ELEKTROFOREZ

Öğr. Gör. Tuğba SOYDAŞ

İAÜ TIP FAKÜLTESİ
TIBBİ BİYOLOJİ ABD
 ELEKTROFOREZ
Moleküler biyoloji protokollerinde genellikle önce
proteinlerin veya nükleik asitlerin bir karışımı elde edilir.
– Çalışılacak bir proteinin veya bir nükleik asidin
önce hücrelerden izole edilmesi ve saflaştırılması
gerekmektedir.
• İzolasyon sonrasında jel elektroforezi ile;
– Nükleik asitlerin veya
– Proteinlerin
• Farklı formları birbirlerinden ayrılır.
 JEL ELEKTROFOREZİ
• Nükleik asitlerin (DNA, RNA) analizinde kullanılan
çeşitli yöntemlerden biri de jel elektroforezidir.

• Bu yöntem saflaştırılmış nükleik asitlerin ve

proteinlerin molekül ağırlıklarının, molekül
büyüklüklerinin, miktarlarının ve alt tiplerinin
saptanmasında geniş ölçüde kullanılır.
• DNA, RNA veya proteinlerin elektroforez yöntemi ile
analizi, bu moleküllerin elektriksel bir alanda, jel
içindeki göçlerine dayanır.

• Jel elektroforezinde kullanılan esas madde (matriks),

molekülleri büyüklüklerine göre ayırmak için
kullanılır.
Elektroforez yöntemleri arasında;
 agaroz jel elektroforezi,
 poliakrilamid jel elektroforezi
 kapiller jel elektroforezi

gibi değişik uygulama tipleri vardır.

AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ

• Agaroz jel elektroforezi, DNA analizinde en sık kullanılan

elektroforez yöntemidir.
– Agaroz, deniz yosunlarından (Agar agar) elde edilen bir
polisakkarid’dir.
– Sıcak suda erir, soğutulduğunda ise polimerize olarak jel yapısı ortaya
çıkar.
– Agaroz jel, agarozun tampon içinde (TBE-Tris Borik asit EDTA) berrak
bir çözelti haline gelene kadar kaynatılarak eritilmesiyle hazırlanır.
– Eritilen agaroz bir kalıba dökülür ve katılaşmaya bırakılır.
• Jel matriksinin yoğunluğu, agarozun konsantrasyonu ile doğru
orantılıdır.
• Agaroz jelin konsantrasyon değişiklikleri ile (%0.5 -1.5) matrikste
oluşan por çapları değiştirilebilir.
 YÖNTEM

• Kullanılacak jelin büyüklüğüne göre tartılan agaroz

TBE tamponu içerisinde kaynatma yolu ile
çözündürülür.
• Elle tutulabilecek sıcaklığa (50° C) düştüğünde 0.5
μg/ml etidyum bromür ilave edilir.g /ml etidyum bromür ilave edilir.
• Kenarları kapatılmış kalıplar içerisine dökülür.
• Kuyucuk oluşturmak amacıyla tarak yerleştirilerek
donması beklenir.
• DNA’nın jelde görünür hale gelebilmesi için
etidyum bromür (EB) ile boyanır.

• EB, DNA’ya bağlanır ve UV ışığı absorblayarak

kırmızı-turuncu flouresan ışık verir. Jelde DNA
bantları UV ışık kaynağı altında gözlenir.
• Bu boyama DNA’nın konsantrasyonuna bağlı
olarak zayıf veya kuvvetli olabilir.
YÖNTEM

•Tarak çıkarılır ve jel, elektroforez tankına yerleştirilir.

•Tankın içi elektroforez tamponu ile doldurulur.
•izole edilen ve TE içinde bulunan DNA solüsyonundan alınarak
üzerine 1/5 hacimde yükleme boyası eklenir ve karışım
mikropipet yardımıyla jeldeki kuyucuklara yüklenir.
•Elektroforez tankı güç kaynağına bağlanarak jelden elektrik
akımı geçirilir.
•Elektroforez sona erdikten sonra jel bir transillüminatör üzerine
alınır ve DNA, UV ışık altında gözlenir.
AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ

• Elektrik akımı uygulandığında, nötral pH’ da (-) yük

taşıyan DNA, jel üzerinde anoda doğru hareket eder.

• DNA örneklerinde küçük moleküller büyüklerden

daha hızlı olarak (+) elektroda doğru ilerler.

• Jeldeki DNA bantlarının analizinde molekül

boyutunun saptanmasında belirli DNA belirteçleri
kullanılır ve çalışma kuyucuklarından birine DNA
belirteci(marker) yüklenir.
 AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ
Elektroforezde DNA’nın jel içindeki hareket hızını
etkileyen çeşitli faktörler vardır. Bunlar;

1. DNA molekülünün büyüklüğü

2. Matriks konsantrasyonu (Jel konsantrasyonu).
3. Uygulanan voltaj.
4. Elektroforez tamponunun çeşidi ve konsantrasyonu.

İ.Ü. CTF. Tıbbi Biyoloji AD Temel Genetik Pratik Notlarından değiştirilmiştir.

Agaroz jel elektroforezi ile DNA’nın ayrımlanması

Nucleotide

Purine or
Pyrimidine
O Base
5'
-O P O b-glikozidik bağ
O
H H 1'
O- 4'
H 3' 2' H RNA- riboz (R)
O H(OH) DNA – deoksiriboz (dR)
Phosphate
Pentose sugar
Nucleoside

5-25
gelelectrophoresis.exe
ElectrophoresisDNA_pc.exe
ElectrophoresisBands_pc.exe
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ve Agaroz
Jel Elektroforezi
• Dizisi bilinen bir DNA bölgesinin
– bölgenin sınırlarını belirleyen kısa oligonükleotidler
(Primerler) vasıtasıyla,
– in vitro koşullarda
– sıcaklık döngüleri kullanılarak
• Klonlanmasıdır.

• Agaroz jel elektroforezi konvansiyonel PCR reaksiyonu

sonrası reaksiyonun gerçekleşip gerçekleşmediğinin ve
doğru olup olmadığının belirlenmesinde kullanılır.
Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi (RFLP)
ve Agaroz Jel Elektroforezi

• RFLP:
– Restriksiyon enzimleri vasıtasıyla dizisi bilinen ve
PCR ile çoğaltılan DNA parçası üzerindeki tek
nükleotid değişimlerinin saptanması ve örneğin o
değişiklik için genotipinin belirlenmesinde kullanılır.

• Reaksiyon sonrası sonuç agaroz jel

elektroforezinde analiz edilir.