Segédanyag a LÉGZÉS témakörhöz

A légzés

Azon biokémiai-élettani folyamatok összessége, melynek során nagyenergiájú, redukált

szerves vegyületek feldarabolása, lebontása, oxidálása megy végbe légköri oxigén
felhasználásával. E lebontó folyamatok közben redukált koenzimek keletkeznek és ATP
szintézise folyik, természetesen a legtöbb ATP a mitokondriumban keletkezik a terminális
oxidáció folyamán a redukált koenzimek lebontásakor. Az itt keletkezett ATP-t a növény más
élettani folyamatokban tudja felhasználni.
Nem csak szénhidrogének, hanem fehérjék, zsírok lebontása is végbemegy. A szerves
vegyületek lebontásának 3 fő lépése:

1. polimerek lebontása monomerekké

2. a monomerek oxidatív lebontása (RH + KoE + O2 ⇒ CO2 + KoEH)
3. a redukált koenzimek visszaoxidálása a légköri oxigén felhasználásával

Összesített egyenlet: RH + O2 ⇒ CO2 + H2O + energia

E folyamatok exotermek. Légzési gázcsere figyelhető meg, amely nyomon követhető, ehhez
persze nem fotoszintetizáló szövetekre van szükség. A légzési hányados (CO2 cc / O2 cc)
szénhidrátokra vonatkoztatva RQCH=1, almasavra RQMA=1,3, sztearinsavra RQSA=0,69. A
valódi lebontás természetesen mindig többféle szubsztrát egyidejű felhasználásával valósul
meg.

Egyes növényi szövetek légzésgátlókkal történő kezelés során a citokróm típusú légzési lánc
gátlószereinek jelenlétében is jelentős mértékű O2-felvételt mutatnak. Ez a cianid-rezisztens
légzés. Az O2-felvételért felelős enzim az alternatív oxidáz (OxALT). Ennek O2-affinitása 5-
10x kisebb, mint a citokróm-oxidázé. Az OxALT az ubikinon poolból veszi fel az elektronokat.
A szokásos (citokróm) út mellett az alternatív utak alig, vagy egyáltalán nem működnek, de
ha az ADP cc / ATP cc arány csökken, vagyis az ATP relatív mennyisége megnő, az
elektronok az alternatív útra kerülnek. A piroszőlősav közvetlenül hat az OxALT-ra,
kapcsolódik az enzimhez és aktiválja az alternatív utat. Különböző körülmények között
indukálható a cianid-rezisztens légzés (pl. öregítés, etilén kezelés, tápoldat összetételének
megváltoztatása, stb.)

A légzés egyes folyamatainak megismeréséhez szelektív gátlószereket, ill. szétkapcsolószert

alkalmazunk. Ezek:
1. monojód-ecetsav (ME) – SH-reagens, olyan enzimek működését gátolja, amelyek SH-
csoportot tartalmaznak aktív centrumukban, ilyen pl. a glicerinaldehid-3P-
dehidrogenáz (vagy a citrát-szintáz). Elsősorban a glikolízist gátolja
2. fluoroecetsav (FE) – az acetil-koenzim A-val reagál, így fluoroacetil-csoport jut be a
citromsavciklusba, ahol továbbalakulva a fluorocitrát az akonitáz enzimet gátolja
3. (Na-) azid – a mitokondriumban fejti ki hatását, a terminális oxidációért felelős
citokrómA/A3 gátlója
4. 2,4-dinitrofenol (DNP) – szétkapcsolja a foszforilációt és az elektron transzportláncot,
oly módon, hogy megszünteti a p+ gradienst s így felszabadítja a terminális oxidációt
az ATP-szintézis kontrollja alól, tehát bizonyos (kis) koncentrációban serkenti az O2-
felhasználást, nagyobb koncentrációban már gátlószer (membrán dezintegráció)

1
O2-elektród; Winkler-módszer

E két módszerrel a légzés intenzitását vizsgáljuk. Az O2-elektród használatával az oldatba

helyezett szövet légzését kísérjük figyelemmel az oldat O2-tartalmának fogyásán keresztül,
míg a Winkler-módszer alkalmazásakor titrálással határozzuk meg az inkubáló oldat maradék
O2-tartalmát és a kontrollhoz viszonyítva következtethetünk az inkubált szövet által
elfogyasztott O2 mennyiségére. Természetesen mindkét módszert időegységre vonatkoztatjuk.
A fenti gátlószerek alkalmazásával a légzés egyes folyamatai és az O2-fogyasztás, vagyis a
légzésintenzitás összefüggéseit vizsgálhatjuk.

1. Légzésintenzitás mérése O2-elektród használatával

Búzagyökérrel dolgozunk (kicsi, hordozható készülékhez <hord.> 1,5-2 g; nagyhoz 0,2-0,3

g), de lehet használni élesztő szuszpenziót, vagy apróra (de nem túl apróra → sebzési légzés!)
vágott gombát. Az inkubáló oldatban oldott O2 fogyását követjük, a kiindulási kontroll a
(telített O2-tartalmú) CaSO4 oldat. A gyökereket csak a mérés megkezdése előtt kell
felaprítani (és nem túl apróra), nehogy kiszáradjanak.
„Hordozható készülék.”: Nyílt rendszer.
1.: Hőmérsékleti kalibrálás (T0 és T1). A 0 °C-ot jég-víz keverékkel állítjuk be. A készüléken
a bekapcsoló gomb mellett (alatt) van a kalibráló gomb, állásától függően hőmérsékletre, ill.
oldott O2-tartalomra lehet kalibrálni. Egy kalibráló tárcsával lehet állítani, de ha nem állítható
vele a végpont, akkor a mellékelt csavarhúzóval a készülék oldalán levő kis potméter csavart
lehet nagyon finoman (!) állítani. A szobahőmérsékleti pontot előzőleg pohárba töltött,
kevertetett, sokáig állni hagyott deszt. vízzel lehet beállítani; ez lesz később a 100% oldott O2-
tartalom kalibrációs „oldata” is.
2.: O2-elektród illesztése. A kalibráló gomb átállítása után a nullpontot Na-szulfittal
kevertetett (!) d.v. segítségével lehet beállítani, 100% lásd följebb.
50 ml térfogatokban mérünk, minden mérés között az elektródokat (elsősorban az O2-
elektródot) d.v.-zel kell mosni. Érdemes időeltolással indítani az egyes méréseket. A 0.
időpontban is kell mérni, majd utána bizonyos ideig, ez lehet pl. (kb.) 10 percenként, vagy
más adatok szerint a 40., a 80. és a 120. perc, de lehet rövidebb is; legalább 40-60 percig
érdemes egy mintát követni. A gátlókat (ME, FE, azid) 10-4, a szétkapcsolót (DNP) min. 10-7
M cc.-ban szoktuk adni. A DNP várhatóan kb. (10-7,) 10-6, esetleg 5×10-5 M cc.-ban fog
serkenteni, ennél töményebben már gátlás várható. Érdemes egyforma átmérőjű
főzőpoharakat választani, így elkerülhetjük azt a hibát, hogy a különböző minták eltérő
felületen érintkeznek a levegővel. Lehet mérni pl. két szabadon választott gátló különböző
koncentrációit, vagy egy gátló és a szétkapcsoló különböző koncentrációit, vagy az összes
gátló és a szétkapcsoló egy adott koncentrációját. A kezeletlen kontroll mellett a kezelések két
párhuzamosát lehet mérni, esetleg úgy, hogy amelyik mérés nem sikerült tökéletesen, azt
megismétlik. A mérés végén az O2-elektródot a készülékből kicsavarva, külön pohárba töltött
d.v.-ben illik eltenni, szárazon semmiképpen sem szabad hagyni, a hőmérsékleti elektród
maradhat szárazon.
„Nagy” készülék. Zárt rendszer, vagyis buborékmentesen kell a mérőküvettát beállítani. A
készüléket termosztálni kell (kalibrálni nem), 50, esetleg 100mV-os tartományban célszerű
dolgozni, a rekordert 60cm/óra regisztrálásra érdemes állítani. 0,2-0,5 g gyökeret kb. fél centis
darabokra vágva lehet mérni 7 ml térfogatban. Itt is fontos, hogy frissen felaprított gyökérrel
dolgozzanak. Először a kontrollokat mérjük. Itt érdemes 20 perces inkubációkat tartani, a
nullpont nem érdekes, a légzésintenzitások az oldott O2 koncentrációcsökkenését mutató
„egyenesek” meredekségéből számolhatók. Kontrollt többször is lehet időközben mérni. A

2
mérés közben folyamatosan kevertetni kell az oldatot! A hőmérsékletet állandó értéken kell
tartani, mert egyrészt befolyásolja az O2 oldékonyságát, másrészt a diffúziós határáramot. Az
áram az (AgCl-dal borított Ag) anódtól a (Pt) katód felé folyik, az O2 a katódon redukálódik.

Mindezek a két régebbi O2-elektródra vonatkoznak, az új (nyílt rendszerű) műszert nem kell
termosztálni, elvileg kalibrálni sem, de lehet. Javasolt mérési mennyiség 50 ml. Élesztő
használata az új oxigén-elektróddal: 0,5 g/ml élesztő szuszpenziót készítünk. (A
szuszpenzióba is lehet szacharózt tenni, de valószínűleg jobb, ha csak a mérőoldatba).
50 ml mérőoldatot (kontroll, gátló, DNP), mely szacharózra nézve 4-7 g/l tartalmú (javasolt 5,
de 10 g/l alatt legyen), a mérés előtt legalább 1 percig erősen kevertetünk, majd 0,5 ml élesztő
szuszpenziót teszünk bele, azzal is kevertetjük egy rövid ideig és elkezdjük a mérést. A mérés
közben állandó lassú kevertetést alkalmazunk. Egy mérést 10-15 percig folyamatosan
követünk, percenként, vagy félpercenként leolvasva az oxigéntartalmat. A mérés után
leöblítjük az elektródot, beletesszük az új mérendőbe és kezdődhet a következő mérés. A
mérések után a leöblített elektródot desztillált vízben hagyjuk.

2. Légzésintenzitás mérése Winkler módszerével

A Winkler-módszer alapja is a vízben oldott O2 meghatározása, itt jodometriás titrálással

határozzuk meg az inkubálás után az oldatban maradt O2 mennyiségét. Itt is növényi gyökér
(búza), ill. gomba lehet a minta és a fentihez hasonlóan ez is zárt rendszer, tehát
levegőbuborékoktól mentesen kell kivitelezni a mérést. 1,5-2 g búzagyökér megfelelő lehet a
méréshez. Itt sem szabad kiszáradni hagyni a gyökereket. A lemért és felvágott gyökereket,
ill. gombát Winkler-csövekben inkubáljuk 1-1,5 órán keresztül. Ált. elég szokott lenni az egy
óra is. Lehet a fenti hatóanyagokat használni (gátlók és DNP), ill. lehet a hőmérséklet hatását
vizsgálni. Mindenképpen kell a kontrollból és a kezelésekből is párhuzamos mérés. A
Winkler-csövek térfogata kb. 80-100 ml, ez leginkább a két végüket lezáró gumidugóktól és
azok elhelyezésétől függ, mert maguk a csövek nagyjából egyformák. A térfogatot a
gumidugók közti távolságból és a cső átmérőjéből lehet kiszámolni. A folyadéküvegek
térfogatát is meg kell határozni. A térfogatok megtartására és ismeretére ügyelni kell! A
mérés nagyon elhúzódhat, ezt leginkább úgy lehet elkerülni, ha az elején a kísérlet
megtervezése és a kísérlethez szükséges oldatok elkészítése gyorsan történik. Az inkubációig
kell tehát gyorsan eljutni, hiszen ez plusz egy-másfél órát jelent. A Winkler-csöveket
petricsészében kell elhelyezni, hogy a kifolyó oldatok ne az asztalra folyjanak. Fontos, hogy a
gumidugókkal buborékmentesen kell lezárni a csöveket (ezt érdemes még a minták
hozzáadása előtt gyakorolni vízzel, vagy CaSO4-tal), ettől a ponttól indul az inkubáció. Az
inkubáció alatt érdemes párszor finoman megforgatni a csöveket, hogy az inkubált minta O2-
ellátását elősegítsük. Amíg az inkubáció tart, meg kell határozni a telített CaSO4 oldat O2-
tartalmát, ezzel a titrálást is be lehet gyakorolni. 2-3 CaSO4 kontrollt kell titrálni. A
keményítőt érdemes nem azonnal tenni hozzá a titrált anyaghoz.
Az inkubációs idő letelte után a csöveket össze kell rázni, az egyik dugót pedig kicserélni
csapos dugóra és a folyadékból leengedni az előkészített folyadéküvegbe. Természetesen csak
akkor fog folyni, ha a másik dugót eltávolítjuk. A folyadéküveget pereméig töltjük, majd a
csiszolatos dugójával kiszorítjuk a fölösleges folyadékot és az üveg aljára 1 cm3 lúgos jodid
oldatot, majd 1 cm3 tömény MnCl2 oldatot rétegezünk (pipettaheggyel). Az üveget gyorsan és
buborékmentesen lezárjuk és az aljára rétegzett oldatot többszöri lassú elfordítással
összekeverjük. A Mn(OH)3 csapadékot 10(-15) perc ülepítés után, vegyi fülkében 3 cm3 25%-
os sósavval feloldjuk, majd az oldatot lombikba visszük át és titrálható. 1 cm3 0,005 n
Na2S2O3 40 μg O2-t mér, de előfordulhat, hogy 0,01 n tioszulfáttal dolgozunk (~80 μg O2).

3
A számolásnál figyelembe kell venni a hozzáadott 1-1 cm3 reagenst, de a gyökerek térfogata
elhanyagolható.
A direkt végoxidázok közvetlenül légköri, molekuláris O2-t használnak föl szerves vegyületek
oxidálására, élettani szerepük azonban alapvetően különbözik a terminális oxidációétól.
Aktivitásukat nem kíséri ATP képződése, a felszabaduló energia hő formájában távozik.
Prosztetikus csoportjuk, vagy koenzimjük leggyakrabban átmenetifém ion, vagy flavin
nukleotid. Aktivitásuk többnyire nő
• öregedés
• kompartmentalizáció változása
• védekezési mechanizmus
esetén (pl. polifenol-oxidázok), de pl. a glikolsavoxidáz aktivitásának növekedése a
fotoszintézis fényszakaszának erős működésekor figyelhető meg (ld. fotorespiráció).

Glikolsavoxidáz aktivitás mérése

A glikolsavoxidáz a kloroplasztiszból származó glikolsavat oxidálja glioxálsavvá a

peroxiszómában.

Koenzimje FMN, működése során H2O2

keletkezik, melyet katalázok bontanak le.

(A H2O2 képződése minden flavoproteinre

jellemző)

Szintézise és szabályozása fényindukált

folyamat (fitokróm rendszer); fényen nevelt és
etiolált (sötétben nevelt) növényeknél jelentős
aktivitásbeli eltérést várunk tehát, koenzimje,
az FMN hozzáadásával általában az aktivitás
növelhető, bár tudnivaló, hogy a gyakorlat
során elkészített „enzimkivonat” (valójában
durva extraktum, amelyben sok minden van)
FMN-t is tartalmaz.

Fotometrálással a termék mennyiségét (cc)

detektáljuk, mivel fenilhidrazinnal színes
reakciókomplex keletkezik.

3. Glikolsavoxidáz aktivitás mérése

1, esetleg 2 g búza csíranövény levelet aprítunk dörzsmozsárba, ahol 3 cm3 foszfát pufferben,
kevés kvarchomok jelenlétében eldörzsöljük. Először szárazon érdemes dörzsölni, esetleg
kevés kvarchomokkal, később lehet hozzátenni a puffert. Ezután 3×1 cm3 pufferrel
centrifugacsövekbe mossuk. Az átmosáshoz üvegtölcsért és négyrét hajtott gézlapot
használunk. A centrifugálás előtt gondoskodni kell a megfelelő tömegszimmetriáról (tárázás).

4
Centrifuga: 10 perc / 6000 g. A felülúszó lesz az enzimkivonat: leöntjük a csapadékról és
pufferrel, osztott kémcsőben, 10 cm3-re kiegészítjük, jégkásába ágyazva tároljuk. Elkészítjük
a jegyzetben megadott reakcióelegyeket (a gátlást ált. nem vizsgáljuk), lehetőleg két
párhuzamos sorozatban. Az enzimkivonat hozzáadásával elindítjuk a reakciót, amelyet 10,
vagy 15 perc múlva állítunk le triklórecetsavval (30 % oldat, 0,5 cm3). A kicsapódott
fehérjéket centrifugálással távolítjuk el (10000 g, 5 perc). A leöntött felülúszóhoz adunk
1 cm3 fenilhidrazint (0,3%) és 15 perc után 4 cm3 tömény sósavat (elszívófülke alatt,
savpipettával!), összerázzuk, majd vízcsap alatt óvatosan lehűtjük. 1 cm3 1,5 %-os vörös
vérlúgsó hozzáadása után, 20 perc várakozás elteltével lehet mérni az oldat extinkcióját
540 nm hullámhossznál, spektrofotométeren. A két mintasorhoz (fényen nevelt, ill. etiolált) 1-
1 vak minta tartozik, célszerű az egyik vakot, majd a hozzá tartozó mintasort mérni először,
utána a másik mintasort, szintén a vakkal kezdve.
A színreakció részletes leírása és a számításhoz szükséges kalibrációs görbe a gyakorlati
jegyzet függelékében a 235-236. oldalakon található. A kalibrációs egyenesek egyenletei:
1) x=128,85y+7,5 illetve 2) x=84,61y+19. A töréspontig, azaz y=0,26 abszorpcióig az 1.,
fölötte a 2. egyenlet érvényes.

Polifenol-oxidáz aktivitás mérése

A szövetek sérülése, stb. során lejátszódó

barnulási reakciók a polifenol-oxidázok
működéséhez köthetők, fenoloidok
oxidálásával kinonvegyületek képződnek,
amelyek polimerizációra hajlamosak. Ez
áll a legtöbb jól ismert növényi barnulási
folyamat hátterében. A növény legtöbb
szövetében normálisan is jelen vannak
ezek a réztartalmú enzimek, de sérüléskor
de novo is keletkeznek. Sok ilyen enzim
van, széles szubsztrát specifitással.
Élettani szerepük többek közt a védekezésben van, a keletkező kinonok mérgezőek – a
kórokozón kívül többnyire a növényi sejtet is elpusztítják, így jöhetnek létre nekrotikus
foltok. A keletkező kinonok sokszor színesek, pl. barnák, főként polimerizációs termékeik.
Heteropolimereket is alkothatnak, sőt fehérjék is belekerülhetnek a polimerbe.

4. Polifenol-oxidáz aktivitás mérése

Az előzőhöz hasonló nyers enzimkivonattal dolgozunk; a kívülről hozzáadott szubsztrát

(DOPA) átalakulásával keletkező (színes) kinoidális vegyület keletkezését kísérjük
figyelemmel fotométer segítségével és a reakció időbeli lefutását követjük.
5 g mintát (répa, burgonya, gomba, karalábé) dörzsmozsárban először „szárazon”, majd 5 cm3
foszfát puffer hozzáadásával homogenizálunk (többnyire nincs szükség kvarchomokra),
üvegtölcsérbe helyezett, négyrét hajtott gézlapon átszűrjük, 3×2,5 cm3 foszfát pufferrel
átmossuk, majd centrifugáljuk (20 perc 10000 g). A felülúszót osztott kémcsőbe öntjük át,
pufferrel 10 cm3-re kiegészítjük, ez lesz az enzimkivonat, amelyet ezután jégkásába ágyazva
tartunk. Normál (1 cm-es) küvettákba 2 cm3 foszfát puffert és 0,5 cm3 DOPA oldatot (1 mM)
mérünk. Az enzimkivonatban nyilván jelen vannak természetes szubsztrátok is, mi azonban a

5
feleslegben kívülről hozzáadott dihidroxi-vegyület, a DOPA átalakulását fogjuk tudni mérni.
A fotométeren (amennyiben a 4 utas készüléket használjuk) beállítjuk a 0 és 100%
transzmisszió értékeket a beállító gombok és a vak minta (2,5 cm3 puffer + 0,5 cm3 DOPA)
segítségével. A reakciót 0,5 cm3 enzimkivonat hozzáadásával indítjuk, és azonnal fotométerbe
helyezzük a küvettákat. Az extinkció változását 480 nm hullámhosszon, kezdetben
percenként, később hosszabb szünetekkel lehet mérni, általában elég 10 percig, de ha
valamilyen anomáliát tapasztalunk, érdemes 25-30 percig is követni.

A feladat: összehasonlítani az enzimreakciók időgörbéit, összevetni a különböző minták

viselkedését, elemezni a de novo enzimszintézis lehetőségét, összefüggést keresni a minták
(„természetes”) barnulása és a kapott eredmények között.

Aminek a tankönyvből, előadási jegyzetből stb. utána kell/lehet/ajánlatos nézni:

• a légzés általában
• légzésgátlók hatásmechanizmusa
• glikolsav-glioxálsav átalakuláshoz köthető folyamatok (RUBISCO, fotorespiráció,
glicin-szerin anyagcsere, stb.) és kompartmentalizáció (kloroplasztisz, peroxiszóma,
glioxiszóma, mitokondrium)