BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

TRẦN THỊ MAI

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP

VÀ
TINH CHẾ ACID CARNOSIC TỪ HƯƠNG
THẢO (Rosmarinus officinalis L.), HỌ HOA MÔI
(Lamiaceae) LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

HÀ NỘI - 2022

1
 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y

TRẦN THỊ MAI

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP

VÀ TINH CHẾ ACID CARNOSIC TỪ HƯƠNG
THẢO (Rosmarinus officinalis L.), HỌ HOA MÔI
(Lamiaceae) LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Cán bộ hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Thư

HÀ NỘI - 2022

2
 LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này, bên cạnh
em luôn có sự giúp đỡ vô cùng quý giá đến từ các Thầy Cô, gia đình và bạn
bè. Thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc em xin phép được bày tỏ lòng biết
ơn chân thành nhất đến những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ em
trong suốt thời gian qua.
Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới đến:
TS. Nguyễn Văn Thư, người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên, truyền
cho em nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ em trong suốt quá
trình thực hiện khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các Thầy Cô giáo và các Kỹ thuật
viên của Bộ môn Dược liệu – - Dược học cổ truyền đã hỗ trợ và tạo mọi điều
kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn tới Ban giám đốc Học viện, Phòng Đào tạo
cùng toàn thể cán bộ Giảng viên, Kỹ thuật viên trong Viện Đào tạo Dược,
Học viện Quân Y đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập và
nghiên cứu, đã quan tâm dìu dắt và truyền cho em những kiến thức quý giá
trong suốt 5 năm theo học tại trường.
Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn tới gia đình và lời cảm ơn bạn bè đã
động viên, khích lệ em trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện khóa
luận.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng bằng hết khả năng của mình, song do khả
năng và kinh nghiệm của bản thân có hạn, nên khóa luận không tránh khỏi
những tồn tại, hạn chế và thiếu sót. Vì vậy em rất mong nhận được sự góp ý
chân thành của các Thầy giáo, Cô giáo và Hội đồng chấm khóa luận để khóa
luận của em có thể hoàn thiện hơn.Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 07 năm 2022
Học viên

Trần Thị Mai

3
 MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..............................................................................2
1.1. TỔNG QUAN VỀ HƯƠNG THẢO............................................2
1.1.1. Tên gọi và phân loại thực vật.................................................2
1.1.2. Phân loại thực vật...................................................................2
1.1.3. Đặc điểm thực vật..................................................................3
1.1.4. Phân bố...................................................................................3
1.1.5. Thành phần hóa học...............................................................4
1.1.6. Tác dụng sinh học và công dụng:...........................................9
1.2. TỔNG QUAN VỀ ACID CARNOSIC......................................13
1.2.1. Công thức cấu tạo.................................................................13
1.2.3. Tác dụng sinh học của acid carnosic....................................14
1.2.4. Ứng dụng của acid carnosic.................................................17
1.3. PHƯƠNG PHÁP THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU..................19
1.3.1. Các khái niệm về chất đối chiếu hóa học.............................19
1.3.2. Thiết lập chất đối chiếu sơ cấp.............................................19
1.3.3. Thiết lập chất đối chiếu thứ cấp...........................................20
1.3.4. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đánh giá chất đối chiếu và
yêu cầu về nội dung của quy trình phân tích............................................20

4
 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU....................................................................................................................................22
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN
CỨU.............................................................................................................22
2.1.1. Nguyên liệu..........................................................................22
2.1.2. Hóa chất, thuốc thử..............................................................23
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu..............................................................23
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................................24
2.2.1. Xây dựng phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế acid
carnosic từ dược liệu Hương thảo............................................................24
2.2.2. Bước đầu đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của chất đối
chiếu acid carnosic...................................................................................31
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ SỐ LIỆU............................................33
2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU........................................................33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN....................34
3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT,
PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ACID CARNOSIC TỪ DƯỢC LIỆU
HƯƠNG THẢO...........................................................................................34
3.1.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng acid carnosic từ
dược liệu Hương thảo...............................................................................34
3.1.2. Kết quả xây dựng phương pháp chiết xuất acid carnosic từ
Hương thảo...............................................................................................37
3.1.3. Kết quả xây dựng phương pháp phân lập, tinh chế acid
carnosic từ dược liệu Hương thảo............................................................42

5
 3.2. KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU
CHẤT LƯỢNG CỦA CHẤT ĐỐI CHIẾU ACID CARNOSIC ................42
3.2.1. Tính chất...............................................................................42
3.2.2. Định tính...............................................................................43
3.2.3. Định lượng...........................................................................47
3.2.4. Tạp chất liên quan................................................................50
KẾT LUẬN...........................................................................................................53
KIẾN NGHỊ..........................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

6
 DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Tên bảng Trang
2.1 Các hóa chất, dung môi sử dụng trong 23
nghiên cứu
2.2 Các thiết bị dụng cụ nghiên cứu 23
2.3 Các thông số khảo sát lựa chọn dung môi 26
chiết xuất AC từ Hương thảo
2.4 Các thông số khảo sát lựa chọn phương 27
pháp chiết xuất AC từ Hương thảo
3.1 Kết quả xác định hàm ẩm dược liệu 35
Hương thảo
3.2 Kết quả xác định tính tương thích của hệ 36
thống HPLC
3.3 Sự tương quan giữa diện tích pic và nồng 37
độ acid carnosic
3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng dung môi 39
chiết xuất
3.5 Kết quả khảo sát lựa chọn phương pháp 40
chiết xuất
3.6 Dữ liệu phổ 1H- NMR và 13C- NMR của 47
hợp chất tinh chế được
3.7 Kết quả xác định hàm lượng acid 50
carnosic trong SPTC
3.8 Kết quả phân tích tạp chất trong SPTC 51
3.9 Tóm tắt các chỉ tiêu và phương pháp thử 53
của chất đối chiếu

7
 DANH MỤC CÁC HÌNH
STT Tên hình Trang
1.1 Cây Hương thảo 3
1.2 Cấu trúc của một số terpen phân lập từ 7
loài Hương thảo
1.3 Cấu trúc của một số flavonoid phân 8
lập từ loài Hương thảo
1.4 Cấu trúc của một số phenolic phân lập 9
từ loài Hương thảo
1.5 Công thức cấu tạo của acid carnosic 13
2.1 Hương thảo sấy khô 22
3.1 Tương quan giữa diện tích pic và nồng 38
độ acid carnosic
3.2 Sơ đồ quy trình chiết xuất acid 41
carnosic từ dược liệu Hương thảo
3.3 Phổ 1H-NMR của hợp chất tinh chế 42
được
3.4 Phổ 1H-NMR của hợp chất tinh chế 45
được
3.5 Phổ C-NMR của hợp chất tinh chế
13
46
được
3.6 Cấu trúc hóa học của acid carnosic 48
3.7 Sắc ký đồ mẫu trắng 49
3.8 Sắc ký đồ mẫu acid carnosic chuẩn 49
3.8 Sắc ký đồ mẫu acid carnosic tinh chế 50
được
3.10 Sắc ký đồ mẫu trắng 52
3.11 Sắc ký đồ mẫu thử 52

8
9
 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
STT Phần Phần viết đầy đủ
viết tắt
1. AC Acid carnosic
2. CAN Acetonitril
3. ASEAN Association of Southeast Asian Nations
(Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á)
4. CĐC Chất đối chiếu
5. CTCL Chỉ tiêu chất lượng
6. DCM Dicloromethan
7. DĐVN Dược điển Việt Nam V
V
8. GLP Good Laboratory Practices
(Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm
thuốc)
9. HPLC High-performance Liquid
Chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
10. IC50 Inhibitory Concenration 50%
(Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử)
11. MeOH Methanol
12. NMR Nuclear Magnetic Resonance
(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)
13. PCRS Primary Chemical Reference Standard
(Chất đối chiếu hóa học sơ cấp)
14. PPPT Phương pháp phân tích
15. RSD Relative Standard Deviation
(Độ lệch chuẩn tương đối)
16. R. Rosmarinus officinalis
officinalis
17. SCRS Secondary Chemical Reference
Standard
10
 (Chất đối chiếu hóa học thứ cấp)
18. SD Standard Deviation (Độ lệch chuẩn)
19. SKĐ Sắc ký đồ
20. SPTC Sản phẩm tinh chế

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT (tiếp)

STT Phần Phần viết đầy đủ
viết tắt
21. TCCL Tiêu chuẩn chất lượng
22. TLC Thin layer chromatography (Sắc ký
lớp mỏng)
23. UV- Untraviolet- visible spectroscopy
Vis (Phổ tử ngoại- khả kiến)
24. v/v Thể tích/ thể tích
25. WHO World Health Organization (Tổ chức
Y tế Thế giới)

11
 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
PL1 Phiếu giám định tên khoa học

PL2 Hình ảnh phổ NMR của acid carnosic tinh chế được

12
1
 ĐẶT VẤN ĐỀ
Stress oxy hóa hiện nay là một trong những nguy cơ đáng lo ngại đối
với sức khỏe con người đang được quan tâm nhất. Không chỉ gây nên quá
trình lão hóa thông thường, nó còn là tác nhân gây ra một loạt các bệnh nguy
hiểm như rối loạn thần kinh mà điển hình là bệnh Alzheimer và ung thư [1].
Theo thống kê của tổ chức y tế giới WHO, mỗi năm trên thế giới có khoảng
hơn 300 000 phụ nữ chết do ung thư vú, một con số không hề nhỏ. Đứng
trước những lo ngại này, ngày càng có nhiều nhà nghiên cứu chú ý đến việc
tìm ra những hoạt chất có tác dụng chống oxy và ứng dụng nó vào trong
nghành công nghiệp dược.
Những năm gần đây, xu hướng sử dụng các loại sản phẩm có nguồn
gốc từ thiên nhiên đang ngày càng được ưa chuộng. Trong đó không thể bỏ
qua acid carnosic là một diterpen phenolic được phân lập từ Hương thảo
(Rosmarinus officinalis L.) với tác dụng nổi bật là chống oxy hóa, bên cạnh
đó, nó còn có tác dụng kháng khuẩn, chống viêm và bảo vệ thần kinh…
Đã có nhiều phương pháp kiểm nghiệm hiện đại được sử dụng để kiểm
soát chất lượng thuốc nhưng đòi hỏi phải có các chất đối chiếu, chất chuẩn
đối chiếu. Tuy nhiên, phần lớn chất đối chiếu, chất chuẩn đối chiếu đang được
sử dụng ở Việt Nam thường nhập từ nước ngoài và có giá thành tương đối
cao, nguồn hàng không ổn định, ảnh hưởng đến công tác nghiên cứu và công
tác kiểm tra chất lượng.
Vì vậy, nhằm khắc phục nhược điểm, phục vụ tốt cho công tác kiểm
soát chất lượng acid carnosic, em thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế acid carnosic từ dược
liệu Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) làm chất đối chiếu” với các
mục tiêu:
1. Xây dựng được phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế acid
carnosic từ dược liệu Hương thảo.
2. Bước đầu đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của chất đối chiếu acid
carnosic.
2
 $CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ HƯƠNG THẢO

1.1.1. Tên gọi và phân loại thực vật
1.1.1.1. Tên gọi
- Tên khoa học: Rosmarinus officinalis L.
- Tên thường gọi: Hương thảo, dương chổi…
- Họ: Hoa môi (Lamiaceae).

- Tên khoa học: Rosmarinus officinalis L.

- Tên thường gọi: Hương thảo, dương chổi…
- Họ: Hoa môi (- Lamiaceae).

Hình 1.1. Cây

Hương thảo

1.1.2. Phân loại thực vật

Theo phân loại thực vật, Hương thảo được xếp theo trình tự sau:
Giới Thực vật

Bộ Hoa môi (Lamiales)

Họ Hoa môi3(Lamiaceae)

Chi Rosmarinus

Loài Rosmarinus officinalis L.

 1.1.3. Đặc điểm thực vật
- Thân: thẳng đứng có nhiều nhánh dài, dạng cây bụi nhỏ, thẳng cứng,
cao từ 80 đến 150 cm, lá và hoa có mùi thơm.
- Lá: lá đơn, mọc đối, lá dày, có mép gập xuống, không cuống, mặt trên
lá có màu xanh đậm và bóng, mặt dưới lá có màu trắng và có lông tơ.
- Hoa: mọc ra từ nách lá. Hoa hình môi, có màu xanh dương dài dưới 1
cm, đài hoa hình chuông, có lông mịn, tràng hoa 2 môi, môi dưới chẻ sâu như
môi của một số hoa lan. Mùa hoa từ tháng 3 đến tháng 5.
- Quả: giống như hầu hết quả thuộc họ Lamiaceae, quả là một chùm
gồm 4 quả khô hợp lại, màu nâu.
- Toàn cây có mùi rất thơm. Bộ phận sử dụng được là ngọn cây có hoa
và lá [2].
1.1.4. Phân bố
Hương thảo là loài cỏ thơm ở vùng Địa Trung Hải, được trồng nhiều ở
Nam Âu, Tây Á và Bắc Phi trước đây. Nó mọc hoang dại dọc theo phía Bắc
và phía Nam bờ biển Địa Trung Hải và cũng trong khu vực tiểu vùng
Himalaya. Nó được trồng từ những ngày xa xưa ở nước Anh, Đức, Pháp,
Trung Mỹ, Venezuela.
Tại Việt Nam, cây được nhập trồng ở một số tỉnh miền núi trung du
phía Bắc, miền Trung và miền Nam.Thường trồng bằng cách giâm cành hay
gieo hạt. Cây thích hợp với khí hậu khô ráo, nhiều nắng nhưng không quá
nóng. Đất trồng phải thoát nước tốt [3].
1.1.5. Thành phần hóa học

Qua nghiên cứu, các nhà khoa học thấy rằng trong loài Hương thảo

4
chứa chủ yếu các thành phần là terpen, flavonoid, tinh dầu và các acid
phenolic. Ngoài ra cây còn chứa các acid hữu cơ (citric, glyconic,...)
Các hợp chất terpen là nhóm hợp chất tự nhiên mà phân tử của nó
được cấu tạo bởi một hoặc nhiều đơn vị isopren (C 5H8) và có chung 1 gốc
sinh tổng hợp. Có thể chia thành terpenoid mạch vòng và terpenoid mạch
thẳng. Ngoài ra dựa vào số đơn vị isopren, người ta chia thành monoterpen
(C10), sesquiterpen (C15), diterpen (C20), triterpen (C30), tetraterpen
(C40).

Cấu trúc của một số loại terpen như diterpen, triterpen, phenolic
diterpen,… trong Hương thảo đã được xác định như: 7-methoxyrosmanol
(1), betulin (2), acid oleanolic (3), acid ursolic (4) [4]; acid carnosic (5),
carnosol (6), acid 12-O-methylcarnosic (7) [4]; acid 12-methoxy-trans-
carnosic (8), acid 12-methoxy-cis-carnosic (9), seco-hinokiol (10) [5];
7β-methoxy-abieta-8,13-dien-11,12-dion-(20,6β)-olid (11), 7α
methoxyabieta-8,13-dien-11, 12-dion-(20,6β)-olid (12), acid royleanolic
(13), rosmanol (14), acid betulinic (15), acid 23-hydroxybetulinic (16),
rofficeron (17), epirosmanol (18), methyl carnosat (19) [6]; rosmariquinon
(20), rosmadial (21) [7]; isorosmanol (22); 11,12-di-O-methoxy
isorosmanol (23) [8]. Cấu trúc của các chất này xem trong hình 1.2.

1 2 3

5
 4 5 6

7 8 9

1 1 1
0 1 2

6
 1 1
1
4 5
3

1 1 1
6 7 8

1 2 2
9 0 1

7
 2
2
3
Hình21.2. Cấu trúc của một số terpen phân lập trong Hương thảo
Các hợp chất flavonoid

Flavonoid có mặt trong hầu hết các bộ phận của các loài thực vật bậc
cao, đặc biệt là hoa, tạo cho hoa những màu sắc rực rỡ thu hút các loại côn
trùng giúp cho sự thụ phấn của cây. Flavonoid là nhóm hợp chất phenol có
cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm
2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon, là nhóm hợp
chất tự nhiên thường gặp trong dược liệu có nguồn gốc thực vật. Phần lớn
chúng có màu vàng, ngoài ra còn có những chất màu xanh, tím, đỏ hoặc
không màu. Các flavonoid đã được phân lập trong Hương thảo như:
genkwanin (24), isocutellarein 7-O-glucosid (25), 6''-O-(E)-
feruloylhomoplantaginin (26), 6''-O-(E)-feruloylnepitrin (27), 6''-O-(E)-p-
coumaroylnepitrin (28), 6-methoxyluteolin-7-glucopyranosid (29), luteolin
3'-O-β-D-glucuronid (30), luteolin 3'-O-(3''-O- acetyl)-β-D-glucuronid (31),
kaempferol(32), luteolin (33), ladanein (34), hispidulin (35), diosmethin
(36), diosmin (37), sinensetin (38), homoplantaginin (39), eriocitrin (40),
gallocatechin (41), hesperidin (42), acacetin (43), cirsimaritin (44) [9, 10] .
Cấu trúc của các chất này xem trong hình 1.3.

2 2 2
4 5 9

8
 26: R1= H2, R2=
OMe
27: R1= OH, R2= 30
OMe

3 3 3
1 2 3

3 3 3
7 3 3 8 39
4 5 6

3
9 3
9
8
 4 4 4
0 1 3

4 4
2 4

Hình 1.3. Cấu trúc của một số flavonoid phân lập trong Hương thảo
Các hợp chất phenolic
Bên cạnh các hợp chất terpen và flavonoid đã được phân lập, các
phenolic cũng được tìm thấy trong loài Hương thảo như: acid rosmanic
(45), acid rosmarinic (46), acid caffeic (47), 1-O-(4-hydroxybenzoyl)-β-D-
glucopyranos (48), 1-O-feruloyl-β-D- glucopyranos (49) [9].

10
 4 4
5 6

4 4 4
7 8 9

Hình 1.4. Cấu trúc của một số phenolic phân lập trong Hương thảo
Như vậy: Tổng hợp các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy,
thành phần hoá học trong loài Hương thảo rất đa dạng và phong phú, góp
phần tạo cơ sở khoa học lý giải cho việc sử dụng cây này để chữa bệnh
trong đời sống.
1.1.6. Tác dụng sinh học và công dụng
Hương thảo thường được dùng trong các trường hợp như cơ thể suy
nhược, choáng do huyết áp thấp, người mệt yếu do tuần hoàn kém, mau quên,
ăn uống không tiêu, đau nhức cơ, thấp khớp, viêm họng, nhức đầu, căng
thẳng thần kinh, chống rụng tóc. Được dùng dưới nhiều dạng.
Qua nghiên cứu, các nhà khoa học đã cho thấy các hợp chất trong
Hương thảo có nhiều hoạt tính sinh học như:

11
 - Tác dụng chống oxy hóa: Năm 2008, Naciye Erkan và cộng sự đã
đánh giá khả năng chống oxy hóa của ba hợp chất tinh khiết acid carnosic,
acid rosmarinic và sesamol, cũng như hai chất chiết xuất từ Hương thảo và
tinh dầu hạt đen, được kiểm tra bằng cách áp dụng các xét nghiệm quét gốc
DPPH và ABTS+ và kiểm tra thiocyanat sắt. Qua đó cho ta thấy hàm lượng
phenolic trong tinh dầu Hương thảo cao hơn so với tinh dầu đen (lượng
phenolic bên trong chiết xuất Hương thảo và tinh dầu hạt đen lần lượt là 162
và 28,2 mg GAE/g) từ đó giải thích được hoạt động chống oxy hóa cao hơn
của cây Hương thảo [11]. Các hợp chất phenolic diterpen như carnosol ,
rosmanol , acid carnosic , và acid phenolic như acid rosmarinic, acid caffeic
được phân lập từ Hương thảo, trong đó acid carnosic và carnosol được công
nhận là có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, chống lại các gốc tự do [12].
- Tác dụng chống viêm: Năm 2017, Mahboobeh và cộng sự đã thực
hiện các thử nghiệm in vivo trên chuột. Kết quả cho thấy, chiết xuất etanolic
của các bộ phận cây Hương thảo hoặc aicd rosmarinic giúp giảm rõ rệt mức
độ của các dấu hiệu viêm như COX2, PGE-2, IL-1β, MMP2 và NO. Qua
nghiên cứu, cho thấy khả năng chống viêm hiệu quả trên chuột bị chứng chấn
thương co thắt mãn tính dây thần kinh tọa của Hương thảo được đánh giá qua
sự giảm các dấu hiệu viêm như COX2, PGE-2, IL-1β, MMP2 và NO từ đó
mở ra triển vọng sử dụng điều trị đau thần kinh, rối loạn thần kinh liên quan
đến viêm [13]. Ngoài ra năm 2013, các nghiên cứu của Salvan da Rosa cũng
sử dụng mô hình thí nghiệm và thử nghiệm in vitro trên chuột. Kết quả cho
thấy trong thành phần hóa học phân lập của Hương thảo thì carnosol và acid
rosmarinic có hoạt tính kháng viêm rất mạnh trong mô mỡ do carrageenan
gây ra. Bằng cách ức chế bạch cầu, bạch cầu trung tính và giảm tiết dịch dẫn
đến giảm giải phóng nitricoxid (chất trung gian gây viêm tiền liệt). Hai hợp
chất này có khả năng chống viêm bằng cách ức chế phản ứng miễn dịch bẩm
sinh, ngăn ngừa các bệnh lý viêm và tự miễn dịch [14].
- Tác dụng kháng khuẩn: Theo nghiên cứu của Amani A Tawfeeq, đã
phân tích được cây Hương thảo chứa hàm lượng hóa chất thực vật tốt (hàm
lượng acid rosmarinic là 0,9% và hàm lượng dầu là 1,8%, trong dầu Hương
thảo Iraq chứa long não 23,04%, 1,8-cineol 14,01%, và terpinen-4-ol 13,8%)
12
và có tác dụng chống lại các vi khuẩn khác nhau như Enterococcus faecalis,
Staphylococcus saprophyticus, Acinetobacter baumannii, và Proteus
mirabilis [15]. Ngoài ra, Theo nghiên cứu của S. Tavassoli, trong dịch chiết
MeOH từ lá Hương thảo chứa các thành phần chống vi khuẩn. Chống lại các
chủng vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus delbruekii,
Saccharomyces cerevisia và Candida krusei (Issatchenikia orientalis) [16].
- Tác dụng chống ung thư: Trong một nghiên cứu tổng hợp, Jessy
Moore và cộng sự đã cho thấy khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư của
dịch chiết Hương thảo. Có thể kể một số loại ung thư như ung thư ruột (với
khả năng ức chế liên tục sự phát triển và khả năng tồn tại của tế bào ở nồng
độ tương đối thấp trong khoảng 20–100 µg/ml) , ung thư vú, ung thư tụy (với
khả năng ức chế ở nồng độ 10-100 µg/ml), ung thư gan (Trong tế bào Hep-3B
gan người, khi chiết xuất Hương thảo ở khoảng 0-50 µg/ml thì tế bào giảm
khả năng tồn tại phụ thuộc vào liều chiết xuất với IC50 là 22,88 µg/ml [17]),
ung thư phổi (Trong tế bào ung thư phổi, AC làm giảm khả năng sống sót của
ung thư biểu mô tế bào nhỏ NCI-H82 tế bào (6,25–50 µg/ml; 48 giờ) và giảm
sự tăng sinh của tế bào ung thư biểu mô tế bào không nhỏ A549 (2,5-200
µg/ml) [17] với IC50 hoặc 24,08 µg/ml và 15,9 µg/ml tương ứng trong mỗi
dòng tế bào), ngoài ra còn ung thư tiền liệt tuyến, bạch cầu cấp [18]. Chiết
xuất từ lá Hương thảo đã được chứng minh có tác dụng chống lại các tế bào
ung thư biểu mô, hạn chế sự tăng sinh tế bào ung thư gan ở người. Một số
chất có tác dụng như: carnosol, acid carnosic và acid rosemanic đã được phân
lập trong Hương thảo [12].
- Tác dụng trên bệnh đái tháo đường và biến chứng của đái tháo
đường: Qua bài bảo tổng quan của Tian-Qi Bao và cộng sự cho thấy chiết
xuất Hương thảo và phenolic chính của nó đặc biệt là acid carnosic, acid
rosmarinic và carnosol, phát huy tác dụng chống đái tháo đường thông qua
việc điều chỉnh chuyển hóa glucose bao gồm cải thiện đề kháng insulin, ngăn
chặn quá trình tạo tân tạo glucose, và điều chỉnh sự hấp thu và vận chuyển
glucose. Ngoài ra, chúng cũng điều chỉnh sự trao đổi chất lipid trong bệnh
tiểu đường thông qua ức chế tổng hợp lipid, kích hoạt quá trình oxy hóa β
acid béo và ức chế quá trình phân giải lipid trong mô mỡ. Hơn nữa, chiết xuất
13
Hương thảo và các thành phần phenolic của nó cải thiện bệnh tiểu đường và
các biến chứng thông qua việc ức chế phản ứng viêm và sự mất cân bằng quá
trình oxy hóa [19].
- Tác dụng lên rối loạn thần kinh: Chiết xuất hydroalcohol trong
Hương thảo (100 mg/ kg, PO) được chứng mình tác dụng chống trầm cảm của
nó phụ thuộc vào tương tác với noradrenergic (thụ thể α1), dopaminergic (thụ
thể D1 và D2) và serotonergic (thụ thể 5-HT1A, 5-HT2A và 5-HT3) [20].
Trong một nghiên cứu của Pengelly trong năm 2012, bột Hương thảo (750
mg) với liều lượng gần giống với thức ăn bình thường cho thấy những ảnh
hưởng tích cực đến tốc độ ghi nhớ, thời gian cần thiết để lấy thông tin từ cả
bộ nhớ từng hồi và bộ nhớ làm việc trên 28 người lớn tuổi (tuổi trung bình: 75
tuổi). Điều này rất hữu ích dự báo chức năng nhận thức trong quá trình lão
hóa. Ngoài ra, Hương thảo còn có tác dụng lên các rối loạn thần kinh như
động kinh, đau thần kinh, căng thẳng, lo lắng, bệnh Parkinson [13].

1.2. TỔNG QUAN VỀ ACID CARNOSIC

1.2.1. Công thức cấu tạo

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của acid carnosic

- IUPAC: (4aR, 10aS)- 5, 6- dihydroxy-1, 1- dimethyl- 7- propan- 2-
yl- 2,3,4,9,10,10a-hexahydrophenanthrene-4a-carboxylic acid.
- Công thức phân tử: C20H28O4.

14
 - Phân tử lượng: 332,4 g/mol.
1.2.2. Tính chất của acid carnosic
- Acid carnosic tồn tại dưới dạng chất rắn kết tinh màu vàng nhạt.
- Độ hòa tan của acid carnosic tăng theo áp suất và lượng etanol. Trong
phạm vi áp suất đã nghiên cứu, độ hòa tan của acid carnosic cao hơn ở nhiệt
độ thấp hơn. Ngoài ra, acid carnosic tan khi cho vào methanol [21].
- Nhiệt độ nóng chảy: 185-190°C [21].
- Nhiệt độ sôi: 506,4 ± 50,0°C [21].
- Hằng số phân lý (pKa): 4,14 ± 0,4 [21].
1.2.3. Tác dụng sinh học của acid carnosic
1.2.3.1.Tác dụng chống oxy hóa
Sự oxy hóa là một trong những nguyên nhân gây ra một số bệnh như
ung thư, bệnh tim mạch, rối loạn thần kinh, bệnh Alzheimer, suy giảm nhận
thức và lão hóa [22]. Và acid carnosic cũng là một trong những chất từ tự
nhiên có tác dụng chống oxy hóa hiệu quả đang được quan tâm nghiên cứu.
Theo nghiên cứu của Juan và cộng sự (2006) đã tiến hành nghiên cứu tác
dụng chống oxy hóa của acid carnosic trong dịch chiết MeOH của cây Hương
thảo cho thấy rằng AC có tác dụng thu dọn gốc tự do DPPH (2,2-Diphenyl-1-
picrylhydrazyl ) với giá trị IC50 là 9,2% [23].
Năm 2001, nghiên cứu của Masuda và cộng sự chỉ ra được cơ chế
chống oxy hóa của AC là do nó có hai nhóm phenol phản ứng trong phần
thơm. Trong đó, nhóm phenolic ở vị trí 11 có vai trò quan trọng hơn trong
hoạt động chống oxy hóa của AC. Đầu tiên, nhóm 11-phenolic sẽ cho H+ để
tạo ra gốc carnosat. Sau một loạt các phản ứng ghép nối gốc-gốc phức tạp,
cuối cùng sẽ tạo ra được epoxyquinon. Epoxyquinon này có cấu trúc tương tự
như các sản phẩm chống oxy hóa của vitamin E và bản thân nó cũng có khả
năng antioxy [24].
1.2.3.2. Tác dụng kháng khuẩn
Năm 2019, Valentina cùng cộng sự của ông đã làm một nghiên cứu trên
15
bốn chủng vi khuẩn: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginsa, Bacillus
subtilis và Staphylococcus aureus để chứng minh đặc tính kháng khuẩn của
acid carnosic [25]. Kết quả cho thấy, AC hoạt động chống lại vi khuẩn gram
dương tốt hơn vi khuẩn gram âm. Nguyên nhân chính dẫn đến sự khác biệt
này là do tính nhạy cảm khác nhau của màng tế bào vi khuẩn. Ở vi khuẩn
gram âm, lớp bọc lipopolysaccharid của nó gây hạn chế sự khuếch tán của AC
dẫn đến làm giảm tác dụng kháng khuẩn của nó.
Trong một nghiên cứu khác của Ali và cộng sự (2020) cũng chỉ ra rằng
AC hoạt động chống lại vi khuẩn Gram dương tốt hơn Gram âm. Ở vi khuẩn
Gram âm, thành tế bào và màng tế bào của nó có một lượng nhỏ lipid và một
lượng lớn peptidoglycan. AC là tác nhân làm biến tính protein, làm thay đổi
tính thấm của tế bào vi khuẩn và diệt vi khuẩn [26].
1.2.3.3. Tác dụng giảm đau, chống viêm
Acid carnosic còn là một hoạt chất có tác dụng giảm đau, chống viêm
hiệu quả đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu. Theo nghiên cứu của
Guangtao Xia và cộng sự (2017) đã tiến hành chứng minh tác dụng giảm đau,
chống viêm khớp trên chuột thông qua ức chế viêm bằng cách điều chỉnh con
đường p38 phụ thuộc vào ROS. Trong quá trình theo dõi, người ta thấy rằng
các cytokine gây viêm như COX2, TNF– a, IL– 1β và IL– 18 đều bị giảm khi
điều trị chuột bằng AC [27].
Các nghiên cứu in vitro, in vivo của Mei Liu và cộng sự (2018) đều cho
thấy AC không chỉ ngăn chặn sự biểu hiện của các cytokine gây viêm như
TNFɑ, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-17, MMP-3 mà còn điều hòa việc sản xuất
RANKL [28]. AC có tác dụng cả trên viêm khớp cấp tính và mạn tính. Từ đó
có thể thấy rằng, chiết xuất từ cây Hương thảo là một hoạt chất tiềm năng để
sản xuất các loại thuốc chữa bệnh viêm khớp dạng thấp có nguồn gốc từ tự
nhiên.
1.2.3.4. Phòng ngừa ung thư
Gần đây, nghiên cứu đã chỉ ra rằng acid carnosic còn có tác dụng ngừa
một số loại ung thư như ung thư ruột kết, ung thư vú và các khối u da thông
qua việc ức chế sự tăng sinh, xâm lấn, di căn của tế bào và cảm ứng quá trình
16
apoptosis, sản xuất ROS (các loại oxy phản ứng) [28]. Năm 2012, Barni và
cộng sự đã tiến hành nghiên cứu chứng minh tác dụng của AC đối với các tế
bào ung thư ruột kết ở người. Kết quả cho thấy AC ức chế sự phát triển của tế
bào ung thư bằng cách gây ra quá trình apoptosis và làm giảm hoạt động của
các enzyme phân giải protein bằng cách điều chỉnh biểu hiện của mRNA
COX– 2 [29].
Nghiên cứu của Sicong Jiang và cộng sự (2021) đã chứng minh được
rằng AC làm giảm biểu hiện của protein liên quan đến pha G2/M, MDM2,
cyclin B1 và CDC2. Hoạt động chống ung thư của AC là do khả năng kích
hoạt con đường tín hiệu qua trung gian p21 và gây ra quá trình chết tế bào.
Liều có tác dụng ức chế của AC phụ thuộc vào kiểu hình của dòng tế bào ác
tính. Đối với ung thư vú, AC có IC50 là 25,6 – 96 µM; còn trong ung thư
tuyến tiền liệt thì IC50 thấp hơn, vào khoảng 19,6  µM và 22,9 µM [30].
Vai trò có lợi của hoạt chất này là do tác dụng chống oxy hóa và chống
viêm của nó. Do đó, acid carnosic là một yếu tố chống ung thư đầy hứa hẹn
cần được quan tâm để phát triển hơn nữa.

1.2.3.5. Bảo vệ thần kinh và chống Alzheimer

Acid carnosic đã bảo vệ thần kinh giúp giảm và ngăn ngừa tế bào tổn
thương. AC gây ra tác dụng chống oxy hóa và chống viêm ở một số loại tế
bào được quan sát thấy trong cả mô hình thực nghiệm in vitro và in vivo.
Trong bối cảnh này, AC đã được xem như một tác nhân bảo vệ thần kinh
bằng cách kích hoạt các đường truyền tín hiệu liên quan đến sự tồn tại của tế
bào trong điều kiện căng thẳng. Thật vậy, AC thể hiện khả năng thúc đẩy bảo
vệ ty thể trong các tế bào thần kinh. Rối loạn chức năng ty thể đóng một vai
trò trung tâm trong việc bắt đầu và phát triển các rối loạn thoái hóa thần kinh,
chẳng hạn như bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson và bệnh Huntington, trong số
những bệnh khác. Do đó, việc nghiên cứu các chiến lược nhằm hạn chế sự
suy giảm của ty thể trong trường hợp thoái hóa thần kinh đang được quan tâm
về mặt dược học. Trong nghiên cứu này, nó được mô tả và thảo luận về tác
17
động của acid carnosic lên ty thể não trong các mô hình thực nghiệm về tổn
thương thần kinh. Dựa trên dữ liệu được thảo luận ở đây, AC là một ứng cử
viên tiềm năng như một chất bảo vệ thần kinh bằng cách tác động lên ty thể
của tế bào thần kinh [31].
1.2.4. Ứng dụng của acid carnosic
1.2.4.1. Ứng dụng là phụ gia thực phẩm ở châu Âu
Chất chiết xuất từ cây Hương thảo đã được sử dụng làm chất chống oxy
hóa trong ngành công nghiệp thực phẩm trong hơn 20 năm. Các chất chiết
xuất từ cây Hương thảo đầu tiên được sử dụng làm chất chống oxy hóa trong
thực phẩm là các thành phần có nguồn gốc từ nhựa dầu Hương thảo có mùi
thơm, hòa tan trong dầu được sản xuất bằng cách chiết xuất qua các dung môi
. Các chất chiết xuất từ cây Hương thảo như vậy chủ yếu được sử dụng trong
các ứng dụng ướp muối và được coi như hương vị dù chủ yếu chúng được sử
dụng cho mục đích bảo quản thực phẩm.
Để công nhận hiệu quả của chúng và theo yêu cầu của ngành công
nghiệp thực phẩm, vào năm 2010 chất chiết xuất từ cây Hương thảo đã được
Ủy ban Châu Âu phân loại là phụ gia thực phẩm và được ấn định số E392
(Các chỉ thị của Ủy ban 2010/67/ EU và 2010/69/ EU đã bãi bỏ vào năm 2013
bởi Quy định của EU 231/2012 và 1333/2008). “Chất chống oxy hóa: chiết
xuất từ cây Hương thảo” phải được sản xuất bằng một trong bốn quy trình
chiết xuất được mô tả trong quy định, bằng cách chiết xuất dung môi (etanol,
axeton hoặc etanol theo sau đó là hexan) hoặc chiết xuất cacbon dioxid siêu
tới hạn , tuân theo các tiêu chí về độ tinh khiết. Theo quy định của EU, chỉ
chiết xuất Hương thảo đã khử mùi có chứa acid carnosic và carnosol được coi
là chất phụ gia. Thật vậy, acid carnosic và carnosol dẫn xuất của nó được liệt
kê là các hợp chất chống oxy hóa chính trong chiết xuất Hương thảo và giới
hạn liều lượng E392 được biểu thị bằng mức độ acid carnosic và carnosol,
thay vì toàn bộ chiết xuất Hương thảo.
1.2.4.2. Acid carnosic trong dinh dưỡng và sức khỏe, và mỹ phẩm
Đặc tính chống oxy hóa của acid carnosic đã giúp chống lại quá trình
oxy hóa tia UVA trong nguyên bào sợi của da người, điều này có thể cho thấy
18
tiềm năng ứng dụng cho ngành da liễu [32]. Nhiều ứng dụng sức khỏe dựa
trên các tính năng chống oxy hóa của acid carnosic và carnosol bao gồm giảm
cytochrome c và bảo vệ protein α1-antiproteinase chống lại sự bất hoạt đã
được phát triển [33]. Các đặc tính chống gây ung thư được cho là do acid
carnosic, chiết xuất chủ yếu từ Hương thảo mà còn từ Salvia, Ocimum hoặc
Perovskia [34]. Chiết xuất thực vật chứa nhiều acid carnosic được phát hiện
có khả năng chống lại chất gây ung thư do chống tăng sinh , chống tạo mạch ,
bảo vệ hóa học, đặc tính chống u hoặc kháng tiểu cầu [35] . Trong một số
nghiên cứu in vitro, chiết xuất thực vật có chứa acid carnosic cho thấy khả
năng ngăn ngừa và ức chế ung thư [35]. Nhiều nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng
chiết xuất từ thực vật giàu acid carnosic có tính năng chống viêm, được ứng
dụng trong y tế hoặc mỹ phẩm, vì nó ngăn chặn interleukin, giải phóng oxit
nitric và con đường proto-oncogen tyrosin-protein kinase Src [35]. Chất chiết
xuất từ thực vật có chứa acid carnosic cũng được báo cáo là có đặc tính chống
sự biệt hóa tế bào gốc thành tế bào mỡ giúp giảm cân và chứng minh hiệu quả
trong điều trị tăng đường huyết [36]. Các nghiên cứu khác nhằm phát triển
các ứng dụng đã cho thấy tiềm năng chống lão hóa của chiết xuất Hương thảo
có chứa acid carnosic bằng cách ngăn chặn sự thay đổi oxy hóa của lipid bề
mặt da hoặc bằng cơ chế điều hòa sinh học [37]. Chăm sóc sức khỏe răng
miệng là một ứng dụng khác liên quan đến mỹ phẩm của acid carnosic: các
nghiên cứu trong ống nghiệm đã chỉ ra rằng nó bảo vệ hiệu quả chống lại các
vi sinh vật gây bệnh điển hình [38].

1.3. PHƯƠNG PHÁP THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU

1.3.1. Các khái niệm về chất đối chiếu hóa học
- Chất đối chiếu (CĐC) là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để
dùng trong các phép thử đã được qui định về hóa học, vật lý và sinh học.
Trong các phép thử đó các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các
tính chất của chất cần thử. Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với
mục đích sử dụng [39].
- CĐC hóa học được phân loại theo các mức độ như sau [39]:
+ Chất đối chiếu hóa học sơ cấp (PCRS): là chất được công nhận rộng
19
rãi, các chỉ tiêu chất lượng phù hợp với tài liệu công bố, có hàm lượng được
chấp nhận làm chuẩn định lượng mà không cần phải so sánh với một chất hóa
học khác.
+ Chất đối chiếu hóa học thứ cấp (SCRS): là chất đối chiếu mà các tính
chất hay chỉ tiêu chất lượng được xác định bằng cách so sánh với một chất đối
chiếu sơ cấp. Trong quá trình thiết lập SCRS có sử dụng PCRS để so sánh.
1.3.2. Thiết lập chất đối chiếu sơ cấp
- Quy trình thiết lập PCRS gồm các bước: đánh giá nhu cầu, mục đích
sử dụng, chọn nguyên liệu, phương pháp kiểm nghiệm, xác định hàm lượng,
đóng gói, phân phối. Thực hiện theo hướng dẫn của tài liệu do tổ chức y tế thế
giới (WHO) ban hành [39].
- Tùy vào mục đích sử dụng mà hàm lượng của chất đối chiếu và số
lượng phòng thí nghiệm tham gia đánh giá khác nhau. Với phép thử định tính
và thử tinh khiết chỉ cần 1 phòng thí nghiệm đạt GLP hoặc ISO/IEC 17025 và
hàm lượng có thể chỉ khoảng 90%. Phép thử định lượng, hiệu chỉnh thiết bị
thì ít nhất là 3 phòng thí nghiệm và hàm lượng không nhỏ hơn 95% [39].
- Các chất đối chiếu đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sản xuất
và đảm bảo chất lượng của ngành Dược. Nhưng trên thực tế, các PCRS của
Anh, Mỹ, Quốc tế, Châu Âu lại quá đắt cho nhu cầu phân tích hay nghiên cứu
thường quy. Chính vì vậy, PCRS được các Hội đồng Dược điển của khu vực,
quốc gia hoặc các phòng thí nghiệm đạt chuẩn thiết lập trên cơ sở của quy
trình thiết lập chất đối chiếu thứ cấp.
1.3.3. Thiết lập chất đối chiếu thứ cấp
Trên cơ sở tham khảo quy trình thiết lập PCRS, các Hội đồng Dược
điển quốc gia hay khu vực hoặc các phòng thí nghiệm được ủy quyền của cơ
quan quản lý dược quốc gia xây dựng qui trình thiết lập SCRS của cơ sở đó
[34-36]. Việc thiết lập SCRS dựa trên PCRS thường được tiến hành do nhu
cầu thực tế, khi nguồn PCRS không đủ cung cấp cho nhu cầu sử dụng trong
công tác nghiên cứu và đảm bảo chất lượng thuốc.
Ở Việt Nam, quy trình thiết lập PCRS được thực hiện theo hướng dẫn

20
của ASEAN và một số tài liệu của ISO [40].
1.3.4. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đánh giá chất đối chiếu và
yêu cầu về nội dung của quy trình phân tích
Tiêu chuẩn chất lượng (TCCL) của CĐC bao gồm các chỉ tiêu chất
lượng (CTCL) và phương pháp phân tích (PPPT), được xây dựng dựa trên các
yếu tố như TCCL của các hợp chất được sử dụng làm CĐC được công bố
trong Dược điển hoặc TCCL của nhà sản xuất, các đặc điểm thuộc về bản
chất của vật lý, hóa học của chất nghiên cứu và mục đích sử dụng của CĐC.
PPPT sử dụng để đánh giá các CTCL của CĐC phải là các phương pháp trong
Dược điển, và là phương pháp dự kiến sẽ sử dụng để đánh giá mẫu bằng CĐC
đó [41].
- Các CTCL thông thường hay được công bố trên chứng chỉ phân tích
của CĐC: Mô tả, định tính, pH, kim loại nặng, hàm lượng nước, năng suất
quay cực, cắn sau khi nung, điểm chảy, độ trong và màu sắc dung dịch, giảm
khối lượng do sấy khô, tro sulfat, tạp hữu cơ bay hơi, tạp chất liên quan, định
lượng.
- Một số PPPT trong Dược điển hay dùng để xác định các CTCL của
hoạt chất hoặc thành phẩm thuốc [42]:
+ Định tính: IR, HPLC, TLC, UV-Vis, điểm chảy.
+ Độ tinh khiết: các kĩ thuật sắc ký như HPLC, TLC dùng để xác định
tạp chất liên quan, GC dùng để xác định dung môi hữu cơ bay hơi hoặc tồn dư
dung môi, xác định góc quay cực riêng, đo pH, quét nhiệt vi sai, xác định kim
loại nặng, xác định tro sulfat, độ ẩm, giảm khối lượng do sấy (sấy thường/sấy
chân không), hàm lượng nước.
+ Định lượng: HPLC, UV-Vis, chuẩn độ thể tích, định lượng bằng vi
sinh.

21
 CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1. Nguyên liệu
Lá Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) được thu hái ở thành phố Đà
Lạt, tỉnh Lâm Đồng vào tháng 3 năm 2021. Lá Hương thảo có chất lượng đồng
đều, tươi, không bị sâu bệnh. Nguyên liệu phải được thu hái trong điều kiện khô
ráo để đảm bảo sự đồng đều trong các mẫu khảo sát.

Hình 2.1.Lá Hương thảo sấy khô

22
 Xử lý nguyên liệu: Mẫu nghiên cứu được rửa sạch, sơ chế loại bỏ tạp chất
rồi sấy khô ở nhiệt độ dưới 60ºC. Sau đó được xay thành bột thô theo quy định
của DĐVN V và bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo thoáng mát.
2.1.2. Hóa chất, dung môi
Bảng 2.1. Các hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu
Nguồn
Tên Tiêu chuẩn
gốc
Sigma-
Acid carnosic
Aldrich, NSX, hàm lượng 98%
chuẩn
Mỹ
Việt
Ethanol 96% DĐVN V
Nam
Merck,
Acetonitril (ACN) Tiêu chuẩn phân tích
Đức
Merck,
Acid phosphoric Tiêu chuẩn phân tích
Đức
Methanol Trung
Tiêu chuẩn phân tích
(MeOH) Quốc
Việt
Nước cất 2 lần DĐVN V
Nam
Dichloromethan Trung Tiêu chuẩn tinh khiết,
(DCM) Quốc phân tích
- Các hóa chất, dung môi, thuốc thử cần thiết khác dùng trong phòng thí
nghiệm.
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu
Bảng 2.2. Các thiết bị dụng cụ nghiên cứu

23
 Xuất
Tên thiết bị
xứ
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Waters –
2695D,
Mỹ
bộ phận tiêm mẫu tự động, đầu dò PDA 2998; phần mềm
Empower.
Cân phân tích điện tử Mettler Todedo – MS 205DU độ
Thụy
chính
Sỹ
xác 0,0001g
Cân kỹ thuật Mettler Todedo – MS 205DU độ chính xác Thụy
0,01 g Sỹ
Máy đo hàm ẩm tự động Sartorius Đức

Bảng 2.2. Các thiết bị dụng cụ nghiên cứu

Máy siêu âm Elmasonic Mỹ
Việt
Bộ dụng cụ chiết hồi lưu
Nam
Thụy
Máy cô quay chân không Buchi
Sỹ
Trung
Tủ sấy
Quốc
Bản mỏng Silica gel GF254 (Merck) tráng sẵn Đức
Máy đo phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR) Bruker Mỹ
Một số dụng cụ, thiết bị nghiên cứu khác dùng trong
phòng thí
nghiệm (tủ sấy, máy xay, cốc thủy tinh, …)

24
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xây dựng phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế acid
carnosic từ dược liệu Hương thảo
2.2.1.1. Phương pháp định lượng acid carnosic trong dược liệu Hương
thảo bằng phương pháp HPLC
a. Xác định hàm ẩm của dược liệu Hương thảo:
Tiến hành theo phụ lục 9.6 (DĐVN V) bằng phương pháp mất khối lượng
do làm khô bằng máy đo hàm ẩm tự động. Mỗi mẫu lấy khoảng 3g, sấy ở 105 oC
trong 4h [43].
b. Định lượng
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử:
+ Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 5,0 mg chất chuẩn acid
carnosic vào bình định mức 5ml, sau đó hòa tan và bổ sung bằng MeOH vừa đủ
đến vạch. Lắc đều và thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000μg/ml.
+ Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5g dược liệu Hương thảo cho
vào bình nón 50ml, chiết siêu âm với 15 ml bằng dung môi chiết MeOH trong 40
phút, số lần chiết là 2 lần. Gạn, lọc dịch chiết qua giấy lọc, gộp dịch chiết vào
bình định mức 100 ml, định mức bằng MeOH đến vạch. Lọc dung dịch đã chuẩn
bị ở trên qua màng lọc 0,45 µm và tiêm vào hệ thống phân tích HPLC.
- Điều kiện phân tích: sử dụng phương pháp HPLC đã được thẩm định
[44], cố định được các điều kiện.
+ Cột sắc ký: Eclipse XDB – C18 (150 mm x 4,6 mm; 5 μm).
+ Detector: PDA.
+ Nhiệt độ cột: 25 ± 0,5oC.
+ Thể tích tiêm: 10 µl.
+ Bước sóng định lượng: 230 nm.

25
 + Hệ dung môi: ACN : acid phosphoric 0,1%, tỷ lệ 60:40.
Chương trình rửa giải đẳng dòng.
- Cách tiến hành:
+ Tính tương thích hệ thống:
Cân bằng cột bằng hỗn hợp pha động ít nhất 30 phút. Pha dung dịch chuẩn
acid carnosic có nồng độ khoảng 200 μg/ml từ dung dịch chuẩn gốc (1000
μg/ml). Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn acid carnosic nồng độ 200
μg/ml vào hệ thống HPLC.
Yêu cầu: Hệ số bất đối của pic không được lớn hơn 2,0; số đĩa lý thuyết
của cột không được nhỏ hơn 2000, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic sau
6 lần tiêm lặp lại không được lớn hơn 2,0%.
+ Xây dựng đường chuẩn: Xây dựng phương trình tuyến tính của đường
chuẩn rồi từ đó suy ra nồng độ chất trong mẫu thử.
 Từ dung dịch chuẩn gốc acid carnosic có nồng độ 1000 µg/ml, tiến hành
pha loãng bằng dung môi MeOH để có được dãy chuẩn với các nồng độ
theo thứ tự là: 40, 50, 100, 200, 250 µg/ml.
 Tiêm dung dịch chuẩn, mỗi nồng độ tiêm 3 lần, ghi lại sắc ký đồ và xác
định đáp ứng của pic.
 Tiêm mẫu thử, mỗi mẫu thử lặp lại 3 lần, ghi nhận sắc kí đồ và ghi lại đáp
ứng với chất cần phân tích.
Tiến hành sắc kí theo điều kiện đã chọn ở mục 2.2.1.1 (b) và xây dựng
phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch chất
chuẩn. Xác định hệ số tương quan R2.
Yêu cầu: 0,99 ≤ R2 ≤ 1.
+ Tính kết quả:

26
  Nồng độ acid carnosic chiết được từ dược liệu: Dựa vào đường chuẩn
biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic,
phương trình S = a × C +¿b.
 Hàm lượng AC trong dược liệu được xác định dựa trên công thức:
(S−b)× V × 100× 100
HL (%) =
a x m × ( 100−h ) × 1000000
Trong đó: HL: Hàm lượng acid carnosic trong dược liệu (%).
C: Nồng độ acid carnosic trong dung dịch thử.
V: Thể tích dung dịch hòa tan mẫu thử (ml).
m: Khối lượng dược liệu cân để chiết xuất (g).
h: Hàm ẩm của dược liệu (%).
S: Diện tích pic acid carnosic (µV*s).
a: Hệ số góc của đường chuẩn.
b: Hệ số chắn của đường chuẩn.
2.2.1.2. Xây dựng phương pháp chiết xuất acid carnosic từ Hương thảo
a. Khảo sát các dung môi chiết xuất:
- Nguyên liệu Hương thảo sau khi thu được rửa sạch, sấy khô đến khi hàm
ẩm nhỏ hơn 10%, xay nhỏ. Đóng gói nguyên liệu trong bao bì kín cho đến khi sử
dụng.
- Chuẩn bị dung dịch thử:
+ Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5g dược liệu Hương thảo cho
vào bình nón 50ml, chiết siêu âm với 15 ml dung môi chiết (lần lượt là
EtOH50%, EtOH75%, EtOH 96%) trong 40 phút, số lần chiết 2 lần. Gạn, lọc,
gộp dịch chiết vào bình định mức 100 ml, định mức bằng dung môi chiết đến
vạch. Lọc dung dịch đã chuẩn bị ở trên qua màng lọc 0,45 µm. Chuẩn bị 3 mẫu.
Tiến hành định lượng trên hệ thống HPLC để tính hàm lượng acid carnosic.

27
 - Với mỗi độ cồn trên, thực hiện chiết xuất 3 mẫu, rồi sử dụng phương
pháp HPLC theo quy trình ở mục 2.2.1.1 (b) để tìm dung môi chiết xuất tối ưu.
- Hàm lượng AC trong dược liệu được xác định dựa trên công thức:
(S−b)× V × 100× 100
HL (%) =
a x m × ( 100−h ) × 1000000
Trong đó: HL: Hàm lượng acid carnosic trong dược liệu (%).
C: Nồng độ acid carnosic trong dung dịch thử (μg/ml).
V: Thể tích dung dịch hòa tan mẫu thử (ml).
m: Khối lượng dược liệu cân để chiết xuất (g).
h: Hàm ẩm của dược liệu (%).
S: Diện tích pic acid carnosic (µV*s).
a: Hệ số góc của đường chuẩn.
b: Hệ số chắn của đường chuẩn.
Yêu cầu: Lựa chọn dung môi chiết có hiệu suất chiết AC cao hơn

28
 Bảng 2.3. Các thông số khảo sát lựa chọn dung môi chiết xuất AC từ
Hương thảo
Dung Thời gian Số lần chiết Tỷ lệ
môi chiết xuất xuất DM/DL
EtOH 40 phút/lần 2 15/1
50%
EtOH 40 phút/lần 2 15/1
75%
EtOH 40 phút/lần 2 15/1
96%

b. Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chiết xuất Hương thảo:
Sau khi lựa chọn được dung môi chiết xuất ta tiến hành khảo sát phương
pháp:
- Chuẩn bị mẫu thử:
+ Chiết xuất siêu âm (phương pháp 1):
Cân chính xác khoảng 0,5g dược liệu Hương thảo cho vào bình nón 50ml,
chiết siêu âm với 15 ml EtOH 96% trong 40 phút, số lần chiết 2 lần. Gạn, lọc,
gộp dịch chiết vào bình định mức 100 ml, định mức bằng EtOH 96% đến vạch.
Lọc dung dịch đã chuẩn bị ở trên qua màng lọc 0,45 µm. Chuẩn bị 3 mẫu. Tiến
hành định lượng trên hệ thống HPLC để tính hàm lượng acid carnosic.
+ Chiết xuất hồi lưu (phương pháp 2):
Cân chính xác khoảng 0,5g dược liệu Hương thảo cho vào bình cầu có nút
mài 50ml, chiết hồi lưu 2 lần, mỗi lần sử dụng 15ml EtOH 96% trong 40 phút kể
từ lúc sôi. Gạn, lọc, gộp dịch chiết vào bình định mức 100 ml, định mức bằng
EtOH 96% đến vạch. Lọc dung dịch đã chuẩn bị ở trên qua màng lọc 0,45 µm.

29
Chuẩn bị 3 mẫu. Tiến hành định lượng trên hệ thống HPLC để tính hàm lượng
acid carnosic.
- Các tiến hành tương tự như phần 2.2.1.1 (b)
- Hàm lượng AC trong dược liệu được xác định dựa trên công thức:
(S−b)× V × 100× 100
HL (%) =
a x m × ( 100−h ) × 1000000
Trong đó: HL: Hàm lượng acid carnosic trong dược liệu (%).
C: Nồng độ acid carnosic trong dung dịch thử (μg/ml).
V: Thể tích dung dịch hòa tan mẫu thử (ml).
m: Khối lượng dược liệu cân để chiết xuất (g).
h: Hàm ẩm của dược liệu (%).
S: Diện tích pic acid carnosic (µV*s).
a: Hệ số góc của đường chuẩn.
b: Hệ số chắn của đường chuẩn.
Bảng 2.4 . Các thông số khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất CA
từ Hương thảo
PP chiết Dung Thời gian Số Tỷ lệ
xuất môi chiết lần chiết DM/DL
Siêu âm EtOH 40 2 15/1
96% phút/lần
Hồi lưu EtOH 40 2 15/1
96% phút/lần
 Yêu cầu: Lựa chọn phương pháp chiết có hiệu suất chiết AC cao nhất.
2.2.1.3. Xây dựng phương pháp phân lập, tinh chế acid carnosic từ cây
Hương thảo

30
 Để phân tích, phân tách cũng như tinh chế acid carnosic từ dược liệu
Hương thảo, ta sử dụng phương pháp HPLC điều chế.
- Chuẩn bị mẫu thử:
Cân chính xác khoảng 1g cắn vào cốc có mỏ 10ml, hòa tan cắn trong
lượng tối thiểu dung dịch MeOH.
- Điều kiện phân lập:
+ Cột sắc ký: YMC Pack ODC - A (250 mm x 10 mm; 5 μm).
+ Detector: PDA.
+ Nhiệt độ cột: 25 ± 0,5oC.
+ Thể tích tiêm: 100 µl.
+ Bước sóng định lượng: 230 nm.
+ Hệ dung môi: ACN : acid phosphoric 0,1%, tỷ lệ 60:40.
Chương trình rửa giải đẳng dòng.
- Cách tiến hành:
+ Tiến hành phân lập acid carnosic bằng phương pháp HPLC điều chế với
điều kiện phân lập trên, dung dịch chuẩn tương tự như mục 2.2.1.1 (b).
+ Phương pháp hứng mẫu: Khi pic chất cần phân lập bắt đầu xuất hiện,
tiến hành hứng dịch theo sự xuất hiện của pic. Gộp dịch của pic chất cần phân
lập lại, cô thu hồi dung môi đến áp suất giảm ta được sản phẩm tinh chế (SPTC)
Công thức tính hiệu suất của quá trình từ Hương thảo tạo ra sản phẩm tinh
chế (SPTC) theo quy trình xây dựng:
mSPTC
HSPTC = m × 100%
Hương thảo

Trong đó:
H : hiệu suất của quá trình từ Hương thảo tạo ra sản
phẩm tinh chế acid carnosic (%).

31
 mSPTC : khối lượng SPTC thu được (g).
mHương thảo : khối lượng Hương thảo sử dụng (g).
2.2.2. Bước đầu đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của chất đối chiếu
acid carnosic
2.2.2.1. Tính chất
Tính chất của sản phẩm tinh chế được quan sát bằng mắt thường dưới ánh
sáng ban ngày. Tính chất cảm quan phải phù hợp với nhận dạng của các tài liệu
đã công bố.
2.2.2.2. Định tính
- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
+ Tiến hành sắc ký lớp mỏng dung dịch thử song song với dung dịch
chuẩn trên cùng một bản mỏng. Trên sắc ký đồ, dung dịch thử phải có vết cùng
màu và cùng giá trị Rf với dung dịch chuẩn.
- Định tính bằng dữ liệu phổ
+ Sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D- NMR) : 1H-NMR,
13
C-NMR.
+ So sánh với phổ của mẫu chuẩn ghi song song cùng điều kiện hoặc với
phổ đối chiếu trong các dữ liệu thu được từ thực nghiệm và các dữ liệu đã công
bố.
2.2.2.3. Định lượng acid carnosic tinh chế được bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
Tiến hành định lượng bằng phương pháp HPLC với điều kiện phân tích và
dung dịch chuẩn như ở mục 2.2.1.1 (b).
- Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 5 mg SPTC vào bình
định mức 5ml, hòa tan và bổ sung vừa đủ đến vạch bằng MeOH. Sau đó, pha

32
loãng bằng MeOH thành dung dịch có nồng độ khoảng 200 μg/ml. Tiến hành
định lượng bằng hệ thống HPLC.
- Công thức tính hàm lượng hợp chất chính trong SPTC:
( S−b ) × V × n ×100
HL (%) =
a × m×1000

Trong đó:
a: Hệ số góc của đường chuẩn.
b: Hệ số chắn của đường chuẩn.
V: Thể tích dung dịch hòa tan SPTC (ml).
n: Hệ số pha loãng.
m: Khối lượng SPTC dùng pha dung dịch thử (mg).
HL: Hàm lượng acid carnosic tính theo phần trăm (%).
S: Diện tích pic của mẫu thử (µV*s).
2.2.2.5. Xác định tạp chất liên quan
- Phương pháp: Sử dụng HPLC để xác định cụ thể số lượng tạp chất và
tính gần đúng tỷ lệ tạp chất dựa trên tỉ lệ phần trăm diện tích pic.
- Tiến hành:
+ Điều kiện sắc ký như mục định lượng, thời gian chạy sắc ký phải gấp 2
đến gấp 3 lần thời lưu của pic chính thu được trong SKĐ của mẫu thử.
+ Tiêm vào hệ thống sắc ký lần lượt các dung dịch: mẫu trắng, mẫu thử.
- Công thức tính hàm lượng tạp chất gần đúng theo tỷ lệ diện tích pic khi
áp dụng phương pháp HPLC:
S tạp
Ctạp % = × 100
∑ S pic
Trong đó: Ctạp %: tỉ lệ phần trăm tạp chất trong mẫu phân tích.
Stạp : diện tích pic tạp chất (µV*s).

33
 ∑Spic : tổng diện tích pic (µV*s).

2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ SỐ LIỆU

Các số liệu được xử lý bằng thuật toán thống kê và phần mềm Microsoft
Excel 2016.

2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền – Viện Đào tạo Dược, Học viện
Quân Y.
Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Viện nghiên cứu y dược học quân sự – Học viện Quân Y.

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT, PHÂN
LẬP VÀ TINH CHẾ ACID CARNOSIC TỪ DƯỢC LIỆU HƯƠNG THẢO
3.1.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng acid carnosic từ
dược liệu Hương thảo
3.1.1.1. Kết quả xác định hàm ẩm của dược liệu Hương thảo
Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định hàm ẩm dược liệu Hương thảo
Khối lượng
STT Hàm ẩm (%)
(g)
1 3,012 6,09
2 3,008 6,08
3 3,005 6,04

34
 X ± SD 6,07 ± 0,03
RSD (%) 0,49

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy rằng hàm ẩm của dược liệu Hương thảo là
6,07 ± 0,03 %.
3.1.1.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng acid carnosic từ
dược liệu Hương thảo
Chuẩn AC có độ tinh khiết 98%, trong quá trình cân, khối lượng mẫu
chuẩn đã cân là 0,0051g. Kết quả thu được như sau:
- Tính tương thích hệ thống
Kết quả xác định tính tương thích hệ thống được thể hiện ở bảng 3.2.

35
 Bảng 3.2. Kết quả xác định tính tương thích của hệ thống HPLC
N Diện tích Thời Số Hệ
M
ồng độ pic gian lưu đĩa lý số bất
ẫu
(µg/m) (µV*s) (phút) thuyết đối xứng
1
1 2412450 11,002 2814 1,05
99,92
1
2 2391087 11,340 2834 1,06
99,92
1
3 2392042 11,570 2876 1,07
99,92
1
4 2412078 11,105 2809 1,04
99,92
1
5 2432486 11,019 2840 1,09
99,92
1
6 2433441 11,273 2823 1,07
99,92
2412264± 11,218 2832 1,06
X́ ± SD
16905,91 ±0,201 ±22,12 ±0,02

RSD (%) 0,771 1,79 0,78 1,57

- Nhận xét: Kết quả bảng 3.2 cho thấy các thông số về diện tích pic, thời
gian lưu cũng như số đĩa lý thuyết đều đạt như yêu cầu đề ra. Như vậy, hệ thống
sắc ký là phù hợp với mẫu phân tích.
- Khoảng tuyến tính
Bảng 3.3. Sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ acid carnosic
ST Diện tích pic
Nồng độ chuẩn AC (µg/ml)
T (µV*s)

36
 1 39,98 173442
2 49,8 344567
3 99,96 958656
4 199,92 2412264
5 249,9 3090763

- Kết quả bảng trên được minh họa rõ hơn dưới dạng đồ thị ở hình 3.1

3500000

3000000 f(x) = 13897.4191747437 x − 382208.588570108

R² = 0.999457934959817
Diện tích pic (µV*s)

2500000

2000000

1500000

1000000

500000

0
0 50 100 150
Nồng độ (µg/ml)200 250 300

Hình 3.1: Tương quan giữa diện tích pic và nồng độ acid carnosic
Trong khoảng nồng độ khảo sát (39,98 – 249,9 µg/ml) có sự phụ thuộc
tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích. Phương trình
hồi quy là y = 13897x – 382209 với hệ số tương quan R 2 = 0,9995. Như vậy,
đường chuẩn đã xây dựng đáp ứng các yêu cầu của phương pháp phân tích định
lượng bằng HPLC.

37
 3.1.2. Kết quả xây dựng phương pháp chiết xuất acid carnosic từ
Hương thảo
3.1.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết xuất
+ Tiến hành khảo sát các loại dung môi gồm: EtOH 50%, 75% và 96%
cùng với các thông số lựa chọn như sau: phương pháp chiết siêu âm, tỷ lệ dung
môi/dược liệu 15/1, chiết 2 lần với thời gian chiết là 40 phút/lần. Kết quả khảo
sát được trình bày ở bảng 3.4.

38
 Bảng 3.4. Bảng khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết xuất
M Hiệu suất chiết acid carnosic từ dược liệu Hương thảo (%)
ẫu EtOH 50% EtOH 75% EtOH 96%
Sp H Sp H Spi H
ic ic (%) c (%)
(µV*s) (%) (µV*s) (µV*s)

1 84 1 97 2,07 211 3,82

2586 ,88 3246 3276
2 83 1 99 2,18 211 3,87
4774 ,76 6425 7521
3 85 1 96 2,12 212 3,94
9231 ,92 1357 4783
X - 1 - 2,12 - 3,88
± ,85 ±0,04 ±0,05
SD ±0,07

R - 0 - 0,02 - 0,01
SD ,04
(%)

Từ kết quả của bảng 3.4 cho thấy: Khi sử dụng EtOH 50% là dung môi
chiết xuất thì hiệu suất chiết đạt được là khá thấp (1,85%). Tiến hành thay đổi
dung môi từ nước thành EtOH 75% - EtOH 96% thì hiệu suất chiết tăng đáng kể.
Hiệu suất chiết là khác nhau ở mỗi nồng độ ethanol khác nhau, hiệu suất đạt cao
nhất khi chiết bằng EtOH 96% với giá trị là 3,88 %. Vì vậy, EtOH 96% được lựa
chọn là dung môi chiết xuất cho các khảo sát tiếp theo.

39
 3.1.2.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chiết xuất
Dựa trên kết quả của quá trình khảo sát dung môi chiết xuất, nhận thấy
rằng EtOH 96% là dung môi chiết tốt nhất. Cố định dung môi chiết xuất là EtOH
96%, tiến hành khảo sát hai phương pháp là phương pháp chiết siêu âm và
phương pháp chiết hồi lưu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất
Mẫ Hiệu suất chiết acid carnosic từ dược liệu Hương thảo
u (%)
Phương pháp siêu âm Phương pháp hồi lưu
Spic H (%) Spic H (%)
(µV*s) (µV*s)

1 211327 3,82 286885 4,97

6 6
2 211752 3,87 286879 4,80
1 0
3 212478 3,94 286887 4,72
3 0
X ± SD - 3,88±0,0 - 4,83±0,1
5 1
RS - 0,01 - 0,03
D

Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, khi sử dụng 2 phương pháp
chiết là chiết siêu âm và chiết hồi lưu thì hiệu suất chiết thu được là khác
nhau.Trong đó, chiết hồi lưu là phương pháp cho hiệu suất chiết cao hơn với giá
trị 4,83%. Ngoài ra, chiết hồi lưu là phương pháp ngày nay được sử dụng nhiều

40
trong nghiên cứu và chiết xuất dược liệu do có nhiều ưu điểm vượt trội. Do đó,
lựa chọn chiết hồi lưu là phương pháp để tiến hành những khảo sát tiếp theo.
 Từ kết quả khảo sát, tiếp tục nâng quy mô khối lượng dược liệu lên
100g, quy trình chiết acid carnosic từ dược liệu Hương thảo được xác định như
sau:
- Sơ đồ quy trình:

41
 Hình 3.2. Sơ đồ quy trình chiết xuất acid carnosic từ dược liệu Hương
thảo

- Cách tiến hành:

+ Chuẩn bị nguyên liệu: Hương thảo được sấy ở 70℃ đến khi có hàm ẩm
< 10%. Nghiền nguyên liệu bằng thiết bị nghiền dược liệu. Sấy tiếp bột dược liệu
ở 70℃ trong 1h. Bột nguyên liệu sau khi sấy được đo hàm ẩm bằng máy đo hàm
ẩm và được đóng trong túi PE kín, 2 lớp. Bảo quản nguyên liệu ở nhiệt độ phòng
đến khi sử dụng.
+ Kiểm tra hệ thống chiết xuất và cô cao: máy hồi lưu (Mỹ) và bộ cất quay
Buchi (Thụy Sĩ) phải được kiểm tra và đánh giá tình trạng hoạt động trước khi
tiến hành, phải đảm bảo sạch và không còn dư phẩm.
+ Chiết xuất:
 Cân khoảng 100 g bột dược liệu Hương thảo, cho vào bình cầu dung
tích 1 lít.
 Đong 500 ml ethanol 96% vào ống đong.

 Làm ẩm bột dược liệu bằng một lượng ethanol 96% vừa đủ.

 Cho phần Ethanol 96% còn lại vào bột dược liệu.

 Tiến hành chiết hồi lưu trong thời gian 40 phút, số lần chiết 3 lần.

 Lọc dịch chiết: Gộp dịch chiết từ 3 lần chiết xuất, lọc qua phễu lọc
hút chân không để thu phần dịch trong.
- Tiến hành cô thành cắn đến khối lượng không đổi để phục vụ cho quá
trình chạy HPLC điều chế.

42
 3.1.3. Kết quả xây dựng phương pháp phân lập, tinh chế acid carnosic
từ dược liệu Hương thảo
- Từ 100g dược liệu Hương thảo, bằng phương pháp chiết hồi lưu 3 lần
với EtOH 96%, ta thu được 2,8 g cắn.
- Hòa tan 1g cắn (tương đương 37,71 g Hương thảo) trong lượng tối thiểu
MeOH, lọc sơ qua giấy lọc để tránh tính trạng tắc cặn. Rồi tiếp tục lấy dịch, lọc
qua màng lọc 0,45μm cho vào vial để sử dụng cho quy trình HPLC điều chế.
- Sử dụng phương pháp HPLC điều chế theo quy trình ở mục 2.2.1.3.
Hứng phân đoạn được xác định là acid carnosic. Cô thu hồi dung môi đến khô
hoàn toàn thu được 27,9 mg SPTC.
- Hiệu suất điều chế của quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế theo quy
trình xây dựng:
mSPTC 0,0279
HSPTC = m × 100 = 1
×100 = 2,79%
cắn

- Hiệu suất của quá trình tinh chế acid carnosic từ dược liệu Hương thảo:
m SPTC 0,0279
HSPTC= m × 100 = 35,71 × 100 = 0,0781%
dl

3.2. KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT
LƯỢNG CỦA CHẤT ĐỐI CHIẾU ACID CARNOSIC
3.2.1. Tính chất
Quan sát sản phẩm tinh chế: acid carnosic là chất rắn dạng bột màu vàng
nhạt, phù hợp với nhận dạng của các tài liệu đã công bố.
3.2.2. Định tính
3.2.2.1. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Khảo sát bằng hệ dung môi DCM / MeOH (10 / 1, v/v)

43
 C T C T

UV 354 nm UV 254 nm
Hình 3.3. Sắc ký đồ TLC SPTC với hệ DCM / MeOH (10/1, v/v)
Nhận xét: SPTC chỉ có một vết, có màu và giá trị R f = 0,58 trùng với mẫu
chuẩn. Vì vậy, trong SPTC có chứa acid carnosic.
3.2.2.2. Định tính bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều

44
 Phổ 1H-NMR của hợp chất tinh chế được cho thấy sự xuất hiện tín hiệu
proton của …… ????

Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất tinh chế được

45
 Phổ 13C-NMR của hợp chất tinh chế được thấy có sự xuất hiện tín hiệu của
…..

Hình 3.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất tinh chế được

46
 Bảng 3.6. Dữ liệu phổ 1H- NMR và 13C- NMR của hợp chất tinh chế
được
V δC * δCa,b δHa,c
ị trí

So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất tinh chế được với tài liệu đã công
bố về hợp chất acid carnosic, thấy sự tương ứng giữa các vị trí (bảng 3.6) và
hoàn toàn phù hợp.
Từ những dữ liệu trên, có thể khẳng định hợp chất tinh chế được chính là
acid carnosic, có công thức phân tử C20H28O4 và cấu trúc hóa học như hình
3.6.

47
 Hình 3.6. Cấu trúc hóa học của acid carnosic
3.2.3. Định lượng
- Định lượng:

Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu trắng

48
 Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu acid carnosic chuẩn

Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu acid carnosic tinh chế được

Kết quả xác định hàm lượng acid carnosic được thể hiện ở bảng 3.7.

49
 Bảng 3.7. Kết quả xác định hàm lượng acid carnosic trong SPTC

mthử (mg) Sthử (μV*s) Hàm

lượng (%)
5,2 2402257 96,32
5,3 2429270 95,43
5,1 2400270 98,15
X ± SD 96,63 ±
1,13
RSD (%) 0,01

Nhận xét: Hàm lượng acid carnosic trong sản phẩm tinh chế đạt 96,63±
1,13%, đáp ứng được yêu cầu đặt ra của việc chiết xuất, phân lập, tinh chế một
chất đặc trưng từ dược liệu làm chất đối chiếu có hàm lượng tối thiểu đạt 95,0%.
3.2.4. Tạp chất liên quan
Kết quả phân tích tạp chất trong SPTC được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.8. Kết quả phân tích tạp chất trong SPTC

Mẫ Stạp(µV*s) ∑Spic % tạp

u thử tR = 19,104 phút chuẩn
(µV*s)

1 42528 241226 1,763

8

2 43361 241225 1,839

4

3 39898 241227 1,654

50
 2

X ± SD 1,752±
0,09

RSD (%) 5,31

Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu trắng

51
 Hình 3.11. Sắc ký đồ mẫu thử

Bảng 3.9. Tóm tắt các chỉ tiêu và phương pháp thử của chất đối chiếu
Chỉ tiêu chất Yêu cầu Phương pháp thử
lượng
1. Tính chất Phải phù hợp với nhận dạng Quan sát bằng mắt thường
của các tài liệu đã công bố. dưới ánh sáng ban ngày.
2. Định tính

Sắc ký lớp mỏng Phải có màu và Rf trùng với Sắc ký lớp mỏng.
dung dịch chuẩn.
Phổ cộng hưởng Phải giống mẫu chuẩn hoặc Đo phổ NMR: 1H- NMR,
từ hạt nhân- phù hợp với phổ đối chiếu. 13C- NMR, so sánh với
NMR phổ chuẩn đã thiết lập.
3. Định lượng Không được ít hơn 95,0%. Phương pháp HPLC.

4. Tạp chất liên Không được vượt quá 5%, Phương pháp HPLC.
quan loại những pic có tỷ lệ diện
tích dưới 0,05%.

52
 KẾT LUẬN
Sau thời gian tiến hành làm thực nghiệm, đề tài đã hoàn thành được hai
mục tiêu đề ra và rút ra được một số kết luận sau:
1. Xây dựng được phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế acid
carnosic từ dược liệu Hương thảo.
100g Hương thảo được chiết xuất bằng phương pháp chiết hồi lưu bằng
EtOH 96% thu được 2,8 g cắn. Acid carnosic được phân lập từ 1g cắn bằng
phương pháp HPLC điều chế, tinh chế với hệ dung môi rửa giải ACN : acid
phosphoric 0,1% (60:40) thu được 27,9 mg SPTC. Hiệu suất của quá trình từ
dược liệu Hương thảo tạo ra sản phẩm tinh chế (SPTC) theo quy trình xây dựng
là 0,0781%.
2. Bước đầu đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của chất đối
chiếu acid carnosic.
Bao gồm 5 chỉ tiêu:
- Tính chất: chất rắn dạng bột màu vàng nhạt.
- Định tính: bằng sắc ký lớp mỏng so sánh với mẫu chuẩn, bằng phổ cộng
hưởng từ hạt nhân một chiều kết hợp đối chiếu tài liệu tham khảo.
- Định lượng: Bằng HPLC. Kết quả hàm lượng acid carnosic tinh chế
được là 96,63± 1,13%
- Tạp chất liên quan: Bằng HPLC. Kết quả % tạp trong SPTC là 1,752%.

53
 KIẾN NGHỊ
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên những kết quả nghiên cứu trên
mới chỉ đóng góp một phần nhỏ vào công trình nghiên cứu. Vì vậy, em xin đưa
ra đề xuất:
Tiếp tục nghiên cứu thiết lập tiêu chuẩn chất đối chiếu acid carnosic theo
đúng hướng dẫn của ASEAN, WHO về thiết lập, phân phối và bảo quản chất đối
chiếu.

54
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Sotgia F., Martinez-Outschoorn U E and Lisanti M P (2011)
Mitochondrial oxidative stress drives tumor progression and metastasis:
should we use antioxidants as a key component of cancer treatment and
prevention? BMC medicine 9 (1): 1-5
2. Tuệ Tĩnh Thiền sư Tuyển tập 3033 cây thuốc đông y (xuất bản lần thứ 2)
1362
3. Đỗ Tât Lợi (2003) Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam (xuất bản lần
thứ 8) NXB y học, 648-649
4. Gui-hua L (2011) Determination of Ursolic Acid and Oleanolic Acid in
Rosmarinus officinalis by RPHPLC-PAD. Food Sci 32 (12): 243-245
5. Cantrell C L., Richheimer S L., Nicholas G M, et al. (2005) s eco-
Hinokiol, a New Abietane Diterpenoid from Rosmarinus officinalis.
Journal of natural products 68 (1): 98-100
6. Zhang Y., Smuts J P., Dodbiba E, et al. (2012) Degradation study of
carnosic acid, carnosol, rosmarinic acid, and rosemary extract
(Rosmarinus officinalis L.) assessed using HPLC. Journal of agricultural
and food chemistry 60 (36): 9305-9314
7. Nakatani N and Inatani R (1983) A new diterpene lactone, rosmadial, from
Rosemary (Rosmarinus officinalis L.). Agricultural and Biological
Chemistry 47 (2): 353-358
8. Munné-Bosch S., Alegre L and Schwarz K (2000) The formation of
phenolic diterpenes in Rosmarinus officinalis L. under Mediterranean
climate. European Food Research and Technology 210 (4): 263-267
9. Bai N., He K., Roller M, et al. (2010) Flavonoids and phenolic compounds
from Rosmarinus officinalis. Journal of agricultural and food chemistry
58 (9): 5363-5367
10. Begum A., Sandhya S., Vinod K R, et al. (2013) An in-depth review on
the medicinal flora Rosmarinus officinalis (Lamiaceae). Acta scientiarum
polonorum Technologia alimentaria 12 (1): 61-74
11. Erkan N., Ayranci G and Ayranci E (2008) Antioxidant activities of
rosemary (Rosmarinus Officinalis L.) extract, blackseed (Nigella sativa L.)
essential oil, carnosic acid, rosmarinic acid and sesamol. Food chemistry
110 (1): 76-82
12. Vicente G., Molina S., González-Vallinas M, et al. (2013) Supercritical
rosemary extracts, their antioxidant activity and effect on hepatic tumor
progression. The Journal of Supercritical Fluids 79: 101-108
13. Rahbardar M G and Hosseinzadeh H (2020) Therapeutic effects of
rosemary (Rosmarinus officinalis L.) and its active constituents on
nervous system disorders. Iranian Journal of Basic Medical Sciences 23
(9): 1100
14. da Rosa J S., Facchin B M., Bastos J, et al. (2013) Systemic administration
of Rosmarinus officinalis attenuates the inflammatory response induced by
carrageenan in the mouse model of pleurisy. Planta medica 79 (17): 1605-
1614
15. Tawfeeq A A., Mahdi M F., Abaas I S, et al. (2018) Isolation,
quantification, and identification of rosmarinic acid, gas chromatography-
mass spectrometry analysis of essential oil, cytotoxic effect, and
antimicrobial investigation of rosmarinus officinalis leaves. Asian J
Pharm Clin Res 11 (6): 126-132
16. Tavassoli S., Mousavi S., Emam-Djomeh Z, et al. (2011) Comparative
study of the antimicrobial activity of Rosmarinus officinalis L. essential
oil and methanolic extract. Middle-East Journal of Scientific Research 9
(4): 467-471
17. Yesil-Celiktas O., Sevimli C., Bedir E, et al. (2010) Inhibitory effects of
rosemary extracts, carnosic acid and rosmarinic acid on the growth of
various human cancer cell lines. Plant foods for human nutrition 65 (2):
158-163
18. Moore J., Megaly M., MacNeil A J, et al. (2016) Rosemary extract
reduces Akt/mTOR/p70S6K activation and inhibits proliferation and
survival of A549 human lung cancer cells. Biomedicine &
Pharmacotherapy 83: 725-732
19. Bao T-Q., Li Y., Qu C, et al. (2020) Antidiabetic effects and mechanisms
of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) and its phenolic components. The
American Journal of Chinese Medicine 48 (06): 1353-1368
20. Machado D G., Bettio L E., Cunha M P, et al. (2009) Antidepressant-like
effect of the extract of Rosmarinus officinalis in mice: involvement of the
monoaminergic system. Progress in Neuro-Psychopharmacology and
Biological Psychiatry 33 (4): 642-650
21. Cháfer A., Fornari T., Berna A, et al. (2005) Solubility of solid carnosic
acid in supercritical CO2 with ethanol as a co-solvent. The Journal of
supercritical fluids 34 (3): 323-329
22. Pisoschi A M., Pop A., Cimpeanu C, et al. (2016) Antioxidant capacity
determination in plants and plant-derived products: A review. Oxidative
medicine and cellular longevity 2016: 200
23. Garbarino J A., Troncoso N., Delpiano P, et al. (2006) Antioxidant activity
analysis for the selection of Rosmarinus officinalis L. Natural Product
Communications 1 (12): 300-315
24. Masuda T., Inaba Y and Takeda Y (2001) Antioxidant mechanism of
carnosic acid: structural identification of two oxidation products. Journal
of Agricultural and Food Chemistry 49 (11): 5560-5565
25. Pavić V., Jakovljević M., Molnar M, et al. (2019) Extraction of carnosic
acid and carnosol from sage (Salvia officinalis L.) leaves by supercritical
fluid extraction and their antioxidant and antibacterial activity. Plants 8
(1): 16
26. Myali A A H A., Hassoon A S., Hussain M H, et al. (2020) Reversed
phase liquid chromatographic-ultra violet detection and evaluation of
phenolic antioxidants in fresh rosemary leaves and determination of
antibacterial activity of extract. Journal 2290 (2): 200-232
27. Xia G., Wang X., Sun H, et al. (2017) Carnosic acid (CA) attenuates
collagen-induced arthritis in db/db mice via inflammation suppression by
regulating ROS-dependent p38 pathway. Free Radical Biology and
Medicine 108: 418-432
28. Liu M., Zhou X., Zhou L, et al. (2018) Carnosic acid inhibits
inflammation response and joint destruction on osteoclasts, fibroblast‐like
synoviocytes, and collagen‐induced arthritis rats. Journal of cellular
physiology 233 (8): 6291-6303
29. Barni M., Carlini M., Cafferata E, et al. (2012) Carnosic acid inhibits the
proliferation and migration capacity of human colorectal cancer cells.
Oncology reports 27 (4): 1041-1048
30. Jiang S., Qiu Y., Wang Z, et al. (2021) Carnosic Acid Induces
Antiproliferation and Anti-Metastatic Property of Esophageal Cancer Cells
via MAPK Signaling Pathways. Journal of Oncology 2021: 150
31. de Oliveira M R (2018) Carnosic acid as a promising agent in protecting
mitochondria of brain cells. Molecular neurobiology 55 (8): 6687-6699
32. Offord E A., Gautier J-C., Avanti O, et al. (2002) Photoprotective
potential of lycopene, β-carotene, vitamin E, vitamin C and carnosic acid
in UVA-irradiated human skin fibroblasts. Free Radical Biology and
Medicine 32 (12): 1293-1303
33. Aruoma O., Halliwell B., Aeschbach R, et al. (1992) Antioxidant and pro-
oxidant properties of active rosemary constituents: carnosol and carnosic
acid. Xenobiotica 22 (2): 257-268
34. Aoyagi Y., Takahashi Y., Satake Y, et al. (2006) Cytotoxicity of abietane
diterpenoids from Perovskia abrotanoides and of their semisynthetic
analogues. Bioorganic & medicinal chemistry 14 (15): 5285-5291
35. Hadad N and Levy R (2012) The synergistic anti-inflammatory effects of
lycopene, lutein, β-carotene, and carnosic acid combinations via redox-
based inhibition of NF-κB signaling. Free Radical Biology and Medicine
53 (7): 1381-1391
36. Dickmann L J., VandenBrink B M and Lin Y S (2012) In vitro
hepatotoxicity and cytochrome P450 induction and inhibition
characteristics of carnosic acid, a dietary supplement with antiadipogenic
properties. Drug Metabolism and Disposition 40 (7): 1263-1267
37. Calabrese V., Scapagnini G., Catalano C, et al. (2000) Biochemical studies
of a natural antioxidant isolated from rosemary and its application in
cosmetic dermatology. International journal of tissue reactions 22 (1): 5-
13
38. Bernardes W A., Lucarini R., Tozatti M G, et al. (2010) Antimicrobial
activity of Rosmarinus officinalis against oral pathogens: relevance of
carnosic acid and carnosol. Chemistry & biodiversity 7 (7): 1835-1840
39. Jeong E., Jang H., Kim S, et al. (2015) Protective effect of eupatilin
against renal ischemia-reperfusion injury in mice. Journal 47 (Issue): 757-
762
40. Kim H (2019) Globalization and regulatory change: The interplay of laws
and technologies in E-commerce in Southeast Asia. Computer Law &
Security Review 35 (5): 105315
41. Klabbers J (2022) An introduction to international organizations law
Cambridge University Press,
42. Oketch-Rabah H A., Roe A L., Rider C V, et al. (2020) United States
Pharmacopeia (USP) comprehensive review of the hepatotoxicity of green
tea extracts. Toxicology Reports 7: 386-402
43. Bộ y tế (2018) Dược điển Việt Nam V Nhà xuất bản y học 1354-1355
44. Okamura N., Fujimoto Y., Kuwabara S, et al. (1994) High-performance
liquid chromatographic determination of carnosic acid and carnosol in
Rosmarinus officinalis and Salvia officinalis. Journal of Chromatography
A 679 (2): 381-386
 PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1. PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC
PHỤ LỤC 2. HÌNH ẢNH CỦA PHỔ ACID CARNOSIC TINH CHẾ
ĐƯỢC