong Hình 5a.
So sánh sự giảm khối lượng của CS và CS/HAp scaffolds, sự phân hủy của các scaffolds
CS/HAp chậm hơn so với CS đối với tất các thời điểm thử nghiệm. Nguyên nhân có thể được
cho là do việc bổ sung hạt nano HAp vào matrix CS. Việc bổ sung nHAp làm giảm tốc độ
phân hủy các scaffolds composite.
3.3. Sự khoáng hóa sinh học in vitro
Yêu cầu cần thiết để một vật liệu sinh học tổng hợp liên kết với xương sống là sự hình thành
apatite giống xương, được gọi là khoáng sinh học trên bề mặt của nó khi được cấy vào cơ thể
sống.
Trong nghiên cứu này, khả năng khoáng hóa sinh học của scaffolds CS và CS/HAp đã được
kiểm tra thông qua các thử nghiệm trong ống nghiệm bằng cách ủ mẫu trong dung dịch SBF
mô phỏng thành phần điện giải của huyết tương người. Hình thái bề mặt của scaffolds
CS/HAp đã bị thay đổi đáng kể sau khi ủ trong SBF trong 10 và 15 ngày. Tuy nhiên, hầu như
không có bất kỳ thay đổi nào trên bề mặt của CS scaffolds. Nghiên cứu này cho thấy khả
năng khoáng hóa sinh học trong ống nghiệm của scaffolds CS/HAp tốt hơn so với các
scaffolds khác.

3.4. Hấp phụ protein

Hoạt động của protein trên bề mặt đóng một vai trò quan trọng trong xác định bề mặt phân
chia mô cấy. Trước khi tế bào bám dính vào bề mặt vật liệu sinh học, protein bị hấp phụ từ
dịch của cơ thể, và sự hấp phụ này có thể kiểm soát sự kết dính và hành vi tiếp theo của tế
bào. Phân tích thống kê cho thấy số lượng protein được hấp thụ trên scaffolds CS/HAp cao
hơn đáng kể so với CS ở tất cả các thời gian ủ (p*** <0.001). Sự gia tăng đáng kể các protein
được hấp phụ trên scaffolds composite được cho là do sự hiện diện của hạt nano HAp. Việc
bổ sung HAp có thể sửa đổi các đặc điểm của bề mặt scaffold (ví dụ, thành phần hóa học,
điện tích và hình thái học), do đó tăng số lượng các vị trí hoạt động trên scaffolds composite
để có thể tương tác với protein.

4. Kết luận
Nghiên cứu này chứng tỏ rằng scaffolds mô phỏng sinh học 3D CS/HAp đã được chế tạo
thành công từ các nguồn tự nhiên. Việc bổ sung nano-HAp đã cải thiện đáng kể các đặc tính,
hoạt tính sinh học và khả năng tương thích sinh học của các khung định dạng 3D CS/HAp.
Scaffolds CS/HAp thể hiện cấu trúc lỗ xốp phù hợp, tỷ lệ trương nở, độ bền kéo và khả năng
phân hủy sinh học, những yếu tố cần thiết trong khung định dạng xương. Hơn nữa, nghiên
cứu hiện tại cho thấy scaffolds CS/HAp cho thấy khả năng sinh tổng hợp trong ống nghiệm
tốt hơn và khả năng hấp phụ protein cao hơn nhiều so với các công trình trước. Thành phần
vô cơ bắt chước apatite sinh học đóng một chức năng quan trọng trong quá trình tổng hợp
sinh học nâng cao và khả năng hấp phụ protein của scaffolds composite CS/HAp là vật liệu
tiềm năng cho các ứng dụng BTE.