CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THỰC PHẨM (210119)

VSV biến đổi Gene

(GM microorganisms)
GV: Nguyễn Mạnh Cường
Email: nnguyenccuong@gmail.com

WELCOME TO
CLASS – Week 10!!!
Prokaryotic cell – TB nhân sơ
Eukaryotic cell –
TB nhân thực
 Xem các
enzymes được

VSV biến đổi gene cho phép dùng

trong thực
phẩm theo
FSANZ
• Vi khuẩn (Bacteria)
• Gram âm – chủ yếu là E. coli.
• Gram dương – chủ yếu là Bacillus.

• Nấm (Fungi)
• Nấm men (Yeast) – Kluyveromyces là đối tượng chính.
• Nấm mốc (Moulds) – Aspergillus là đối tượng chính.

Nếu so sánh với động vật và thực vật biến đổi gene, VSV có ưu
điểm phát triển nhanh hơn, dễ tạo ra những thay đổi mang tính di
truyền hơn.
VSV biến đổi gene
Tại sao chúng ta cần sử
dụng VSV biến đổi gene?

• Sản phẩm sinh học (ví dụ: enzyme) vì nhiều lý do không thể được
tạo ra một cách tự nhiên bởi một vi khuẩn bình thường → cần VSV
biến đổi gene → Yêu cầu đối với VSV biến đổi gene?
Ø Vật chủ GM phải không gây bệnh và không độc hại.
o GRAS - Generally Recognized as Safe.
Ø Vật chủ GM nên cho năng suất sản phẩm cao.
Ø Vật chủ GM có khả năng phát triển nhanh chóng.
Ø Vật chủ GM có khả năng phát triển trong các môi trường rẻ tiền.
Ø Vật chủ GM không được tạo ra các chất chuyển hóa độc hại.
Ø Vật chủ GM không nên tiết ra nhiều protein khác (sản phẩm phụ).
VSV biến đổi gene

Lựa chọn VSV

• Vi khuẩn - không có khả năng đường hoá protein.

• Nấm có khả năng đường hoá protein.

• Vi khuẩn Gram dương có thể tiết ra protein hiệu quả

hơn vi khuẩn Gram âm.
Ø Vi khuẩn Gram âm có màng lipid bên ngoài .
 Gram-positive
Bacterial cell

- Enzymes có thể
khuếch tán qua
các lỗ nhỏ của
thành tế bào.

Gram-negative
Bacterial cell

Enzymes ko thể
khuếch tán qua
màng ngoài của tế
bào.
VSV biến đổi gene
Ứng dụng VSV GM
Dược học
• Nguồn protein điều trị
Ø Đầu tiên là insulin của E. coli (1978).
Ø Các yếu tố đông máu, hormone tăng trưởng, vắc xin.

Thực phẩm
• Nguồn enzymes
• Chymosin trong làm pho mát
• Amylase, lipase, pectinase, protease…
VSV biến đổi gene
Ứng dụng VSV biến
đổi gene
Thực phẩm (tt)
• Nguồn hormones tăng trưởng.
• Bolvine - Hormone tăng trưởng của bò
• Nguồn axit amin
• Tryptophan, proline
• Trong tương lai
• Vaccine ăn được
• Nuôi cấy giống khởi động kháng thực khuẩn.
GM enzymes
Những VSV này đã được xác
nhận là nguồn sản xuất
enzymes an toàn và có khả
năng thích ứng với mội
trường công nghiệp.
VSV biến đổi gene
Ứng dụng VSV biến
đổi gene

• VSV GM không được hiện diện trong thực phẩm, nhưng các
sản phẩm của chúng được chấp nhận.
• Các bước đưa sản phẩm VSV GM vào thực phẩm:
Ø Xây dựng hệ thống tổng hợp và sản xuất protein.
Ø Chuyển đổi 1 VSV bình thường sang GM.
Ø VSV GM được nuôi trong lò phản ứng sinh học (bioreactor).
Ø Sản phẩm có giá trị được tách khỏi vi khuẩn và tinh lọc.
Ø Sản phẩm cuối cùng không có vi khuẩn GM (hoặc DNA của VSV
GM).
VSV biến đổi gene
Chủ đề

1. Chymosin tái tổ hợp

2. Bacillus GM
3. Fungi GM
VSV biến đổi gene
Chymosin
• Là enzyme thuỷ phân protein được sử dụng
trong sản xuất pho mát.
• Được thêm vào qt axit hóa sữa - tăng cường
đông tụ casein.
Ø Cắt к-casein giữa Phe105-Met106 thành para-
к-casein và glycomacropeptide.
Ø Độ đặc hiệu cao.
• Có nguồn gốc truyền thống từ rennet ở dạ
dày của bê khi giết mổ.
VSV biến đổi gene
Chymosin
Các vấn đề từ nguồn sản xuất chymosin truyền
thống:
• Nguồn cung - không ổn định (nhu cầu toàn cầu
về thịt bê).
• Hoạt động - không nhất quán.
• Độ tinh khiết - ô nhiễm pepsin của bò (tạo mùi
và phân hủy protein không mong muốn).
• Không được xếp vào loại ăn chay.
VSV biến đổi gene
Chymosin
• Các chất thay thế rennet bê đã được phân tích
Ø Nguồn gốc động vật (pepsin bò, pepsin lợn, pepsin gà)
Ø Nguồn gốc nấm (Mucor latexillus, Mucor miehei, Endothia parasitica)
• Tất cả đều có khuyết điểm
• Nhạy cảm với pH.
• Quá phân giải protein (đắng).
• Quá bền nhiệt (tạo ra vấn đề về chế biến whey và các vấn đề về chất
lượng pho mát cứng).
VSV biến đổi gene
Chymosin tái tổ hợp
• Sản xuất chymosin bê từ vi khuẩn
GM
Ø Từ E. coli đầu tiên (1990)
Ø Là enzyme tái tổ hợp đầu tiên được
FDA Hoa Kỳ chấp thuận sử dụng trong
thực phẩm.
Ø 2008 - 80% pho mát được làm bằng
chymosin tái tổ hợp (Mỹ và Anh).
VSV biến đổi gene
Chymosin tái tổ hợp

• Cấu trúc chymosin

Ø Chymosin là một protein phức tạp
Ø Được chuyển vào trong tế bào biểu mô bê
• Ban đầu không hoạt động (preprochymosin).
• Phần "trước" của protein là tín hiệu bài tiết.
• Tín hiệu bài tiết bị loại bỏ trong quá trình bài
tiết.
• Phần “pro” của protein bị loại bỏ bởi hoạt
động xúc tác tự động (tự cắt ra) chỉ trong
điều kiện có tính axit. pre pro Mature chymosin
• Protein trưởng thành cuối cùng là enzyme
chymosin hoạt động.
VSV biến đổi gene
Chymosin tái tổ hợp
• Cần quan tâm cấu trúc chymosin
Ø Tính đặc hiệu cao.
Ø Chymosin tái tổ hợp cần phải hoàn toàn giống nhau (trình tự và cấu
trúc).
VSV biến đổi gene
Chymosin tái tổ hợp
• Vấn đề với vật chủ vi khuẩn (thử nghiệm ban đầu)
Ø Không tiết ra được chymosin tái tổ hợp
Ø Tạo ra proteins không hòa tan (5% tổng số protein tế bào)
o Trong tế bào vi khuẩn xuất hiện các khối protein biến tính.
Ø Thường xảy ra với các protein có nguồn gốc sinh vật nhân thực.
o Lưới nội chất và bộ máy golgi trong tế bào biểu mô bê là những môi trường khác nhau đối
với tế bào chất của vi khuẩn.
o Chaperones cũng khác nhau (có thể không nhận ra)
Ø Proteins đưa vào VK có thể cần được làm sạch trước hoặc gây biến đổi từ
đầu trước khi đưa vào.
o Đắt tiền.

• Vật chủ thay thế - nấm (loài nhân thực)

VSV biến đổi gene
Chymosin tái tổ hợp

• Nấm men (yeast) – Thử nghiệm ban đầu.

Ø Cũng có plasmid.
Ø Khó xảy ra biến đổi sinh học hơn vi khuẩn
o Cần sử dụng electroporation (qt điện hoá tế bào để tăng tính
thấm của màng tế bào và đưa các hợp chất bên ngoài hay
DNA vào tế bào).
o Cần loại bỏ thành tế bào nấm men trước tiên – thành tế bào
dày, cản trở việc cấy đoạn chymosin gốc vào nấm men.
Ø Một lượng lớn chymosin được sản xuất.
o Nhiều sản phẩm phụ không hòa tan được.
o Không tiết ra được chymosin.
VSV biến đổi gene
Chymosin tái tổ hợp

• Nấm men (yeast) – TT

Ø Chymosin do tế bào biểu mô bê tiết ra
o Tín hiệu bài tiết không được nhận diện bởi hệ thống bài
tiết trong nấm men.
Ø Chymosin (trong plasmid) trong bò được cấy thử vào
Saccharomyces.
Ø Thử tín hiệu bài tiết trong Saccharomyces.
o Thành công - chymosin được tiết ra một cách hiệu quả
o Vấn đề - năng suất thấp
üKhông hiệu quả về chi phí.
VSV biến đổi gene
Chymosin tái tổ hợp
• Nấm men (yeast) – TT
Ø Thử một loại men khác
o Kluyveromyces lactis
ü Loại men này tiết ra một lượng lớn nhiều loại proteins
một cách tự nhiên.
ü Nguồn sản xuất lactase – ezyme phân huỷ lactose →
phổ biến ngoài thị trường.
ü Sản lượng cao của chymosin được tiết ra.
VSV biến đổi gene
Chymosin tái tổ hợp

Chymosin thương mại:

• Nguồn vi khuẩn (CHY-MAX, Chr Hansen)

Ø E. coli
• Nguồn nấm men (Maxiren, DSM Foods)
Ø Kluyveromyces lactis
• Nguồn nấm mốc (Chymogen, Chr Hansen)
Ø Aspergillus niger

http://www.chr-hansen.com/press/news/show_news/introducing-chy-maxR-m-a-major-innovation-in-coagulants.html
http://www.dsm.com/en_US/html/dfs/dairy-products-enzymes-maxiren.htm
VSV biến đổi gene
Chymosin tái tổ hợp

• Một nghiên cứu đã so sánh chymosin tự nhiên (bê) và

chymosin tái tổ hợp khảo sát trên 19 loại phô mai khác nhau.
Ø Chất lượng phomat hầu như không có sự khác biệt.
Ø Phomat dùng chymosin tái tổ hợp phù hợp ăn chay, còn
chymosin từ ĐV thì không.
VSV biến đổi gene
Chymosin tái tổ hợp
• Quy định an toàn (FDA - Mỹ)
Ø 2 loại chymosin đều được đánh giá là an toàn trong sử dụng
cho thực phẩm
o Đánh giá độc tính - không có nguy cơ độc lực từ chymosin.
Ø Quá trình tinh lọc chymosin
o Quá trình tinh lọc đối với chymosin tái tổ hợp đơn giản hơn.
o Tiêu diệt vật chủ vi khuẩn GM.
o Loại bỏ tạp chất của vi khuẩn GM, hầu hết là tạp chất họ
nấm
ü Độc tố nấm mốc là mối quan tâm chính.
VSV biến đổi gene
GM Bacillus
• Được sử dụng trong nhiều thập kỷ làm nguồn sản xuất enzyme
tái tổ hợp
• Là vi khuẩn gram dương
Ø Có khả năng tiết ra proteins cao.
Ø Bacillus là vi khuẩn môi trường (phổ biến trong đất)
o Luôn tiết ra các enzyme phân giải chất hữu cơ để lấy chất dinh dưỡng.
• Bacillus subtilis (VK kiểu mẫu)
• Bacillus licheniformis
• Bacillus amyloliquefaciens
• Geobacillus stearothermophilus
VSV biến đổi gene
GM Bacillus
• Hầu hết VK chi Bacillus được đánh giá là
GRAS
Ø Không liên quan đến bệnh
Ø Hệ gen sau khi được giải trình tự
o Khác với Bacillus cereus (sinh độc tố gây ngộ
độc thực phẩm) và Bacillus anthracis (bệnh than)
o Không có gen tạo độc tố
• Có thể tạo bào tử
Ø Không mong muốn trong sản xuất enzyme
công nghiệp.
Ø Tạo đột biến không sinh sản bào tử.
VSV biến đổi gene
GM Bacillus
• Khả năng sản sinh và tiết proteins cao
Ø Có thể tách tế bào một cách đơn giản khỏi môi trường nuôi cấy có
chứa enzyme bằng cách ly tâm / lọc.
• Nhưng đồng thời cũng sản xuất ra protease
Ø Phân hủy các proteins / enzymes quan tâm khác.
Ø Phát triển các chủng đột biến tkhông tạo ra protease.
• Cần tách / tinh sạch enzyme quan tâm từ hỗn hợp proteins tiết
ra.
Ø Phương pháp thay thế là sao chép gen vào các chủng Bacillus đã
biến đổi.
VSV biến đổi gene
Nấm GM
• VSV nhân thực
• Chất sản sinh và tiết protein tốt
Ø Nấm là loài VSV môi trường (phổ biến trong đất).
Ø Thường có phân huỷ phân hủy các hợp chất polyme lớn (protein,
xenlulo, tinh bột) để lấy chất dinh dưỡng từ xác thực vật chết.
• Nấm mốc (đa bào)
Ø Aspergillus
Ø Fusarium
Ø Trichoderma
• Nấm men (đơn bào)
Ø Kluyvaryomyces
VSV biến đổi gene
Nấm GM

Aspergillus niger
• Trình tự bộ gen được giải trình tự hoàn toàn vào
năm 2001.
• Bộ gene bao gồm 14.000 genes nhỏ (VK có bộ
gene khoảng 4.000 – 5.000 genes)
• Có khả năng tạo ra 600 proteases
Ø 60 proteases có thể được sử dụng cho sản xuất.
VSV biến đổi gene
Nấm GM

• Sử dụng trong thực phẩm lên men truyền thống

Ø Tất cả đều không gây bệnh

• Nấm mốc GM có độc hại?

Ø Một số loài nấm tạo ra mycotoxins (độc tố nấm mốc gây ung thư) liều
lượng thấp.
Ø Nấm GM cũng có các gen để mã hóa mycotoxins, nhưng chúng
thường bị bất hoạt.
Ø Điều kiện lên men được kiểm soát để giảm thiểu sản sinh độc tố
mycotoxins.
 Ứng dụng nấm GM
Mycoprotein
• Protein tế bào đơn – sản phẩm thịt có nguồn gốc
thực vật và VSV → sản phẩm chay.
• Thường dùng trong sản xuất thực phẩm chay
• 44% protein, 25% chất xơ, ít chất béo / cholesterol
• Được chấp thuận từ năm 1984 tại Anh
Ø Sau đó ở Mỹ, Pháp, Thụy Sĩ, Thụy Điển, Ireland, Bỉ…
Ø Doanh thu 250 triệu đô la ở Anh hằng năm.
• Giống nấm ăn (mushrooms), nhưng chế biến khác.
• Không có độc tố nấm mốc – mycotoxins.
 Chú giải
• Chaperone: là các protein hỗ trợ quá trình "cuộn gấp" hoặc
"duỗi mở" hóa trị cũng như lắp ráp hoặc tách các đại phân tử
khác. Chaperone có mặt khi các đại phân tử thực hiện các
chức năng sinh học bình thường của chúng và hoàn thành
chính xác các quy trình gấp và/hoặc lắp ráp.
• Electroporation: Quá trình điện hóa, hay quá trình ổn định điện,
là một kỹ thuật vi sinh, trong đó điện trường được áp dụng cho
tế bào để tăng tính thấm của màng tế bào, cho phép đưa hóa
chất, thuốc hoặc DNA vào tế bào.
 NỘP NOTEBOOK
• Link GG Drive sẽ nộp notebook cá nhân.
https://drive.google.com/drive/u/1/folders/1UkQx0dXgMvGBhD81pw4QyV9_MtDkozhc

• Chú ý: khi nộp notebook, các bạn lưu tên dưới dạng:
• "Class... - MSSV - Họ và tên" (có khoảng cách trước và sau gạch nối).

• Hạn chót nộp notebook: 12h00 pm (Trưa) Chủ Nhật 12/12/2021.

• Tất cả mọi trường hợp nộp trễ sẽ bị mất điểm hoặc không có điểm tuỳ theo lý do.
• QUAN TRỌNG: Sau khi nộp, các bạn cần tự chụp lại 1 bức ảnh có file các bạn
trên drive để đề phòng trường hợp file các bạn bị mất hoặc bị ai xoá. Khi các bạn
quên chụp, nếu có trường hợp gì xảy ra đối với file của các bạn, các bạn sẽ tự chịu
trách nhiệm.
QUESTIONS?
………………………
………………………
………………………
………………………
………………………
………………………
………………………
………………………