TEMA 1: EL LABORATORI D’HEMATOLOGIA.

LA SANG I L’HEMATOPOESI

1. INTRODUCCIÓ

L’hematologia és la rama de la medicina que es dedica a l’estudi, diagnòstic i tractament

de patologies relacionades amb la sang i els òrgans hematopoètics.

Els laboratoris d’hematologia es divideixen en les següents seccions:

• Secció de citologia: estudi de cèl·lules sanguínies i els seus precursors.
• Secció d'hemostàsia: estudi de la coagulació sanguínia.
• Secció de banc de sang i hemoteràpia: estudi de compatibilitat de la sang i dels
components sanguinis.

2. LA SANG

La sang és un teixit líquid que circula pels vasos sanguinis dels vertebrats, transportant i
distribuint gasos, nutrients i substàncies de rebuig.
La sang perifèrica és el nom que rep tota la sang del cos, excepte la de la medul·la òssia.
Amb sang perifèrica anticoagulada sense centrifugar no es distingeixen les fases.
Amb sang perifèrica anticoagulada i centrifugada es distingeixen 2 fases: fase líquida o
plasma i components cel·lulars o elements formes .

2.1. ELEMENTS FORMES DE LA SANGUÍNIA

Els elements formes que formen la sang són cèl·lules i derivats cel·lulars que floten en el
plasma.
Aquests representen el 45% del volum sanguini.
N’hi ha de 3 tipus: glòbuls rojos (eritròcits), glòbuls blancs (leucòcits) i trombòcits
(plaquetes).

2.1.1. Eritròcits o glòbuls rojos

Són cèl·lules que no tenen nucli i que tenen una forma bicòncava.
La seva funció és transportar l’oxigen dels pulmons als diferents teixits.
Representen el 95% dels components cel·lulars de la sang.
Sobre la membrana es situen glicoproteïnes antigèniques, que són les que defineixen el
grup sanguini.

El seu citoplasma està format per enzims i en un 90% per hemoglobina.

L’hemoglobina és la responsable del color roig de la sang.
És una proteïna tetramèrica formada per 4 globulines unides per un grup hemo.
2.1.2. Leucòcits o glòbuls blancs

La seva funció és defensiva, ja que formen part del sistema immunitari.

Són els responsables de detectar i eliminar gèrmens, cèl·lules infectades i cèl·lules
estranyes.
Representen el 0,1% dels components cel·lulars de la sang.
A més, tenen capacitat migratòria per infiltrar-se en teixits.

Es divideixen en 2 grups: leucòcits polimorfonuclears o granulòcits i monomorfonuclears o

agranulòcits.

• Leucòcits polimorfonuclears o granulòcits

Sembla que hi ha més d’un nucli, però només n’hi ha un, el qual està dividit en 2 o més
lòbuls units per ponts cromàtics.
Aquests nuclis tenen granulacions citoplasmàtiques.

Segons l’afinitat de les granulacions amb diferents colorants, es classifiquen en:

◦ Eosinòfils

Apareixen en al·lèrgies o infestacions per paràsits.

Representen entre un 2-5% dels leucòcits.
Són de color rogenc-ataronjat.
Tenen un nucli bilobulat (ulleres) o trilobulat.
Els grànuls tenen afinitat pels colorants àcids (eosina).

◦ Basòfils

Apareixen en inflamacions.
Representen entre un 0-1% dels leucòcits.
Són d’un color blavós.
Tenen 2 o 3 lòbuls.
Els grànuls són tan destacats que tapen el nucli.
Tenen afinitat per colorants bàsics (blau de metilè).

◦ Neutròfils

Apareixen en infeccions i en la fagocitosi de bacteris.

Representen entre el 36-71% dels leucòcits.
El nucli està dividit en 2 o 5 lòbuls.
Tenen grànuls neutres de color gris, però aquests no
tenen afinitat per cap colorant.
Es divideixen en:

- Caiats

Són els neutròfils que es troben en estadi juvenil.

Representen entre el 2-5% dels leucòcits.
Són polinuclears i granulats.
Els grànuls són poc vistosos i tenen un to marronós.
 Si es troben dins del moll d’os, poden passar al següent estadi i madurar, és a dir,
convertir-se en segmentats.
Si surten a la sang perifèrica, no passen al següent estadi.

- Segmentats

Són els neutròfils que es troben en estadi madur.

Representen entre el 36-66% dels leucòcits.
Poden tenir entre 2 i 5 lòbuls.
Tenen una granulació molt fina.
Maduren en el moll d’os.

• Leucòcits monomorfonuclears o agranulòcits

Només tenen un nucli.

El nucli no té ni lòbuls ni granulacions citoplasmàtiques, excepte les cèl·lules NK.
Poden ser de 3 tipus:

◦ Limfòcits

Intervenen en la resposta immunitària cel·lular i humoral.

Representen entre un 22-40% dels leucòcits.
Tenen 1 nucli i molt poc citoplasma.
Poden ser limfòcits B o limfòcits T.

◦ Monòcits

Intervenen en la fagocitosi, eliminen bacteris, cèl·lules infectades...

Representen entre un 4-8% dels leucòcits.
El nucli té una forma arronyonada.
Hi ha zones en què no es tenyeix.
Quan penetren en els teixits es diferencien en: macròfags i histiòcits.

◦ Cèl·lules NK

La seva funció és destruir cèl·lules infectades per virus o cèl·lules canceroses, de manera
natural i inespecífica.
Són limfòcits grans que presenten grans grànuls citoplasmàtics i que normalment no es
troben a la sang.
Tenen un nucli rodó.

2.1.3. Plaquetes o trombòcits

Representen el 4’8% dels components cel·lulars de la sang.

Són petites porcions de citoplasma sense nucli, rodejades de membrana i amb grànuls.
Contenen factors de creixement i de coagulació sanguínia.

El megacariòcit és una cèl·lula poliploïdia amb nucli que mesura entre 100-150 micres (és
molt gran).
Les plaquetes procedeixen del megacariòcit, el qual és present en la medul·la òssia.
Quan el megacariòcit madura, es divideix, i és quan es formen les plaquetes.
2.2. EL PLASMA SANGUINI

Representa el 55% del volum sanguini.

És la part líquida de la sang on floten els elements formes.
En la seva composició destaquen:
• Aigua, representa el 91% i és el que manté la suspensió.
• Molècules orgàniques, representa el 8% (albúmina, globulines, fibrinogen...)
• Nutrients, aminoàcids, glucoses i greixos.
• Reguladors, enzims i hormones.
• Electròlits, són ions que mantenen el pH i la pressió osmòtica del plasma.
• Vitamines.
• Gasos, principalment CO2.

Distribueix els nutrients per tot l’organisme.

Transporta les substàncies de rebuig cap als sistemes excretors.
S’obté al laboratori mitjançant la centrifugació de sang anticoagulada, el qual és un procés
reversible.

Hi ha 2 tipus de plasma:
- Plasma ric en plaquetes (PRP)
S’obté centrifugant la sang anticoagulada a 500-1000 rpm durant 3-5 minuts.
Les plaquetes queden en suspensió en el plasma.
S’utilitza en proves funcionals de plaquetes, com el test d’agregació plaquetària.
El que dona terbolesa al tub són les plaquetes, com més tèrbol més plaquetes i viceversa.

- Plasma pobre en plaquetes (PPP)

S’obté centrifugant la sang a 2500-3000 rpm durant 10 minuts.
La força centrífuga és tan elevada que tots els elements formes sedimenten.
S’utilitza en proves de coagulació.

2.3. EL SÈRUM

El sèrum és la sang recollida sense anticoagulant, per tant, es produeix la coagulació.

Aquest és un procés irreversible.
El procés de coagulació és:
1) Es consumeixen els factors de coagulació.
2) El fibrinogen es transforma en fibrina.
3) Es forma un coàgul i queda una fase líquida, que és el sèrum.

En el laboratori es pot accelerar el procés mitjançant la centrifugació.

Quan es du a terme la coagulació, el sèrum manca dels factors de coagulació i de
fibrinogen, perquè s’han consumit.
Això s’utilitza, per exemple en immunoassajos.
3. L’HEMATOPOESI

L’hematopoesi és el procés de producció i maduració de totes les cèl·lules sanguínies.

Es produeix principalment a la medul·la òssia.
Per a estudiar-la, es divideix en 4 compartiments:
• Es localitzen a la medul·la òssia: cèl·lules mare, cèl·lules progenitores i cèl·lules
precursores.
• Es localitzen a la sang perifèria i als teixits: cèl·lules sanguínies madures.
A l’edat adulta la producció de cèl·lules sanguínies queda confinada a la medul·la òssia
dels ossos plans, curts...

3.1. CÈL·LULES MARE

Es localitzen a la medul·la òssia.

Poden replicar-se, proliferar i diferenciar-se en qualsevol tipus de cèl·lula sanguínia, per
tant, són pluripotents.
En resposta a factors de creixement es diferencien en 2 cèl·lules mare multipotents que
no tenen capacitat de renovar-se:
- Mieloide (CFU-M), sèrie roja, megacariocítica, granulocítica i monocítica.
Estan relacionats amb tot el que no són limfòcits.
- Limfoide (CFU-L), sèrie limfoide, per tant, estan relacionats amb els limfòcits.

3.2. CÈL·LULES PROGENITORES

Es localitzen a la medul·la òssia.

Provenen de la proliferació i diferenciació de les cèl·lules mare.
Tenen una composició antigènica de la membrana diferent de les cèl·lules mare.
Hi ha 2 tipus de cèl·lules progenitores:
- Progenitors mieloides, granulòcits, eritròcits, monòcits i megacariòcits.
- Progenitors limfoides, són unipotents i els limfoides, les cèl·lules NK, les cèl·lules
dendrítiques... en són exemple.

3.3. CÈL·LULES PRECURSORES

Es localitzen a la medul·la òssia.

Són els precursors de l’estadi cel·lular del procés d’evolució de les cèl·lules progenitores
fins les cèl·lules sanguínies madures.
Les seves característiques morfològiques i les propietats tintorials són identificables amb
microscopi.
Durant la maduració sofreixen els següents canvis morfològics:
- Disminució de la mida cel·lular i la basofília citoplasmàtica.
- Condensació de la cromatina nuclear.
- Desaparició dels nuclèols.
- Desapareix el nucli i els orgànuls citoplasmàtics de la sèrie eritroide.

3.4. CÈL·LULES SANGUÍNIES MADURES

Es localitzen a la sang perifèrica, als teixits i a la medul·la òssia.

Provenen de la diferenciació de les cèl·lules precursores.
L’última divisió possible és:
- Macròfags, sorgeixen a partir de monòcits.
- Cèl·lules plasmàtiques, sorgeixen a partir de limfòcits B.
4. EL LABORATORI D’HEMATOLOGIA

El laboratori d’hematologia es divideix en diferents seccions: citologia, hemostàsia, bancs

de sang, biologia molecular i biogenètica.
Els equips de laboratori bàsics són: centrífugues, pH metre, microscopi òptic, agitadors
magnètics i vòrtex, banys termostàtics, estufes, balances de precisió, cabina d’extracció
de gasos, refrigeradors i congeladors.

4.1. RECEPCIÓ DE MOSTRES

Les fases en el laboratori d’hematologia són: la fase preanalítica i la fase analítica.

En el laboratori hi ha una àrea de recepció de mostres, és a dir, personal que comprovi
que la mostra rebuda és adequada, ja que la mostra es pot rebutjar o retornar.

4.1.1. Petició

Els pacients tenen dret a petició.

Les peticions inclouen: una identificació del pacient, una identificació de la mostra, una
identificació de la persona que realitza la petició, ell destí de l’informe dels resultats i les
determinacions sol·licitades.
De vegades també s’inclou informació clínica.

4.1.2. Mostres

Les mostres típiques que es reben són la sang perifèrica obtinguda per venopunció i la
medul·la òssia obtinguda per aspirat.
Ha d’haver-hi una verificació, veure si les determinacions sol·licitades coincideixen amb el
tipus de mostra, tubs utilitzats, conservació...

Hi ha múltiples models de tubs:

• Tub de tap lila, conté anticoagulant (EDTA), aquest elimina Ca+2.
S’utilitza en recomptes i estudis morfològics, immunohematologia i
PCR.

• Tub de tap blau clar, conté 1 part d’anticoagulant de citrat sòdic que es combina
amb Ca, i 9 parts de sang.
S’utilitza per fer proves de coagulació.

• Tub de tap negre, conté 1 part d’anticoagulant de citrat per 4 parts de sang.
S’utilitza per dur a terme la determinació de la velocitat de
sedimentació globular (VSG).

• Tub de tap verd, conté l’anticoagulant heparina, on actua l’antitrombina.

S’utilitza en citogenètica i biologia molecular.

• Tub de tap roig/marró, no conté anticoagulant

S’utilitza en el banc de sang per determinar eritropoetina.
S’utilitza per obtenir sèrum en proves d’immunologia,
determinació d’anticossos...
 • Tub de tap groc, conté anticoagulant ACD (àcid cítric+dextrosa o CPDA
(citrat+fosfat+dextrosa+adenina).
Conserva les cèl·lules durant 20 dies.
S’utilitza per determinar grups sanguinis.

• Sang capil·lar, s’obté mitjançant punció cutània amb una llanceta.

S’utilitza per determinar el temps de sangria de Ivy i el control de
tractament anticoagulant en consulta externa.

4.2. SECCIÓ DE CITOLOGIA

En els estudis amb sang perifèrica s’estudia la sèrie roja, blanca i plaquetària.
En els estudis amb medul·la òssia s’estudia l’hematopoesi.
Dins de la secció de citologia hi ha els següents procediments: hemograma,
eritropatologia, citomorfologia i citometria de flux.

4.2.1. Hemograma

L’hemograma de sang perifèrica inclou:

- Recompte de cèl·lules de les 3 sèries.
- Quantificació d’hemoglobina.
- Paràmetres morfològics d’hematies i de plaquetes.
- Fórmula leucocitària.
- Velocitat de sedimentació globular.
Com a equipament s’utilitzen comptadors hematològics automatitzadors.

4.2.2. Eritropatologia

S’estudien anèmies degudes a patologies de les hematies, i en concret a:

- Alteracions de la membrana.
- Hemoglobinopaties.
- Alteracions d’enzims eritrocitaris.

L’equipament per realitzar les tècniques inclou:

- Electroforesi
- Espectrofotometria
- Cromatografia
- Equips per determinar crioglobulines i EPO.

4.2.3. Citomorfologia

Mitjançant tincions i observació microscòpica estudia:

- Morfologia de les cèl·lules sanguínies i els seus precursors.
- Diagnòstic de neoplàsies.

L’equipament per realitzar aquestes tècniques és ultracentrífugues, tenyidors i

immunotenyidors automàtics.
4.2.4. Citometria de flux

Permet caracteritzar cèl·lules sanguínies i els seus precursors mitjançant l’obtenció de

perfils antigènics.
S’utilitzen anticossos específics com fluorocroms.
És una tècnica útil per a:
- Diagnòstic de neoplàsies sanguínies i altres símptomes (leucèmies, mielomes...).
- Estudi del cicle cel·lular.
Per poder realitzar-la es necessita un citòmetre de flux, el qual es pot complementar amb
un software per al tractament de dades.

4.3. SECCIÓ D’HEMOSTÀSIA I TROMBOSI

S’estudien les 3 fases de la coagulació sanguínia:

• Hemostàsia primària, és el procés de formació del trombe plaquetari.
S’estudia la funcionalitat de les plaquetes per a veure alteracions de l’hemostàsia
primària.
Es realitza mitjançant tècniques com les d’agregació.

• Hemostàsia secundària, és el procés de formació d’un coàgul de fibrina.

S’estudia mitjançant els mètodes coagulomètrics.

• Fibrinòlisi, és l’eliminació del coàgul per degradació de la fibrina.

Les tècniques que s’utilitzen són semblants a les de l’hemostàsia primària.

4.4. SECCIÓ DE BANC DE SANG

És un servei de transfusió associat a una unitat d’extracció de sang per a donació.

Les seves activitats es divideixen en:
• Immunohematologia, s’ocupa de determinar grups sanguinis, anticossos
irregulars i realitzar proves de compatibilitat.
• Hemoteràpia, s’ocupa de l’obtenció, l’emmagatzematge i la distribució de sang i
hemoderivats.
L’equipament d’aquesta secció inclou:
- Màquines per a tècniques d’immunodiagnòstic.
- Màquines per a separació.
- Centrífugues.
- Neveres i congeladors.

4.5. SECCIÓ DE BIOLOGIA MOLECULAR I CITOGENÈTICA

Aquesta secció és clau en el diagnòstic, pronòstic i estudi de l’evolució d’homeopaties.

L’estudi del cariotip és de gran utilitat per al diagnòstic de neoplàsies, per tot i així hi ha
limitacions de la citogenètica en la detecció de:
- Petites alteracions cromosòmiques.
- Mutacions genètiques.

Per això hi ha tècniques de biologia molecular basades en:

- Hibridació d’àcids nucleics.
- Amplificació d’àcids nucleics, permet diagnosticar múltiples patologies.
5. REALITZACIÓ DE DETERMINACIONS

En el laboratori hematològic hi ha d’haver una validació de la tècnica, en què es té en

compte:
- Tenir els equips i protocols analítics adequats.
- Resultats dels controls de qualitat dintre dels límits d’acceptació.
- No s’han d’enregistrar incidències.

A més, també ha d’haver un control de qualitat format per:

- Controls interns normals i patològics.
- Controls externs realitzats per entitats de referència.
- Repeticions aleatòries.

5.1 FASE POSTANALÍTICA

Durant la fase postanalítica hi ha d’haver:

- Validació facultativa realitzada per personal qualificat.
- Resultats i informes coherents que compleixin els requisits.
- Elaboració, emissió i entrega d’informes.
- Gestió d’arxius generats per l’activitat del laboratori.

6. GESTIÓ DE LA QUALITAT

És un sistema basat en la gestió de processos i la millora contínua que està avaluat per
certificació ISO.

6.1. PROCESSOS DEL SISTEMA DE QUALITAT

Tots els processos que es desenvolupen en el sistema de gestió de qualitat es recullin en

fitxes de processos.
La integració dels processos es plasma en un mapa de processos.
6.2. INDICADORS DE PROCÈS

Són paràmetres quantitatius per monitoritzar els processos i aconseguir una millora
contínua.
Els més habituals són:
- % mostres no conformes.
- % recepcions per problemes tècnics.
- % informes emesos fora de termini.
- Temps mitjà d’espera des de la recepció fins a l’emissió de l’informe.

6.3. CERTIFICACIÓ I ACREDITACIÓ

Són dues formes d’avaluar el sistema de gestió de qualitat.

Són processos voluntaris, independents i renovables.
Produeixen 2 documents:
• Certificació, ISO 9000, és un document que justifica la qualitat aconseguida.
• Acreditació, s’avalua la qualitat i el rendiment dels serveis.
És habitual acreditar tècniques o procediments concrets, d’aquesta manera
reconeix la competència tècnica i professional del laboratori per a la realització de
les activitats acreditades.
Per tant, l’acreditació avalua la fiabilitat dels resultats.

7. SEGURETAT I PREVENCIÓ DE RISCOS AL LABORATORI D’HEMATOLOGIA

El disseny del laboratori d’hematologia i de les condicions de treball ha de respondre als

criteris de prevenció de riscos, és a dir, la prevenció de riscos biològics, químics i genèrics
(riscos físics, elèctrics i d’incendis).

7.1. BIOSEGURETAT

La bioseguretat engloba totes les normes, tècniques, pràctiques i hàbits de treball que
intenten evitar l’exposició accidental del personal a agents biològics perillosos o la seva
alliberació en el medi ambient.
En els laboratoris d’hematologia el principal problema de bioseguretat és la contaminació
amb microorganismes, mostres, reactius, productes...
Per això s’ha de considerar com a perillosa qualsevol mostra biològica, i portar les
mesures mínimes de protecció, és a dir, equips de protecció individual (EPI) i eliminar els
residus.

7.2. SEGURETAT QUÍMICA

Molts dels reactius que s’utilitzen en el laboratori d’hematologia contenen substàncies

químiques perilloses per a la salut, per això s’ha de tenir en compte el risc d’exposició.
Els riscs d’exposició poden ser per penetració cutània, inhalació o ingesta.
Per això s’han d’establir uns procediments d’emmagatzematge segur i de gestió de
residus.
També s’utilitzen Fitxes de Dades de Seguretat (FDS) dels productes.
Aquestes normalment les proporcionen els proveïdors, o també es poden aconseguir per
internet a la web del Ministeri de Seguretat.
7.3. EQUIPAMENT DEL LABORATORI

Per minimitzar els riscos laborals s’ha de disposar de:

• Instal·lacions d’emergència senyalitzades (dutxes, renta-ulls, extintors...).
• EPIs adequats al material i equipament (guants, bata, pantalles...).
• Senyalització adequada d’espais, mostres i procediments.
• Emmagatzematge específic de substàncies nocives (armaris específics).
• Recollida de residus (contenidors adequats).
• Kits per a recollida de vessaments (productes químics i citotòxics).
• Manual de seguretat i pla de gestió de residus.

7.4. HÀBITS DE TREBALL

Les actuacions del personal del laboratori ha de seguir unes normes i un codi de bon
comportament.
Les principals normes són:
- Rentat freqüent de mans.
- Prohibit menjar, beure i fumar.
- Ús d’EPI adequat i roba botonada sense mànigues amples ni penjolls.
- Prohibit pipetejar amb la boca.
- Manipulació adequada de productes volàtils o inflamables.
- Correcte etiquetat d'envasos.

7.5. MANUAL DE SEGURETAT

El manual de seguretat és un document d’obligat coneixement i compliment per a tot el

personal del laboratori.
Inclou:
- Avaluació de riscs inerts a cada lloc.
- Descripció i normes d’ús de l’equipament de seguretat (cabines biològiques, EPI...).
- Hàbits de treball adequats.
- Normes d’emmagatzematge de productes químics.
- Normes per a l’eliminació i gestió de residus.
- Normes d’actuació en cas d’emergència.

7.6. PLA DE GESTIÓ DE RESIDUS

El pla de gestió de residus inclou les mesures per a la recollida selectiva, la classificació i
l’emmagatzematge temporal dels residus fins la seva recollida per una empresa gestora.
Els tipus de residus que hi ha són:
• Biosanitaris especials, són quantitats grans de sang o altres líquids biològics,
objectes punxants o tallants que han estat en contacte amb productes biològics i
material contaminat amb agents biològics.
• Químics, són els reactius, productes caducats, envasos...
• Citotòxics, són els productes cancerígens, mutàgens i teratògens, i els seus
envasos.
• Radioactius, els líquids es recullen en garrafes i els sòlids en contenidors.
7.6.1. Vessaments

Els vessaments són accidents comuns en el laboratori, per això el personal de recollida ha
de portar els EPI adequats.

En el cas de vessaments de líquids biològics els passos ha seguir són:

1) Absorció del líquid amb el material adequat.
2) Eliminar-lo com un residu biosanitari especial.
3) Desinfectar amb una solució d’hipoclorit, les superfícies que hagin estat en contacte
amb el líquid.

En el cas de vessaments de substàncies químiques aquestes poden ser:

• Productes en pols, es recullen directament i evitant la formació d’aerosols.
• Productes líquids, la seva recollida requereix 3 passos:
◦ Neutralització, el neutralitzant dependrà de la substància vessada, tot
i que hi ha neutralitzadors comercials polivalents.
◦ Absorció, els vessaments de petites quantitats es poden absorbir amb
cel·lulosa i els de grans quantitats amb carbó actiu, serradures...
◦ Eliminació, s’han de posar en un envàs adequat i eliminar-se en el
seu contenidor específic.
 TEMA 2: ESTUDI MORFOLÒGIC DE CÈL·LULES SANGUÍNIES EN SANG
PERIFÈRICA I MEDUL·LA ÒSSIA

1. INTRODUCCIÓ

L’estudi morfològic de les cèl·lules sanguínies en sang perifèrica i medul·la òssia es

realitza a la secció de citologia del laboratori d’hematologia.
L’estudi es realitza a partir de mostres, però com les cèl·lules no tenen suficient contrast
es tenyeixen.
D’aquesta manera es poden veure els següents criteris morfològics:
• Forma i mida.
• Presència o absència de nucli.
• Característiques nuclears.
• Característiques citoplasmàtiques.

2. L’EXTENSIÓ DE SANG PERIFÈRICA

Una extensió o frotis de sang perifèrica és una capa fina de sang disposada sobre un
portaobjectes per realitzar una anàlisi morfològica de les cèl·lules amb l’ajuda d’un
microscopi, i de vegades, de tincions.
La sang es pot obtenir per 2 vies:
• Venopunció, s’ha d’anticoagular amb EDTA.
• Punció al rovell del dit, s’obté sang capil·lar.

2.1. TÈCNICA DEL PORTAOBJECTES EN FALCA

La tècnica del portaobjectes és la tècnica d’extensió sanguínia més habitual.

Per a realitzar-la es necessiten 2 portaobjectes de vidre, un per fer de suport i l’altre com a
extensor.
Els passos a seguir són:
1) Dipositar una gota de 3 mm (10-15 microlitres) aproximadament sobre el portaobjectes
suport.
2) Col·locar el portaobjectes extensor sobre el suport formant un angle de 35-45 graus.
3) Lliscar el portaobjectes extensor sobre tota la longitud del portaobjectes suport, per a
així formar una monocapa de cèl·lules.

2.2. CARACTERÍSTIQUES I ZONES D’UNA EXTENSIÓ SANGUÍNIA

Una extensió sanguínia realitzada correctament ha de ser:

• Llisa, sense forats ni ratlles.
• Costats laterals visibles, a 1 mm dels costats del portaobjectes.
• Disminució del gruix progressiu i continu.

En les extensions es distingeixen 3 zones:

• Cap, és la zona més gran on es troben eritròcits en més d’una capa i molts
limfòcits.
• Cos, és la zona mitjana on els eritròcits es troben només en una capa i els
leucòcits equilibrats.
• Cua, és la zona final on els eritròcits deixen buits i on hi ha més granulòcits i
monòcits.
2.3. FACTORS QUE INFLUEIXEN EN LA QUALITAT DE L’EXTENSIÓ

Els factors que influeixen en la qualitat de l’extensió són:

• Portaobjectes bruts.
• Portaobjectes amb grassa.
• Excés de sang.
• Quantitat insuficient de sang.
• Sang coagulada.
• Sang no distribuïda pels costats del portaobjectes.
• Velocitat de desplaçament no constant.
• Major pressió a un costat del portaobjectes que a l’altre durant el desplaçament.

3. TINCIONS HEMATOLÒGIQUES PER A EXTENSIONS SANGUÍNIES

Les tincions hematològiques convencionals són tincions que es realitzen per a pintar les
diverses estructures sanguínies, augmentant el contrast entre elles i el medi que les
rodeja, i facilitant així la identificació dels diferents tipus cel·lulars al microscopi.
Les tincions convencionals més útils són les policromes i les supravitals.

Un altre grup de tincions són les tincions especials.

Les tincions hematològiques especials permeten detectar activitats enzimàtiques, principis
immediats, elements inorgànics o molècules específiques d’utilitat en el diagnòstic i
seguiment d’hemopaties.

3.1. TINCIONS CONVENCIONALS POLICROMES

Les tincions policromes són tincions hematològiques que utilitzen combinacions de

colorants amb diferents afinitats perquè les estructures cel·lulars es tinyin amb colors
diferents.
S’aplica sobre cèl·lules mortes, per tant, és necessari realitzar una fixació prèvia.
Aquesta fixació evita que es produeixin alteracions de l’estructura cel·lular i facilita
l’adhesió de les cèl·lules al portaobjectes.
Les tincions policromes més utilitzades deriven de la tinció de Romanowsky, que es basa
en la combinació de blau de metilè i eosina.
Les més habituals són la tinció de May Grünwald-Giemsa, la tinció de Wright i la tinció
panòptica ràpida.

3.1.1. Tinció de May Grünwald-Giemsa

La tinció de May Grünwald-Giemsa és la més utilitzada en hematologia.

Amb ella es poden identificar neutròfils, limfòcits, eosinòfils, basòfils i monòcits.
És la combinació de 2 colorants: May Grünwald (eosina+blau de metilè en metanol) i
Giemsa (eosina+derivats del blau de metilè+azur I i II).
Aquests dos colorants s’ionitzen en solució aquosa i es combinen amb els diferents
components cel·lulars, creant sals insolubles de diferents colors.
Les reaccions de tinció depenen del pH, per això per obtenir millors resultats convé
tamponar a 6’4-6’9.

El blau de metilè tenyeix estructures basòfiles (àcids nucleics, grànuls de basòfils).

L’eosina tenyeix estructures acidòfiles (hemoglobina, proteïnes, grànuls d’eosinòfils).
Procediment:

1) Realitzar el frotis i deixar assecar.

2) Preparar un cristal·litzador i afegir aigua destil·lada al seu interior.
3) Col·locar sobre el cristal·litzador unes varetes paral·leles.
4) Cobrir la preparació amb un volum conegut de May Grünwald i deixar 2 minuts.
5) Afegir el mateix volum d’aigua destil·lada i deixar 2-3 minuts.
6) Decantar el contingut del portaobjectes.
7) Cobrir amb Giemsa recent diluït 1/10 i deixar 20 minuts.
8) Rentar amb aigua destil·lada i deixar assecar.
9) Observar amb el microscopi a diferents augments.

3.1.2. Tinció de Wright

La tinció de Wright també és molt habitual.

En aquest cas només s’utilitza un colorant que combina eosina, blau de metilè i derivats
del blau de metilè en metanol.
Aquesta tinció es realitza en 2 passos.

Procediment:

1) Cobrir la preparació amb colorant Wright sense diluir durant 5-8 minuts, ja que el
metanol facilita la fixació.
2) Abocar el portaobjectes per eliminar el colorant.
3) Cobrir la preparació amb colorant Wright diluït en tampó de pH 7’2, durant 10-15
minuts.
4) Abocar el portaobjectes per eliminar el colorant.
5) Rentar el portaobjectes amb aigua destil·lada i deixar-lo assecar.
6) Observar amb el microscopi a diferents augments.

3.1.3. Tinció panòptica ràpida

La tinció panòptica ràpida és molt utilitzat en laboratoris d’urgències.

Combina les tècniques anteriors per aconseguir més rapidesa.
En aquest cas s’utilitzen 3 reactius: solució fixadora (metanol), colorant àcid tamponat
(derivat de l’eosina en tampó fosfat) i colorant bàsic tamponat (derivat del blau de metilè).
És un mètode basat en incubacions per immersió seqüencial.

Procediment:

1) Realitzar el frotis i deixar assecar.

2) Col·locar els 3 reactius en 3 recipients.
3) Submergir la preparació 5 vegades en cada reactiu. (1 segon per immersió).
4) Rentar el portaobjectes amb aigua destil·lada i deixar assecar.
5) Observar al microscopi a diferents augments.

3.2. TINCIONS CONVENCIONALS SUPRAVITALS

Les tincions supravitals són tincions dissenyades per a l’observació de cèl·lules vives, per
tant, no requereixen una fixació prèvia.
En aquestes tincions primer s’ha de mesclar el colorant amb la sang, i després realitzar
l’extensió en el portaobjectes.
La tinció més habitual és la del blau cresil brillant per a reticulòcits.

3.2.1. Tinció de blau cresil brillant per a reticulòcits

En aquesta tinció es detecten estructures granulars internes, les quals es tenyeixen de

color blau.

Procediment:

1) Homogeneïtzem la mostra de sang EDTA.

2) Dispensem 3 gotes de sang en un tub i 3 de colorant i ho deixem incubar 30 min.
3) Realitzem un frotis a partir de la mescla de sang i colorant i deixem assecar.
4) Observem al microscopi a 40x i 100x.

3.3. TINCIONS ESPECIALS

Les tincions especials són més habituals en extensions de medul·la òssia que en sang
perifèrica.
Però la tinció amb fosfatasa alcalina granulocítica és habitual utilitzar-la amb extensions
de sang perifèrica.

3.3.1. Fosfatasa alcalina granulocítica

Aquesta tinció és útil per detectar activitat enzimàtica als grànuls secundaris de leucòcits i
neutròfils.
S’utilitza en l’estudi de síndromes mieloproliferatius.

4. EXAMEN MICROSCÒPIC D’EXTENSIONS DE SANG PERIFÈRICA

L’examen microscòpic d’extensions de sang perifèrica és una prova imprescindible en el

diagnòstic hematològic.
Permet detectar i confirmar alteracions quantitatives i morfològiques en els eritròcits,
leucòcits i plaquetes.

4.1. INDICACIONS DE L’EXAMEN MICROSCÒPIC

L’examen de l’extensió perifèrica està indicat en els següents casos:

- Hemograma amb desviació significativa en els recomptes.
- Sospita clínica de malalties hematològiques.
- Sospita clínica de malalties amb manifestacions hematològiques, com per exemple,
infeccions, parasitosis, tractaments oncològics...

4.2. EXAMEN MICROSCÒPIC

4.2.1. Examen a 10x

L’examen microscòpic del frotis s’inicia amb l’objectiu de 10x per a avaluar:
• Qualitat general del frotis.
• Distribució adequada de leucòcits.
• Presència de cèl·lules grans anormals.
• Possibles aglutinacions de leucòcits, plaquetes i hematies (Rouleaux).
• Presència de paràsits.
4.2.2. Examen a 40x

A continuació, es realitza una estimació del recompte de leucòcits/mm 3 , per a fer-ho:

1) Es compten els leucòcits presents en 10 camps de 40x.
2) Es calcula la mitjana de leucòcits per camp i es multiplica per 2.000.
Aquesta aproximació serveix per detectar discrepàncies amb el recompte automàtic.

4.2.3. Examen a 100x

Aquest examen es realitza amb l’objectiu d’immersió 100x i observant la zona fent zig-zag.
S’analitzen leucòcits, eritròcits i plaquetes.
En l’anàlisi de leucòcits es du a terme el recompte de leucòcits o fórmula leucocitària, i
l’anàlisi morfològica dels leucòcits per detectar alteracions.
En l’anàlisi d’eritròcits es du a terme la detecció i el recompte d’eritroblasts i l’anàlisi
morfològic d’eritròcits per detectar alteracions.
En l’anàlisi de plaquetes es du a terme l’estimació del recompte de plaquetes/mm 3 i la
detecció d’agregats plaquetaris per poder distingir trombopènies (problema real) de
pseudotrombopènies (falsa trombopènia perquè les plaquetes s’agrupen i se’n compten
menys).

5. L’EXTENSIÓ DE MEDUL·LA ÒSSIA

Una extensió o frotis de medul·la òssia consisteix en una capa fina d’un aspirat de
medul·la òssia disposada sobre un portaobjectes per realitzar una anàlisi morfològic de
les seves cèl·lules amb l’ajuda d’un microscopi i, de vegades, de tincions.
Permet l’anàlisi microscòpic de cèl·lules hematopoètiques.
Aquesta anàlisi és fonamental per a l’estudi de malalties hematològiques i malalties no
hematològiques, com per exemple les metàstasis de tumors o malalties infeccioses o
parasitàries (tuberculosi, leishmaniosi...)

5.1. ASPIRAT DE MEDUL·LA ÒSSIA

Les mostres de medul·la òssia s’obtenen mitjançant punció i aspiració de la medul·la dels
ossos que conserva l’hematopoesi.
Generalment s’aspira medul·la de la cresta ilíaca posterior, superior i també anterior i de
l’esternó.
El procés d’aspiració consisteix en punxar l’os amb un trocar i aspirar amb una xeringa
una petita quantitat de medul·la òssia, normalment amb 0,5 ml és suficient.
En el cas dels nens es punxa a la tíbia, ja que tots els ossos tenen medul·la òssia, però un
cop creixen es converteix en greix.
Per això a les persones grans es punxa als ossos del maluc o l’esternó, perquè a la resta
d’ossos no n’hi ha.

L’aspirat té 2 components:
• Grum medul·lar, conté cèl·lules hematopoètiques, cèl·lules del teixit connectiu,
grassa i matriu extracel·lular.
• Sang medul·lar, prové de la vascularització de la medul·la i està formada per sinus
venosos i sang sinusal.
Si a l’aspirat no s’aconsegueixen grúmols o sang medul·lar es pot fer una biòpsia.
5.2. OBTENCIÓ D’EXTENSIONS

Les extensions de medul·la òssia s’han de realitzar el més ràpid possible després de
l’extracció, i és fonamental que continguin grúmols.
Si no es pot realitzar immediatament la medul·la s’ha de portar al laboratori amb tubs que
continguin EDTA.
Les preparacions es poden obtenir per aixafament o la tècnica del portaobjectes en cunya.
La tècnica del portaobjectes en cunya es realitza quan el grúmol és escàs o quan l’aspirat
només conté sang medul·lar.

5.2.1. Tècnica per aixafament

1) Es col·loca en un portaobjectes un petit volum d’aspirat que contingui grúmols.

2) Es recolza un altre portaobjectes sobre l’altre, de manera que el grúmol s’aixafi.
3) Lliscar un portaobjectes sobre l’altre, de manera que el material aixafat s’estengui sobre
el portaobjectes.
4) Deixar assecar l’extensió a l’aire.

6. TINCIONS HEMATOLÒGIQUES PER A EXTENSIONS DE MEDUL·LA ÒSSIA

Les tincions per a extensions de medul·la òssia es divideixen en tincions convencionals i

tincions especials.

6.1. TINCIONS CONVENCIONALS

Són les mateixes tincions policromes que s’utilitzen per a tenyir extensions de sang
perifèrica, és a dir, May Grünwald-Giemsa i Wright.
L’única diferència és que els temps d’incubació dels colorants són més llargs.
El teixit connectiu i la matriu extracel·lular es tenyeixen de color blau fosc o porpra.

6.2. TINCIONS ESPECIALS

Aquestes tincions s’utilitzen perquè com l’hematopoesi origina diferents tipus cel·lulars
funcionalment diferents, però morfològicament similars, és difícil distingir-les amb les
tincions convencionals.
Per això les tincions convencionals es complementen amb les tincions especials per a
millorar la diferenciació cel·lular.
Detecten activitats enzimàtiques, principis immediats, elements inorgànics i molècules
importants en el diagnòstic i seguiment d’hemopaties.

6.2.1. Tincions citoquímiques

Les tincions citoquímiques són reaccions químiques senzilles que originen productes
pintats i que posen de manifest determinats components cel·lulars.
Les tincions citoquímiques més habituals són:

• Tinció de Perls per a ferro

S’utilitza per detectar la presència de ferro en forma d’hemosiderina.

Tenyeix l’interior d’eritroblasts, alguns eritròcits i macròfags medul·lars, del
fetge i de la melsa.
És important per a l’estudi d’anèmies, lupus, sobrecàrrega fèrrica...
 D’aquesta manera es poden disminuir els nivells d’anèmia ferropènica.

• Tinció de PAS

S’utilitza per detectar carbohidrats.

Aquesta tinció tenyeix neutròfils, megacariòcits i plaquetes.

• Mieloperoxidasa (MPO)

Aquesta tinció tenyeix neutròfils, eosinòfils i monòcits.

• Esterases

Aquesta tinció tenyeix monòcits i precursors de monòcits.

• Fosfatasa àcida

La fosfatasa àcida és un enzim que hidrolitza monoèsters de l’àcid fosfòric .

S’utilitza en la identificació de leucèmies de cèl·lules velloses (cèl·lules peludes).

• Negre Sudan B

S’utilitza per a la detecció de lípids.

Aquesta tinció tenyeix neutròfils i els seus precursors.

6.2.2. Tincions immunocitoquímiques

Les tincions immunocitoquímiques es basen en l’ús d’anticossos específics per a detectar

molècules que caracteritzen poblacions cel·lulars concretes.
És un mètode senzill i potent d’identificació de poblacions cel·lulars.
Aquesta tinció s’utilitza per a la identificació i classificació de cèl·lules neoplàsiques.

Els complexes antigen-anticòs no són visibles amb microscopi, per això es requereix un
sistema de visualització basat en marcadors, és a dir, fluorocroms i enzims (peroxidasa i
fosfatasa alcalina).

Hi ha diversos procediments d’acoblament al marcador:

- Sistema biotina-estreptavidina, és un sistema d’ampliació de la resposta i un

amplificador de la tinció. El que en un altre sistema acobla una molècula de fluorocrom, en
aquest n’acobla 3.

- Ús de polímers sintètics.
En les tècniques on s’utilitzen enzims es produeix un precipitat de color a les zones on hi
ha anticossos.

7. EXAMEN MICROSCÒPIC D’EXTENSIONS DE MEDUL·LA ÒSSIA

7.1. INDICACIONS DE L’EXAMEN MICROSCÒPIC

En l’examen microscòpic de la medul·la òssia s’avalua la leucopoesi, l’eritropoesi, la

trombopoesi, el sistema reticle-endotelial i elements anormals.
7.2. L’EXAMEN MICROSCÒPIC
7.2.1. Examen a baix augment (10x i 40x)

Es valoren els següents paràmetres:

• Presència de grúmols.
• Cel·lularitat global.
• Relació mieloeritroide.
• Quantitat de grassa.
• Alteracions estromals.
• Presència d’alguns tipus cel·lulars medul·lars.
• Presència d’elements cel·lulars extramedul·lars.
• Presència de paràsits.

7.2.2. Examen a gran augment (100x)

La seva finalitat és analitzar les alteracions i realitzar el mielograma.

8. AUTOMATITZACIÓ DE LES TINCIONS HEMATOLÒGIQUES

En els sistemes automàtics globals hi ha un software que:

• Selecciona les mostres.
• Realitza extensions.
• Tenyeix.
• Escaneja preparacions amb un sistema de visualització microscòpica.
• Calcula la fórmula leucocitària.