CC – T4 Sandra Badia

TEMA 4: PRODUCCIÓ I MANTENIMENT

1. AUTORITZACIONS
Per treballar amb cèl·lules animals o humanes a part de tenir un comitè de bioseguretat, els
experiments han de passar per la comissió d’ètica en experimentació animal i humana per a
que doni el consentiment. A més a més, per treballar amb animals directament, necessites fer uns
cursos com a manipulador d’animals.

2. TREBALL EN LA CABINA DE SEGURETAT BIOLÒGICA (CSB)

Quan es treballa amb línies cel·lulars, el nivell de bioseguretat amb què es treballa és de tipus 2,
una cabina de bioseguretat. Aquesta cabina ha de ser netejada amb etanol 70% i que tingui el
mínim material possible a dins. A més a més, els moviments dins la cabina han de ser lents, per no
generar un flux d’aire incorrecte o que bloquegi les reixes de corrent.
A la cabina hi ha tres zones de treball: la zona neta, la zona de treball i la zona de contaminació,
per tant s’ha de mantenir sempre l’ordre i neteja i distingir els articles nets dels contaminats
(l’asèpsia és bàsica).

3. TIPUS DE CULTIUS DE CÈL·LULES

 Cultiu primari: cultiu que prové directament de les cèl·lules d’un teixit, ja poden ser d’humà,
animal, embrionari... A partir d’aquest, es disgrega i s’obtenen cèl·lules individuals:
o En forma d’explant
o En suspensió i/o adherents
Una característica important es que es heterogeni, perquè en un teixit hi ha diferents tipus de
cèl·lules.

 Cultiu secundari: després de cultivar les cèl·lules i que aquestes creixin, s’arriba a un punt de
limitació (nutrients i espai), llavors s’han de desadherir (tripsinitzar), extreure-les del cultiu i
tornar-les a sembrar o congelar-les. Aquesta tripsinització dona lloc a un subcultiu, que es el
cultiu secundari. Els cultius secundaris son més homogenis perquè es pot fer prèviament una
selecció de cèl·lules determinades. Després, és pot tornar a fer un subcultiu que donaria lloc a
una línia cel·lular.

23
CC – T4 Sandra Badia

 Línies cel·lulars: després de fer un cultiu secundari, obtenim una línia cel·lular. Aquestes
poden ser:
o Finites: es divideixen un nombre determinat de vegades, fins que arriba a un punt que
no es divideixen més i entren en senescència cel·lular (perden l’habilitat de proliferar).
o Immortals: poden seguir proliferant indefinidament. Aquesta proliferació pot ser
espontània (lenta, la normal de la cèl·lula) o induïda.

4. ESTABLIMENT D’UN CULTIU PRIMARI

4.1. DISGREGACIÓ DEL TEIXIT
Per a generar un cultiu primari s’ha de disgregar un teixit, si prové d'un animal o humà es
necessita el permís del comitè d'ètica. Les cèl·lules estan unides entre elles i a la matriu
extracelul·lar mitjançant diferents tipus d'unions, per a disgregar-les s'han de desfer les unions
cel·lulars. Es pot realitzar mitjançant diverses estratègies, dependrà del teixit al qual pertanyin:

- Dissecció de teixit: tallar amb un bisturí o tisores el teixit, aquests trossos petits (explants)
es sembren i començaran a proliferar les cèl·lules.
- Disgregació mecànica: per a aconseguir cèl·lules individualitzades, amb pipetes, xeringues
o malles molt fines.
- Disgregació enzimàtica: disgregació específica mitjançant enzims. A vegades es fa una
combinació d'una disgregació mecànica i enzimàtica.
Quan aconseguim les cèl·lules primàries o explants les cèl·lules comencen a proliferar i generarem
un subcultiu i una línia cel·lular.

24
CC – T4 Sandra Badia

4.1.1.Digestió enzimàtica del teixit

Mitjançant la digestió enzimàtica es busca la utilització d'enzims per a obtenir cèl·lules
individualitzades amb elevada viabilitat, són enzims proteolítics, per la qual cosa a més de
trencar unions poden degradar la cèl·lula.
Els enzims poden ser més o menys forts, per exemple, la Tripsina (tripsinització) és molt forta i no
es especifica, així que una acció prologada trencarà la cèl·lula
Disgreguem el teixit disseccionant-lo i tractant-lo amb una solució d'enzims. Si són teixits densos es
tenen durant tota la nit (overnight) a 37 °C amb rotació dins d'una incubadora i tractament
enzimàtic, l'endemà es deixa sedimentar i obtenim el sobrenedant amb les cèl·lules
individualitzades i el pèl·let són petits explants. Després d'aquest tractament es poden fer dos
tipus de cultius:

- Sembrar els petits explants en un flascó.

- Resuspendre el sobrenedant.

25
CC – T4 Sandra Badia

4.2. PROLIFERACIÓ DE CÈL·LULES

Després de sembrar l'explant les cèl·lules proliferen cap a la perifèria. Com el cultiu primari és
heterogeni s'observen diferents tipus de clons, per exemple, en el cas de les cèl·lules mamàries, a
partir d'un explant hi ha fibroblasts i cèl·lules epitelials (luminals o basals), els diferents tipus de
cèl·lules epitelials que es poden distingir a partir de diferents marcadors. És important aquesta
diferenciació perquè, per exemple, el càncer de mama es deu a la proliferació de cèl·lules luminals.

5. CULTIU SECUNDARI: SUBCULTIU DE CÈL·LULES ADHERENTS

Després de realitzar el cultiu primari, generem un cultiu secundari fent un subcultiu. Aquest es pot
fer mitjançant diverses estratègies:
- Tripsinizació parcial: s'afegeix al flascó la solució enzimàtica amb tripsina perquè les
cèl·lules es desadhereixin, però controlant-lo amb el microscopi invertit ja que quan
comencen a desadherir-se cal frenar l'efecte de la tripsina, així extraurem les cèl·lules
outgrowth i l'explant es quedarà adherit al flascó. L'explant podrà tornar a créixer i generar
un cultiu primari. Aquest reciclatge de l'explant es pot fer entre 5 i 6 vegades.
- Treure l'explant: sembrar-lo en un altre flascó i permetre la generació de nous outgrowth.
Es realitza una tripsinizació total de les cèl·lules.
La tripsinizació, consisteix en:
1. Les cèl·lules creixen en un medi de cultiu
complet (normalment amb sèrum).
2. S'extreu el medi i es netegen amb solució
salina (PBS/HBSS), sense Mg2+ ni Ca2+ (el
calci i magnesi faciliten les unions
cel·lulars).

26
CC – T4 Sandra Badia

3. Utilització d'enzims proteolítics (Tripsina) i un agent quelant (EDTA), que segresta els
ions de Mg2+ i Ca2+, perquè es degradin les unions i evitar que es tornin a formar.
4. Es deixa actuar l'enzim a 37 °C, el temps dependrà del tipus cel·lular. Es controla amb el
microscopi invertit.
5. Quan siguin rodones les cèl·lules estaran desadherides (adherides son planes) i es para el
tractament amb tripsina tornant a afegir medi fresc complet amb sèrum, d’aquesta manera
la tripsina s’inactiva, ja que deix d’interaccionar amb les proteïnes de les cèl·lules per a
interaccionar amb les del medi (el sèrum es ric en proteïnes).
6. Recompte de cèl·lules, sembra de concentració coneguda o
congelar.
Les cèl·lules adherides en el flascó estan planes i al desadherir-se
s'eliminen les unions i es tornen rodones, el mateix succeeix quan
es divideixen.
Dinàmica de la cèl·lula en un flascó de cultiu
Ressembrem una concentració de cèl·lules coneguda, aquestes
cèl·lules seguiran una dinàmica determinada: primer una fase de
latència (fase lag - no es divideixen), on s'adapten al mitjà i triguen
sobre 24h a adherir-se i proliferar, després comencen a dividir-se
de manera exponencial (fase log), ho fan mentre i hagi espai i
nutrients, fins arribar a un punt on tenim el cultiu confluent (no hi
ha espai – no es poden dividir més), això vol dir que han arribat a la
fase de plateau, si volem que les cèl·lules segueixin creixent,
s’han de subcultivar abans d'entrar en la fase de plateau.

 Avantatges: propagar i
expandir les cèl·lules,
fer clonatges, congelar i poder treballar amb repliques.

 Desavantatges: s'ha de vigilar el tractament, algunes

cèl·lules s'adapten i pot ser que siguin les que no ens
interessin, els subcultius no són tan iguals que
el teixit inicial, el que produeix deriva genètica i
segons subcultiu hi ha més risc de contaminació
creuada.

6. SELECCIÓ O SEPARACIÓ DE CÈL·LULES

Al seleccionar unes cèl·lules del nostre cultiu secundari, aquestes passen a formar un cultiu
homogeni. Mètodes:

- Centrifugació
- Afinitat per anticossos
- Medis de cultiu
- Clonació

6.1. CENTRIFUGACIÓ

27
CC – T4 Sandra Badia

És la forma més fàcil de separar les cèl·lules

- Centrifugació diferencial per a distingir segons la grandària.

- Centrifugació de gradient de densitat, les cèl·lules estan en un gradient i es distribueixen
segons el seu coeficient de sedimentació.

6.2. AFINAT PER ANTICOSSOS

Hi han dos tipus de selecció: positiva, selecciono les cèl·lules que interaccionen amb l’anticòs o
negativa, els que no interaccionen.

 Immune panning: en una placa de Petri s'afegeix

un anticòs específic per a un tipus determinat de
cèl·lules, el cultiu heterogeni es sembra sobre aquesta placa, així les cèl·lules amb els antígens
en la seva superfície s'uniran a l'anticòs i es quedaran fixades, és una selecció positiva.

 Magnetic sorting: anticòs conjugat amb una partícula magnètica. En la superfície de la

cèl·lula hi ha un determinat antigen (Epcam) unit a un anticòs (anti-Epcam) que alhora aquest
està unit a una nanopartícula magnètica, així que si tinc una cèl·lula amb aquest antigen
l'anticòs s'unirà i la marcarà amb la partícula magnètica. Per a seleccionar les cèl·lules
marcades amb la nanopartícula ho incubo durant 15 minuts i ho fico en un imant, decanto el
líquid i les cèl·lules marcades quedaran adherides per l'imant.

28
CC – T4 Sandra Badia

 MACS (Magnetic-activated cell sorting): és la mateixa tècnica que l'anterior, però amb major
quantitat de cèl·lules (gran escala). S'utilitza en les tècniques de reproducció assistida, per a
diferenciar entre espermatozoides normals i apoptòtics, en entrar en apoptosis es transloca la
fosfatenil serina de la monocapa citoplasmàtica a l'extracelul·lar de la membrana plasmàtica, la
fosfatenil serina pot ser detectada per anticossos, es tracta d'una selecció negativa (s’enganxen
els espermes inviables).

 FACS (Fluorescence-activated cell sorter): és una

citometria de flux i se separen les cèl·lules en funció dels
marcadors. Es busca seleccionar un tipus determinat de
cèl·lules a partir d'un teixit. Utilitza anticossos que
reconeixen diferents antígens marcats amb diferents
fluorocroms.
Aquestes cèl·lules vives es marquen amb fluorocroms que
s'enganxen a antígens de superfície (per a mantenir-les
vives) i els anticossos s'uniran als antígens. La suspensió
cel·lular es passa pel FAC, que consisteix a fer que la
suspensió es transformi en petites gotes, de manera que en
cada gota hi hagi una cèl·lula o cap, així individualitzem la
mostra, a més un làser il·lumina i produeix fluorescència en
les gotes amb l'anticòs marcat amb el fluorocrom, i el
detector les detectarà, i segons la fluorescència dona una
determinada càrrega a les gotes. Després es passen les
gotes per un camp elèctric i les separa en funció de la
càrrega, aquesta càrrega és “proporcional” al fluorocrom de la membrana.
Cal tenir en compte que hi ha cèl·lules amb més d'un antigen diferent en la seva superfície, per
tant, la diferència entre un tipus cel·lular i un altre és la quantitat d'un antigen en la superfície. A

29
CC – T4 Sandra Badia

partir del FAC puc triar les cèl·lules que m'interessin per a després cultivar-les, la quantitat de
làsers que té el FAC permet jugar amb més anticossos.

6.3. MEDI DE CULTIU

Els medis de cultius poden ser generalistes, permeten el creixement de múltiples cèl·lules, amb
sèrum promouen la proliferació de fibroblasts i si volem la proliferació d'un tipus concret hi ha
medis químicament definits.

7. CELLULAR LIFESPAN
Les línies cel·lulars poden ser finites o immortals.
En una línia cel·lular finita les cèl·lules es
divideixen fins a un cert nombre de divisions (tot i
tenir medi i espai), i després entren en
senescència. La senescència es pot veure
morfològicament en un cultiu. Les cèl·lules en
senescència no estan mortes, són metabòlicament
actives.
Population doubling level (PDL): Fa referència al nombre total de cops que les cèl·lules en una
població s’han duplicat des de la seva isolació primària in vitro. És la relació entre les cèl·lules que
sembro amb les que recullo, té en compte l’envelliment de les cèl·lules. Normalment s’arriba a PDL
50-60.

𝑃𝐷𝐿 = 𝑋 + 3.322 (𝑙𝑜𝑔 𝑌 − 𝑙𝑜𝑔 𝐼)

- X: PDL inicial (PDL1), quan es genera el primer cultiu secundari.

- log Y: cèl·lules que recullo.
- log I: cèl·lules que va sembrar inicialment.

7.1. SENESCÈNCIA
La senescència es produeix per:

 Longitud dels telòmers: disminueix segons augmenten els PDL. Hi ha determinats processos
cel·lulars, com la síntesi de DNA o el loop telomèric, que fan que cada vegada que la cèl·lula es
divideixi perd una quantitat determinada de DNA, tret que tingui algun mecanisme que allargui
els telòmers (telomerasa o recombinació). Aquest escurçament es pot observar a través d'un
Southern Blot o sondes de seqüències telomèriques.
 Oncogens
 Dany DNA
 Estrès oxidatiu
 Condicions del cultiu
Com detectar senescència en un cultiu?
A més de morfològicament, mitjançant marcadors cel·lulars:

30
CC – T4 Sandra Badia

- Increment de proteïnes relacionades amb la detecció del cicle cel·lular. Per exemple, de
p16 (és un CKI: inhibidor de pRb, proteïna bàsica per a la proliferació del cicle cel·lular) o de
p53/p21.
- Β-galactosidasa: a través d'una reacció enzimàtica genera un substrat blau.
- Marcadors de danys: com p53BP1.
- SAHF (senescense associated heterochromatin foci): les cèl·lules no proliferen i en comptes
d'haver-hi eucromatina hi ha més heterocromatina.

7.2. IMMORTALITZACIÓ
Una línia cel·lular contínua està immortalitzada (es considera immortalitzada quan supera els
130 PDL), es divideix contínuament. Pot ser immortal de manera espontània o induïda per agents
químics o infecció vírica.
S'ha de distingir una línia cel·lular immortal i una transformada, la transformada a més no té perquè
ser tumorogènica.
Com ja hem dit abans, una de les causes de senescència és l'escurçament dels telòmers, pel fet
que un telòmer funcional fa un loop en l'extrem i si el telòmer és molt curt queda desplegat, la qual
cosa és equivalent a un trencament de cadena senzilla (SSB) o de doble cadena (DSB), això és un
senyal de dany per a la cèl·lula i posa en marxa els mecanismes de parada del cicle cel·lular. Hi
han diversos mètodes per tal d’immortalitzar les cèl·lules i no es pari el cicle cel·lular:

- Expressió de hTERT (telomerasa): s'infecta amb un lentivirus que porti el gen hTERT (de
la telomerasa) al costat d’un marcador (fluorescent o resistència a antibiòtics). No totes les
cèl·lules s'infecten, per això és important clonar-les per a obtenir una població homogènia
respecte al gen d'interès que vull expressar. Es poden seleccionar i realitzar un Western
Blot per a detectar o no la presència d’aquest.

 Tipus de vectors per a integrar el gen d'interès:

31
CC – T4 Sandra Badia

- Oncogens vírics (SV4oLT): bloqueja la via

de p53 o pRb i la cèl·lula no respondrà a
l'escurçament dels telòmers (la celula no
detecta el seu escurçament). Els cromosomes
es fusionen entre ells, formen cromosomes
amb dos centròmers i inicien un fenomen
d'inestabilitat cromosòmica. La inestabilitat
desemboca en crisi, la qual la majoria de les
cèl·lules no superen i moren, però 1 entre 10-5
i 10-9 generen una mutació que activa la
polimerasa i torna a proliferar.
Per alguns tipus cel·lulars, la sobre expressió de SV40LT antigen o hTERT no és suficient
per aconseguir la immortalització. Es pot intentar la combinació de les dues metodologies.

- Fusió cel·lular: fusió d'una cèl·lula mortal finita amb una immortal, per a aconseguir una
immortalitzada. Es realitza mitjançant un virus o polietilenglicol (PEG). Donarà lloc a
cèl·lules polinucleades:
 Homocarió finit: finita més
finita.
 Homocarió immortal: immortal
més immortal.
 Heterocarió immortal: finita
més immortal.
Si tenim un cultiu amb barreja de fusions, amb el temps les cèl·lules finites moriran, però
tindré una població heterogènia perquè hi hauran heterocarions i homocarions immortals.
Per a diferenciar-los, s'utilitzen cèl·lules amb mutacions als enzims necessaris per a
sintetitzar nucleòtids.
La cèl·lula immortal té mutacions en HEIKT i TK. Per a sintetitzar nucleòtids la cèl·lula té
dues vies:

32
CC – T4 Sandra Badia

 Via de novo: el dihidrofolat passa a tetrahidrofolat i

és capaç de sintetitzar nucleòtids
 Via salvatge: 2 enzims, la hipoxantina guanina
fosforibosil transferasa (HGPRT) i timidina quinasa
(TK) converteixen la hipoxantina i timidina en
nucleòtids. Si un dels dos enzims falla es bloqueja la
síntesi.
Si genero cèl·lules immortals sense HGPRT ni TK no podran dur a terme la via salvatge,
encara que podrien utilitzar la via de síntesi de novo, però es cultiven en un medi HAT amb
Aminopterina, així que les cèl·lules amb mutacions en un dels dos enzims no sobreviurá en
HAT. En fusionar la cèl·lula normal amb la immortal mutada, generaran tres possibilitats:
 Homocarió finit: amb el temps entrarà en
senescència i morirà.
 Homocarió immortal mutat: proliferarà i quan posem
el mitjà HAT entrarà en senescència, ja que les
dues vies estan inactives i no pot sintetitzar
nucleòtids.
 Heterocarió immortal mutat: proliferaran i quan
posem el mitjà HAT sobreviuran perquè sí que
podrà sintetitzar nucleòtids, ja que té un nucli procedent de la normal.

7.2.1.Producció d’anticossos: hibridomes

La fusió cel·lular s'utilitza per a generar hibridomes, són cèl·lules productores d'anticossos. Les
cèl·lules B produeixen anticossos, a més són mortals i poden produir nucleòtids per la via
salvatge, però interessa que aquestes siguin immortals perquè produeixin més anticossos, per
tant, es fusiona la cèl·lula B amb cèl·lules immortals del mieloma que tenen la via salvatge
mutada (deficients en un dels enzims) i són incapaces de formar anticossos. En fusionar-les tindré
3 tipus:

- Cèl·lules B amb cèl·lules B: produiran anticossos, però són mortals.

- Mieloma immortal amb mieloma immortal: no produirà anticossos i al medi HAT moriran.
- Cèl·lules B més mieloma: són les úniques que sobreviuran al medi HAT i produiran
anticossos.
Es realitzarà un screening per a triar l'anticòs que interessi i generar anticossos monoclonals o
policlonals.
Per tant, immunitzar el ratolí
amb l’antigen d’interès,
fusionar cèl·lules B amb
cèl·lules de mieloma, incubació
en medi HAT per tal de
seleccionar els heterocarions
(cèl·lules B + cèl·lules
mieloma), selecció amb ELISA
de la cèl·lula o clon de cèl·lula
que em genera l’anticòs que
m’interessa per a la
superproducció d’aquest.

33
CC – T4 Sandra Badia

Depenent del mètode utilitzat per a realitzar la immortalització, les línies seran diferents.
Normalment es treballa amb línies continues, ja que son molt fàcils de utilitzar, tenen un costs
reduït, i una elevada capacitat de proliferació. El problema es que la seva rellevància fisiològica
cada vegada es més baixa, cada vegada deixen de caracteritzar el teixit del qual provenen.
Les cèl·lules primàries, a diferencia de les línies continues, son semblants al teixit del qual
provenen (elevada rellevància fisiològica), son mes estables genèticament, però son molt més
difícils de treballar, tenen un cost molt mes gran, i la capacitat proliferativa es baixa.
Immortalitzar les cèl·lules no es tan fàcil, segons quina cèl·lula no accepta algun mecanisme o no
n’accepta cap directament. Hi ha altres cèl·lules que no els hi agrada l’estratègia dels virus, per tant
s’han de fer combinacions amb altres estratègies per trobar l’adequada per aquell tipus cel·lular.

7.3. CÈL·LULES IMMORTALITZADES VS CÈL·LULES TRANSFORMADES

La transformació i la immortalització son dos conceptes diferents. Les cèl·lules immortalitzades
son cèl·lules relativament normals, és a dir, adquireixen poques anomalies cromosòmiques al
llarg de la seva deriva genètica. En canvi, una cèl·lula transformada, presenta diferents
característiques:

- Inestabilitat genòmica: presenten una elevada taxa de mutació, son aneuploides, tenen
translocacions de cromosomes, sobrexpressió d’oncogens i deleció de gens supressors de
tumors.
- Presenta tres grans classes de canvis fenotípics, un o els tres es poden trobar expressats
en una línia cel·lular:
 Immortalització
 Creixement aberrant: pèrdua de creixement per inhibició per contacte. Les cèl·lules
transformades perden la inhibició i poden créixer en suspensió, unes damunt les
altres, a més, algunes poden ser independents de substrat.
 Malignitat: ja que poden créixer tumors invasius in vivo, capacitats angiogèniques;
millora de secreció de proteasa i propietats invasives.
Les cèl·lules transformades i les normals tenen una dinàmica diferent, la fase plateau s’assoleix
amb un nombre major de cèl·lules.

34
CC – T4 Sandra Badia

35