Мутаційний статус гена Her-2/neu у хворих на РМЗ відповідно до

рекомендацій ASCO/CAP 2018 року

Рак молочної залози (РМЗ) за даними Міжнародного агентства по
дослідженню раку (International Agency for Research in Cancer) займає вагоме
місце в сучасній онкології, має перше місце серед усіх неоплазій жіночого
населення України у 2018 році та складає 21,6 % [http://www.iarc.fr]. Щорічне
зростання захворюваності на РМЗ в розвинених країнах зумовлене збільшенням
тривалості життя та урбанізації.
Вагоме патогенетичне значення у формуванні пухлинного росту РМЗ
відіграють рецептори епідермального фактора росту (EGFR). Активізацію
внутрішньоклітинних каскадів, контролюючих клітинну проліферацію,
відбувається за рахунок димеризації із подальшим аутофосфорилюванням
тирозинових залишків внаслідок зв’язування факторів росту із рецепторами
Her-1 (ErbB1), Her-2/neu (ErbB2) Her-3 (ErbB3), Her-4 (ErbB4) на поверхні
клітини. Серед сімейства білків EGFR значну увагу викликає EGFR 2-го типу
(Her-2/neu). За наявної гіперекспресії Her-2/neu в клітинах РМЗ новоутворення
характеризується агресивним перебігом, метастазуванням на ранніх стадіях та
стійкістю до хіміо- і гормональної терапії. У 10–34 % випадків поєднана із
інвазивним РМЗ [Белохвостова, А. С., И. А. Смирнова, and А. А. Енилеева. "Таргетная терапия в лечении HER2-позитивного рака молочной железы." Сибирский
онкологический журнал 2 (56) (2013). ].
У нормальних тканинах людини рецептор Her-2/neu визначається в
звичайному стані, гіперекспресія ж може бути виявлена лише в пухлинних
клітинах. Найбільш широко вивчена гіперекспресія Her-2/neu у пацієнтів з РМЗ.
У разі норми на поверхні епітеліальної клітини знаходиться близько
20 тис. рецепторів Her-2/neu. За гіперекспресії на клітинах РМЗ кількість
даного рецептору може збільшуватися в більше ніж 100 разів ) [ Pietras RJ, Arboleda J, Reese DM, et al: HER-2

tyrosine kinase pathway targets estrogen receptor and promotes hormone independent growth in human breast cancer cells. Oncogene 10:2435-2446, 1995 ], що призводить до
порушень клітинних циклів та безконтрольного поділу [ Chazin VR, Kaleko M, Miller AD, et al: Transformation mediated by the

human HER-2 gene independent of the epidermal growth factor receptor. Oncogene 7:1859-1866, 1992 ].
 Наявність взаємного зв’язку між поганим клінічним прогнозом та
гіперекспресією, наявністю/відсутністю ампліфікації гена Her-2/neu надає
можливість розглядати цей ген в патогенезі розвитку РМЗ. Немало важливим
аспектом є роль гена Her-2/neu як мішені в терапії для направленого
інгібіювання тирозинкіназної активності, внаслідок чого синтезували препарат
з механізмом протипухлинної дії – трастузумаб.
Для проведення адекватного оцінювання Her-2/neu-статуса доцільно
використовувати для досліду біопсійний та післяопераційний матеріал
пацієнтів з РМЗ, які, за можливості, ще не проходили специфічне лікування. На
сьогодні широко розповсюдженні два методи визначення рівня активності гена
Her-2/neu: імуногістохімічний метод (ІГХ) та флуоресцентна гібридизація in
situ (FISH) [20, 21].
Базовим методом на сьогодні є ІГХ, який базується на техніці
специфічного забарвлення клітинної стінки з метою визначення рівня експресії
білка. Саме результати візуалізації реакції «антиген-антитіло» є важливим
етапом дослідження. Завдяки використанню мітки, зв’язаної з Fc-фрагментом
антитіл, можна визначити зв’язані з антигеном антитіла. Антитіла – це розчинні
глікопротеїни глобулінової фракції сиворотки крові чи інших біологічних
рідин, які утворюються у відповідь на присутність антигена (чужорідних
речовин: таких як бактерій, вірусів, токсинів) в організмі теплокровних тварин.
(Теоретические основі и практическое применение методов иммуногистохимии (руководство) под ред. Коржевского, изд.2.)
Для визначення кількості безпосередньо самого гена використовують
другий метод – FISH, в основі якого лежить детекція специфічних ДНК-
послідовностей на досліджуваних ділянках хромосоми. Механізм методу
полягає в гібридизації флуоресцентної специфічної проби з комплементарними
ділянками хромосом за умови фіксованого (in situ) субстрату [Beaty В., Mai S., Squire J. FISH
A Practical Approach. — New York, 2002. ]. Таким чином, за використання FISH можливо оцінити
кількість генів у ядрах пухлинних клітин РМЗ, що беруть участь у продукції
рецептора Her-2/neu. В разі збільшення кількості цього гена (ампліфікації),
дуже висока вірогідність гіперекспресії відповідного білка. Серед переваг
методу на відміну від ІГХ слід зазначити високу чутливість та меншу
залежність від кваліфікації дослідника. Недоліком є більш висока ціна та
наявність складного обладнання.
Метод FISH поєднує в собі сильні сторони класичних цитогенетичних,
цитологічних та молекулярних методів. Але при цьому, об’єктом дослідження
методу є унікальні нуклеотидні послідовності певної хромосоми або її окремої
частини. Використання FISH дозволяє оцінювати генетичний статус в окремій
клітині і визначати, наприклад, декілька етіопатогенетично значущих
аномальних клітин серед тисячі інших з нормальним генотипом [ Брюгманн, Аня и др. «Тестирование

HER2 при раке молочной железы: сравнительное исследование BRISH, FISH и IHC». Прикладная иммуногистохимия и молекулярная морфология 19,3 (2011): 203-211.].

Під час роботи з подвійним зондом FISH для дослідження ампліфікації

гена Her-2/neu, де, окрім ділянки досліджуваного гена, додатково мітиться
біляцентромерна ділянки хромосоми 17, діагностичний пошук більш
ускладнений через часте визначення при РМЗ випадків з полісомією хромосоми
17 (Marchio et al., 2009). Серед них до 35 % випадків полісомії хромосоми 17
низького ступеня та 8 % – високого. Полісомія обумовлена наявністю
додаткових копій в ядрі однієї або декількох окремих хромосом (Marchio et al.,
2009). На практиці відносно часта полісомія при РМЗ супроводжуються
належним збільшенням кількості копій генів, розташованих на хромосомі, що в
свою чергу, як правило, призводить до збільшення експресії кодованих білків.
Такі ситуації можуть викликати хибнопозитивний результат ІГХ при
визначенні статусу Her-2/neu [Клименко С. В., Л. М. Захарцева. "Оценка мутационного статуса гена Her-2/neu в
клетках рака молочной железы." // Онкологія. – 2007. Т. 9, №3. – С. 175-178 ]. За даними Pu X. et al. (Pu X. et al.
Comparison of the 2007 and 2013 ASCO/CAP evaluation systems for HER2 amplification in breast cancer //Pathology-Research and

Practice. – 2015. – Т. 211. – №. 6. – С. 421-425.) статус Her-2/neu при РМЗ у випадку наявності
полісомії хромосоми 17 може набувати різних інтерпритацій в залежності від
застсування критеріїв оцінювання.
В 1996 році американська спільнота клінічних онкологів (ASCO – Clinical
Practice Guidelines Committee) вперше опублікувала рекомендації щодо
клінічного застосування тестів пухлинних маркерів, основані на доказовій базі
[22]. З часом рекомендації оновлюються, змінюючи інтерпретацію результатів
діагностичних тестів для підвищення якості тестування Her-2/neu [23]. Останні
три оновлення, які стосувалися змін в інтерпритації ампліфікаційного статусу
гена Her-2/neu були в 2007, 2013 та 2018 роках.
ДОПИСАТИ ПРО ОСОБЛИВОСТІ ОЦІНКИ В КОЖНІ З РОКІВ
В літературних джерелах, які були опубліковані після виходу
рекомендацій ASCO/CAP 2013 року, відзначається важливість
оцінки результатів FISH в категоріях, які в 2018 році
перекваліфікувалися в групу з сумнівним ампліфікаційним статусом гена Her-
2/neu [ Press MF, Villalobos I, Santiago A, et al: Assessing the new American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guidelines for HER2 testing by fluorescence in situ hybridization: Experience of an
academic consultation practice. Arch Pathol Lab Med 140:1250–1258, 2016
. Ballard M, Jalikis F, Krings G, et al: ‘Non–classical’ HER2 FISH results in breastcancer: A multi-institutional study. Mod Pathol 30:227–235, 2017
. Lim TH, Lim AS, Thike AA, et al: Implications of the updated 2013 American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations on human epidermal growth factor receptor 2 gene
testing using immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization for breast cancer. Arch Pathol Lab Med 140:140–147, 2016
Bethune GC, Veldhuijzen van Zanten D, MacIntosh RF, et al: Impact of the 2013 American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor
receptor 2 (HER2) testing of invasive breast carcinoma: A focus on tumours assessed as ‘equivocal’ for HER2 gene amplification by fluorescence in-situ hybridization. Histopathology 67:880–887, 2015
Solomon JP, Dell’Aquila M, Fadare O, et al: Her2/neu status determination in breast cancer: A single institutional experience using a dual-testing approach with immunohistochemistry and fluorescence in situ

]
hybridization. Am J Clin Pathol 147:432–437, 2017

Згідно рекомендацій ASCO/CAP від 2018 року тести в сумнівних групах

повинні виконуватися на тому ж зразку тканини з використанням зрізів того ж
блоку ІГХ. В ідеальному випадку, сусідні рівні тканин від спільного блоку
мають бути протестовані та проаналізовані паралельно. У випадку, коли ІГХ
вже була виконана, дані по дослідженню слід використовувати для вибору
областей підрахунку під час FISH-дослідження. При цьому потрібно зважати,
щоб області з самою сильною експресією білка були включені в підрахунок
FISH аналізу. [Wolff, Antonio C., et al. "Human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society
of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline focused update." Archives of pathology & laboratory

medicine 142.11 (2018): 1364-1382. ].

За критеріями ASCO/CAP 2018 року Wolff, Antonio C., et al. "Human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American

для
Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline focused update."  Archives of pathology & laboratory medicine 142.11 (2018): 1364-1382.

визначення мутаційного статусу гена Her-2/neu при РМЗ слід використовувати

подвійний зонд FISH та у разі виявлення випадку з сумнівним результатом
додатково оцінювати ІГХ. Press MF, Villalobos I, Santiago A, et al: Assessing the new American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guidelines for HER2
testing by fluorescence in situ hybridization: Experience of an academic consultation practice. Arch Pathol Lab Med 140: 1250– 1258, 2016
Ballard M, Jalikis F, Krings G, et al: ‘Non–classical' HER2 FISH results in breastcancer: A multi-institutional study. Mod Pathol 30: 227– 235, 2017

Для визначення значимості результатів FISH рівень експресії білка

повинен співставлятися з мутаційним статусом гена коли відсутні надійні
клінічні дані для приймання рішень. В основному така робота полягає в оцінені
ІГХ на зрізі тканини того самого блоку, який використовувався для FISH.
Якщо подальше дослідження зразка тканин чи біопсійного матеріалу з
метою визначення мутаційного статусу гена Her-2/neu не є доступним, можливе
залучення в повторне дослідження матеріалу інших зразків тканини від
пацієнта. Shah, Mithun Vinod, et al. "Change in pattern of HER2 fluorescent in situ hybridization (FISH) results in breast cancers submitted for FISH testing: experience of a reference laboratory using
US Food and Drug Administration criteria and American Society of Clinical Oncology and College of American Pathologists guidelines." Journal of Clinical Oncology 34.29 (2016): 3502-3510.

Оцінювання результатів методу FISH за критеріями ASCO/CAP 2007,

2013 та 2018 років проводили для 797 випадків хворих на РМЗ. Розподіл
випадків РМЗ на підгрупи (без ампліфікації гена Her-2/neu, з ампліфікацією
гена Her-2/neu та сумнівними результатами) при застосуванні критеріїв
ASCO/CAP від 2007, 2013 та 2018 років представлений у таблиці 1.

Таблиця 1

Розподіл груп у відповідності до мутаційного статусу гена Her-2/neu при

РМЗ у відповідності до Рекомендації ASCO/CAP 2007, 2013 та 2018 років

Мутаційний статус гена Рекомендації ASCO/CAP

Her-2/neu 2007 2013 2018
Відсутність ампліфікації, 408 320 320
(Довірчий інтервал), (± 12,6) (± 9,4) (± 9,4)
[χ2] [9,85] [2,46] [2,46]
Визначена ампліфікація 374 424 380
(Довірчий інтервал), (± 11,3) (± 13,1) (± 11,6)
[χ2] [0,89] [2,50] [0,41]
Сумівні випадки 15 53 97
(Довірчий інтервал), (± 1,3) (± 1,8) (± 0,6)
[χ2] [29,09] [0,07] [32,07]
Сума 797 797 797

Частки пацієнтів, в яких не була визначена ампліфікація гена Her-2/neu

при використанні критеріїв ASCO/CAP 2018 року у порівнянні з ASCO/CAP
2013 року не відрізнялися(р > 0,05). Хоча кількості випадків РМЗ у групі з
позитивним ампліфікаційним статусом гена Her-2/neu відповідно до
рекомендацій ASCO/CAP 2018 року дещо менша від аналогічної групи за
ASCO/CAP 2013 року (р = 0,056). Група випадків із сумнівними результатами
FISH при застосуванні кожного із оновлень ASCO/CAP 2013 та 2018 років,
значуще збільшувалася (з 6,6 % до 12,2 %, р <0,05).
Спостерігалася тенденція щодо зменшення кількості випадків РМЗ у
групі з ампліфікацією досліджуваного гена при перегляді зразків відповідно до
рекомендацій ASCO/CAP 2018 року, у порівнянні з ASCO/CAP 2013 року
(р = 0,056). Необхідно зазначити, що при застосуванні критеріїв ASCO/CAP
2018 року кількість випадків, віднесених до групи із сумнівними результатами,
була значно більшою, ніж при використанні ASCO/CAP 2013 року (12,2 % та
6,6 %, відповідно, р <0,05).
Застосування вдосконалення критеріїв оцінки мутаційного статус гена
Her-2/neu ASCO/CAP в діагностичній практиці спричинили зменшення
кількості Her-2/neu-негативних пацієнток з 51,2 % (за критеріями ASCO/CAP
2007 року) до 40,2 % (за критеріями ASCO/CAP 2013 та 2018 років) (тест
МакНемара χ2 = 6,52, df = 1, p = 0,01). У підгрупах із визначеною ампліфікацією
гена Her-2/neu статистично значущої різниці не було 46,9 % (ASCO/CAP 2007
року) та 53,2 % (ASCO/CAP 2013 року) проти 47,7 % (ASCO/CAP 2018 року)
(тест МакНемара χ2 = 2,20, df = 1, p = 0,14).

При застосуванні рекомендацій ASCO/CAP 2007, 2013 та 2018 років для

оцінювання мутаційного статусу гена Her-2/neu методом FISH статистично
значуще збільшувалась частка випадків РМЗ із сумнівними результатами щодо
ампліфікаційного статусу гена Her-2/neu з 15 (1,9 %) (за критеріями ASCO/CAP
2007) до 53 (6,6 %) (тест МакНемара χ2 = 634,71, df = 1, p < 0,01), а в разі
використання ASCO/CAP 2018 року до 97 (12,2 %) (тест МакНемара χ2 = 496,21,
df = 1, p < 0,01) (рис. 1).

0.14

0.12
R² = 1
0.1

0.08

0.06

0.04

0.02

0
ASCO/CAP 2007 ASCO/CAP 2013 ASCO/CAP 2018

Сумівні Polynomial (Сумівні)

Рис. 1. Розподіл випадків РМЗ по підгрупам у відповідності до статусу гена

Her-2/neu за критеріями оцінювання ASCO/CAP від 2007, 2013 та
2018 років.

1. Встановлено, що кількість випадків із сумнівним результатом було

більше при використанні ASCO/CAP 2018 року, у порівнянні з 2013 та
2007 роками (12,2 %, 6,6 % та 1,9 %, p < 0,05 відповідно).