TLC 2

Wpływ właściwości substancji na jej detekcję w chromatografii -

wybrane elementy procedury walidacji metod chromatograficznych
Część teoretyczna – walidacja (według IUPAC)
Walidacja to proces który pozwala na określenie czy dana metoda analityczna będzie
odpowiednia do przeprowadzenia określonych pomiarów, np. do oznaczania ilościowego
substancji w analizowanym preparacie. Według IUPAC, można go podzielić na 4 następujące
po sobie etapy. Tylko zadowalające rezultaty otrzymane w etapie poprzedzającym uprawniają
do przejścia do kolejnego etapu walidacji.

Faza I Sprawdzenie procedury analitycznej pod kątem spełniania w zadowalającym stopniu

następujących kryteriów:

 Specyficzność jest to zdolność do dokładnego pomiaru stężenia analitu w obecności

wszystkich innych składników próbki. Oznacza to, że żaden ze składników matrycy nie
wpływa na wielkość sygnału analitycznego pochodzącego od analitu.
 Precyzja określa stopień wzajemnego podobieństwa szeregu wyników uzyskanych na
skutek wielokrotnego powtórzenia procedury pomiarowej z wykorzystaniem kolejnych porcji
tej samej homogenicznej próbki. Precyzję wyraża się za pomocą odchylenia standardowego
( SD) wyrażonego równaniem nr 2 lub względnego odchylenia standardowego ( RSD), które
wyraża się równaniem nr 3. W celu obliczenia obliczenia odchylenia standardowego należy
wcześniej obliczyć średnią arytmetyczną z wynikówpomiarów otrzymanych w wyniku n
powtórzeń ze wzoru 1. Z matematycznego punktu widzenia obliczanie odchylenia
standardowego ma sens gdy n ≥ 3. Zgodnie z zaleceniami IUPAC obliczenia należy
wykonywać dla n≥ 5 po odrzuceniu błędów grubych.
n

∑ x i (1)
i=1
x́=
n
n

SD=
√ ∑ ( xi − x́ )2 (2)
i=1

RSD ( )=
n −1
100 ∙ SD
x́
(3)
x́ - średnia arytmetyczna, xi- kolejna wartość uzyskanego wyniku, n- liczba
pomiarów
Precyzja definiowana jest za pomocą trzech parametrów walidacyjnych:
◦ Precyzję jednodniową (ang. intra-day precision) odchylenie standardowe dla
pomiarów wykonanych tego samego dnia , przez tego samego operatora, na tym
samym sprzęcie, tego samego dnia.
 ◦ Precyzję wielodniową (ang inter-day precision) odchylenie standardowe
pomiarów wykonanych przez tego samego operatora na tym samym sprzęcie w
różne dni.
◦ Odtwarzalność odchylenie standardowe wyników uzyskanych wyników
pomiarów przeprowadzonych przez różnych operatorów na różnym sprzęcie w
różnych dniach.
 Liniowość ma za zadanie określić w jakim stopniu uzyskany sygnał jest wprost
proporcjonalny do stężenia danej substancji w analizowanej próbce tzn. jak bardzo przebieg
wykresu powyższych zależności jest zbliżony do linii prostej.
 Dokładność określa stopień podobieństwa wartość uzyskanego pomiaru do wartości
wzorcowej
 Zakres przydatności definiowany jest jako najmniejsze i największe stężenie
graniczne dla którego dana metoda analityczna ma określoną dokładność, precyzję i
liniowość
 Czułość podaje stosunek zmiany poziomu sygnału otrzymanego z detektora do
zmiany stężenia analitu
 Limit detekcji ( LOD) jest to najmniejsze stężenie oznaczanej substancji, które może
być wykryte ale nie może zostać oznaczone w sposób ilościowy. LOD określa się jako
S
stosunek sygnału do szumu ( )
N
którego wartość powinna być równa według IUPAC co
najmniej 3:1.
 Granica oznaczalności ( LOQ) to najmniejsze stężenie oznaczanej substancji które
może być wykryte oraz oznaczone w sposób ilościowy. LOQ można określić analogicznie jak
LOD ale w tym przypadku wartość stosunku sygnału do szumu powinna wynosić co najmniej
10:1.
 Stabilność mówi o tym, jak długo próbki, wzorce oraz odczynniki wykorzystywane
w analizie pozostają stabilne. Co zapewni osiągnięcie powtarzalnych i wiarygodnych
wyników

Faza II. Określenie odporności metody

 Odporność (ang. robustness) procedury jest miarą podatności procedury analitycznej
na małe lecz mierzalne zmiany parametrów wpływających na precyzję i dokładność.
Zazwyczaj stabilność określana jest za pomocą RSD uzyskanych rezultatów w
odniesieniu do wyników, które zostały uzyskane w ściśle określonych warunkach
prowadzenia procedury analitycznej.
W przypadku wysokosprawnej chromatografii cieczowej zazwyczaj bada się wpływ
następujących zmian:
o Zawartość organicznego składnika fazy ruchomej
o Zawartość dodatków do fazy ruchomej
o pH stosowanego buforu
o Temperatury kolumny
o Czasu ekstrakcji analizowanego składnika
o Składu mieszaniny ekstrakcyjnej próbki
o Kształtu gradientu
o Prędkości przepływu fazy ruchomej
 o Kolumny chromatograficznej pod względem partii produkcyjnej oraz wytwórcy

Faza III. Określenie przydatności procedury chromatograficznej do oznaczania analitu.

 Kryterium zdolności rozdzielczej układu chromatograficznego.

Wyznaczane jest na podstawie takich parametrów chromatograficznych jak: czasy
retencji poszczególnych składników, rozdzielczość( Rs), stosunek wysokości piku do
wysokości doliny(h/v)
 Kryterium rzetelności określenia początku i końca piku chromatograficznego
( i/lub wysokości piku) odpowiadającego analizowanej substancji które należy
wyznaczyć na podstawie współczynnika ogonowania czyli asymetrii piku
 Kryterium powtarzalności wyników pomiaru
Wyznaczane jest na podstawie RSD powierzchni pików lub ich wysokości. Według
zaleceń IUPAC, dla głównych składników jego wartość powinna wynosić poniżej 2%
natomiast dla zanieczyszczeń poniżej 5%

Faza IV Powtórna lub okresowa walidacja procedury analitycznej

Przeprowadzenie ponownej walidacji może być konieczne gdy nastąpi:

 Modyfikacja badanego preparatu
 Modyfikacja technologii syntezy substancji macierzystej
 Modyfikacja procedury analitycznej

Po wykonaniu powyższych kroków należy sporządzić raport z walidacji zawierający

otrzymane wyniki oraz, ostateczną ocenę przydatności metody do oznaczania określonej
substancji bądź grupy substancji w określonych warunkach. Szczegóły zawartości raportu
walidacyjnego są często określane w wewnętrznych wymaganiach podmiotu
przeprowadzającego walidację.

Część ęksperymentalna:
1. Materiały
a) Płytki TLC SiO2 bez czynnika fluorescencyjnego o wymiarach 5x10cm
b) Barwniki (1. Tartazyna, . Błękit brylantowy FCF) rozpuszczone w etanolu – roztwory
podstawowe c= 1 g/L
c) Faza ruchoma: etanol 96%/n-heksan/toluen ; 80/15/20 (v/v/v)

2. Aparatura
a) Aplikator Camag Linomat IV
b) Pozioma komora do TLC
c) Wideokamera Camag Reprostar 3 z oprogramowaniem WinCats i VideoScan

3. Wykonanie
a) Umieścić plastykową probówkę Eppendorfa na szalce wagi analitycznej w sposób
umożliwiający późniejsze nasypanie barwnika do środka bez dotykania Eppendorfa i
wytarować wagę.
 b) Odważyć około 1 mg tartazyny umieszczając go za pomocą odpowiedniego rozmiaru
szpatułki w Eppendofie Spisać masę odważki.
c) Używając biurety automatycznej dolać do Ependorfa tyle metanolu aby stężenie
sporządzonego roztworu wynosiło 1 g/L.
d) Powyższe czynności powtórzyć dla
e) Przygotować roztwory barwników przez rozcieńczenie odpowiednich roztworów
podstawowych. Do stężeń 1,0; 0,8; 0,6; 0,4; 0,2 g/L.

f) Nanieść za pomocą aplikatora Linomat IV po 1 μL każdego z wcześniej sporządzonych

roztworów w odległości 1 cm od dłuższej krawędzi płytki w postaci pasm o szerokości 4
mm (2 substancje/płytka).

g) Rozwinąć płytki z naniesionymi substancjami w nienasyconej komorze za pomocą fazy

ruchomej opisanej w podrozdziale odczynniki na dystansie 3,5 cm i zaznaczyć ołówkiem
linię mety.

h) Wysuszyć, wykonać fotografię cyfrową przy użyciu wideokamery w odbitym świetle

widzialnym.

i) Za pomocą oprogramowania VideoScan wyznaczyć pole pod pikiem dla każdego z

otrzymanych pików.

j) Dane przenieść do arkusza kalkulacyjnego.

4. Obliczenia
Na podstawie otrzymanych wyników sporządzić ilościowe krzywe kalibracyjne dla każdej z
chromatografowanych substancji, tj. zależności pola powierzchni pod pikiem od ilości substancji.
Obliczyć precyzję oznaczeń ilościowych na podstawie odchylenia standardowego. Uwaga!
Proszę nie używać funkcji „odch. standardowe” z MS Excel. W ten sposób otrzymuje się tylko
odchylenie standardowe punktów od krzywej. Wartość odchylenia standardowego oblicza się
obliczając średnią różnicę pomiędzy wartością oczekiwaną (obliczoną z krzywej kalibracyjnej) a
wartością rzeczywistą (polem pod pikiem zmierzonym za pomocą analizy zdjęcia z wideokamery w
programie VideoScan).
Obliczyć limity detekcji i oznaczalności na podstawie krzywych kalibracyjnych ( wartości
wyrazu wlolnego w liniowej krzywej kalibracyjnej) . Podać zakres oznaczalności dla metody
oznaczania tartazyny i błękitu FCF.

5. Wnioski
a) Na podstawie parametrów równań krzywej kalibracyjnej porównać czułość oznaczeń obydwu
związków chemicznych . Dla którego czułość jest wyższa?Z czego wynika różnica?
b) Porównać limity detekcji i oznaczalności z zakresem kalibracji i określić przydatność metody
do wykonywania oznaczeń ilościowych dla błekitu FCF i tartazyny.