Opgave 1

To forskellige, spontane mutationer i kinase-domænet af EGFR (G719S og L858R) kan

forårsage lungekræft. Tabellen nedenfor viser resultatet af kinetiske målinger af aktiviteten af
EGFR for vildtype (WT) og de to mutanter.

EGFR-variant kcat (s-1)

WT 0.026
G719S 0.280
L858R 1.335

Spørgsmål 1. Forklar med afsæt i funktionen af EGFR og aktivitetsmålingerne hvorfor

mutationerne kan forårsage kræft.

Svar: G719S og L858R er henholdsvis 10 og 51 gange mere aktive end WT. Når EGFR-kinasen
er mere aktiv vil man derfor forvente mere signalering og mere celledeling/kræft.

Når EGFR-receptoren aktiveres, rekrutteres proteinet Grb2, hvilket kan analyseres in vitro via
et pull down-eksperiment med varianter af receptorerne fra lungeceller fra raske personer (WT)
samt personer med lungekræft (L858R).

Spørgsmål 2. Forklar hvorfor L858R er i stand til at trække meget Grb2 med ned mens WT
kun trækker en lille mængde Grb2 ned.

Svar: EGRF-signalering forårsager flere fosforyleringer på C-terminalen på EGFR, der

fungerer som docking sites for Grb2 (via SH2 domæner). Da L858R er mere aktiv vil C-
terminalen være mere phosphoryleret så L858R kan interagere med Grb2. WT kinasen er ikke
phosphoryleret og kan dermed ikke så effektivt trække Grb2 med ned.

For at forstå hvordan L858R-mutationen ændrer kinase-aktiviteten bestemmes

krystalstrukturer til høj opløsning.

Spørgsmål 3. Hent strukturerne af WT (2ITX) og L858R (2ITV) kinase-varianterne i PyMOL

og foretag en strukturel overlejring. Hvor ses den største strukturelle forskel og kan denne
forklare hvorfor L858R er mere aktiv?

Svar: De to strukturer er meget ens, men dog forskellige i aktiveringsloopet. Aktiveringsloopets

konformation er vigtig for aktiviteten af kinaser generelt, så en sandsynlig forklaring er at
L858R findes på en mere aktiveret form (hvilket er korrekt).

Tabellen nedenfor viser affinitetsmålinger mellem EFGR-varianterne og lægemidlet Gefitinib,

der benyttes i behandlingen af visse typer lungekræft.

EFGR-variant KD (nM)

1
 WT 53.5
G719S 123.6
L858R 2.6

Spørgsmål 4. Forklar hvorfor patienter med L858R-mutationen, men ikke patienter med
G719S-mutationen responderer positivt på behandlingen med Gefitinib.

Svar: Gefitinib binder mere end 20 gange stærkere til L858R end WT og vil dermed inhibere
celledeling i kræftvæv med denne mutation. Gefitinib binder svagere til G719S end til WT og
vil dermed inhibere celledeling i WT væv før den inhiberer celledeling i kræftvæv med denne
mutant.

2
Opgave 2
Umiddelbart efter coronavirus trænger ind i en celle translateres to tredjedele af RNA-
genomet til polyproteinerne pp1a og pp1ab, der indeholder to proteaser. Proteaserne kløver
pp1a og pp1ab til 16 ikke-strukturelle proteiner. Det er lykkedes forskere at udvikle ligander,
der hæmmer den primære protease. Brug følgende kommandoer til at hente den biologiske
enhed af den primære protease i PyMOL:

fetch 6M0K, type=pdb1, async=0

split_states 6M0K

Spørgsmål 1. Udbyg dette til et script, der farver protein hvidt, fremhæver liganden i
spacefill, viser active site rester som sticks (Cys145, His41 og Glu166) og farver dem gule.
Hæmmer liganden proteasens aktivitet via binding til det aktive site eller dimer interface?

Svar:
reinit
fetch 6M0K, type=pdb1, async=0
split_states 6M0K
color white, 6M0K*
remove solvent
sele resn FJC
show spheres, sele
sele resi 145+41+166
show sticks, sele
color yellow, sele

Active site. FJC har hydrogen bindinger til Cys145 og Glu166.

Polyproteinet pp1ab translateres som en forlængelse af pp1a, hvor en RNA-struktur

(frameshift stimulation element, FSE) bremser ribosomet og i visse tilfælde fører til et -1
skifte i læserammen, så ribosomet undgår et stopkodon og kan fortsætte translationen af det
længere protein. I figuren herunder vises: (a) RNA-strukturdiagram for SARS-CoV-2 FSE
vist med stem farver, 3D-struktur vist som cartoon med (b) stem-farver og (c) regnbue-farver
fra 5' (blå) til 3' (rød).

3
 3'
Stem 2
Stem 1 J3/2

Stem 3
5'

Spørgsmål 2. Beskriv RNA-strukturen af elementerne Stem1, Stem2, Stem3 og J3/2.

Svar: Stem 1 er en hairpin med U bulge, Stem 2 er en pseudoknude, Stem 3 er en hairpin med
A bulge. J3/2 er en junction mellem stem 2 og 3.

3D-strukturen i panel b og c ovenfor giver en mulig forklaring på hvordan ribosomet bremses

og foretager et -1 skifte i læserammen. Strukturen kan studeres nærmere i PyMOL ved at
hente PDB-filen 6XRZ og følge RNA-kædens forløb.

Spørgsmål 3. Hvilke strukturelementer danner en "ring" omkring 5' enden? Foreslå en

mekanisme hvormed FSE blokerer og skubber ribosomet én position tilbage i læserammen.

Svar: Man kan se at 5' enden går ind gennem en "ring" i midten af strukturen. Ringen dannes
af stem 1, pseudoknude-interaktionen (stem 2), J3/2 og hairpin (stem 3). Ribosomet har nok
svært ved at trække 5' enden igennem denne pseudoknude - specielt hvis pseudoknuden er
presset op mod ribosomet. Hvis den strukturelle blokering samtidig passer med at den glatte
sekvens er placeret i ribosomet kan hele sekvensen blive skubbet en position baglæns.

Nedenfor ses et sekvens-alignment af FSE-elementet fra SARS-CoV2 med sekvenser fra

lignende vira med eksempler på co-varierende baseændringer i Stem1 og Stem2 markeret
med røde og fede bogstaver:

Spørgsmål 4. Hvor mange forskellige typer co-varierende baseændringer er der på de

markerede positioner i Stem1 og Stem2? Hvorfor ses typisk deletioner/indsættelser på 3 baser
i denne RNA-struktur?

4
Svar: I den markerede kolonne i Stem 1 ses 3 typer af co-varierende baseændringer (GC, AU,
UA). I den markerede kolonne i Stem 2 ses 2 typer af co-varierende baseændringer (AU,
UA). Da denne struktur er placeret i kodende region, kan der ikke være 1 eller 2 base
deletioner/indsættelser, da det vil bryde læserammen.

5
Opgave 3
Studier med enkelt-molekyle FRET af et protein indeholdende et fluorofor-par (FRET-par)
med en Förster-afstand på R0 = 60 Å viser at enzymet skifter imellem to konformationelle
tilstande med FRET-effektiviteter på henholdsvis 0,2 og 0,8. Tilstanden med FRET-
effektivitet 0,2 betegnes Enz1 mens tilstanden med FRET-effektivitet 0,8 betegnes Enz2,
hvorved hastigheds- og ligevægtskonstanter defineres som følger:

Spørgsmål 1. Hvor stor forskel er der på afstanden imellem donor og acceptor mellem Enz1
og Enz2?

Svar: FRET-effektiviteten er givet ved:

Vi isolerer r:
E*R^6+ E*r^6 = R^6
E*r^6 = R^6- E*R^6 = R^6(1-E)
r = (R^6(1-E)/E))^(1/6)
For 0.2 giver det
r = ((6nm)^6(1-0.2)/0.2))^(1/6) = 7.55nm
For 0.8 giver det
r = ((6nm)^6(1-0.8)/0.8))^(1/6) = 4.76nm
Forskellen er dermed: 7.55nm – 4.76 nm = 2,8 nm = 28 Å

Nedenfor ses et repræsentativt enkelt-molekyle FRET-eksperiment for systemet.

Spørgsmål 2. Giv et begrundet estimat for K.

Svar: Ligevægtskonstanten er defineret ud fra den tid som molekylet tilbringer i det to
tilstande. Den er ca. dobbelt så meget tid i Enz1 med lav FRET. Der for er K = 1/2

Eksperimentet gentages nu for en mutant af enzymet, hvilket giver nedenstående resultat.

6
Spørgsmål 3. Angiv ud fra dette om k1, k-1 og K hver især er større, mindre eller omtrent
uændret for mutanten relativt til vildtype-enzymet. Begrund dit svar.

Svar: Det observeres at intervallerne som molekylet tilbringer i Enz2 er kortere, hvorimod
intervallerne i Enz1 har samme længde. Dermed er k1 uændret, k-1 er øget og K er mindre.

Eksperimentet gentages nu for vildtype-enzymet i tilstedeværelse af en inhibitor, som vist

nedenfor.

Spørgsmål 4. Giv med udgangspunkt i disse data en forklaring på hvordan inhibitoren virker.

Svar: Den lukkede tilstand Enz2 har en meget længere levetid. Det viser at inhibitoren binder
og stabiliserer den lukkede form af enzymet.

7
Opgave 4
Et bakterielt toksin binder til receptorer i tarmvæggen hvorefter det endocyteres. Toksinet
katalyserer ADP-ribosylering af G-protein-koblede receptorers S-subunit, hvilket medfører
en overproduktion af cyklisk AMP (cAMP), som igen leder til udskillelse af klorid-ioner,
bikarbonat og vand. Strukturen af toksinet viste at det er en oligomer, der er vist sammen med
monomeren nedenfor.

Spørgsmål 1. Angiv toksinets foldningsklasse og beskriv den oligomere tilstand.

Svar: Toksinet tilhører αβ-foldningsklassen (mere specifikt α+β). Oligomeren består af 5

kopier af monomeren og er således en pentamer.

Toksinet binder til specifikke saccharider på den glykosylerede endocytose-receptor. Figuren

herunder viser strukturen af toksinet med et bundet monosaccharid fra to synsvinkler.
Kulstofatomer i toksinet og saccharidet er vist i henholdsvis grønt og gult og
hydrogenbindinger er vist som blå stiplede linjer.

Spørgsmål 2. Angivet hvilket specifikt monosaccharid, der er bundet til receptoren, herunder
konfigurationen omkring det anomere kulstof.

8
Svar: Det bundne saccharid er fucose, hvilket ses af methylgruppen i position 6.
Konfigurationen om det anomere carbon er β, idet hydroxyl-gruppen i position 1 er på samme
side af ringen som ved position 6.

Strukturen af toksinet er også bestemt i kompleks med et trisaccharid som vist nedenfor, hvor
de tre saccharider er mærket henholdsvis A, B og C.

Spørgsmål 3. Beskriv glycosidbindingerne mellem A og B samt mellem B og C med

angivelse af de indgående kulstofatomer og konfigurationen.

Svar: A-B er α-1,3 og C-B er β-1,4.

Figuren ovenfor til højre viser bindingen af trisaccharidet inklusive de omgivende

vandmolekyler (røde kugler) og hydrogenbindinger (blå stiplede linjer). I et forsøg blev der
designet to mutanter med henholdsvis en enkelt mutation (H18A) og en dobbeltmutation
(H18A / H94A), hvorefter dissociationskonstanten for binding til trisaccharidet blev målt.

Toksinvariant Målt KD
Vildtype 10 mM
H18A > 50 mM
H18A / H94A ingen binding

Spørgsmål 4. Forklar de observerede bindingskonstanter.

Svar: Der er ingen direkte vekselvirkning mellem trisaccharidet og Histidin 18, men H18
positionerer vandmolekyler der danner hydrogenbindinger til C-saccharidet. Ved fravær af
H18 vil disse vekselvirkninger være fraværende og dermed destabilisere bindingen.
H94 danner en hydrogenbinding til O-4 i C-saccharidet. Når også H94 er muteret vil den i
forvejen svage binding være helt fraværende.

9
Opgave 5
Gennem de sidste ca. 50-70 år er der sket en kolossal ophobning af syntetisk fremstillet
plastik som affald i naturen. Dette nedbrydes meget langsomt, i visse tilfælde af enzymdrevne
processer. Strukturerne af de mest udbredte klasser af plastik er vist nedenunder.

Spørgsmål 1. Hvorfor er det en udfordring for enzymer at nedbryde disse stoffer ud fra et
kemisk perspektiv? Hvilke stofgrupper må forventes at være hhv. sværest og lettest at
nedbryde og hvorfor?

Svar: Plastik repræsenterer nye former for makromolekyler som ikke har eksisteret før.
Derfor har der heller ikke været et evolutionært behov for at udvikle enzymer til at nedbryde
dem. Enzymer skal typisk have en funktionel gruppe at angribe, f.eks. via hydrolyse. De tre
grupper PE, PVC og PS mangler helt sådanne angrebspunkter og må derfor være sværest at
nedbryde. De andre repræsenterer funktionelle grupper som estre (PLA, PA11 og PET) og
amider (PUR) som skulle kunne give et vist udgangspunkt, men jo er langtfra naturlige
substrater.

Der er ikke desto mindre identificeret forskellige enzymer der (om end langsomt) nedbryder
forskellige typer plastik. Nogle af disse produceres af mikroorganismer der vokser på en
losseplads med primært PET-plastik. Ét sådant enzym (en PETase) nedbryder PET til MHET,
mens et andet (en MHETase) nedbryder MHET til PTA og EG, som vist nedenfor.

10
Strukturen af MHETase er bestemt i nærvær af stoffet benzoat (se nedenfor). MHETase kan
deles op i to domæner, en lysegrå del, som er næsten identisk med PETase og en mørkegrå
del der ikke findes i PETase. Dvs. MHETase kan beskrives som PETase (lysegrå) med låg
(mørkegrå).

Spørgsmål 2. Hvorfor kan benzoat binde til det aktive site i MHETase? Hvilken enzymklasse
forbindes sidekæderne i det aktive site normalt med og hvorfor findes de i MHETase?

Svar: Benzoatgruppen findes også i TPA (den mangler bare en carboxylgruppe). MHETasen
minder om en serinprotease (med katalytisk triade Asp492, His528 og Ser 225).
Esterbindingen er ækvivalent med en peptid binding hvad angår hydrolytisk mekanisme.

Spørgsmål 3. MHETase har en meget lav kcat. Forklar hvorfor det giver mening at
MHETasen har et låg-domæne i modsætning til PETasen.

Svar: PETasen arbejder med uopløseligt materiale så det behøver ikke indkapsles. Derimod
er MHET lille og skal tilbageholdes i det aktive site eftersom den langsomme reaktionsrate
gør MHET tilbøjelig til at diffundere væk før det når at blive nedbrudt.

11
Man fremstiller nu et
hybridenzym bestående af
en MHETase og en
PETase forbundet med en
8-aminosyrerest linker.
Dets evne til at danne TPA
måles og sammenlignes
med de isolerede enzymer
med følgende resultat.

Spørgsmål 4. Forklar de tre enzymers forskellige aktivitetsniveauer ud fra disse data.

Svar: PETase er ”død” da den danner MHET, ikke TPA. Hybridenzymet virker bedre end
MHETase fordi der er tale om koblede nedbrydningsveje (PTA => MHET => TPA) så man
øger den effektive koncentration af MHETase ved at have det tæt på stedet hvor MHET
dannes af PETasen.

12