DNA İZOLASYON TEKNİKLERİ

Dr. Ali Osman ADIGÜZEL

 Bir moleküler biyolog kaç farklı tip DNA hazırlama
ihtiyacı duyar

1) Total hücre DNA’sı

2) Plazmid DNA’sı
3) Faj DNA’sı

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

 Total hücre DNA’sının hazırlanması sırasında
izlenen temel aşamalar

1) Bakteri kültürünün hazırlanması ve bakterinin

2 ortamdan alınarak toplanması
2) Hücrelerin parçalanılarak içeriklerinin açığa
3
çıkarılması
3) Elde edilen özütte DNA dışındaki moleküllerin
4
uzaklaştırılması
4) Elde edilen DNA’nın yoğunlaştırılması

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü 1

 Hücre yoğunluğunun belirlenmesinde kullanılan
teknikler
Yayma plak yöntemi ve bulanıklıktan faydalanılarak standart eğri
oluşturma

McFarland standartı
oluşturma

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

 Bir hücre özütünden DNA nın saflaştırılması
1- Proteinlerin presipitasyonu

Fenol

Fenol Kloroform (1/1)

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

 Bir hücre özütünden DNA nın saflaştırılması
2- Proteaz ve ribonükleaz (Rnase)

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

 Bir hücre özütünden DNA nın saflaştırılması
3- Cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB)

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

 Bir hücre özütünden DNA nın saflaştırılması
4- Anyon değiştirici reçineler

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

 DNA’ların konsantre edilmesi

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

 Plazmid DNA İzolasyonu

PLAZMİT DNA İZOLASYONU

BÜYÜKLÜĞE BAĞLI KONFORMASYONA BAĞLI

SEPERASYON SEPERASYON

Alkali Denatürasyon

Etidyum Bromür- Sezyum Klorür Yoğunluk Gradiyent

Sentrifügasyonu
OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü
 Büyüklüğe bağlı seperasyon

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

 Konformasyona Bağlı seperasyon

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

 Alkali denatürasyon

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

 EtBr-CsCl santrifügasyon

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

 Plazmid sayısının arttırılması

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

 Bakteriyofaj DNA sının hazırlanması

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

 Bakteriyofaj DNA sının hazırlanması

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

• DNADNA
is negatively
Agarozcharged.
Jel Elektroforezi

Elektro: Elektrik
Phoresis (Forez): Karşıya geçirmek
Elektroforez: Yüklü parçacıkların elektrik akımı etkisi
altında hareketini açıklayan terim

• Polymerized agarose is porous,

allowing for the movement of DNA
Scanning Electron Micrograph of
Agarose Gel (1×1 µm) à
 • DNA
How is negatively
DNA fast willcharged.
Agaroz Jel Boyunca
the Nasıl Hareket Eder ?
DNA migrate?
strength of the electrical field, buffer, density of agarose gel…
Ayrıma
Sizeetki eden
of the faktörler
DNA!
• Molekülün
*Small DNA büyüklüğü vethan
move faster şeklilarge DNA
• Elektrik alanın gücü separates DNA according to size
…gel electrophoresis
• Örneklerin göreceli hidrofobisitesi
• Kullanılan tamponun iyonik DNAkuvveti ve sıcaklığı

garose gel, linear DNA migrate inversely

al to the log10 of their molecular weight.
• DNA
How is negatively
Agaroz
fast Jel charged.
willElektroforezi Uygulaması için Nelere İhtiyaç
the DNA migrate?
Vardır ?
strength of the electrical field, buffer, density of agarose gel…
• Agaroz
Size of the DNA!
• Tampon
*Small DNA move faster than large DNA
• Yatay
…gelElektroforez Seti
electrophoresis separates DNA according to size
• Mikrodalga fırın
• Örnek yükleme boyası DNA
• Güç kaynağı
• DNA markır (merdiven)
• Görüntüleme sistemi
• DNA
How is negatively
Agaroz
fast Jel charged.
willNasıl
theHazırlanır ?
DNA migrate?
strength of the electrical field, buffer, density of agarose gel…
Agarozun yapısı
• Galaktoz
• 3,6 Anhidrogalaktoz

DNA
200 kDa dan daha büyük
moleküllerin ayrılması için kullanılır.

Agaroz jel hazırlanırken kullanılan

tamponlar (50 mM pH 7,5-7,8)
• TAE (Tris-Asetat EDTA)
• TBE (Tris-Borat EDTA)
• TPE (Tris- Fosfat EDTA)
• DNA
How is negatively
Tampon
fast will charged.
içindeki agarozmigrate?
the DNA yoğunluğu ne kadar olmalı ?
strength of the electrical field, buffer, density of agarose gel…

DNA
• DNA
How is negatively
Agaroz willcharged.
fast jelin hazırlanışı
the DNA migrate?
strength of the electrical field, buffer, density of agarose gel…

DNA
• DNA
How is negatively
Örnekler
fast will charged.
kuyulara
the DNA nasılmigrate?
yüklenir ?
strength of the electrical field, buffer, density of agarose gel…
DNA örnekleri yürütme tamponu olarak isimlendirilen su, sakaroz
ve bir boya (ksilen siyanol, bromfenol mavisi, bromkresol yeşili) dan
oluşan çözelti ile karıştırılır.

DNA

Glycerol
Bromophenol Blue
6X Loading Buffer
Bir jelde minimum 2 ng lık DNA belirlenebilir.
• DNA
How is negatively
Markör DNAcharged.
fast will the DNA migrate?
strength of the electrical field, buffer, density of agarose gel…
Belirli sayıda ağırlığı ya da boyutu bilinen DNA parçalarını içeren
karışımdır.

DNA

50- 2 500 bp 100-2 000 bp 100-15 000 bp 10-300 bp

• DNA
How is negatively
fast willcharged.
Elektroforezin başlatılması
the DNA migrate?
strength of the electrical field, buffer, density of agarose gel…

DNA
• DNA
How is negatively
fast willcharged.
Elektroforez sonucu
the DNADNA uzunluğunun hesaplanması
migrate?
strength of the electrical field, buffer, density of agarose gel…
-
ß 12,000 bp
DNA
ß 5,000

ß 2,000
ß 1,650

ß 1,000
ß 850
ß 650
ß 500
ß 400
ß 300
ß 200
ß 100
+
• DNA
How is negatively
Jeldeki willcharged.
fast DNA’ların görüntülenmesi
the DNA migrate?
strength of the electrical field, buffer, density of agarose gel…
0.5 µg/ ml (jeldeki yoğunluk)

Alternatif boyalar

• Methylene Blue

• BioRAD - Bio-Safe DNA Stain

• Ward’s - QUIKView DNA Stain

• Carolina BLU Stain

…others
• DNA
How is negatively
Jeldeki willcharged.
fast DNA’ların görüntülenmesi
the DNA migrate?
strength of the electrical field, buffer, density of agarose gel…

1 µg/ ml (jeldeki yoğunluk)

% 0,02 lik metilen mavisi

0,1 X tampon ile yıkama