Opgave 1

Stoffet N-glutaryl-L-phenylalanine-p-nitrophenol (GPN) kan benyttes som såkaldt

kromogent substrat for proteasen chymotrypsin.

N-glutaryl-L-phenylalanine p-nitrophenol

Spørgsmål 1. Beskriv hvad der forstås ved et "kromogent substrat", herunder hvilke
egenskaber ved GPN, der gør at det kan bruges som substrat for chymotrypsin.

Svar: "Kromogen" betyder "danner farve", hvilket bruges om substrater, der ved enzymatisk
omdannelse danner et andet stof, der absorberer ved en specifik bølgelængde. Her p-
nitrophenol. Substratet kan fungere for chymotrypsin, da det har ligheder med et peptid.
Bindingen, der kløves er dog en ester.

Ved den enzymatiske reaktion dannes stoffet p-nitrophenol, der er en svag syre med en pKa-
værdi på 7,15. Nedenfor ses absorptionskurver for stoffets to protoneringsformer.

Spørgsmål 2. Angiv i punktform de eksperimentelle trin, du vil tage for at opstille en

standardkurve for aktiviteten af chymotrypsin overfor GPN målt ved spektroskopi.
Standardkurven skal vise initialhastighed som funktion af enzymkoncentration. Angiv valg af
pH-værdi og bølgelængde samt forslag til andre komponenter i reaktionsopløsningen.

Svar: Vælger pH 8 (deprotoneret form af p-nitrophenol) og dermed bølgelængde 400 nm til at

følge reaktionen. Der kan derudover være f.eks. 50 mM Tris-Cl, pH 8 og 100 mM KCl i
opløsningen.

Eksperimentelle trin:
1) Fast mængde substrat + buffer blandes i f.eks. 10 rør med stigende mængde enzym.
2) Herefter måles udviklingen i A400 over ca. 120 sek umiddelbart efter tilsætning af
enzym. Initialhastigheden beregnes ud fra hældning af kurven.
3) Hastigheden plottes som funktion af koncentrationen af enzym.

1
Spørgsmål 3. Den vedhæftede Excel-fil "Chymotrypsin data.xlsx" indeholder et sæt
datapunkter for en sådan standardkurve målt i vandig buffer ved 25°C. Opstil standardkurven
og angiv og argumentér valg af konfidensinterval.

Svar: Data plottes i Excel:

Konfidensinterval vurderes til 5-15 * 10-5 M enzym (som vist med orange + bedste, rette linje).

I et andet forsøg foretages en gradvis denaturering chymotrypsin ved opvarmning af enzymet

til forskellige temperaturer. Efter opvarmning sættes enzymet på is og aktiviteten måles som
ovenfor:

[E] (·10-5 M) 10,0 10,0 10,0

Temperatur (°C) 40 45 50
v0 (·10-10 M·s-1) 7,2736 5,7122 3,8821

Spørgsmål. 4. Forklar hvordan ovenstående data kan relateres til standardkurven og angiv i
hvert tilfælde den relative aktivitet (i %) af enzymet.

Svar: For de denaturerede enzymer måles en hastighed, der aflæses på standardkurven og

modsvarer en koncentration af upåvirket enzym. Her kan også bedste rette linje benyttes.

40°C. vo = 7.2736, svarer til 7.36*10-5 M, enzymet er 7.36/10 = 74% aktivt.

45°C. vo = 5.7122, svarer til 5.60*10-5 M, enzymet er 5.60/10 = 56% aktivt.
50°C. vo = 3.8821, svarer til 3.52*10-5 M, enzymet er 3.52/10 = 35% aktivt.

2
Opgave 2

Omicron-varianten af SARS-CoV2, der er opstået i Sydafrika, adskiller sig meget fra tidligere
varianter og har f.eks. 36 mutationer i Spike-proteinet. Nedenstående figur viser Spike-trimer
fra den oprindelige Wuhan-virus, hvor monomer i åben konformation er vist i cyan (A).
Monomer for Delta-variant (B) og Omicron-variant (C) er vist ved siden af med mutationer
vist for substitutioner (rød) og inserts/deletions (gul).

Spørgsmål 1. Forklar hvordan mutationer opstår i SARS-CoV2, hvorfor de bevares i

varianterne under naturlig selektion, og hvad der kan forårsage de mange mutationer observeret
i Omicron-varianten.

Svar:
• 3 point for at forklare at mutationer opstår under kopiering af RdRp (RNA dependent
RNA polymerase).
• 3 point for at forklare at mutationer, der enten neutrale eller forbedrer Spike proteinets
egenskaber vil blive bevaret i varianterne under naturlig selektion. Derimod vil
mutationer der forværrer Spike proteinets egenskaber forsvinde.
• 4 point for at forklare at virus skal replikere i en stor population for at mutationer
opstår. Evt. en kronisk infektion i individ med nedsat immunforsvar.

En af de mest almindelige mutationer er D614G, som menes at øge fleksibiliteten af S1-

domænet. En anden almindelig mutation er P681H i et fleksibelt loop, der kløves af den
cellulære protease furin.

Spørgsmål 2. Brug BLOSUM62-matricen til at vurdere om disse mutationer har høj eller lav
similaritet og hvilken positiv effekt disse mutationer kan have for infektion af cellen.

Svar:
• 4 point for at begge mutationer har lav similaritet hhv. -1 og -2.
• 3 point for at forklare at øget flexibilitet kan gøre det lettere at binde til flere ACE2
receptorer.

3
 • 3 point for at forklare at bedre furin kløvning frigør S2 fusionsdomæne, så fusion
sker lettere.

Det vedhæftede PyMOL-script "Omicron-spike.pml" viser alle 36 mutationer i Omicron-

varianten plottet på en model af Spike-proteinet (F1) samt interaktion med ACE2-receptor (F2)
og antistof (F3). RBD, der interagerer med ACE2-receptor har følgende mutationer: G339D,
S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S,
Q498R, N501Y, Y505H.

Spørgsmål 3. Hvilke af disse mutationer sker i området, der er i tæt kontakt med ACE2-
receptoren? Undersøg om disse mutationer har negativ eller positiv similaritets-score og forklar
hvad det kan betyde for bevarelse af bindingssitet.

Svar:
• 5 point for ca. 8 mutationer i RBD-ACE2 interaktion.
• 5 point for at forklare at nogle af disse mutationer har positive similaritetsscores og
derved potentielt bevarer interaktionen med ACE2: G446S=0, N501Y=-2, Q498R=1,
G496S=0, Q493R=1, S477N=1, T478K=-1, E484A=-1.

Spørgsmål 4. Hvor mange og hvilke mutationer findes i området, der interagerer med antistof?
Hvilken type af områder på Spike proteinet genkendes af antistoffer og hvilken type
modifikationer kan hæmme antistofbinding?

Svar:
• 5 point for 4 mutationer i NTD. Deletioner: G142-, V143-, Y144-, og Y145D.
• 5 point for tilgængelig protein struktur på Spike proteinet genkendes, men
glykosylering gemmer visse områder, så de ikke genkendes.

4
Opgave 3

Nukleotiderne GTP og GDP kan i mikroorganismer omdannes til hhv. pppGpp og ppGpp ved
at overføre en difosfatgruppe fra ATP til 3'-OH. pppGpp og ppGpp betegnes alarmoner, og er
vigtige for at hjælpe bakterier til at adaptere til ændringer i deres omgivelser. De to alarmoner
syntetiseres af alarmonsynthetasen Als, som består af 185 aminosyrer og binder både ATP og
GTP/GDP. På en gel filtreringskolonne i en vandig buffer pH 7,4 eluerer Als som vist på
nedenstående figur til venstre. Til højre ses en kalibreringskurve for samme kolonne hvor man
har bestemt elueringsvolumen for proteiner med kendte molekylemasser. Ligningen ovenfor
grafen angiver den bedste rette linje.

Spørgsmål 1. Hvor mange subunits består Als af under disse betingelser? Forklar hvordan du
når frem til dit svar.

Svar: Følger man ligningen i grafen til højre, har Als (der eluerer ved 245 ml) en MW på 78
kDa. Med 185 aa har den en monomermasse på ca 20 kDa, dvs. proteinet er en tetramer.

Det er lykkedes at krystallisere Als i kompleks med stoffet AMPCPP (vist nedenfor til venstre)
og GDP. Figuren til højre viser området omkring det aktive site, hvor den angivne H + stammer
fra 3'-OH-gruppen på GDP.

Spørgsmål 2. Hvordan adskiller AMPCPP sig fra ATP og hvad kan være grunden til at det
benyttes ved strukturbestemmelsen?

5
Svar: AMPCPP kan ikke hydrolyseres mellem α- og β-fosfatgrupperne så pyrofosfatgruppen
kan ikke overføres til GDP/GTP. Det tillader at man fanger strukturen i en præ-katalytisk
tilstand.

Spørgsmål 3. Beskriv de interaktioner, der binder nukleotiderne til Als og kom med et bud på
den rolle, som den divalente metalion spiller i den katalytiske mekanisme. Sammenlign med
carbonic anhydrase.

Svar: Arg46, Arg 59 og Arg77 laver elektrostatiske kontakter til fosfatgrupperne, mens
Arg105 laver en π-kation kontakt til GDP. Mg2+ er med til at polarisere 3’OH gruppen til
angreb på AMPCPP så pyrofosfatgruppen kan angribes (dog ikke hydrolyseres i AMPCPP’s
tilfælde). Mg2+’s rolle minder om Zn2+ i CA som også polariserer en polær gruppe (i CA’s
tilfælde vand) til nukleofilt angreb.

Man måler nu hvordan GDP og GTP påvirker aktiviteten af Als, dvs. produktionen af hhv.
ppGpp (fra GDP) og pppGpp (fra GTP). Herfra bestemmes Vmax (stiplede linjer) til hhv. 6.60
(GDP) og 1.93 (GTP) µmol min-1 mg-1. v0-værdierne for de enkelte punkter er angivet
nedenfor.

GXP v0 (GDP) v0 (GTP)

[mM] [µmol min-1 mg-1] [µmol min-1 mg-1]
0.10 0.0104 0.0145
0.25 0.0690 0.0677
0.50 0.2752 0.3276
0.75 0.8448 0.5517
1.0 1.0862 0.7241
2.0 4.0345 1.3793
3.0 5.3300 1.6207
5.0 6.1379 1.7759

Spørgsmål 4. Beregn og kommentér graden af kooperativitet i aktiviteten overfor hhv. GDP

og GTP. Benyt hæmoglobins binding til ilt som model og husk at ved vmax er enzymet 100%
mættet med substrat. Husk at aktiviteten er proportional med hvor meget af enzymet der er
bundet.

Svar: Der beregnes følgende tabel i Excel, hvor Y = v/vmax. v-enhed er µmol min-1 mg-1.

Y/(1-Y) Y/(1-Y) log log Y/(1- log Y/(1-

[GXP](mM) v (GDP) v(GTP) Y(GDP) Y(GTP) GDP GTP ([GXP]) Y) GDP Y) GTP
0.10 0.01 0.01 0.00 0.01 0.00 0.01 -1.00 -2.80 -2.12
0.25 0.07 0.07 0.01 0.04 0.01 0.04 -0.60 -1.98 -1.44
0.50 0.28 0.33 0.04 0.17 0.04 0.20 -0.30 -1.36 -0.69
0.75 0.84 0.55 0.13 0.29 0.15 0.40 -0.12 -0.83 -0.40
1.00 1.09 0.72 0.16 0.38 0.20 0.60 0.00 -0.71 -0.22
1.99 4.03 1.38 0.61 0.71 1.57 2.50 0.30 0.20 0.40
3.01 5.33 1.62 0.81 0.84 4.20 5.24 0.48 0.62 0.72
5.01 6.14 1.78 0.93 0.92 13.28 11.52 0.70 1.12 1.06

6
Dette giver flg. Excel plot:
Hill plots for GDP og GTP
1.50

y = 1.9058x - 0.205 1.00

0.50

0.00
-1.10 -0.60 -0.10 0.40
log (Y/(1-Y))

-0.50

-1.00
y = 2.3469x - 0.5554
-1.50

-2.00

-2.50

-3.00

-3.50
log [GXP] (mM)

log Y/(1-Y) GDP

log Y/(1-Y) GTP
Linear (log Y/(1-Y) GDP)

Der er altså en kooperativitet på ca. 2 for både GDP og GTP, altså mere end ingen
kooperativitet (hældning på 1) men ikke fuld kooperativitet i betragtning af at det er en
tetramer (hældning på 4).

7
Opgave 4

Et enzym mærkes med to fluoroforer, der udgør et FRET-par med R0 = 54 Å og analyseres

med FRET-spektroskopi. I fravær af ligand måles en konstant FRET-effektivitet på E = 0.2.

Spørgsmål 1. Hvad er afstanden imellem de to fluoroforer?

Svar: Regnes ud ved at indsætte i følgende formel:

𝑅06
𝐸=
𝑅06 + 𝑟 6

R = 72.8Å

Efter tilsætning af substratet observeres følgende FRET-effektivitet (E) som funktion af tiden
for et repræsentativt enzymmolekyle. Nedenfor vises resultatet af to eksperimenter udført hhv.
med (sort) og uden (rød) substrat.

Spørgsmål 2. Beskriv substratets effekt på enzymets struktur og dynamik ud fra ovenstående

graf.

Svar: Vi ser at tilsætning af substratet tilføjer en ekstra tilstand med høj FRET. Dvs. at binding
af substratet gør at enzymet lukker til en kompakt konformation.

Enzymets dynamik kan fortolkes ud fra en model med to tilstande, S1 og S2, hvor S1 har lav
og S2 har høj FRET-effektivitet.

For en mutant af enzymet fås nu følgende data.

8
Spørgsmål 3. Hvordan påvirker mutation (øger eller sænker) k1, k-1, og Keq under
tilstedeværelse af substrat? Begrund dit svar.

Svar: Hastighedskonstanter vurderes ud fra dwell-times: k1 er transitionen ud af S1 som er

~konstant. k-1 er øget pga. kortere dwell-time. Ligevægten er forskud imod lav FRET-
tilstanden, S1. Altså er Keq mindre.

Spørgsmål 4. For en lang række forskellige substrater har enzymet samme kcat. Forklar denne
observation med udgangspunkt i hvad du ved om enzymets dynamik.

Svar: Et oplagt svar er at katalyse hastigheden er begrænset af en åbne-lukke bevægelse, hvis

hastighed er uafhængig af substratet.

9
Opgave 5

Influenzavirus har på overfladen to proteiner, hemagglutinin (H) og neuramidase (N), som

danner spikes på samme måde som kendes fra ny coronavirus. Der findes flere forskellige
subtyper af hver af de to proteiner, således at forskellige influenzastammer betegnes med
kombinationen af hemagglutinin og neuramidase, fx H1N1 eller H2N9.

Strukturen af forskellige neuramidaser er blevet bestemt ved røntgenkrystallografi. PDB-filen

5nzn indeholder den biologisk relevante oligomer af neuramidase fra H1N1 i kompleks med
lægemidlet Ozeltamivir.

Spørgsmål 1. Beskriv N1 oligomerens sammensætning og symmetri.

Svar: Oligomeren består af 4 protomerer og er således en tetramer. I den rette orientering ses
at en 90° rotation vil føre en protomer over i nabo protomeren og hele tetrameren over i sig
selv. Der er derfor firtals symmetri.

N1-monomeren er opbygget af et repeterende strukturelt motiv (kaldet supersekundær

struktur), der forekommer 6 gange:

Motiv 1: /5nzn/A/A/114-178
Motiv 2: /5nzn/A/A/179-221
Motiv 3: /5nzn/A/A/222-273
Motiv 4: /5nzn/A/A/274-344
Motiv 5: /5nzn/A/A/345-399
Motiv 6: /5nzn/A/A/95-103+400-450

Den sidste forekomst er irregulær, da den består af en kombination af proteinets N-terminale

og C-terminale del.

Spørgsmål 2. Skriv et PyMOL-script der viser en monomer af N1 hvor hver forekomst af det
strukturelle motiv er vist med hver sin farve. Besvarelsen skal indeholde både script og
tilhørende billede.

Svar:

reinitialize
fetch 5nzn
disable all
bg_color white

create 5nznA, /5nzn/A/A

enable 5nznA
show cartoon, 5nznA
color magenta, 5nznA
color blue, /5nznA/A/A/114-178
color cyan, /5nznA/A/A/179-221
color green, /5nznA/A/A/222-273
color yellow, /5nznA/A/A/274-344
color orange, /5nznA/A/A/345-399
color red, /5nznA/A/A/95-103+400-450

10
Spørgsmål 3. Beskriv motivet og foldningsklassen for N1.

Svar: Motivet er en 4 strenget up’n’down β-plade hvor alle β-kæder er anti-parallelle. N1

tilhører β foldningsklassen.

Spørgsmål 4. Skriv et PyMOL-script, der overlejrer Motiv 2,3,4,5 og 6 på Motiv 1 vha.

kommandoen ’super’. Besvarelsen skal indeholde både script og tilhørende billede af de
overlejrede motiver.

Svar:
reinitialize
fetch 5nzn
disable all
bg_color white

create 5nznA, /5nzn/A/A

enable 5nznA
show cartoon, 5nznA
color magenta, 5nznA
color blue, /5nznA/A/A/114-178
color cyan, /5nznA/A/A/179-221
color green, /5nznA/A/A/222-273
color yellow, /5nznA/A/A/274-344
color orange, /5nznA/A/A/345-399
color red, /5nznA/A/A/95-103+400-450

create bl1, /5nznA/A/A/114-178

create bl2, /5nznA/A/A/179-221
create bl3, /5nznA/A/A/222-273
create bl4, /5nznA/A/A/274-344
create bl5, /5nznA/A/A/345-399
create bl6, /5nznA/A/A/95-103+400-450

disable 5nznA

super bl2, bl1

super bl3, bl1
super bl4, bl1
super bl5, bl1
super bl6, bl1

11