Các exosomes có nguồn gốc từ sữa bò từ sữa non được làm giàu với các protein liên quan

đến phản ứng miễn dịch và tăng trưởng.

Exosomes là những túi ngoại bào do nhiều loại tế bào tiết ra vào khoang ngoại
bào. Chúng chứa các loại cargos cụ thể ở trạng thái tế bào thường phản ánh
tình trạng sinh lý (bệnh) của tế bào / sinh vật. Sữa chứa một lượng exosomes
cao và không rõ liệu hàng hóa của chúng có bị thay đổi dựa trên giai đoạn tiết
sữa của sinh vật hay không. Ở đây, chúng tôi đã phân lập exosomes từ sữa bò
thu được ở các giai đoạn khác nhau của quá trình cho con bú và kiểm tra hàm
lượng bằng phương pháp proteomics định lượng. Các exosomes được phân lập
bằng cách ly tâm gradient mật độ OptiPrep từ sữa thu được từ bò sau 24, 48 và
72 giờ sau khi đẻ. Như đối chứng, exosomes cũng được phân lập từ bò trong
giai đoạn giữa thời kỳ cho con bú, được gọi là sữa trưởng thành (MM). Đặc điểm
sinh hóa và lý sinh của exosomes cho thấy sự phong phú cao của exosomes
trong các mẫu sữa non và MM. Phân tích proteomics định lượng nhấn mạnh sự
thay đổi trong hàng hóa proteomic của exomes dựa trên trạng thái tiết sữa của
bò. Phân tích làm giàu chức năng cho thấy exosomes từ sữa non được làm giàu
đáng kể với các protein có khả năng điều chỉnh phản ứng miễn dịch và tăng
trưởng. Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của các exosomes trong
sữa non và do đó mở ra con đường mới để khai thác các túi này trong việc điều
chỉnh phản ứng miễn dịch và tăng trưởng.

Các túi ngoại bào là các túi màng (30–150 nm) có nguồn gốc nội bào, được tiết
ra bởi nhiều loại tế bào trong các điều kiện sinh lý và bệnh lý1, 2. Các túi ngoại
bào này làm trung gian giao tiếp giữa các tế bào bằng cách chuyển các protein,
lipid và RNA khác nhau giữa các loại tế bào khác nhau3. Exosomes đã được
phát hiện trong tất cả các chất thải sinh học bao gồm máu, sữa, nước bọt, nước
tiểu, nước ối và dịch rửa phế quản phế nang4. Sữa đã được ca ngợi là một hệ
thống dinh dưỡng tổng hợp cao được mô tả trong quá trình tiến hóa của động
vật có vú để thúc đẩy sự tăng trưởng của trẻ sơ sinh5. Mặc dù proteome của
sữa bò cho thấy sự khác biệt đáng kể so với sữa mẹ, nhưng cả sữa bò cũng
như sữa non vẫn được nghiên cứu một cách nhất quán do đóng góp đáng kể
của chúng trong việc sản xuất sữa công thức và chất bổ sung protein cho trẻ
em6. Sữa non nổi tiếng như một chất lỏng đóng gói chất dinh dưỡng được sản
xuất bởi các tuyến vú trong giai đoạn cuối của thai kỳ ngay trước khi sinh con và
chứa đầy các yếu tố miễn dịch, phát triển và sửa chữa mô7. Một loạt các protein
đã được xác định trong sữa non của bò, bao gồm một số protein dồi dào như
casein, β-lactoglobulin và α-lactalbumin, và các protein phong phú thấp, chẳng
hạn như kháng nguyên biệt hóa monocyte CD14 (CD14), phân tử kết dính tế bào
phụ thuộc glycosyl hóa 1 (GLYCAM1), xanthine dehydrogenase / oxidase (XDH /
XO), lactadherin (MFGE8) và clusterin (CLU) 8. Ngoài việc cung cấp chất dinh
dưỡng cho con cái, những protein này còn đóng vai trò quan trọng trong việc
điều chỉnh hệ thống miễn dịch9.

Exosomes gần đây được coi là nhân tố chính trong giao tiếp tế bào10. Người ta
đã đề xuất rằng các exosomes có nguồn gốc từ sữa mẹ có thể được hấp thụ bởi
mô / tế bào của người nhận và được sử dụng để củng cố hệ thống miễn dịch
của trẻ sơ sinh5. Ngày càng có nhiều bằng chứng về vai trò của các exosomes
sữa bò như là chất vận chuyển các miRNA để tạo ra các chức năng điều hòa
trong các tế bào nhận11. Proteome exosome của sữa bò đã cung cấp thông tin
mới về thành phần protein sữa và làm nổi bật tầm quan trọng sinh lý chưa được
thực hiện của exosome đối với sinh lý học của động vật có vú4. Hơn nữa, hàng
hóa của exosomes đã được chứng minh là bị thay đổi do hoạt động thể chất,
cho bò ăn và nhiễm trùng cho thấy rằng exomes sữa có thể được khai thác như
những kho chứa các dấu ấn sinh học 4, 12.

Các nghiên cứu về proteomics trước đây đã liên tục tập trung vào các mẫu sữa
non chưa phân đoạn và các mẫu sữa có lượng protein ít và màng thường không
được thể hiện đầy đủ 8, 13. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập và đặc
trưng các exosomes từ sữa non của bò khỏe mạnh thu được 24, 48 và 72 giờ
sau khi đẻ. Ngoài ra, exosomes cũng được phân lập và đặc trưng từ bò ở giai
đoạn giữa chu kỳ sữa được gọi là sữa trưởng thành. Định lượng proteomics và
phân tích làm giàu chức năng của các exsome được phân lập từ các mẫu sữa
non đã làm nổi bật sự làm giàu của các protein liên quan đến phản ứng miễn
dịch và tăng trưởng. Nghiên cứu này sẽ không chỉ giúp làm sáng tỏ sự khác biệt
trong hàng hóa proteomic của exomes từ sữa non đến bò giữa thời kỳ cho con
bú mà còn cung cấp những hiểu biết sâu sắc về những thay đổi chức năng trong
tế bào tuyến vú trong các giai đoạn khác nhau của quá trình cho con bú.
 Các dấu hiệu exosomal được làm giàu trong các mẫu
sữa non
Để đánh giá sự phong phú của các protein được làm
giàu từ exosomal đã biết trong các exosomes sữa non
và MM, dữ liệu định lượng proteomic được vẽ dưới
dạng bản đồ nhiệt cho các thành phần ESCRT, Rab
GTPases và tích phân. Như được trình bày trong Hình
4a, phù hợp với phân tích Western blot (Hình 1b),
protein phụ ESCRT Alix (PDCD6IP) được tìm thấy có
nhiều hơn trong các mẫu sữa non so với các mẫu MM.
Nhiều protein thành phần ESCRT bao gồm các protein
họ CHMP và VPS đã được làm giàu trong các mẫu
sữa non 72 giờ. Hơn nữa, tất cả bốn exomes đều
được làm giàu với Rab GTPases có liên quan đến quá
trình sinh học exosome, buôn bán mụn nước và hợp
nhất18 (Hình 4b). Tương tự như vậy, các tích phân rất
quan trọng đối với việc các tế bào đích hấp thụ
exosomes (Hình 4c) từ sữa non và MM19. Tuy nhiên,
loại phân tử chính xác của phân tử tích phân khác
nhau giữa các exsome. Một số protein phổ biến liên
quan đến sữa, như Butyrophilin, Xanthine oxidase,
Adipophilin và Lactadherin (MFG-E8) cũng có mặt với
mức độ phong phú cao hơn trong các exosomes.

Các exosom từ sữa bò được làm giàu bằng các chất đánh dấu exosomal. (a) Bản đồ nhiệt cho thấy
sự phong phú của các protein đánh dấu ngoại vi trong sữa non và các exosomes MM. Biểu thức tỷ
lệ của mỗi protein, được ký hiệu là hàng Z-score, được vẽ trong thang màu đỏ-xanh. Mức độ biểu
hiện cao được biểu thị bằng màu đỏ và mức độ biểu hiện thấp được hiển thị bằng màu xanh lam.
Tương tự như phân tích Western blot, Alix (PDCD6IP) được tìm thấy có nhiều hơn trong các mẫu
sữa non khi so sánh với các mẫu MM. Các mẫu sữa non 72 giờ có hàm lượng protein thành phần
ESCRT cao hơn. (b) Sự phong phú cao hơn của các protein họ Rab đã được quan sát thấy trong cả
sữa non và các exsome MM. (c) Sự tăng sinh của các tích phân, đóng vai trò quan trọng trong việc
hấp thụ exosomal của các tế bào đích đã được quan sát thấy trong tất cả các exsome.

Các exosomes từ sữa non được làm giàu với các protein liên quan đến phản ứng miễn dịch
Để có thêm thông tin chi tiết từ dữ liệu protein, các protein được xác định từ các exomes phân lập
từ các mẫu sữa non 24, 48 và 72 giờ đã được kết hợp thành một danh sách tổng thể (từ nay được
gọi là sữa non). Dữ liệu protein exosome kết hợp của sữa non được so sánh với proteome exosome
MM (Hình 5a). Tổng cộng 8124 và 4443 protein duy nhất đã được xác định trong mỗi loại sữa non
kết hợp và các proteome ngoại vi MM. Phần lớn các protein (3137) được xác định là điểm chung
giữa MM và các proteome ngoại vi sữa non kết hợp. Protein dồi dào ít nhất gấp 3 lần trong sữa non
kết hợp và proteome ngoại vi MM được tiếp tục phân tích làm giàu chức năng bằng cách sử dụng
công cụ FunRich20. Protein dồi dào ít nhất gấp 3 lần trong các mẫu sữa non 24 giờ so với MM cũng
được sử dụng trong phân tích này. Như thể hiện trong Hình 5b, các exosomes từ các mẫu sữa non
được làm giàu đáng kể với các protein liên quan đến phản ứng miễn dịch bẩm sinh, phản ứng viêm,
phản ứng giai đoạn cấp tính, kích hoạt tiểu cầu, tăng trưởng tế bào và kích hoạt bổ thể. Ngược lại,
các exosomes từ MM được làm giàu với các protein liên quan đến quá trình vận chuyển và quá trình
apoptosis. Việc phân tích các con đường sinh học trong các exosomes phân lập từ các mẫu sữa
non đã làm nổi bật sự phong phú của các protein liên quan đến quá trình phân hủy tiểu cầu / bạch
cầu trung tính, các peptit kháng khuẩn, hình thành cục máu đông, sợi đàn hồi và hoạt hóa bổ thể.
Nhìn chung, những dữ liệu này cho thấy rằng các exsome trong sữa non được làm giàu với các
protein liên quan đến phản ứng miễn dịch và tăng trưởng. Do đó, có thể suy đoán rằng exosomes
trong sữa non có thể có một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh phản ứng miễn dịch và tăng
trưởng ở trẻ sơ sinh, ít nhất là một phần.

Các exosomes từ sữa non được làm giàu với các

protein liên quan đến phản ứng miễn dịch. (a) Sơ
đồ Venn của các protein được xác định trong MM
và exosomes sữa non. Hơn 4980 protein đã
được xác định duy nhất trong các mẫu sữa non.
(b) Phân tích làm giàu chức năng bằng cách sử
dụng FunRich cho thấy các protein khác nhau
liên quan đến phản ứng miễn dịch bẩm sinh,
phản ứng viêm, phản ứng giai đoạn cấp tính,
kích hoạt tiểu cầu và tăng trưởng tế bào được
làm giàu cao trong các exsome phân lập từ sữa
non (mẫu 24, 48 và 72 giờ) cùng với làm giàu
đáng kể trong 24 giờ mẫu của chính nó. * Kí hiệu
P 0,05. (c) Biểu đồ đại diện cho các protein liên
quan đến hoạt hóa bổ thể và các peptit kháng
khuẩn được làm giàu đáng kể trong các exsome
từ sữa non và mẫu 24 giờ khi so sánh với MM. *
Kí hiệu P 0,05.

Thảo luận:
Trong quá khứ, ngày càng có nhiều sự quan tâm nhằm làm sáng tỏ khuôn khổ nhiều mặt của
proteome sữa. Do đó, nhiều kỹ thuật khác nhau đã được sử dụng để phân tách và xác định các
protein này trong cả mẫu sữa non và mẫu MM. Bản chất phức tạp của sữa không cho phép độ sâu
bao phủ của proteome cao hơn vì hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào các mẫu sữa không
phân đoạn. Mặc dù có một số nghiên cứu đáng kể liên quan đến việc tìm hiểu các đặc tính của sữa
non bò, có rất ít nghiên cứu cố gắng làm nổi bật sự thay đổi từ sữa non sang sữa trưởng thành, tại
các thời điểm khác nhau. Gần đây, Zang et al. lần đầu tiên cho thấy những thay đổi về số lượng xảy
ra trong proteome sữa bò trong 9 ngày đầu đẻ 8. Hiểu được sự chuyển đổi này là rất quan trọng để
giải mã sự phức tạp trong tương tác của các protein sữa có tác động tiềm tàng đến sự phát triển
của trẻ sơ sinh.

Mục đích của nghiên cứu này là điều tra, mô tả đặc điểm và so sánh proteome exosome sữa bò từ
mẫu MM và sữa non sau 24, 48 và 72 giờ đẻ. Chúng tôi đã sử dụng phương pháp ly tâm gradient
mật độ OptiPrep để tinh lọc các exosomes. Tất cả các quần thể exosom được phân lập đều thể hiện
dấu hiệu TSG101 exosomal, trong khi Alix được tìm thấy có nhiều hơn trong các mẫu sữa non. Các
exosomes tiết lộ hình thái hình cốc điển hình và được cân bằng trong cùng một mật độ đề xuất là
1,08–1,24 gm / mL15. Phân tích protein so sánh cho thấy các protein phổ biến cũng như nhiều
protein độc nhất trong số các mẫu. Như mong đợi exosomes từ tất cả bốn mẫu được làm giàu với
một số protein sữa phổ biến như Butyrophilin, Xanthine oxidase, Adipophilin và Lactadherin (MFG-
E8). Nhiều loại protein khác nhau đóng vai trò quan trọng trong việc kết hợp và kết hợp các túi, bao
gồm cả các protein họ Rab nổi tiếng, cũng có mặt rất nhiều18. Hơn nữa, các tích phân chịu trách
nhiệm cho việc neo đậu và hấp thụ các exosomes đã được quan sát thấy ở biên độ trong tất cả bốn
mẫu. Một mô hình khác biệt xuất hiện trong các mẫu khi protein phong phú hơn gấp 3 lần trong mẫu
24 giờ so với MM. Quan sát thấy rằng một số protein có nhiều trong 24 giờ, giảm dần ở 48 và 72
giờ và có lượng tương tự với mẫu MM. Trước đây, một số protein liên quan đến hệ miễn dịch trong
sữa bò đã được báo cáo là giảm theo thời gian

Các bằng chứng gần đây đã chỉ ra rằng exosomes đóng một vai trò không thể thiếu trong việc kích
hoạt chức năng miễn dịch và exosomes từ sữa mẹ đã được chứng minh là có tác động đến hệ
thống miễn dịch của trẻ sơ sinh23. Phân tích làm giàu bằng cách sử dụng FunRich24 cho thấy
exosomes từ các mẫu sữa non của bò được làm giàu đáng kể với các protein liên quan đến phản
ứng miễn dịch bẩm sinh. Các protein tham gia vào phản ứng giai đoạn cấp tính giống như phản ứng
toàn thân (APR) quan trọng nhất được điều chỉnh cao trong các mẫu sữa non. Các protein trong giai
đoạn cấp tính điều chỉnh thành phần huyết tương và được biết là có lợi cho sinh vật bằng cách ngăn
chặn sự phát triển của vi sinh vật và thiết lập lại cân bằng nội môi. Một số vi sinh vật dễ bị opso hóa
bởi các protein giai đoạn cấp tính cũng có thể kích hoạt bổ thể bất hợp pháp25. Các peptit kháng
khuẩn khác nhau cũng được tìm thấy với mức độ phong phú cao hơn cùng với phản ứng viêm và
các protein hoạt hóa bổ thể. Sự hiện diện của chúng rất quan trọng, vì chúng là tuyến phòng thủ đầu
tiên trong quá trình phát triển của trẻ sơ sinh. Các protein bổ sung này cân bằng với các cơ chế bảo
vệ miễn dịch và không miễn dịch khác trên niêm mạc đường tiêu hóa ở trẻ sơ sinh. Protein điều hòa
sự phát triển tế bào và điều hòa tích cực sự tăng sinh tế bào cũng được làm giàu trong các mẫu
sữa non. Những protein này điều chỉnh sự tiến triển của hệ thống miễn dịch của trẻ sơ sinh cùng với
sự biệt hóa, sửa chữa và tăng trưởng của các cơ quan và mô đích khác nhau dành riêng cho trẻ sơ
sinh trong khi vẫn duy trì chức năng của tuyến vú đang cho con bú26. Sự phong phú của các
protein điều hòa quá trình đông máu cùng với hoạt hóa tiểu cầu cho thấy vai trò đặc biệt của sữa
non trong việc điều chỉnh hệ thống miễn dịch bẩm sinh của trẻ sơ sinh.

Mặc dù proteome exosome của sữa bò đã được nghiên cứu trước đây4 nhưng nó tập trung vào
sữa thu được từ một con bò đang cho con bú. Nghiên cứu này cung cấp một phân tích chức năng
chuyên sâu mới của sữa non, trong đó chúng tôi đã sử dụng phương pháp tiếp cận proteomics để
thu thập thông tin mầm non về mặt sinh học về vai trò chức năng của protein sữa ngoài nguyên tử
của bò. Có thể một số protein được xác định trong nghiên cứu này có thể được hấp phụ vào bề mặt
màng ngoài của các exsome. Tuy nhiên, các kết quả cho thấy rằng một loạt các protein có trong
proteome exosome của sữa non có vai trò cơ bản trong quá trình phát triển và sửa chữa tế bào
cũng như các phản ứng miễn dịch bẩm sinh chống lại sự lây nhiễm mầm bệnh. Hơn nữa, kết quả
chỉ ra rằng các protein khác nhau có trong sữa non điều chỉnh các sự kiện tăng sinh trong đường
tiêu hóa của trẻ sơ sinh, bao gồm cả sự phát triển tế bào máu. Dữ liệu này nhấn mạnh vai trò sinh
học của các exosomes sữa bò chứa rất nhiều protein không chỉ tham gia vào quá trình điều hòa
miễn dịch mà còn trong quá trình tăng trưởng, sửa chữa và phát triển của trẻ sơ sinh.

Nguyên liệu và phương pháp:

Sữa mẫu:

Bò sữa đẻ vào mùa thu được chọn ngẫu nhiên trong nghiên cứu này. Bò sữa được Holstein
Friesian lai tạo và cư trú tại Trang trại bò sữa gia đình Warnock ở Swanpool thuộc Đông Bắc
Victoria, Úc. Những con bò được sử dụng trong nghiên cứu có mức độ hoạt động trung bình và
không có bất kỳ bệnh tật nào. Ủy ban Đạo đức Động vật La Trobe đã phê duyệt tất cả các quy trình
thử nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu này. Tất cả các phương pháp được thực hiện theo các
hướng dẫn và quy định có liên quan. Trước khi nghiên cứu, tất cả các con bò đều khỏe mạnh. Các
mẫu sữa non của bò được lấy riêng trong vòng 24 (hai lần vắt sữa đầu tiên là 12 và 24 giờ gộp lại
với nhau), 48 và 72 giờ sau khi đẻ. Các mẫu sữa trưởng thành (MM) cũng được thu thập để phân
tích so sánh. Bò sữa đẻ vào mùa thu được chọn ngẫu nhiên cho nghiên cứu này. Các mẫu sữa
được đông lạnh ngay sau khi vắt sữa và được bảo quản ở -80 ° C cho đến khi sử dụng