РНК репликация

Обратна транскрипция
Department of Biology
Medical University of Sofia
The central dogma
http://thisisartlab.com/
 Класификация на вирусите според генома

Reverse transcription

Reverse
transcription
RNA RNA RNA
replication replication replication

https://viralzone.expasy.org/
• За организмите с клетъчен строеж има един предполагаем общ
предшественик– LUCA (last universal common ancestor). За вирусите най-
вероятно няма общ предшественик.
• Най-вероятно Еволюцията е създавала различните вируси по различно време и
по различни начини. Главен довод за това е фактът, че вирусите използват
много разнообразни генегични механизми.
• Балтиморовата класификация на вирусите (по името на автора й David
Baltimore) разпределя вирусите на 7 групи в зависимост от типа на генома.
• Разликите във вирусните геноми водят и до разлики в начина на синтез на
мРНК.
• Освен това и механизмите за намножаване на генома са различни.
• Два от механизмите са нови за вас – РНК репликация и обратна транскрипция.
 РНК репликация
• Как е открита – при изучаване на менговируси и полиовируси през 1960-те години е било забелязано,
че те не са чувствителни към актиномицин D, който инхибира ситнеза на РНК върху ДНК матрица. Това
е показало, че съществува вирусен ензим, който копира РНК без за се нуждае от ДНК матрица.
• Какъв е процесът – Синтез на РНК върху матрица РНК.
• Официално име – РНК-зависима РНК репликация.
• Името на ензима – РНК-зависима РНК полимераза (RNA-dependent RNA polymerase, RdRP) или РНК
репликаза. Тя се кодира от вирусния геном.
• Субстрати на РНК репликазата – нуклеотид-трифосфати (NTPs).
• РНК репликазата е запазена само за РНК вирусите и не се използва от клетъчни РНК.
• Почти всички РНК вируси (с изключение на ретровирусите) са способни на РНК репликация. С други
думи – тя е за РНК вируси, които нямат ДНК стадий.
• Процесът има два стадия:
1. Иницииране: синтезът на РНК започва от (или близо до) 3' края на РНК матрицата. В някои
случаи то не изисква праймер (de novo), а в други случаи участват праймери (вирусни протеини,
означават се като genome-linked primer, VPg). При de novo инициирането нуклеозид трифосфат се
прибавя към 3'-OH на началния нуклеотид .
2. Удължаване: става чрез повтаряне на описания трансфер до пълния синтез на РНК продукта.
Антисенс РНК – само припомняне.
Това е РНК последователност, която е комплементарна на ендогенна мРНК. Когато те се свържат,
транскрипцията на мРНК се блокира. Антисенс РНК-и се прилагат като иновативни методи за лечение.

Sense на вирусните РНК

При вирусите "sense" има по-различно значение.
Геномът на един РНК вирус може да бъде positive-sense (+ верига РНК) или negative-sense (- верига).
По този признак различаваме вируси с положителен и отрицателен геном.

Положителната геномна вирусна РНК (5′-to-3′) може да бъде транслирана директно във вирусен протеин
(т.е., за синтеза на белтъка не се изисква вирусният геном да е реплициран преди това). В този случай
вирусната РНК играе роля както на геном, така и на вирусна мРНК и инфектираната клетка може
незабавно да я транслира. Поради този факт не е необходимо вирусната РНК репликаза да бъде
пакетирана във вириона. Тя ще бъде първият вирусен белтък, произведен в инфектираната клетка, за да
може вирусният геном да се намножи.

Отрицателната геномна вирусна РНК (3′-to-5′) е комплементарна на вирусната мРНК. За синтез на

вирусни протеини се изисква първо да се създаде положително копие на геномната РНК. В този случай
вирионът трябва да съдържа готова за действие репликаза.
Сравнение на
транскрипцията на
отрицателна и
положителна РНК

При вирусите
понятията репликация
и транскрипция до
голяма степен се
припокриват.

https://mmbr.asm.org/
(A) - ПОЛОЖИТЕЛНА
• Веднага след като се освободи от вирусните белтъци положителната геномна РНК се поема от
клетъчната машинария и директно се транслира в един общ белтък, наречен полипротеин.
• Полипротеинът се обработва до получаване на единични белтъци.
• Новопроизведената РНК репликаза копира положителната геномна РНК в комплементарна
отрицателна мРНК.
• Все още не е ясно как се превключва от транслация към транскрипция на една и съща РНК.
• Новопроизведената отрицателна РНК е матрица за синтез на нова положителна РНК.
• Тя може да е матрица за транслация, за репликация, или да бъде опакована във вириони.

(B) - ОТРИЦАТЕЛНА
• Отрицателната РНК се транскрибира в положителна.
• Получените копия може да се използват и като матрица за нова геномна РНК, и като матрица за
белтъчен синтез.
• Копирането на отрицателната ДНК се извършва от репликаза, опакована във вириона.
Репликация на
отрицателна
РНК
Синтезира се (+) копие, то
е матрица за ново (-)
копие.

Положителното
копие на геномната
НК се нарича
антигеном.

https://viralzone.expasy.org/
• Разопаковането на вириона дава старт на репликацията.
• Началото на репликацията на отрицателната РНК се дава от участък, наречен лидер.
• Синтезира се антигеном. Той остава разопакован.
• Антигеномът се реплицира по същия начин, както генома.
• РНК репликазата започва да го копира след като се е свързала с началния му участък, наречен
трейлър.

Превключване репликация / транскрипция

• РНК репликазата прави и репликация, и транскрипция, НО:

Докато РНК репликазата прави репликация, тя игнорира всички сигнали, инициращи
транскрипция на отделни гени.
• Обяснение – вероятно тя по принцип действа като транскриптаза и превключва към
репликация само при определена концентрация на комплексите вирусна РНК-капсидни
белтъци (когато е възможно сглобяване на нови вируси и те се нуждаят от геном).
Транскрипция
на множество
мРНК върху
една
отрицателна
РНК

• РНК репликазата се свързва с лидерна последователност в 3' края на отрицателната геномна РНК.
• Синтезира къса лидерна РНК и спира до участък, който е сигнал за започване на транскрипция на
даден ген.
• Транскриптът, иницииран по този начин, получава шапка.
• На края на всеки ген има терминиращ участък. Там РНК репликазата се запъва върху нуклеотид с база У
и резултатът е поли-А опашка.
• Репликазата се плъзга напред, докато намери иницииращия участък следващия на следващия ген.
 Репликация на отрицателната вирусна РНК – в ядрото или в
цитоплазмата?

• Някои вируси с отрицателна РНК имат несегментиран геном (само една молекула РНК).
Други имат сегментиран геном, състоящ се от няколко молекули РНК.
• Важна разлика при тяхната репликация е мястото на процеса.
• При вирусите с несегментиран геном репликацията е в цитоплазмата. При копирането на
геномната РНК се получават множество мРНК.
• При вирусите със сегментиран геном тя е в ядрото. Всеки РНК сегмент се копира като
отделна мРНК.

Едно изключение: Човешките делтавируси
(Human Deltavirus; HDV; Satellite virus;)
https://www.researchgate.net/
Репликационен цикъл:
• Изисква коинфекция на същата клетка и с
хепатит В.
• (+)РНК на делтавируса се реплицира в
ядрото като търкалящо се колело. Така се
синтезира верига от множество свързани
антигеноми.
• Определени места на РНК веригите действат
като рибозими и чрез самонарязване се
получават отделни антигеноми.
• Те са матрица за нова геномна (+)РНК.
• Вирусните белтъци се синтезират в
цитоплазмата, влизат в ядрото и образуват
комплекси с геномната РНК (RNP).
• Комплексите излизат в цитоплазмата и там
се свързват с повърхностен антиген на
вируса на хепатит В (наричан още
австралийски антиген).
• Образуването на тези по-сложни комплекси
води до сглобяване на зрели вириони на
делтавируса.
Репликация на позитивна вирусна РНК

Мембранен джоб
 Репликация на позитивна вирусна РНК
• Тя може да служи и за геномна, и за мРНК.
• Директно може да се поеме от рибозомите на инфектираната клетка и да се транслира.
• Транслират се първо гените, необходими за репликацията.
• Синтезираните белтъци правят комплекси с клетъчни белтъци, които провокират образуване на
мембранни джобове при различни органели.
• Най-често джобовете са по зърнеста ендоплазмена мрежа, но се появяват и при митохондрии,
вакуоли, апарат на Голджи, плазмена мембрана.
• Вероятно целта на скриването на РНК репликацията в мембранни джобчета е да се затруднят
защитните механизми на клетката.
• Репликацията отначало вероятно води до образуване на двуверижна РНК. Тя от своя страна може да
се копира в геномна и мРНК.
• 5' на положителната вирусна РНК може да остане гол, да се кепира или да се свърже с вирусен белтък
с роля на праймер (VPG – viral genome-linked protein).
• 3' може да остане гол, или да получи поли-А опашка.
• Най-често при транслацията се произвежда полипротеин, който се нарязва от вирусни или клетъчни
протеази до получаване на отделни вирусни белтъци.
 Цикъл на репликация и транскрипция
на (+)РНК
• Вирусите с (+)РНК влизат в клетката чрез
ендоцитоза.
• (+)РНК се освобождава от капсида и се поема от

https://www.semanticscholar.org/paper/The-dependence-
рибозомите.
• Синтезират се вирусни белтъци, отговарящи за

of-viral-RNA-replication-on-co-opted-Nagy-Pogany
репликацията, те се свързват с вирусната РНК.
Така се образува вирусен репликационен
комплекс (viral replication complexes, VRC).
• Той се свързва с някоя от мембраните и
провокира образуването на джобове.
• Малко количество (−)РНК става матрица за
голямо количество (+)РНК.
• Новите (+)РНК се освобождават от VRC, докато
(−)РНК остава свързана с тях.
• (+)РНК влиза в нови цикли на репликация и
транскрипция, а част от нея се свързва с
капсидни белтъци.
 Структура на РНК-репликазата. Субединиците на ензима са:
• Сърцевината се нарича polymerase basic
Пример – грипен вирус protein 1 (PB1); той отговаря за
Insight into Influenza: A Virus Cap-Snatching. Vlugt et al., 2018

1 Angstrom=0.1 nm
репликацията.
• polymerase basic protein 2 (PB2) – отговаря
за транскрипцията на вирусната мРНК
• polymerase acidic protein (PA) – също
отговаря за транскрипцията на вирусната
мРНК

PB1 (в синьо) има два входа и два изхода.

• Вход 1 - за матрицата (вирусната РНК),
идваща като нуклеопротеинов комплекс
(NP, в жълто)
• Вход 2- за нуклеозид трифосфатите
(NTPs).
• Изход 1 – за матрицата
• Изход 2- за продукта
• Двата входни тунела се сливат в активния
център и после се разклоняват на два
изходни тунела.
 Обратна транскрипция
Откриване
През 1970-те години централната догма на биологията е развенчана с откриването на ензимите,
отговарящи за репродукцията на ретровирусите. Те използват ретровирусната РНК като матрица за
синтез на комплементарна ДНК (кДНК), която в последствие се вгражда в генома на инфектираната
клетка.
Ензимът
По принцип е РНК-зависима ДНК-полимераза, но обикновено се нарича обратна транскриптаза.
Къде действа
Обратна транскриптаза притежават някои вируси, бактериите, животните, растенията. При всички тях
ензимът копира РНК във вид на ДНК, която се вгражда в генома на клетката.
По този начин обратната транскрипция участва в:
• Размножаване на ретровирусите
• Увеличаване на генетичното разнообразие чрез ретротранспозони
• Репликация на хромозомните теломери
• Синтез на извънхромозомни multicopy single-stranded DNA (msDNA) при бактерии (с които не се
занимаваме, но е добре да се знае, че са свързани с клетъчното стареене при бактериите).
 Различни роли на обратната транскрипция

https://www.thermofisher.com/
Теломеразната обратна
транскриптаза (TERT)
Копиране на използва РНК-матрица за
Копиране на ретровирусни ретротранспозони преди удължаване на
геноми преди вграждане в вграждане в клетъчната Синтез на msDNA при
теломерите при
клетъчната ДНК. ДНК. бактерии.
бозайници.
Ако сте любопитни:
КАК СТАРЕЯТ ЕДНОКЛЕТЪЧНИТЕ

https://journals.plos.org/plosgenetics. A Bacterial Kind of Aging

Тук е даден механизъм за стареене на
бактериите. Когато клетката започне делене,
msDNA (multicopy single-stranded DNA) се
събира предимно в едната от дъщернине
клетки. Тази дъщерна клетка се приема за
по-стара и ще остави много по-малък брой
поколения.
За стареенето на бактериите допринасят и
други продукти на обмяната, които също
преимуществено попадат само в едната
дъщерна клетка.

Thomas Nyström. 2007

По подобен начин стареят и дрождите. Те са
примитивни едноклетъчни еукариоти.

Какъв е изводът – дори и едноклетъчните не

са безсмъртни.
 Асиметрично делене на пъпкуващи дрожди
 Майчината (по-голямата) клетка старее с всяко поколение. Тя остарява за около 20
клетъчни цикъла. По-дребните дъщерни клетки запазват способността си за делене.

Kobayashi, Cell. Mol. Life Sci. (2011)

B: ERC - self replicating extrachromosomal circles – отделени от хромозомите парчета кръгова ДНК,
носеща гени за рРНК. Хромозомната ДНК се разпределя правилно. ERC остават само в майчината
клетка и са свързани с нейното стареене. В майчината клетка остават и увредени митохондрии,
протеини, ненужни вакуоли и епизоми.
Репродуктивен цикъл на https://www.researchgate.net

ретровирусите
(1) Свързване с клетъчната
мембрана
(2) Влизане в клетката
(3) Обратна транскрипция
(4) Транспорт на провирусния
геном в ядрото
(5) Интегриране на провирусния
геном в клетъчния геном
(6) Транскрипция на провируса
(7) Транслация на вирусната мРНК
за получаване на вирусни
белтъци
(8) Сглобяване на вирион
(9) Зреене на вириона и излизане
от клетката.
Обратната транскриптаза – два ензима в един

Обратната транскриптаза има две субединици,

които се кодират от общ ген.
Ензимът има няколко функции:
• Придържа РНК матрицата към ДНК продукта.
Това става в полимеразния активен център,
който прилича на пръсти, обгръщащи двете
вериги.
• След като ДНК копието е готово, ензимът
премахва РНК матрицата, като я хидролизира.
Това става в нуклеазния център.
• Накрая се синтезира втората верига на кДНК.
Това става отново в полимеразния център.

https://en.wikipedia.org/
Маханизъм на обратната транскрипция при HIV
 Маханизъм на обратната транскрипция при HIV
Иницииране - тРНК за лизин дества като праймер. Тя има участък, който е коплементарен на
вирусната РНК (primer binding site, PBS).
1- Обратната транскриптаза прибавя ДНК нуклеотиди към 3' края на праймера и копира некодиращия
участък U5 и участъкът R. Теди два участъка присъстват и в двата края на вирусната РНК.
2- Нуклеазният домен рибонуклеаза-Н (RNAseH) на ензима разрушава U5 и R в 5’ края на РНК.
3- тРНК-праймерът прави скок към 3’ края на вирусния геном, носейки копията на U5 и R, които
хибридизират със съществуващия там участък R.
4- ДНК-копието се удължава.
5- По-голямата част от вирусния геном се разгражда от рибонуклеаза-Н, остава само участъкът PP.
6- Синтезира се втората верига на кДНК, като PP се използва като праймер.
7- тРНК-праймерът се оттегля и е готов за нов скок към нова вирусна РНК.
8- Участъкът PBS от втората ДНК верига хибридизира с PBS от първата.
9- Двете вериги се удължават до получаване на цялостно двойноверижно ДНК копие на вирусния
геном.
Обратната транскриптаза на ретровирусите е доста небрежен ензим

Ензимът твърде често греши – поставя грешен нуклеотид веднъж на около 2000 нуклеотида.
Това създава ли големи проблеми на вируса?
Всъщност, високото ниво на медицината превръща този проблем в предимство. Бързата изменчивост
пречи на създаването на ваксина, освен това някои вируси напипват мутации, които ги правят
устойчиви на прилаганите лекарства.
Как се решава този проблем?
Прилага се комбинация от лекарства. Вирусът може да стане резистентен към цялата комбинация,
само ако създаде форми, устойчиви едновременно на всяко от комбинираните лекарства.
Препращане към материал, който ще бъде
обсъждан по-късно:
КАК ТЕЛОМЕРАЗАТА ОПРЕДЕЛЯ БРОЯ НА
КЛЕТЪЧНИТЕ ДЕЛЕНИЯ

http://cnx.org
www.martinfrost.ws