Lakatos Szilvia

DE OEC ÁOK
OLKD Tanszék
 kriosztát
 Kerekes
 Szánkás szánkás

 Fagyasztó mikrotóm = kriosztát

kerekes
 Teljes mértékben manuális
 A tárgyasztal fix, a kés mozog (előre-hátra)
A penge fixen áll, és a blokk mozog (fel-le),
amit egy kerék forgatásával befolyásolunk.
 OLKD Tanszéken félautomata mikrotómok
 Sorozatmetszet készítésére
alkalmas
 Régebben acélból készült, vastag, nehéz
késeket használtak.
 Ma már eldobható vékony pengéket
alkalmazunk.
A kések élüket tekintve lehetnek:
 mindkét oldalukon egyenesek = biplán
(fagyasztott metszethez)
 felső élükön homorúak = plankonkáv (paraffinos
metszet készítés)
 Mindkét oldalon homorú = bikonkáv (puha
anyagokhoz)
 Kemény anyagokhoz a tetejükön kicsit
megtört penge (csontkés)
A dőlésszöget a minta keménysége határozza
meg.
 Keményebb anyagoknál nagyobb, míg
puhábbaknál kisebbre állítjuk.
 A dőlésszöget 13°és 18°között változtatjuk
 Ha az anyag nem metsződik, akkor vagy túl
kemény a minta, vagy nem tökéletes a
víztelenítés/paraffin átitatás
 Ha csak minden 2.-3. metszet lesz jó, a többi
szétmorzsolódik, akkor életlen a kés, vagy túl
lapos a dőlésszöge, illetve túl vékony a
metszet
 Ha a metszetek gyűrődnek, akkor magas a
külső környezet hőmérséklete
 Ha hosszirányban csíkos/hasadt a metszet,
akkor kicsorbult a penge
 Ha haránt irányban hasadozott, akkor túl
meredeken áll a kés
 Zsírtalanítás
A tárgylemez tisztítása acetonnal történik, ami
leoldja a zsírt.
A zsíros tárgylemezre nem tapad rendesen a minta,
illetve fals reakciókat adhat.
1. Sósavas alkoholban (600ml 96%-os alkohol +
30ml cc. HCl + 1000ml desztvíz)
2. 30’’-es acetonos előkészítés
 Coatingolás
A coating a tárgylemez bevonása valamilyen
anyaggal, ami segít, hogy a metszet a
tárgylemezre tapadjon.
A tárgylemez
 Adatok felírása ceruzával speciálisan
kiképzett végére
A tárgylemezre a sorszámot, illetve bármilyen adatot kell írni a
mindig GRAFITCERUZÁVAL írjuk fel, mert az alkoholos, feliratokat.

xylolos, acetonos kezelések során leoldódik a tinta, és

akkor nem tudjuk azonosítani a metszeteinket.
 Szilán
 Laboratóriumban készíthetünk szilános tárgylemezt, de manapság
ezeket már gyárilag készítik, így használat előtt már semmilyen
előkezelést nem igényelnek (zsírtalanítást sem!! Mert azzal lemossuk a
szilános réteget)
 Főként immunhisztokémiai reakciókhoz használják, ahol nagyon fontos
a metszetek megfelelő tapadása, mert magas hőkezelésnek vannak
kitéve a reakció során, amit ki kell bírniuk.
 2ml szilan + 98ml aceton oldatba mártás után 3x desztvizes öblítés,
szárítani 37°C-on (termosztátban), a metszetet 56°C-on
 Glicerines tojásfehérje
 Ez is a tárgylemez bevonására szolgál, amit szűrt tojásfehérjéből
készítünk glicerin és thymol hozzáadásával. Ezt 0-5°C-on tároljuk,
hígítva használjuk a tárgylemez bevonására.
 Króm zselatin
 10g zselatin + 1000ml desztvíz  56°C-on egy éjszaka + 0,9g KCr(SO4)2
 Az előkészített tárgylemezre vesszük fel a metszetet.
A lemetszett mintát fényes felszínével lefelé
hideg vízre tesszük, hogy kiterüljön, majd a
tárgylemezzel alá nyúlunk, felvesszük rá, és
átvisszük meleg vízre (50-54°C-os, hogy a
paraffin kicsit meglágyuljon, de ne olvadjon
szét, a hőmérséklet a mintától és a
metszetvastagságtól is függ), hogy
kisimuljanak a gyűrődések.
 Ezután a metszetet 37°C-os termosztátba
tesszük, hogy megszáradjanak (egy éjszakán
át)
1. Hideg víz

2. Meleg víz

Benne desztillált víz!

50-54°C
A metszeteket inkubátorba tesszük, hogy
megszáradjanak. Gyakorlatilag „rászárad” a
tárgylemezre, így a tapadás elég jó ahhoz, hogy
a festés során szükséges vegyszeres
kezelésekkor ne váljon le a tárgylemezről a
metszet.
Az inkubátor hőmérséklete 37°C.
 Kerekes mikrotóm, aminek a légterét hűtjük.
Ez nem fixált, nem paraffinos minták
metszésére alkalmas. A mintát egy tőkére
ragasztjuk, majd fagyasztjuk (szénsavhó és
izopentán segítségével), ezután a
kriosztátban metszük.
A kriosztát belső hőmérséklete: -20-25°C
 Félautomata
 „Szendvics”: tőke + ragasztó (hidegben
megfagy) + parafadarab + ragasztó + minta
 A „szendvicset” belemártjuk a kb. -70°C-os
könnyűbenzinbe (izopentán, petroléter, éter,
stb.). A lehűlést a szilárd halmazállapotú CO2
azaz szénsavhó segítségével érjük el.
 Lehetőség van a fagyasztást folyékony
nitrogénnel csinálni, ilyenkor a hőmérséklet
kb. -180°C, de ez sokkal drágább, így
kevésbé használatos.
 Paraffinos metszetkészítés: a beágyazás
során a minta megkeményedik. A beágyazás
hosszadalmas, oldószer-igényes, hőkezelés
szükséges.
 Fagyasztott metszetkészítés: nincs szükség
beágyazásra. A minta megkeményítése
fagyasztással történik. Gyors folyamat,
amihez nincs szükség különösebben
oldószerekre, hőkezelés sincs. Viszont
JÉGKRISTÁLYOK ALAKULNAK KI! Csak előzetes
diagnózis felállítására alkalmas!
A szövetek, sejtek lebomlását, károsodását alacsony hőmérsékletre való hirtelen lehűtéssel
lehet megakadályozni. A fagyasztásra folyékony levegőt, vagy folyékony nitrogént (-180°C)
használunk, amibe egy fém tartályban valamilyen intermediumot rakunk (ezen a hőmérsékleten
nem fagy meg, és a szövetekbe jól penetrál), ami többnyire isopentán. A vizsgálati anyag ebbe a
folyadékba kerül, így egyenletesen fagy meg. A következő feladat a szövetmintában levő víz
eltávolítása. A lefagyott anyagból a vizet vákuumban párologtatjuk el. A kristályos víz a
szövetdarabból vákuum hatása alatt elpárolog. Ennek céljából a rendszert tovább hűtjük, és
vákuum alatt tartjuk. A rendszerbe vízelnyelő anyagot is kell helyezni, ami az elpárologtatott
vizet megköti, ilyen anyag a foszfor-pentoxid. Az elpárologtatott vizet un. hidegujjas eljárással
ki is fagyaszthatjuk. A hideg ujj folyékony nitrogént tartalmazó olyan üveg, amely benyúlik a
vákuumba. Az elpárologtatás során lassan emeljük a rendszer hőmérsékletét.
A víz eltávolítását végezhetjük (a) metszés előtt. Ebben az esetben a rendszerbe, egy kis
üvegedénybe alacsony olvadáspontú paraffint helyezünk, a
lefagyasztott anyagot a paraffinra tesszük. Az elpárologtatás végén, vákuum alatt a
rendszert addig melegítjük, amíg a paraffin felolvad és a már vízmentes
anyag belesüllyed. Így szövetdarabunk paraffinba ágyazódott.
A víz eltávolítása történhet (b) metszés után is. Ebben az esetben a metszetet zárt
vákuum csőben hozzuk szobahőmérsékletre, paraffinolajat tartalmazó
tárgylemezre helyezzük, majd fedőlemezzel lefedjük.
Immunhisztokémia kezdetén használták.