itn Centro Panamericano Fiebre Aftose 39-40: 51-56, 1980. 51 RELACION DE TITULOS DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES Y LA PROTECCION DE BOVINOS FRENTE AL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA P. Sutmmbller'; A. Vieira! RESUMEN Medionte a prueba de seroneutralizacién en ‘tubo, en el Centro Panamericano de Fiebre Attosa (CPFA) s2 examinaron sueros sanguineos de 791 bovinos vacunados y expuestos al virus de la fie- bre aftosa (FA). Como sistema para detectar virus no neutralizado se aplic’ la téonica de virus estén- darsuero variable en monocamedas de célulss BHK; 1. La infecci6n de los bovinos con el virus dde la FA se hizo por via intradermolingual, en tres Inboratorios diferentes. Hubo diferencias signifi- ‘ativas on la relacién titulo de anticuerpos y pro- teccién frente al desaffo entre los tres laboratorios ¥¥ entre los distintos tipos de virus. Puesto que to- dos los sueros fueron examinados en el CPFA, estas diferencias sefalan la dificultad de la estan darizaci6n de pruebas relacionadas con la infeccién de bovinos. Los titulos de neutralizacién sobre 1:64 indicaron un alto grado de prateccién. Es di- {cil interpretar el rango de 1:8 a 1:32, en téemi- ‘0s de proteccién al desatio. INTRODUCTION Para el estudio de anticuarpos neutralizantes del virus de la fisbre aftosa (FA) en suero bovino, Centro Panamericano de Fiebre Aftosa (CPFA) viene usando desde hace varios afot la téenica de virus ertindar-suero variable (1) El sistema indicador para el virus no neutral zado estd constituido por monocamadas de células de rin de hemster lactante (BHK;1 clon 13) (4), cultivadas en tubos. Este trabajo analiza los {itulos de neutralizacién obtenidor por esta tée- rica frente a la proteccién de bovinos vacunados y ‘expuestos a virus virulento. camero Panamericano de Fire Aftom, OPS/OMS, (China Porta $89, 20000 Rio de Jarairo- RJ, Bras. MATERIALES Y METODOS Bovinot CPFA. Se emplearon 273 novillos mestizos Ccebti originarios de haciendas libres de FA dura te varios afios. Antes de la aplicacién de vacuna antiaftosa inactivada con hidréxido de aluminio © con adyuvante oleoso, los bovinos fueron exa- minados para verificar la ausencia de anticuer Os protectores o neutralizantes. Las vacunas fueron elaboradas en el CPFA con las siguientes cepas de virus: 0, Campos, Azy Cruzeiro y Cy Resende. El desaffo de los animales se efectud entre 21 y 28 dfas después, con cepas hombloges de virus UCV?. Se vacunaron 179 bovinos no inmuniza dos con vacuna antiaftosa inactivada, con hidréxi do de aluminio y formalina, Los bovinos fueron infectados 21 dias més tarde. La vacuna, a infec- ‘ign y las pruebas de neutralizaci6n se hicieron ‘on los mismos virus mencionados. ‘SELAB®. Se vacunsron 339 bovinos proceden- ‘es de una ragién libre de flebre aftosa, con vacuna insctivade con hidr6xido de sluminio y saponins infecténdolos 21 dfas después. Las vacunas conte ‘nian cepas de laboratorios comerciales. Le infec: cién fue hecha con la cepa Az« Argantina/68 (8345) y la prueba de seroneutralizacion con Ia cope A; Cruzeiro. La cepe 0; Caseros se us6 para la infeccion y la cepa 0, Campos para la seronau- talizaciOn. El virus C, Resende se us6 tanto para la infeccién de los bovinos como para las pruebas de neutralizacién, Unidad de Controle de Vacines (UCV), Grupo Exeou: ‘ro de Combawe & Fabre Aftons (GECOFAI, Rlo Grande 60 Sul, Brel, Servicio de Laboratorios (SELAB), SENASA, Cho- rroarin 134, Buenos Aire, Argantios.52 Proteccion de los bovinos Cada bovino recibié, por via intradermol qual, 10° Dlso de virus virulento. Se considera- ron protegides los que no desarrollaron lesiones podales, ‘Sueros ‘Antes de la infeccién se extrajo suero sangui- reo, que se guardé a -20°C hasta el respectivo examen. Noutralizacion del virus Todas las pruebas de neutralizacién fueron hhechas en el CPFA, segiin descrito (1). El método puede resumirse asi Inactivacién del suero a 60°C durante 20 mi- futos. Dilucién de 1:2 @ 1:256 en medio Eagle modificado (MEM). Preparacién de una suspension de 10° Dizo/ml de virus en MEM. Agregado de 1 mi de esta suspensién a 1 mi de cada une de las diluciones de suero y mantenimiento de ta Bltn Centro Panamericano Fiebre Aftosa 39-40 mezcla a 37°C por 1 hora, sequido durante 30 minutos a 4°. Inoculacién de 0,2 mi de Ia dilucién virus-suero ‘en monocamadas de células BHK cultivadas 48 hhoras en tubos pyrex (de 16 x 150 mm), con un cambio reciente de 0,8 mi de MEM. Empleo de 6 tubos por dilucién, Lectura de todos los tubos 72 horas después de una incubacién a 37°C y cal ‘culo de los puntos finales segin el método de Reed y Muench (6). EI titulo de neutralizacion se expresa como el reciproco del log: o de la dilucién ‘que protege el 50% de los cultivos celulares contra 100 DICCso de virus. A menudo se menciona este valor como el indice "8" (1) RESULTADOS Los sueros fueron clasificados de acuerdo con su titulo de neutralizacion “S", por su origen (CPFA, UCV, SELAB) y el tipo de virus utilizado (Cuadros 1 y 2) (CUADRO 1. Bovinos clestiendos de acverdo con e titulo de seronevtalizecién, le proteccién a desat, {tipo de virus usd y ol Inboratorio donde se rwizaron ls prusbas cPrAY seLAB? vey" oA Cc Tom 0 AC Tom O AC Total <05 070 1723 075 «1682727 B32 2/23 7/82 ONT «2B O/R?_2157 06-10 20 6/4 56 16/50 6/28 16/28 32/4 © S400 1724 BO 47 BIST 92 106 10 29n9 17/92 14/21 3093 61M BNO 4/10 6 19/28 16-20 1515 16/5 18/15 4545 25/57 2-777 HD 3IS BIB 7/7 18/20 24-25 1212 14/11 166 3808 Tee 3/3 3090 0 tono 2/2 12a 25-30 6S 12/2 nny an 22 22 4a 33 OD >ao eae 16n6 um Tote 54/92 62/90 45/82 162/272 70/194 39/80 80/116 18A/QI0 9159 32/61 22/89 62/179 ‘cantro Panamericana de Fiebre Afton, Riode Janeiro, Grail servicio de Laboretrior-Servicio Nacional de Sanided Animal (SELAB-SENASA), Buenos Aires, Argentine. “Unidade de Controle de Vacinas, Geupo Emicutivo de Combat Fabre Aftoaa (UCV-GECOFA\), Rio Grande do Sul,Bltn Centro Panamericano Fiebre Aftoss 39-40 53 CUADRO 2. Bovinescsitcndoe de neverto com el ‘tule de seroneutralizeisn, mw proteccién ‘#1 dentio yo ipo de virus vado Trealo Virus euteal zante ° A Co a0 a) v7 Total 133/285 139/249 147/257 413/781 * Namero de protegidouNimero de expuesto. wey o Porcenaje de protseciin Se construyeron curvas de respuesta a la dosis siguiendo el método emplesdo por Gomes y Astudillo para la prusba de seroproteccién (3) En resumen, los porcentajes de proteccién de ca- da dosis se transformaron en probits. La linea de regresin de estos. probits y los puntos medios del titulo de anticuerpos fueron caleulados por ‘computador* segiin el método del cuadrado menor onderado (2). Con esta relacién entre porcentaie de proteccién y dilucion del suero se establecieron ccurvas de respuesta para los sueros colectados en e CPFA, en la UCV yenel SELAB (Fig. 1) Curvas de relaci6n entre el porcentaje de pro- teccién y los titulos de neutralizacién para los 3 tipos de virus aparecen en la Fig. 2 Las Figs. 3, 4 y 5 muestran la respuesta de cada ‘uno de los tipos de virus en relacién con el origen de los sueros. “PDP11/94 computador (DIGITAL). €! programe on BASIC 4 obtane madianteslicind. — cra SELAB ~=- ev 20 30 ‘Thulo de neutratizacién FIGURA 1. Relciin entre lor titvls de nayoalizaciin y of porcentle de protecidn de Bovince vecunads con vacune ‘antiaftom inate, on 2 hignrs diferentes (CPFA, Blo de daneko, Breil: SELAB, Buenos Aires, Arpentin, UCY, Rio Grande do Su, Brel54 Btn Centro Panamericano Fiebre Aftoss 39-40 0! 9 8: / a6 —o 5: Tipo de virus 4 3 2 le ave 132 use 10 20 30 ‘Titulo de notrliacién FIGURA 2. Relcién entre (os titular de neutralizeciin de diferentes capas de viusattso y ls proteccion de bovinos ecunadot con vacua antiatcos inactvede 99} — cra VIRUS © -A- vey Poreeneje de proteesién byes oy & © xa 10 30 “Tieulo de netrlizcion FIGURA 2, Rekcién ene los tituls de neutraliaciin de virus aftom tipo O y le provccién de Bovinos vacunados en dos lugares diferentes CPFA, Riode Janeiro, Breil; UCY, Plo Grande do Su, Brasil‘Blen Centro Panamericano Fiebre Aftosa 39-40 55 99| a 9 8 a7 i gs : — ora 5 VIRUS A === ucv 4 3 2 1 dl vee is r32 sa To 20 30 ‘Titulo de neutealizaci6n FIGURA 4. Relecion etre bs titulos de neutralizaciin del virus aftto tipo A y tx proteccisn de bovinos vacunados en os tuparesaiterantes (CPFA, Rio de Janeiro, Brasil; UCV, Rio Grande do Su, Bree 3 s — core = VIRUS C| SELAB ; --= vey 8 é iI ka 16 use 64 30 2 ‘Tieulo de nevcaizacish FIGURA 5. Relscién entre fos titulos de naytralincién del virus aftoso tipo C y le proteccin de bovinos wecunadot fen tres lugares diferente (CPFA, Rio de Janeiro, Brasil; SELAB, Buenos Aires, Argentine, UCV. Rio Grande do Su, Brasil56 DIScUSION El Manual del CPFA de Control de Vacuna Are tiaftosa (7) dice: “"Una serie de vacuna es aprobada ‘cuando todas sus valencias proporcionan un TNs igual 0 superior 2 1,5 en seis o més bovinos de los ‘ocho utilizados”, Este valor tiene por base datos ‘acumulados en el CPFA. En la Fig. 1 se muestra ‘que a la dilucién 1:32 corresponde un nivel de proteccidn de 90% en bovinos en el CPFA, Sin embargo, se observaron grandes diferencias entre sueros de distintos origenes (Fig. 1). Por ejemplo, fas bovinos infectados en la UCV y en et SELAB, con un titulo de neutralizacion 1:32 te ‘nian un nivel de proteccién de sélo 65 y 80%, res- pectivamente. Hay que tener en cuenta que las va lencias probadas estuvieron distribuidas con bas ‘ante uniformidad en los tres lugres y que todas las pruebas de neutralizacién fueron hechas en el CPFA. De este modo, las diferencias de las respuet- tas de los tres lugares deber‘an atribuirse més bien 8 diferencia de factores como la edad y condicio- nes de los bovinos y a su manejo durante las prue bas 0 bien, a la teonica de infeccién. En el cato del suero de Argentina (SELAB), puede haber influido el uso de cepas O y A heterdlogas Las curvas de los tres tipos de virus son bien di- ferentes. En la dlucion 1:32 estén protegidos 70 y 78% de los bovinos infectados con los tipos O y A, respectivamente (Fig. 2). La curva para ol virus C se desplaza hacia la izquierde, habiendo una rele cién mayor entre titulos bajos y un porcentaje alto de bovinos protegidos contra el virus de tipo C. Las diferentes respuestas para los virus en cada lu g2r aparecen en las Figs. 3, 4 y 5, pudiéndose ver ‘que son atin més acentuadas. En el SELAB, con los tipos 0 y A, parte de las diferencias podria deberse 2 las distintas copas utilizadas en el desaffo y en las pruebas de neutralizacién. Los resultados sefalan ‘que lot bovinos de ta UCV necesitaron para todos los virus mayores titulos de anticuerpos para estar protegidos. No std bien claro si las diferencias de la curva de respuesta para los tipos de virus son ‘consecuencia de un comportamiento distinto de los virus en cultivos celulares y en los bovinos o por ambas razones. Estas observaciones indican la necesidad de uniformar los procedimientos de los laboratorios, aun cuando sea mas facil estandardi- Blin Centro Panamericano Fiebre Aftosa 39-40 zar técnicas como la prueba de neutralizacién que aquellas vinculadas @ la infecciSn de bovinos. En el caso de los virus utilizados en este trabajo parece que un titulo 1:32 para los tipos O y Ade las vacunas resulta bajo, mientras que el mismo es suficiente para el virus C. De este modo, es proba ble que sea necesatio establecer un padrén més bien srbitrario para garantizar vacunas de potencia adecuada, con base en la cepa de virus que requiera los thtulos més altos de anticuerpos. Con 1:64 pue- de esperarse un elevado nivel de proteceién, por 10 ‘menos en lo que se refiere alas cepas empleadas. ‘Al evaluar la proteccién de bovinos, hay que ser ‘auteloso con Ios titulos de sueros en la parte agu: dda de la curva, entre 1:8 y 1:32. Pequefas diferen cias de titulo, atribuibles a variaciones normales de | prueba, podirian dar una gran diferencia en el éloulo de la proteccién, AGRADECIMIENTOS Los sueros usados en la prueba de neutraliza: cién fueron extraidos durante los afias 1970-74, Los autores agradecen al personal de la Unidad de Control de Vacunas (UCV) de Porto Alegre, RS, Brasil; del Servicio de Laboratorios Servicio Na ional de Sanidad Animal (SELAB-SENASA), ‘Argentina, asf como también al personal de! CPFA por haber proporcionado los sueros para realizar este estudio. REFERENCIAS 1. CENTRO PANAMERICANO OE FIEBRE AFTOSA Manus! de prooedimientos antiaftosa. Ser. Man. Té. 2, 1980. 2. FINNEY, D4. Statistical method in bioloica aay Griffin Co, Le, London 1952 (page. 528) 3. GOMES, |: ASTUDILLO, V. Foot nd mouth disease 10 eatle immunity. Boln Contr. Panam. Fiebre Attow 17-18: 9.16, 1976. 4. MACPHERSON, 1; STOKER, M. Polvoma transfor: ration of hamtr cll cloneean investigntion of ge netic fectors affecting call competence. Virology 16: 147-151, 1962. 5. REED, LJ; MUENCH, H.A. Simple method of os timating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27. 499-497, 1938, contol de vacune