Machine Translated by Google

Xác định và Định lượng các tạp chất trong Methotrexate

DULAL C. CHATTERJI, ALTICE G. FRAZIER và JOSEPH F. GALLELLIX

Nhận ngày 4 tháng 5 năm 1977, từ Khoa Dược, Trung tâm Lâm sàng, Viện Y tế Quốc gia , Rethesda, MD 20014. để xuất bản ngày 15 tháng 8 năm 1977. Đã được chấp nhận

Trừ khi có quy định khác, tất cả các giá trị độ hấp thụ được báo cáo đều được
Tóm tắt 0 Các tạp chất trong các mẫu methotrexat số lượng lớn, thương mại và
xác định trong dung dịch đệm amoniac-amoni bicacbonat pH 8,3.
khảo sát được phân tách sắc ký bằng phương pháp rửa giải gradient từ cột
Các nghiên cứu tương tự để xác định và định lượng các tạp chất đã được thực
dietylaminoetylcellulose. Bên cạnh các tạp chất đã biết trong các mẫu thương mại
hiện bằng cách sử dụng methotrexate tiêm4 có bán trên thị trường và methotrexat "để
và số lượng lớn, hai tạp chất khác là 4-amino-N10-methylpteroyl-N-methylg1utamine
sử dụng cho mục đích nghiên cứu", tiêm điện tử5.
và 2,4-di amino-N1O-methylpteramide, đã được xác định. Một lô metho trexate mới,
được tổng hợp cho Viện Ung thư Quốc gia chỉ để sử dụng trong nghiên cứu, cho
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
thấy một phổ tạp chất khác nhau. Độ tinh khiết của tất cả các mẫu methotrexate
được nghiên cứu là khoảng 86% được tính trên cơ sở khan.
Sự phân tách sắc ký của chất đối chiếu methotrexate USP được trình bày trong
Hình 1; độ truyền phần trăm được vẽ biểu đồ dựa trên thể tích của đệm amoniac-
amoni bicacbonat.

Cụm từ khóa 0 Methotrexate - phân tích sắc ký, UV, NMR, và phân tích khối phổ của Bên cạnh đỉnh chính (met, hotrexate), độ truyền qua của sáu đỉnh khác được minh

các tạp chất trong các công thức khác nhau Độ tinh khiết - trong các công thức họa.
khác nhau của methotrexate, phân tách sắc ký, CJV, NMR và phân tích khối phổ 0 Xác định các tạp chất trong Methotrexate USP-Đỉnh VII Phổ UV của tạp chất

Chất chống nhựa - methotrexate, Phân tách sắc ký , UV, NMR và phân tích khối phổ chính, đỉnh VII, giống với phổ UV của một mẫu axit N'o-metbylpteroylglutamic đích

của các tạp chất trong các công thức khác nhau thực . Thời gian lưu tương đối của pic VII và của một mẫu axit N'O-meth
ylpteroylglutamic xác thực cũng được phát hiện là giống hệt nhau trong hệ thống
sắc ký lỏng cao áp đã được báo cáo trước đây (6). Danh tính của tạp chất đã được
báo cáo trước đây (1,2).
Giống như nhiều pteridin đa thế khác, khó điều chế
meto trexat tinh khiết. Mặc dù methotrexate đã được sử Đỉnh IV-Đỉnh IV được xác định là 2,4-diamin0-N ~~ -methylpteroic

dụng như một chất đối kháng axit folic trong một thời gian axit bằng cách so sánh phổ UV của nó với phổ của một mẫu xác thực. Tong et al. (1).

dài và một số báo cáo đã thảo luận về việc phát hiện các
tạp chất của nó (1, a), chi tiết về định lượng và xác định Đỉnh III-Danh tính của đỉnh I11 chưa được báo cáo. Phổ UV của hợp chất giống
các tạp chất im chưa xuất hiện. Gần đây, việc sử dụng liều hệt với quang phổ của meth otrexate và gợi ý rằng nhóm mang màu chính, gốc 2,4-

lượng 10-20 g methotrexate để điều trị một số bệnh ung diamino N'o-methylpteroyl, vẫn còn nguyên vẹn. Khối phổ của đỉnh 111 chỉ ra trọng
lượng phân tử là 449 (metotrexat, 454) và cho thấy các đỉnh ở m / e 449 (nhỏ),
thư nhất định (3) đã thu hút sự quan tâm mới đến chủ đề
308 (nhỏ), 275,175 (đỉnh cơ bản), 141,134 và 84. Đỉnh ở 449 được quy đến đỉnh
này vì có thể sử dụng một lượng đáng kể tạp chất. Vì một
ion phân tử. Đỉnh ở 175 được quy cho nhóm 2,4-diamino-6-methylpteridine , đỉnh ở
số chất không gây ô nhiễm có thể có hoạt tính dược lý đáng 134 là do nhóm pN-metylaminobenzoyl, và đỉnh ở 308 là do 2,4-diamin0-N ~~ -
kể, một cuộc điều tra có hệ thống để xác định và định methylpteroyl hoặc nhóm R. Sơ đồ I cho thấy cấu trúc có thể có và các phép gán

lượng các tạp chất này đã được thực hiện. cho đỉnh 111. Có vẻ như R (2,4-diamin0-N '~ -methylpteroyl, C ~~ HI ~ N ~ O) có
khối lượng nhóm thế là 141.

THỰC NGHIỆM

Quy trình tách sắc ký-Sắc ký trên cột tliethylaminoethylcellulose như đã mô tả Sự thủy phân đỉnh 111 bằng cách đun sôi với natri hydroxit tạo ra axit glu
trước đây (4,5) được sử dụng như một kỹ thuật tách. Các quy trình chuẩn bị cột tamic, axit này được xác định trên máy phân tích axit amin bằng cách so sánh với
và đệm và theo dõi các pic như đã báo cáo (4,5), ngoại trừ việc sử dụng một các hợp chất đánh dấu. Kết quả cho thấy đoạn (nhóm thế trên R) là một dẫn xuất của

-
gradient tuyến tính của đệm amoniac-amoni bicacbonat 0,01-0,4 M (pH 8,3) làm chất axit glutamic. Vì khối lượng mảnh vỡ là kỳ quặc
rửa giải.

Xác định và Định lượng Tạp chất trong Methotrex ate-Từ 10 đến 25 mg chất đối 175-14-

chiếu methotrexate USP được sắc ký trong mỗi lô. Các ống đỉnh của các phân số
khác nhau, được biểu thị bằng độ truyền phần trăm trên sắc ký đồ, sau đó được
phân tích bằng phép đo quang phổ UV ở các giá trị pH khác nhau. Để xác định rõ
hơn, các phân đoạn tương tự từ một số lần chạy được gộp lại, nhanh chóng làm
bay hơi đến thể tích nhỏ hơn trong thiết bị bay hơi nhanh, và sau đó làm khô
đông lạnh. Các mẫu đông khô sau đó được phân tích bằng NMR và khối phổ. 0 CH3
R
Tôi

.
* *TÔI

Tôi 308 j
275
Phổ NMR 'thu được ở 100 MHz sử dụng oxit deuterium làm dung môi. Phép đo khối
phổ được thực hiện trên máy tính khối phổ khí - lỏng - khối phổ với nhiệt độ
H
nguồn là 290 '.
Điện thế ion hóa của đỉnh 111 là 70 ev, và nhiệt độ của đầu dò là 190 '. Đối với
đỉnh 11, thế ion hóa là 9,2 ev và nhiệt độ đầu dò là 210 '.

Để định lượng, khoảng 20 mg methotrexate USP phụ đối chiếu 3 được cân chính
xác, cho lên cột và lập đồ thị chromato. Các phần khác nhau sau đó được thu khối lượng 141

thập một cách định lượng, đưa đến một thể tích cụ thể, và phân tích bằng phép Sơ đồ I
đo quang phổ UV.

Lô 473-232, đường tiêm natri methotrexate, 50 mg methotrexate / lọ,

1 Máy quang phổ Model XL-100-15 , Varian Associates, Palo Alto, Calif. Phòng thí nghiệm Lederle, Bộ phận của American Cyanamid Co., Pearl River, NY
2 LKB 9000, LKB, Stockholm, Thụy Điển. 5 Lô BV-76-221, Phòng thí nghiệm Ben Venue, Bedford, Ohio, cho Viện Ung thư Quốc gia

3 Lô 1260x8105, Phòng thí nghiệm Lederle, Bộ phận của American Cyanamid Co., dưới dạng methotrexate để tiêm, không chứa chất bảo quản, 1,0 g natri methotrexate / lọ,
Sông Châu Giang, NY để tiêm.

622 I Tạp chí Khoa học Dược phẩm

Machine Translated by Google

" 0 &; CH3

-

-
RN R - C-NH

0 "' "'1 MỘT--

Cn 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
Một
B 2 THỂ TÍCH, ml

79
Hình 1-Sắc ký đồ của chất đối chiếu methotrexat USP từ cột xenlulo
HO
Tôi

TÔI\
bằng phương pháp rửa giải gradient tuyến tính từ 0,01 đến 0,4 M
RN CHCNHCHJ 0
đệm amoniac-amoni bicacbonat, pH 8,3.
RN yH2 COH
phổ của hợp chất (pH 8,3) không cho thấy đỉnh xung quanh 300 nm, cho thấy rằng
Tôi

Nó không có gốc p-aminobenzoyl.

CHjCHPCOH Đỉnh VI cũng không được xác định. Tuy nhiên, quá trình rửa giải chậm từ
cột cel lulose cho thấy rằng hợp chất có thể có nhiều hơn một vị trí anion ở
C CH, CNHCH, pH 8,3. Hình 2 cho thấy phổ UV của các đỉnh I và VI ở pH 8,3.

D Các tạp chất trong Methotrexate Tiêm-Thuốc tiêm methotrexate thương mại4,
khi được sắc ký như mô tả, về cơ bản giống với methotrexate USP về các tạp
chất của nó, ngoại trừ lượng tương đối hơi khác (Bảng I). Các tạp chất chính
CH3 0 là dẫn xuất glutamine (đỉnh III), axit 2,4-diamin0-N ~~ -methylpteroic (đỉnh
IV), và axit Nlo-metylpteroylglutamic (đỉnh VII). Tuy nhiên, tiêm methotrexate "để
sử dụng trong điều tra" có một phổ tạp chất khác nhau (Hình 3 ). Tạp chất duy nhất
chung cho cả USP và methotrexate nghiên cứu dường như là dẫn xuất glutamine (đỉnh
111). Tất cả các tạp chất khác là mới và chưa được xác định (Hình 1 và 3).
Tôi

được đánh số, hai nitrogens và công thức CeH & O :! (khối lượng 141) đã được
chỉ định cho nó. Định lượng tạp chất trong methotrexat-Các tạp chất trong methotrexat được

Hai cấu trúc đã được xem xét. Cấu trúc A, khi thủy phân, sẽ tạo ra axit N- định lượng bằng cách xác định giá trị độ hấp thụ của chúng ở 257 nm đối với

metylglutamic và do đó, khó xảy ra. Cấu trúc B nên tạo ra axit glutamic khi đỉnh IV và ở 302 nm đối với đỉnh 11,111 và VII. Độ hấp thụ phân tử, c, của

thủy phân và có thể chiếm đỉnh nổi bật ở m / e 84 (Sơ đồ I). Hơn nữa, để có axit Nlo-metylpteroylglutamic (đỉnh VII) ở 302 nm giống như của metotrexat ở

được khối lượng 84 từ Cấu trúc A, con đường được chỉ ra trong Sơ đồ I1 sẽ 302 nm ( 24.500 c, dựa trên metotrexat ngậm nước) và được sử dụng để tính
phải được tuân theo, điều này có vẻ khó xảy ra. Tình huống này cung cấp thêm lượng của đỉnh VII trong mẫu. Giá trị độ hấp thụ mol là 21.700 ở bước sóng

hỗ trợ để loại trừ Cấu trúc A. Cấu trúc B có thể là hợp chất gốc hoặc có thể 257 nm đối với đỉnh IV, như đã báo cáo trước đây (7), được sử dụng để tính

là kết quả của sự mất nước và chu kỳ hóa của amit chuỗi mở, C hoặc D, trong toán lượng đỉnh IV trong các mẫu.

quá trình đo khối phổ.

Tạp chất chính khác duy nhất là đỉnh I11 (dẫn xuất glutamine); để tính toán,

Cấu trúc tuần hoàn B đã được loại trừ trên cơ sở sau đây. độ hấp thụ mol của nó ở 302 nm được giả định là giống như của metotrexat ở

1. Phổ NMR của hợp chất không cho thấy các đỉnh mong đợi của metyl imide 302 nm và pH 8,3. Giả thiết được đưa ra vì phổ UV ở pH 8,3 của đỉnh I11 và

như trong B; tức là, không có singlet ba proton ở 6 giờ 4-5 ppm. phổ của metotrexat là giống nhau về mọi mặt và độ hấp thụ mol của một loạt các
nhóm pteroyl được thế (8,9) là rất giống nhau (bao hàm cả N1o- axit

2. Cấu trúc tuần hoàn B sẽ không có bản chất ion và nên rửa giải metylpteroylglutamic , đỉnh VII). Tuy nhiên, do giả định, giá trị phần trăm

gần như với mặt trước của dung môi trong cột trao đổi ion. tạp chất được báo cáo cho đỉnh 111, mặc dù chính xác cho các mục đích so sánh,

3. Sự khác biệt duy nhất giữa phổ NMR của đỉnh I11 và phổ của methotrexate có thể có một số sai số trên cơ sở tuyệt đối. Sử dụng các lập luận tương tự,

là một singlet ở 6 2,6 ppm. Đĩa đơn này tích hợp cho ba proton. Metyl imide độ hấp thụ mol của đỉnh I1 được giả định là giống như độ hấp thụ mol của

(trong B) sẽ có sự chuyển dịch hóa học hơn nhiều. Tuy nhiên, sự chuyển dịch metotrexat ở 302 nm (pH 8,3).

hóa học phù hợp với cấu trúc metyl amit của C hoặc D.

4. Việc rửa giải pic không phải với dung môi, nhưng vẫn còn khá sớm, cho Độ tinh khiết phần trăm của methotrexate trong ba khẩu phần Methotrexate

thấy cấu trúc axit monocacboxylic. được xác định theo phương pháp đã báo cáo trước đây (4). Nói một cách ngắn

Vì vị trí chính xác của nhóm metyl (trong C và D) không được xác nhận, nên gọn, độ tinh khiết phần trăm của metotrexat được tính theo hàm của AJA, trong
đó A, là độ hấp thụ của dung dịch metotrexat trước khi tách nền bằng chro và
đỉnh 111 dự kiến được gọi là "dẫn xuất glutamine" và có cấu trúc C hoặc D.
A, là độ hấp thụ của meto nguyên chất.

Đỉnh 11-Đỉnh I1 có phổ UV rất gần với metotrexat, trong việc phân định sự
hiện diện của nhóm 2,4-diamin0-N ~~ -methylpteroyl . Việc rửa giải rất sớm từ
cột cũng cho thấy hợp chất không phải là ion ở pH 8,3 (pH của dung dịch đệm
rửa giải). Phổ khối lượng của đỉnh I1 (9,2 ev, nhiệt độ đầu dò 210 °) cho m /
e 324 (ion phân tử), 306,175 (đỉnh cơ bản) và 149. Đối với đỉnh 111, khối
lượng 175 được gán cho 2,4- di phần amino-6-methylpteridine. Khối lượng 149
được quy cho nhóm p N-metylaminobenzamit. Đỉnh ở m / e 306 có thể bị ủ rũ do
sự khử nước của amit thành nitril tương ứng ở nhiệt độ cao của đầu dò. Do
đó, đỉnh I1 được gán cấu trúc 2,4-diamino-Nlo-methylpteramide (I).
21 \
\ '\\\

-
0, 0,31 ,

Các đỉnh I và VI-Peak I không được xác định. Tuy nhiên, sự rửa giải gần như a1 0,2 _ Tôi

v-.y \ \
giống hệt nhau với mặt trước của dung môi gợi ý rằng nó không phải là ion. UV

\
Tôi

0,01 tôi Tôi

220 250 Tôi 350 300 Tôi 400

-Nqo ~ oQo-Q 0 khối lượng 84 0
WAVELENGTH, nrn
Hình 2-Bản đồ UV của pic I (-) và VI (- - -), từ sắc ký đồ trong
Sơ đồ II Hình 1, trong dung dịch đệm amoniac-amoni bicacbonat, pH 8,3.

Tập 67, số 5, tháng 5 năm 19781 623

Machine Translated by Google

w methotrexate sẽ chỉ khoảng 2% (tổng số tạp chất là khoảng 8%, và sai số

V
0
z 25% sẽ gây ra sai số tuyệt đối là 8 X 0,25 = 2%).
a Do đó, giả định này, mặc dù không có giá trị tuyệt đối về mặt lý thuyết,
m
a là hợp lý cho các tính toán thực tế và chính xác khi so sánh các mẫu
methotrexat khác nhau nếu các tạp chất và số lượng tương đối của chúng
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
2 THỂ TÍCH, ml
tương tự nhau.
Trình bày trong Bảng I là phần trăm độ tinh khiết so sánh của
Hình 3-Sắc ký đồ của methotrexat khảo sát từ cột cel lulose bằng cách methotrexate và nhận dạng và định lượng các tạp chất của nó trong ba
rửa giải phân huỷ tuyến tính từ 0,01 đến 0,4 M đệm amoniac bicacbonat, chế phẩm khác nhau. Độ tinh khiết phần trăm của methotrexate trong cả
pH 8,3. ba phần tử preara gần như giống nhau. Ngoài ra, thuốc tiêm methotrexate
USP và thuốc tiêm methotrexate thương mại có tạp chất tương tự. Tuy
dung dịch trexat sau khi tách sắc ký. Thủ tục cần giải thích thêm. nhiên, chế phẩm methotrexate nghiên cứu chứa các tạp chất khác nhau,
Phương pháp này ngụ ý rằng độ hấp thụ (trên cơ sở trọng lượng chứ chưa được xác định (Hình 1 và 3). Những tạp chất này cần được điều tra
không phải trên cơ sở phân tử) của các tạp chất giống với độ hấp thụ thêm.
của methotrexat, điều này có thể không hoàn toàn đúng.
Tuy nhiên, như đã đề cập, các tạp chất chính có phổ UV, hệ số tắt và NGƯỜI GIỚI THIỆU
trọng lượng phân tử tương tự nhau. Do đó, giả thiết có lẽ là hợp lệ.
Hơn nữa, ngay cả khi giả định sai số 25% trong giả định tổng thể, sai (1) W. P. Tong, J. Rosenberg, và D. B. Ludlum, Lancet, 2, 719 (1975).
số tuyệt đối trong việc xác định độ tinh khiết của
(2) D. M. Valerino, sđd, 2,1025 (1972).
Bảng I-Phần trăm tinh khiết so sánh của Methotrexate và (3) CB Pratt, D. Roberts, E. C. Shanks, và F. 1. Warmath, Cancer
Sự phấn khích của độ tinh khiết của nó trong ba tiền đề khác nhau Res., 34,3326 (1974).
(4) J. F. Gallelli và G. Yokoyama, J. Pharm. Khoa học, 56,387 (1967).
Nồng độ, %
(5) V. T. Oliverio, Hậu môn. Chem., 33,263 (năm 1961).
Commer- Investi (6) D. C. Chatterji và J. F. Gallelli, J. Pharrn. Khoa học viễn tưởng, 66,
cia1 gational 1219 (1977).
Hợp chất USP tiêm tiêm (7) CC Levy và P. Goldman, J. Biol. Chem., 242,2933 (1967).
(8) D. B. Cosulich và J. M. Smith, J. Am. Chèm. SOC., 70, 1924 (1948).
Methotrexat (cơ sở khan) "(đỉnh V) 86,0 NL0- 86,2 86,7 5,2
Methylpteroylglutamic axit (đỉnh 4,0 -
VII) (9) D. R. Seeger, D. B. Cosulich, J. M. Smith, Jr. và M. D. Hultquist,
2,4-Diamin0-N '~-axit metylpteroic 1,5 2,6 - sđd., 71,1755 (1949).
(oeak Iv) 4-1 4-b; min0-N ~~
-methylpteroyl-N-metyl-
(đỉnh
-. 1,6 111)
111) glutamine (đỉnh glutamine 1,2 -
SỰ NHÌN NHẬN

2,4-Diamin0-N '~ -methylpteramide (đỉnh 0,2 - 0,2 -

Diamin0-N' ~ -methylpteramide (đỉnh 0,5 0,5 2,4- Các tác giả biết ơn Tiến sĩ Henry Fales, Phòng thí nghiệm Hóa học,
11)
1,0 0,5 - Viện Tim, Phổi và Máu Quốc gia, Viện Y tế Quốc gia, vì đã xác định khối
Tạp chất không xác định
lượng và phổ NMR và đã đưa ra lời khuyên hữu ích.
Tất cả các mẫu methotrexat chứa khoảng 5% nước. ments.

Nhiệt động lực học của dung dịch nước của Parabens

K. S. ALEXANDER, B. LAPRADE, J. W. MAUGER và

ANTHONY N. PARUTA "
Nhận <ngày 13 tháng 1 năm 1977, từ Cao đẳng Dược , Đại học Rhode Island, Kingston, RlO2881. 17,1977. Được chấp nhận xuất bản vào tháng 8

Tóm tắt Độ hòa tan của một loạt paraben liên quan được xác định trong
nước ở bốn nhiệt độ. Các paraben được chọn là metyl thông qua n-butyl
p-hydroxybenzoat, và sự thay đổi nhiệt độ là 5O tăng từ 25 đến 40 '.
Những chất hòa tan này là chất bảo quản hữu ích, đặc biệt là sự kết hợp
của các dẫn xuất metyl và propyl este. Mối quan hệ hóa học của các hợp
chất này thay đổi bằng cách bổ sung metylen mạch thẳng liên tiếp vào
phần este của phân tử. Các giá trị nhiệt động lực học thu được đối với
các hệ thống nước này có thể liên quan đến các biến thể phân tử này vì
phần còn lại của phân tử là con stant. Đối với nhiệt động lực học tổng
thể, các hàm năng lượng tự do như lý tưởng, thực tế và dư thừa được
tìm thấy là các hàm trơn, phi tuyến của số nguyên tử cacbon trong phần
alkyl của mệnh
aben este. Mối quan hệ tuyến tính với số nguyên tử cacbon trong phần
este của các este này được tìm thấy với năng lượng tự do dư thừa một phần
của chất tan.
Cụm từ khóa Parabens, khả năng hòa tan khác nhau trong nước ở bốn nhiệt
độ nhiệt độ, các thông số nhiệt động lực học liên quan đến số nguyên tử cacbon
Độ hòa tan-các paraben khác nhau trong nước ở bốn nhiệt độ, các
thông số động nhiệt liên quan đến số nguyên tử cacbon 0 Các thông số
tên nhiệt động liên quan đến độ hòa tan của các paraben khác nhau trong
nước ở bốn nhiệt độ số nguyên tử cacbon

Các thông số nhiệt động lực học liên quan đến hiện tượng soh
tion được xác định bằng cách nghiên cứu sự biến thiên của độ
hòa tan với nhiệt độ.
Mối quan hệ nổi tiếng của nhiệt độ tương hỗ của phần mol
phân tử log độ tan uersus cho phép xác định
sự tạo ra các điểm nóng của dung dịch, AH, và các entropi của
solu tions, AS,, từ các dốc và các điểm tương ứng (1).
Từ sự nung nóng của phản ứng tổng hợp, có thể xác định được
khả năng hòa tan theo phần mol lý tưởng. Từ các đại lượng xuất
phát cơ bản này, cũng có thể tính được hàm trộn và hàm dư thừa.

624 I Tạp chí Khoa học Dược phẩm