Molekuli glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC)

Receptor za antigen na T limfocitima (TCR)

Receptori za antigene na T limfocitima (TCR, engl. T cell receptor), mogu da prepoznaju samo
proteinske antigene koji su iskazani na površini drugih ćelija, tako da je za ispoljavanje njihove
funkcije nužno da reaguju sa drugim ćelijama npr. sa inficiranim ćelijama domaćina, antigen-
prezentujućim ćelijama, makrofagama i B limfocitima. Specijalizovani proteini, koji imaju ulogu
u iskazivanju antigena T limfocitima, su produkti gena glavnog histokompatibilnog kompleksa
(MHC, engl. major histocompatibility complex). TCR prepoznaje strukturu antigeničnog peptida
kao i određene ostatke MHC molekula, na površini antigen-prezentujućih ili drugih ćelija
domaćina.

Svi limfociti T na svojoj površini imaju izraženi receptor (engl. T-cell Receptor, TCR) u sklopu
kojeg se nalazi CD3 kompleks, zadužen za prenos signala nastalog prepoznavanjem specifičnog
antigena u unutrašnjosti ćelije.

PEPTIDNI FRAGMENTI PROTEINSKIH ANTIGENA

Funkcija T ćelija je kontrolisana procesom aktivacije T-ćelijskog receptora (engl. T cell antigen
receptor  TCR) i posljedičnom signalizacijom.

Kompleks T-ćelijskog antigenskog receptora sačinjen je od ligand-vezujuće podjedinice, α i β

lanaca, i signalne podjedinice, tj. CD3ε, γ i δ lanaca i disulfidno povezanog homodimera ζ
lanaca. The zeta-chain homodimer is a key component in the TCR complex and exerts its function through its
cytoplasmic immunoreceptor-tyrosine activation motif (1).

Ovaj kompleks učestvuje u procesu aktivacije T ćelija, koji započinje nakon interakcije
varijabilnog domena TCR sa peptidnim fragmentima proteinskih antigena prikazanim od strane
MHC molekula klase I i klase II (MHC I za CD8 T ćelije i MHC II za CD4 T ćelije), koje se
nalaze na antigen-prezentujućim ćelijama, uključujući dendritske ćelije, makrofage i B ćelije.

Međutim, signalizacija isključivo preko/posredstvom TCR nije dovoljna za funkcionalnu

aktivaciju T ćelija, i može rezultovati uvođenjem u anergično stanje u kojem T ćelije ne reaguju
na stimulaciju antigenom i ne mogu biti restimulisane. Stoga, osnovni princip aktivacije T ćelija
pretpostavlja neophodnost kostimulacije kroz ligaciju TCR sa drugim integralnim proteinima
membrane (pomoćnim molekulama), koreceptorima (CD4 i CD8) i receptorima za kostimulatore
(CD28), što obezbijeđuje dodatne signale koji potpomažu produktivnu aktivaciju T ćelija.
Identifikovan je veći broj kostimulatornih molekula, uključujući CD4, CD8, CD28, CD2, LFA-1
(engl. leukocyte function-associated antigen-1), inducibilni kostimulator T ćelija (engl. Inducible
T-cell COStimulator  ICOS)…
Kostimulatorni receptori i integrini služe kao ćelijski adhezioni molekuli (kada TCR prepozna
antigen, CD4/CD8 koreceptori se vežu za odgovarajuće MHC molekule) za vezivanje sa
odgovarajućim MHC molekulama, kao i za stabilizaciju interakcije između T ćelija i APĆ. Pored
toga, doprinose transdukciji signala moduliranjem praga odgovora (minimalni intenzitet
podražaja koji je neophodan da bi se izazvao odgovor).

Integrini i CD44 se takođe vezuju za proteine ekstracelularnog matriksa što zadržava efektorne T
ćelije u području infekcije. Ove adhezivne interakcije su značajne za stabilnu interakciju T ćelija
i APCs. Aviditet integrina za svoje ligande se povećava nakon delovanja hemokina na T ćelije,
kao i posle stimulacije T ćelija kroz TCR kompleks. Ekspresija integrina se povećava posle TCR
stimulacije, a ekspresija liganada za integrine na APCs, je povećana posle stimulacije sa
inflamatornim citokinima.
(the minimum intensity of a stimulus that is necessary to evoke a response. For example, an auditory threshold is the
slightest perceptible sound; an excitatory threshold is the minimum stimulus intensity that triggers an action
potential in a neuron; and a renal threshold is the concentration of a substance in the blood required before the
excess is excreted. Also called limen; response threshold.)

Na molekularnom nivou, kada sa CD3 molekulama nekovalentno povezani αβ TCR heterodimer,

u sadejstvu sa CD4 ili CD8 koreceptorima, specifično prepozna peptid-MHC kompleks na
površini ćelije koja iskazuje antigene, započinje kompleksan signalni put generisanjem
biohemijskih signala, uslovljenih konformacionim promjenama i grupisanjem (engl. clustering)
pomenutih molekula u imunološku sinapsu u zoni kontakta T ćelijaAPĆ.

Signalni put koji se aktivira vezivanjem za CD4/CD8 koreceptore se uključuje u aktivaciju

specifične familije Src kinaza tzv. Lck koja je nekovalentno vezana za citoplazmatični rep CD4 i
CD8 koreceptora. Prenos signala je posredovan Lck kinazom. Veza CD4/CD8 i Lck je
neophodna za maturaciju i aktivaciju T limfocita. Kada TCR prepozna antigen, CD4/CD8
koreceptori se vežu za odgovarajuće MHC molekule. Ovo vezivanje približava koreceptor i
njegovu Lck, do TCR kompleksa, a Lck fosforiliše tirozinske ostatke ITAM-a u CD3 i ζ lancima
i tako inicira aktivaciju T ćelija.

______________________________________________________________________________

Fosforilacija tirozinskih ostataka konzervisanih peptidnih sekvenci unutar citoplazmatičnih

domena signalne podjedinice, posredovana tirozin-specifičnim proteinskim kinazama, Lck i Fyn
iz Src familije/porodice kinaza, i regulisana od strane/aktivnošću CD45 fosfataze, je početni
događaj u TCR signalizaciji.

Katalitička aktivnost limfocit-specifične protein-tirozin kinaze (Lck) je velikim dijelom

regulisana fosforilacionim statusom dva ključna tirozinska ostatka (jednog lokalizovanog u
aktivacionoj petlji kinaznog domena (Tyr394), a drugog (Tyr505) na C-terminusu regulatornog
domena), odnosno suprotnim dejstvima kinaza (Csk i Lck) i fosfataza (CD45) na pul/zalihu
bazalno aktivne Lck. Fosforilacija regulatornog Tyr505 posredstvom C-terminalne Src kinaze
(Csk), omogućava da Lck poprimi/zauzme inaktivnu konformaciju. CD45 je tirozin fosfataza
(zahvaljujući čijoj aktivnosti) koja (u T ćelijama koje se nalaze u stanju mirovanja) defosforiliše
prethodno fosforilisani (posredstvom Csk) tirozinski ostatak (Tyr505) lokalizovan na C-
terminusu regulatornog domena Lck, održavajući na taj način zalihu bazalno aktivne Lck, te ima
ulogu u regulaciji njene aktivnosti tokom rane faze aktivacije T ćelija. Nakon angažovanja TCR,
ova zaliha bazalno aktivne Lck auto- ili transfosforiliše tirozinski ostatak u kinaznom domenu
(Tyr394), što zauzvrat pojačava katalitičku aktivnost Lck. CD45 can also dephosphorylate Y394,
returning Lck to the basally active state.

CD4/CD8 asocirana Lck. Odmah nakon organizacije membranskih molekula i formiranja

sinapse dolazi do aktivacije tirozin kinaza povezanih sa citoplazmatičnim domenima molekula
CD3 i koreceptornih proteina, kao i fosforilacija tirozina u CD3 i ζ lancima. Citoplazmatični
regioni CD3 i ζ lanaca sadrže peptidnu sekvencu tzv. ITAM koja će biti fosforilisana Lck-om,
kinazom koja pripada Src familiji tirozin kinaza, i koja je povezana sa citoplazmatičnim repom
CD4/CD8 koreceptora. Lck može biti aktivirana autofosforilacijom, a aktivna Lck fosforiliše
tirozinske ostatke ITAM-a u CD3 i ζ lancima. Još jedna kinaza je fizički povezana sa TCR
kompleksom. To je Fyn, kinaza koja je povezana sa CD3 proteinom i ima sličnu ulogu kao Lck.

Tirozin kinaze su enzimi koji katališu fosforilaciju ostataka tirozina u različitim proteinskim
supstratima. Kada se TCR veže za peptid-MHC kompleks, vezaće se i CD4 ili CD8 koreceptori
za nepolimorfne regione molekula klase II ili I; vezivanje će približiti citoplazmatične repove
CD4/CD8 koreceptora, ITAM regionima, CD3 i ζ lanaca.

Fosforilisani tirozin u okviru ITAM sekvence postaje vezno mjesto za tirozin kinazu ZAP-70.
ZAP-70 sadrži dva konzervisana regiona koja se vežu za fosfotirozine ITAM sekvenci ζ lanaca.
Vezani ZAP-70 postaje supstrat za susjednu Lck, koja fosforiliše tirozine ZAP-70. Jednom
aktivirani ZAP-70, može da se autofosforiliše kao i da fosforiliše brojne signalne molekule.
Kritično mjesto za aktivaciju “downstream” signalnih molekula je aktivacija ZAP-70. Da bi se
dostigao kritičan nivo angažovanja ZAP-70 molekula potrebna je njegova multipla aktivacija i
multipla fosforilacija ITAM-a ζ lanaca. Potreba da se jedna T ćelija veže za antigen više puta,
svaki čin vezivanja dovodi do ponovne fosforilacije ITAM-a ζ lanaca, što vodi ka multiplom
angažovanju ZAP-70 molekula.

Tirozinska fosforilacija ITAM-a posreduje u vezivanju ZAP-70 za TCR. Asocijacijom sa

fosforilisanim receptorom ZAP-70 olakšava sopstvenu tirozinsku fosforilaciju posredovanu
protein-tirozin kinazama iz Src familije. Fosforilacija tirozinskih ostataka ZAP-70 služi dvjema
funkcijama. Prvo, fosforilacijom se obezbjeđuju mjesta za vezivanje i interakciju sa SH2
domenima efektornih molekula, čime se posljedično doprinosi propagaciji signala. Jedan takav
molekul koji je identifikovan je Lck. Drugo, pored regrutovanja, fosforilacija ZAP-70 može
obezbijediti mehanizam za njenu katalitičku aktivaciju.

We have shown that activated Zap70 was released from the phosphorylated ITAMs of the TCR-
CD3 complex into the plane of the plasma membrane. The released Zap70 moved for distances
within the membrane that allowed it to interact with spatially distinct signaling molecules (i.e.,
LAT). The release of Zap70 was controlled by at least two synergistic mechanisms.
Phosphorylation of Tyr126 by Lck and/or trans-autophosphorylation diminished the binding
affinity of Zap70 for phosphorylated ITAMs. ATP binding, a hallmark of active kinases40, also
lowered the binding affinity of Zap70 for phosphorylated ITAMs and guaranteed that only
activated kinases were released, which thereby maximized signal amplification and dispersion.
The change in binding affinity was probably due to conformational changes transferred from the
ATP-binding site to the SH2 domains by intramolecular interactions, which has been described
as the ‘linker-kinase sandwich’34.

The 70-kd ζ chain–associated protein kinase (ZAP70) is then recruited to the ITAMs followed by
its phosphorylation and subsequent activation which results in further amplification of the
response. These activated PTKs induce tyrosine phosphorylation of several polypeptides,
including the transmembrane adaptor LAT (Linker Activator for T-Cells). Protein tyrosine
phosphorylation subsequently leads to the activation of multiple pathways, including ERK
(Extracellular Signal Regulated Kinase), JNK (c-Jun N-terminal Kinase), NF-κB (Nuclear factor
of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1) and NFAT(Nuclear Factor of Activated T-
Cells) pathways, which ultimately induce effector functions.
Aktivirane Src kinaze fosforilišu imunoreceptorske tirozinske aktivacione motive (engl. immune
receptor tyrosine-based activation motifs  ITAMs) sadržane u citoplazmatičnim domenima
CD3γ, δ, ε i ζ lanaca. Fosforilacija tirozinskih ostataka ITAM-a posreduje udruživanju ZAP70 sa
TCR kompleksom. Protein-kinaza 70(kD) povezana sa ζ lancem (ZAP70) posjeduje dva SH2
domena, međusobno odvojena sa 65 aminokiselinskih ostataka, koji se vezuju za dvostruko
fosforilisane ITAM-e ζ lanca CD3 podjedinice T-ćelijskog receptora.

Katalitička aktivnost Lck /limfocit-specifične protein tirozin kinaze/ (engl. lymphocyte-specific

protein tyrosine kinase  Lck) je regulisana fosforilacijom i defosforilacijom dva tirozinska
ostatka unutar, u pogledu sekvence polipeptidnog lanca unutar familije Src kinaza, konzervisanih
regiona. Fosforilacija Tyr394, lokalizovanog u aktivacionoj petlji kinaznog domena, dovodi do
katalitičke aktivacije. Nasuprot tome, fosforilacija drugog tirozinskog ostatka, Tyr505 na C-
terminusu, je inhibitorna jer intramolekulska interakcija između fosforilisanog Tyr505 i SH2
domena kao posljedicu ima autoinhibiciju. CD45 defosforiliše Tyr505 i povećava katalitičku
aktivnost Lck; smatra se da je aktivacija Lck posredstvom CD45 neophodna za iniciranje T-
ćelijske signalizacije.

Drugi regulatorni mehanizam podrazumijeva mobilizaciju i grupisanje TCR i signalnih molekula

na mjestu kontakta T ćelije i APĆ. Ovi klasteri su obogaćeni fosforilisanim TCR, što sugeriše da
klasteri olakšavaju fosforilaciju proteina u signalnoj transdukciji. Značajno je da ovi klasteri
prostorno isključuju CD45, vjerovatno zbog steričke smetnje vanćelijskog domena CD45. Tako
se smanjuje aktivnost CD45 fosfataze i mijenja se ravnoteža bohemijskih reakcija unutar
klastera.

Membranska proksimalna sekvenca

…cytoplasmic tail of human CD28 contains highly conserved tyrosine-based signaling motifs
that are phosphorylated in response to TCR or CD28 stimulation, and bind targets with SH2
domains in a phosphotyrosine-dependent manner. The membrane-proximal YXXM motif is
shared between CD28, CTLA4, and ICOS, and is a consensus site for the p85 subunit of the lipid
kinase phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K).

The -chain-activating protein, ZAP70, plays a role in T-cell activation. It possesses two SH2 domains separated by
65 residues that bind to the doubly phosphorylated immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) on the
-subunit of the CD3 T-cell receptor.

Tyrosine phosphorylation of the ITAM mediates the association of ZAP-70 with the TCR. The association of
ZAP-70 with the phosphorylated receptor facilitates its tyrosine phosphorylation that is mediated by the src
PTKs. Tyrosine phosphorylation of ZAP-70 may serve two functions. First, phosphorylation may provide
docking sites for SH2-containing effector molecules to interact with ZAP-70 and thereby propagate signaling.
One such molecule that has been identified is lck. Lck associates with ZAP-70 following TCR stimulation; an
interaction that is mediated through the SH2 domain of lck. However, the functional significance of this
interaction remains unclear. Second, in addition to recruitment, phosphorylation of ZAP-70 may provide a
mechanism for its catalytic activation.
Prije stimulacije TCR receptora, Lck koja je nekovalentno vezana za citoplazmatični rep
CD4/CD8 koreceptora ostaje odvojena od TCR i održava se u inaktivnom stanju dejstvom C-
terminalne Src kinaze (Src).

Pokazano je da se aktivirana ZAP70 kinaza oslobađa od interakcije sa fosforilisanim tirozinskim

ostacima ITAM-a unutar TCR-CD3 kompleksa u ravni plazma membrane. Oslobođena ZAP70
se kreće ka membrani, što joj omogućava interakciju sa prostorno različitim signalnim
molekulama. Oslobađanje ZAP70 je kontrolisano posredstvom/preko dva sinergistička
mehanizma.

ZAP70, tirozin-protein kinaza koja aktivira ζ lanac // ζ-lanac-aktivirajući protein

Tirozin-protein kinaza 70(kD) povezana sa ζ lancem (ZAP70) preko fosforilisanih tirozinskih

ostataka u okviru ITAM sekvenci citoplazmatičnog domena

CD4 i CD8 koreceptori olakšavaju sprovođenje signala pomoću tirozin kinaze nazvane Lck, koja
je nekovalentno vezana za citoplazmatski rep tih koreceptora, Lck koju blizinu TCR kompleksa
dovode CD4 ili CD8 molekuli, fosforiliše tirozinske ostatke u ITAM CD3 i ζ-proteina.
Fosforilisani ITAM ζ-lanca postaju mjesta za vezivanje tirozin kinaze ZAP70 (zeta-asocirani
protein od 70 kD), koju takođe fosforiliše Lck da bi postala enzimski aktivna. Aktivna ZAP70
zatim fosforiliše razne adapterske proteine i enzime koji se grupišu u blizini TCR kompleksa i
učestvuju u sprovođenju dodatnih signala. Osnovni signalni putevi koji zavise od fosforilacije ζ-
lanca i ZAP-70 su put kalcijum-NFAT, putevi Ras i Rac-MAP kinaza, put PKCΘ(„teta“)-NF-κB
i put PI-3 kinaze.

ITAM su regioni signalnih proteina koji se fosforilišu na tirozinskim ostacima, čime postaju
mjesta za vezivanje drugih tirozin kinaza. Prag signalizacije. Uređeno kretanje proteina na
membranama.

Lck-posredovana fosforilacija tirozinskog ostatka u/na položaju 126 (Tyr126) i/ili trans-
autofosforilacija smanjuju afinitet vezivanja ZAP70 za fosforilisane ITAM-e. Vezivanje ATP,
obilježje/zaštitni znak aktivnih kinaza, takođe smanjuje afinitet vezivanja i obezbjeđuje/garantuje
oslobađanje samo aktiviranih kinaza, čime se maksimizuje amplifikacija i disperzija signala.
Promjena u afinitetu vezivanja vjerovatno je posljedica konformacionih promjena prenesenih
intramolekularnim interakcijama sa mjesta za vezivanje ATP-a na SH2 domene