TLC 1

Podstawowe parametry chromatograficzne

1. Teoria
Wykres, wielkości sygnału z detektora od czasu ich elucji (bądź w przypadku chromatografii
cienkowarstwowej funkcji odległości od startu), nosi nazwę chromatogramu.

Pierwszą informacją możliwą do uzyskania z chromatogramu są czasy retencji poszczególnych

składników mieszaniny. Czas retencji pojedynczego piku odpowiadającemu chromatografowanej
substancji jest równy czasowi który upłynie pomiędzy zadozowaniem substancji a momentem
wykrycia najwyższego stężenia tego składnika na detektorze. Analogicznie, można mówić w tym
przypadku o objętości retencji czyli objętości fazy ruchomej niezbędnej do wyeluowania
chromatografowanego związku do detektora, przy założeniu że przepływ fazy ruchomej odbywał się
ze stałą prędkością objętościową. Standardowo, dwie powyższe wielkości oznacza się odpowiednio
jako tR i VR.

W przypadku chromatografii cienkowarstwowej, wielkością równoważną czasowi lub

objętości retencji nosi angielską nazwę retardation factor, (polska nazwa, współczynnik opóźnienia
nie jest używana w praktyce) i oznacza się ją jako RF. Odpowiada ona stosunkowi dystansu
przebytego przez plamkę chromatografowanej substancji do dystansu pokonanego przez czoło fazy
ruchomej, co przedstawia rys. 1 i wzór 1.

a (1)
R F=
b

Rys. 1. Graficzna prezentacja sposobu obliczania wartości R F.

Należy podkreślić, że niemożliwe jest przeliczanie bezpośrednie współczynników RF na

czasy i objętości retencji i odwrotnie, ze względu na istotne różnice techniczne pomiędzy
chromatografią cienkowarstwową a kolumnową.
 Czas martwy - tD , to czas jaki substancja spędza poza powierzchnią fazy stacjonarnej
kolumny, w objętości martwej chromatografu ( kolumna poza powierzchnią fazy stacjonarnej,
dozownik, kapilara łącząca dozownik z kolumną, kapilara łącząca celę detektor z kolumną i cela
detektora). Objętość martwą wyznaczyć można mierząc czas przepływu substancji
niezatrzymywanej na powierzchni fazy stacjonarnej od momentu zadozowania do momentu
otrzymania maksymalnej wartości sygnału pochodzącego od tej substancji na detektorze.

Zredukowaną objętością retencji VR’ i zredukowanym czasem retencji tR’ nazywa się
objętość (bądź odpowiednio czas) retencji pomniejszoną o objętość martwą (czas martwy):

V R '=V R −V D (2a)

t R '=t R −t D (2b)

Współczynnik retencji k, zwany także współczynnikiem pojemnościowym, opisuje

stosunek ilości substancji na powierzchni fazy stacjonarnej do ilości substancji w fazie ruchomej:

C S ∗V S V
k= =K S (3)
C M ∗V M VM

gdzie:

CS – stężenie chromatografowanej substancji w fazie stacjonarnej,

VS – objętość fazy stacjonarnej,

CM – stężenie chromatografowanego składnika w fazie ruchomej,

VM – objętość fazy ruchomej,

K – stała podziału substancji pomiędzy fazę ruchomą a stacjonarną.

Praktycznie, k jest to stosunek zredukowanej objętości retencji (zredukowanego czasu retencji)

do objętości martwej układu (czasu martwego układu):

V R' tR'
k= = (4)
V D tD
 W przypadku chromatografii cienkowarstwowej, analogiczną wartością do k
jest wielość oznaczana jako RM którą oblicza się w sposób przedstawiony na
rys. 2 i we wzorze 5.

c
R M = =log
a (
1 − RF
RF ) (5)

Rys. 2. Graficzna prezentacja sposobu obliczania wartości R M.

Wartości RM otrzymane za pomocą chromatografii cienkowarstwowej powiązane

są ze współczynnikiem retencji zależnością opisaną wzorem:

R M =log k (6)

Wzajemne położenie dwóch pików na chromatogramie opisuje współczynnik rozdzielenia 

opisany wzorem:

k2
α= (7)
k1

Rozdzielenie dwóch pików w układzie chromatograficznym w sposób ilościowy opisuje

wielkość zwana współczynnikiem separacji pików RS. Jest to stosunek różnicy zredukowanych
czasów retencji (a w przypadku TLC odległości pomiędzy plamkami rozpatrywanych substancji)
dwóch rozpatrywanych pików do sumy połowy szerokości tych pików:

2 ( t R 1 −t R 1 ) Δt R
R s= = (8)
( w 1+ w 2 ) wb

gdzie:

w1 – szerokość piku/plamki eluowanego o krótszym czasie retencji w podstawie,

w2 – szerokość piku eluowanego o dłuższym czasie retencji w podstawie.

Zakładając że obydwa piki są symetryczne i odpowiadają swoim kształtem rozkładowi Gaussa, wzór
opisujący dwa piki rozdzielone w 95% ma postać:

t 'R2− t ' R1
R S= (9)
4σ
gdzie:

s - odchylenie standardowe.

Szczegółową zależność pomiędzy odchyleniem standardowym a procentem wysokości piku

przedstawia rys.3.

Rys. 3. Rozkład Gaussa – zależność szerokości piku od odległości od podstawy.

Jak widać rozdzielenie rzędu 95% daje wartość RS = 1 co stanowi optimum w stosunku do
czasu analizy (w TLC do dystansu rozwinięcia), gdyż przy pełnym rozdzieleniu (6s) czas elucji obydwu
pików byłby dwukrotnie dłuższy.

Zależność wiążąca wielkości a ,RS , k i N przedstawia wyrażenie:

( )( )√ N
1 α −1 k2
R S= 2 (10)
4 α 1+ k 2

gdzie:

N2 – liczba półek teoretycznych obliczona dla później eluowanego składnika mieszaniny.

Nosi ono nazwę wzoru Purnella.

Liczba półek teoretycznych (N), jest to wielkość opisująca względne poszerzenie piku w
kolumnie (na płytce) chromatograficznej. Dla symetrycznego piku gaussowskiego opisuje je
wyrażenie:
 ( )()
2 2
tR tR
N=16 = (11)
w4σ σ

a dla chromatografii cienkowarstwowej wyrażenie :

( )
2
X
N=16 (11a)
w

gdzie:

X – odległość plamki od startu

w – szerokość plamki (standardowo przyjmuje się że widoczna część plamki ma szerokość 4s).

Efektywna liczba półek teoretycznych Nef w odróżnieniu od zwykłej liczby półek, niesie ze
sobą informację na temat rzeczywistej zdolności rozdzielczej układu. Podstawiając do równania 10
wyrażenie 13:

( ) ( t R− tD
)(
t R− tD
)
2
k
N ef = ( N )=16 = (13)
1+k w4 σ σ

otrzymujemy:

R S=
4 ( )√ N
1 α −1
α ef (14)

Analiza powyższego równania pozwala wysnuć wniosek, że gdy współczynnik rozdzielenia

bliski jest jedności, duże zmiany liczby efektywnych półek teoretycznych powodują niewielkie zmiany
wartości RS. Większe wartości s oznaczają znaczne skrócenie czasu potrzebnego do rozdziału w
przypadku chromatografii kolumnowej i pozwalają znacznie skrócić dystans migracji fazy ruchomej w
chromatografii cienkowarstwowej. Przykładowe obliczenia wartości współczynnika rozdzielenia
pików na odległość 4s i 6s (odpowiednio RS = 1 i RS = 1,5 ) przedstawia tab. 1. [60].
Tab. 1 Liczba efektywnych półek teoretycznych potrzebna do rozdzielenia dwóch pików jako funkcja


RS=1 RS=1,5

 Nef  Ne

   

   

   

   

   

Wysokość półki teoretycznej H, która jest parametrem charakteryzującym sprawność układu

chromatograficznego, jest stosunkiem długości złoża sorbentu do liczby półek chromatograficznych.
Dla kolumny obliczamy ją ze wzoru 15 (uwaga, przy obliczeniach proszę uważać, aby długość złoża
podana była w tych samych jednostkach co szerokość piku!):

L
H= (15)
N

gdzie:

L – długość złoża sorbentu .

Natomiast dla chromatografii cienkowarstwowej, po uwzględnieniu zależności 5

i 13 przedstawia się wzorem :

w2
H= (16)
16 X

2. Materiały
a) Płytki TLC SiO2 bez czynnika fluorescencyjnego o wymiarach 5x10cm
b) Barwniki diazowe (roztwory barwników spożywczych w pojemnikach ponumerowanych od 1
do 10)
c) Faza ruchoma: etanol 96%/n-heksan/toluen - 80/15/20 (v/v/v)

3. Aparatura
a) Strzykawka o pojemności 10 μL z płaską końcówką igły
b) Pozioma komora do TLC
c) Wideokamera Camag Reprostar 3 z oprogramowaniem WinCats i VideoScan
4. Wykonanie

a) Nanieść na płytkę SiO2 TLC (bez czynnika fluorescencyjnego) o wymiarach 5cm * 10 cm na

podłożu poliamidowym po 1 μL roztworu każdego z barwników w odległości 1 cm od dłuższej
krawędzi płytki za pomocą mikrostrzykawki i papierowej podkładki do aplikacji ze
znacznikami.
b) Odczekać 5 minut po naniesieniu ostatniej plamki.
c) Rozwinąć płytkę z naniesionymi barwnikami w poziomej nienasyconej komorze
chromatograficznej za pomocą wcześniej podanej fazy ruchomej na dystansie 4 cm i
zaznaczyć ołówkiem linię mety.
d) Wysuszyć, wykonać fotografię cyfrową przy użyciu Camag Reprostar 3 w świetle widzialnym
(oświetlenie z góry).
e) Za pomocą oprogramowania VideoScan wyznaczyć R F dla każdej z chromatografowanych
substancji.
f) Dane przenieść do arkusza kalkulacyjnego.
5. Obliczenia
a) Obliczyć wartości (RM) i współczynników retencji (k)dla każdej z chromatografowanych
substancji.
b) Obliczyć szerokość plamki (w) w milimetrach według wzoru:

w = (RFend –RFstart)*X [mm] (17)

dla każdej substancji, a następnie liczbę półek teoretycznych na metr (N; [m -1] ) oraz
wysokość półki teoretycznej (H; [mm]) odpowiednio według wzorów 11a i 16.
c) Obliczyć współczynnik rozdzielenia () oraz RS dla poszczególnych składników barwników
składających się z więcej niż jednej substancji.

RS = 2(X2-X1)/(w2-w1) (18)

6. Wnioski
a) Plamki których z barwników znajdują się w analitycznym zakresie dystansu migracji
(0,2<RF<0,9)?
b) Dla którego z składników mieszanin układ chromatograficzny ma największą, a dla którego
najmniejszą sprawność?
c) Które barwniki to mieszaniny? Czy użyty układ chromatograficzny nadaje się do ich
analitycznego rozdzielenia? Odpowiedź uzasadnij podając odpowiednie wartości RS