Bài 5: Phương pháp sắc ký – sắc ký cột

I/ Cơ sở lí thuyết:
-Sắc ký là quá trình tách các cấu tử của một hỗn hợp dựa vào việc các cấu tử này sẽ phân bố khác
nhau giữa pha tĩnh và pha động. Pha tĩnh có thể là cột nhồi ( sắc lí cột) mà pha động là dung môi
hữu cơ di chuyển ngang qua.
-Sắc ký cột là môt phương pháp phổ biến hiện nay dùng để tách các cấu tử hóa học ra khỏi hỗn
hợp của chúng. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách ra chúng, bao gồm:
o Sự lựa chọn chất hấp phụ
o Sự lựa chọn dung môi giải ly.
o Kích thước cột sắt ký, số lượng chất hấp phụ, lượng mẫu chất được dùng.
o Vận tốc giải ly.
II/ Thực nghiệm:
Điều chế dung dịch sắc tố màu của lá cây:
- Nghiền nát 5g lá đã rửa sạch, cho vào erlen 250ml có chứa 30ml hỗn hợp acetone-petroleum
ether dầu hỏa (tỷ lệ 1 : 1 về thể tích) lắc đều 10 phút (Hình 5.1), rồi lọc qua một becher khác bằng
phễu và giấy lọc. Rửa bã trên phễu bằng 10ml hỗn hợp dung môi hợp acetone-petroleum ether
(Hình 5.2).
-Cho dung dịch sau lọc có chứa sắc tố màu vào phễu chiết (Hình 5.3) và tiến hành rửa dung dịch lọc
này 3 lần với mỗi lần 30ml nước. Tách riêng lớp hữu cơ chứa vào một becher khác và làm khan
bằng Na2SO4 khan sau đó lọc để có dung dịch trong và dựng trong erlen nhỏ có tên “ mẫu sắc tố
màu”. Đun cách thủy erlen “ mẫu sắc tố màu” để dung dịch đậm đặc hơn ( còn khoảng 3ml). Giữ
dung dịch đậm đặt ở nơi mát và có nắp đậy kín để nạp vào đầu cột sắt ký.

Hình 5.1. Hỗn hợp Hình 5.2. Dung dịch Hình 5.3. Dung dịch
Lá cây và dung môi. có chứa sắc tố. trong phễu trước khi
rửa.

Chuẩn bị cột sắc ký:

- Ráp cột: Cột sắc ký là một ống thủy tinh, dùng đũa thủy tinh dài nhòi một lớp bông gòn
dày 1-2mm vào dưới đáy cột (không nhồi cứng sẽ làm chậm quá trình giải ly). Ráp cột
thẳng đứng vào giá nhờ cây kẹp, rồi cho sẵn vào cột 5ml Petroleum eter.
-Cho từ từ Silicagel vào cột đã có sẵn Petroleum eter (phải cho từ từ) để các hạt lắng đều tránh
dính lên cột. Nếu cần có thể gõ nhẹ lên cột để tránh tạo bọt khí sẽ ảnh hưởng đến quá trình giải ly.
Cho từ từ đến khi lớp silicagel đạt 5cm thì dừng lại (quá trình này phải luôn có dung môi đầy cột).
Mở khóa cho dung môi từ từ chảy xuống đến khi cách lớp silicagel 1-2 cm thì dừng lại. Dùng đũa
thủy tinh lót miếng bông gòn lên lớp mặt này, mở khóa cho dung môi từ từ chảy xuống cho đến
khi lớp dung môi cách lớp silicagel khoảng 1mm thì ngừng lại. Để yên chuẩn bị nạp mẫu.

Hình 5.4. Cột sắc

ký sau khi chuẩn bị xong.
Nạp mẫu và giải ly cột sắt ký:
- Dùng ống nhỏ giọt đưa mẫu chất vào đầu cột (nếu mẫu khô thì hòa tan bằng một ít
Petroleum eter), ngưng 2 phút để mẫu có thời gian tạo sự cân bằng với chất hấp phụ và
dung môi giải ly (Hình 5.5) . Tiến hành giải ly bằng cách rót eter dầu hỏa vào cột (rót dung môi
thường xuyên để giải ly và mở khóa cho dung môi chảy ra và hứng vào cốc thủy tinh
hoặc bình tam giác nhỏ (Hình 5.6).

Hình 5.5. Cột sắc ký Hình 5.6. Dung dịch

sau khi nạp mẫu. chứa sắc tố β-caroten sau khi giải ly.

- Sắc tố β-Caroten màu vàng sẽ di chuyển nhanh ra khỏi cột trước tiên và được hứng vào
bình. Sau khi dãy màu vàng ra khỏi cột thì thay hệ eter dầu hỏa bằng hệ ester dầu hỏa -
acetate etyl 7:3 lúc đó dãy màu xanh lục sẽ di chuyển xuống dưới cột và được hứng bằng
cốc thủy tinh khác.
Hình 5.7. Sắc tố β-Caroten - (vàng) và Chlorophyll (xanh)