NF3.

APLICACIÓ DE TÈCNIQUES
D’ANÀLISI CROMOSÒMICA
1.INTRODUCCIÓ
1. EL CROMOSOMA
2. EL CICLE CEL·LULAR
3. MUTACIONS
2.PRINCIPIS BÀSICS DE CITOGENÈTICA
1. TINCIÓ I BANDEIG DE CROMOSOMES
2. IDIOGRAMA I NOMENCLATURA DE BANDES
3.CITOGENÈTICA HUMANA I ANÀLISI CROMOSÒMIC
1. CARIOTIP ESTÀNDAR DE SANG PERIFÈRICA
2. ANÀLISI CROMOSÒMIC
3. NOMENCLATURA CITOGENÈTICA I FORMULA CROMOSÒMICA
4. CARIOTIP D’ALTA RESOLUCIÓ
5. CITOGENÈTICA I DIAGNÒSTIC PRENATAL
6. CITGENÈTICA I CÀNCER
 2.1. Tinció i bandeig de
cromosomes

El millor moment per visualitzar i estudiar els cromosomes, és

des de el final de la profase fins al final de la metafase.

Les tècniques de tinció i bandeig cromosòmic en la metafase,

ens permetran identificar els cromosomes i detectar la presència
d’anomalies.
2.1.1. MÈTODES DE TINCIÓ

Les tincions convencionals utilitzen Giemsa o orceïna i tenyeixen

els cromosomes de manera uniforme i intensa.

Permeten contar-los, ordenar-los per tamany, posició del

centròmer i calcular l’Ic.

No sempre és possible la identificació individual de tots els

cromosomes, ja que n’hi ha diversos que tenen morfologia
semblant. Tampoc permet la detecció d’anomalies estructurals
2.1.2. TÈCNIQUES DE BANDEIG CROMOSÒMIC
Tinció discontínua, en bandes transversals
 patrons de bandeig específics per cada cromosoma
Jérôme Lejeune i Klaus Patau: fundadors de la citogenètica humana

Tècniques de bandeig:
 BANDEIG G
 BANDEIG R
 BANDEIG Q
 BANDEIG C
http://www.tokyo-med.ac.jp/genet/index-e.htm
BANDEIG G
Tècnica GTG (bandes G per tripsina i Giemsa)
 Es tracten preparacions metafàsiques envellides amb
tripsina i tenyint-les amb Giemsa.
 És la tècnica més utilitzada en els laboratoris de citogenètica.
 Cada cromosoma es tenyeix amb un patró específic:
 Bandes fosques G+:
 regions riques en Adenina-Timina
 Repliació tardana
 Pocs gens
 Bandes clares G-:
 regions riques en Guanina-Citosina
 Replicació primerenca
 Molts gens
Font: http://biomodel.uah.es/citogene/horwitz/cytogen1.htm
BANDEIG R
O Revers

Patró de bandes revers al de les bandes G

S’obtene tractant les preparacions amb calor (tampó de
Sorensen a 85ºC) i tenyint-les amb Giemsa
Útil per tenyir els extrems distals dels cromosomes.
BANDEIG Q
Bandeig fluorescent mitjançant quinacrina.
S’observen les preparacions en un microscopi de fluorescència
Les bandes més brillants coincideixen amb les bandes G+
BANDEIG C
Tinció de les regions riques en heterocromatina:
 Centròmers
 Regions pericentromèriques del braç q dels cromosomes 1, 9 i 16
 Regió distal del braç q del cromosoma Y.

Es tracten les preparacions amb àcid clorhídric, un àlcali (hidròxid

de bari) i calor (tampó SSC a 60-65ºC) i es tenyeixen amb Giemsa.
Font: http://www.geocities.ws/biolgene/gal.htm
 2.2. IDIOGRAMA I
NOMENCLATURA DE BANDES

Idiograma és la representació gràfica simplificada d’un

cromosoma tenyit mitjançant una tècnica de bandeig.

Mapa cromosòmic, on s’observa la posició del centròmer,

la relació entre el braç curt i el llarg, existència de satèl·lit
en cromosomes acrocèntrics i el patró de bandes.

El més utilitzat és l’idiograma de bandes G

ISCN: International System for Human Cytogenetic Nomenclature

Sistema internacional de nomenclatura de les bandes de

l’idiograma, per tal d’evitar confusions en els informes
d’investigació citogenètica.
Es basa en l’idiograma de bandes G.
Permet identificar una àrea concreta d’un cromosoma
Fonamental per definir alteracions cromosòmiques
estructurals.
París 1971; s’estableixen els criteris de la nomenclatura
cromosòmica humana.
ISCN s’actualitza periòdicament.
Aquest sistema té en compte:

Els braços p i q de cada cromosoma es divideixen en regions

numerades consecutivament.
Cada regió es divideix en bandes G (G+ i G-) numerades
consecutivament.

Amb aquest sistema es pretén denominar amb un codi cada una

de les bandes (G+ i G-) observades en els cromosomes
metafàsics totalment condensats.
CROMOSOMA-BRAÇ-REGIÓ-BANDA
CRITERIS DEL CODI:
El cromosoma es representa sempre amb el braç curt en posició
superior i el llarg en posició inferior.
Les regions de cada braç es numeren de centròmer a telòmer.
Les bandes de cada regió es numeren també de centròmer a
telòmer.
La divisió entre regions s’assenyala sempre a la meitat d’una
banda, que serà sempre la banda 1 de la regió més allunyada del
centròmer.
Exemple:
codi 2q24: quarta banda de la segona regió del braç llarg del
cromosoma 2.
Dos q dos quatre
NO!!!: dos q vint-i-quatre
 El bandeig de cromosomes metafàsics humans té una
resolució de 400 bandes.
 El bandeig de cromosomes en profase (menys compactats), té
més resolució: de 550 bandes fins a 850 bandes.
 Amb una resolució de 550 bandes:
 Es manifesten subbandes dins les bandes dels cromosomes
metafàsics.
 Les subbandes es numeren també de centròmer a telòmer.
 S’afegeix un punt al codi de la banda i el número de subbanda.
Exemple:
Codi 2q24.2: Segona subbanda de la quarta banda de la segona
regió del braç llarg del cromosoma dos.
 Amb una resolució de 850 bandes s’observen subsubbandes
dins de les subbandes, que es numeren amb els mateixos
criteris:
CROMOSOMA 2

A: Resolució B: Resolució
350-400 550 bandes
bandes
 36.3
36.2
36.1

Chromosome 1 35
34.3
34.2
34.1
33
32.3
32.2
32.1
31.3
31.2
p 31.1

22.3
22.2
22.1

21

13.3
13.2
13.1
12
11
11

12

21.1
21.2
21.3
22
23
24
25

q 31

32.1
Font: http://www.tokyo- 32.2
32.3
med.ac.jp/genet/index-e.htm 41
42.1
42.2
42.3
43
44
 25.3
25.2

Chromosome 2 25.1
24
23

22
21

p 16
15
14
13

12
11.2
11.1
11.1
11.2
12
13
14.1
14.2
14.3
21.1
21.2
21.3
22

23
24.1
24.2
q 24.3

31

32.1
32.2
32.3
33
34
35
36
37.1
37.2
37.3
 3.1.CARIOTIP ESTÀNDARD DE
SANG PERIFÈRICA

La citogenètica humana permet el diagnòstic de malalties

amb base genètica.

CARIOTIP: Conjunt de cromosomes d’una espècie, un individu o

una cèl·lula ordenats segons el seu tamany i morfologia
Indicacions per realitzar un cariotip:
Període Indicació
Prenatal Resultat alterat del triple cribatge en el primer trimestre de gestació
Retard en el creixement intrauterí
Observació d’anomalies ecogràfiques en el fetus
Neonatal Presència de defectes congènits, malformacions o tres dismòrfics
Genitals ambigus

Escolar Retard psicomotor

preadolescent Retard mental
Dificultat per l’aprenentatge
Adolescència Falta de desenvolupament puberal
Ginecomastia
Amenorrea
Adult Infertilitat inexplicable
Abort de repetició
Pares de fills amb alteracions genètiques
Cariotip de sang perifèrica:

1.Cultiu del limfòcits (mostra de sang perifèrica).

2.Obtenció d’extensions en metafase
3.Tinció i bandeig dels cromosomes
4.Anàlisi cromosòmic
Fonament de la tècnica de citogenètica:
Per realitzar un cariotip, calen moltes cèl·lules en metafase. Els
limfòcits sanguinis es consideren les cèl·lules més adequades per
aquest propòsit.
Caldrà cultivar-los en un medi apropiat (estèril, amb aa essencials
(glutamina!), vitamines, lípids, àcids grassos, carbohidrats, factors
de creixement, tampó, antibiòtics) a 37ºC durant 72 hores. Els
limfòcits són cèl·lules que contenen ADN (a diferència dels
eritròcits), però ja estan diferenciats, de manera que no patiran
mitosis. Caldrà que afegim al medi de cultiu un estimulant de la
mitosis, la fitohemaglutinina, que promou la desdiferenciació
dels limfòcits madurs, induint la seva divisió cel·lular.
Després del cultiu afegirem colchicina, que produeix una parada
de les mitosis en metafase, ja que trenca les fibres del fus
acromàtic impedint que les cèl·lules passin a anafase. Obtindrem
moltes cèl·lules en metafase, entre els milers de cèl·lules en
interfase.
Després de les 72 hores de cultiu i el temps de colchicina, es
procedirà al sacrifici de la mostra. En aquesta fase trencarem la
membrana plasmàtica i la membrana nuclear de les cèl·lules i
després les rentarem amb un fixador (fixador Carnoy) per tal que
les metafases amb els seus cromosomes es puguin visualitzar.
El trencament el farem amb un xoc hipotònic (per òsmosis entra
aigua a les cèl·lules i trenca les membranes).
El rentats es fan amb fixador Carnoy (metanol + àcid glacial) que
eliminen les restes de membrana i citoplasma i fixen la mostra.
Farem l’extensió en un portaobjectes per la seva visualització.
Els passarem amb tripsina per aconseguir el bandeig
cromosòmic (la tripsina provoca la desnaturalització i
trencament de determinades regions del cromosoma segons el
seu contingut en AT o CG).
Tenyirem amb Giemsa per observar les bandes.
L’anàlisi cromosòmic es farà en un microscopi, localitzant les
metafases amb l’objectiu de 10X i analitzant-les amb el de 100X,
amb oli d’immersió.
Es conten el nombre de cromosomes de la metafase i
s’identifiquen els cromosomes homòlegs, diferenciant-los dels
sexuals. S’utilitzarà l’ideograma, com a patró de referència de la
morfologia i de les bandes dels cromosomes.
 3.2. Anàlisi cromosòmic

 Recompte i anàlisi cromosòmic de metafases complertes

 Ordre i aparellament:
 CARACTERÍSTIQUES MORFOLÒGIQUES DELS CROMOSOMES
HUMANS:
 Tamany
 Posició del centròmer
 Presència de constriccions secundàries
 GRUPS
 PATRÓ DE BANDES G
 Automatització de l’anàlisi cromosómic: CARIOTIPADORS
 Recompte i anàlisi cromosòmic de metafases:
 Un mínim de 20 metafases complertes visualitzades a 100X.
 Fotografiar les 5 millors, en les quals es compara cada cromosoma
amb el seu homòleg BANDA a BANDA.
 En cas de mosaics, cal analitzar 30 metafases!!!!

 Ordre i aparellament:
Construcció del cariotip ordenant els cromosomes per parelles
homòlogues, en funció de:
Les CARACTERÍSTIQUES MORFOLÒGIQUES
El PATRÓ DE BANDES G dels cromosomes metafàsics.
CARACTERÍSTIQUES MORFOLÒGIQUES DELS CROMOSOMES HUMANS:

 Tamany: De gran a petit.

 Posició del centròmer:

Metacèntrics ; Submetacèntric; Acrocènctrics

 Presència de constriccions secundàries

 GRUPS DE CROMOSOMES:
 GRUP A: Cromosomes 1, 2, i 3. 1 i 3 metacèntrics i 2 submetacèntrics.
 GRUP B: Cromosomes 4 i 5; grans i submetacèntrics.
 GRUP C: Cromosomes 6 a 12, submetacèntrics de tamany mitjà, excepte X.
 GRUP D: Cromosomes 13, 14 i 15. Acrocèntrics de tamany gran, amb constricció
secundària i satèl·lit.
 GRUP E: Cromosomes 16, 17 i 18. Submetacèntrics i petits.
 GRUP F: Cromosomes 19 i 20. Metacèntrics petits.
 GRUP G: Cromosomes 21 i 22. Acrocèntrics petits, amb constricció secundària i
satèl·lit.
 CROMOSOMES SEXUALS: X (submetacèntric mitjà) Y (acrocèntric petit)
 PATRÓ DE BANDES:
El patró G és el més utilitzat en citogenètica. És útil per
diferenciar els cromosomes, principalment els del grup C.
El patró de bandes depèn del grau de condensació dels
cromosomes tenyits. El patró estàndard de 350-400 bandes
correspon a cromosomes metafàsics totalment condensats.
Idiograma cromosoma 14
 3.3. Formula citogenètia

Formula cromosòmica
Sense anomalies
Anomalies numèriques
Anomalies estructurals
Formula cromosòmica
Sense anomalies
Anomalies numèriques
Anomalies estructurals
Mosaics: Es descriuen totes les línies cel·lulars començant per
les anormals i acabant amb la normal. Les línies cel·lulars es
separen amb /. Per conèixer la proporció de cada línia cel·lular es
posen entre claudàtors el nº de metafases analitzades
 Mos47,XXY[15]/46XY[30]: Individu amb mosaicisme en el qual
s’han analitzat 45 metafases. En 15 d’elles s’ha detectat una
disomia del cromosoma Y, mentre que les 30 restants són
normals.
 Abreviatures en les formules cromosòmiques
Abreviatura Significat Abreviatura Significat
o símbol o símbol
cen centròmer mos mosaic
chi quimera p braç curt
chr cromosoma pter telòmer del braç curt
del deleció q braç llarg
der cromosoma invertit qter telòmer del braç llarg
dic cromosoma dicèntric r cromosoma en anell
dup duplicació rec cromosoma recombinant
dir directa rob translocació robertsoniana
i isocromosoma t translocació
ins inserció ; separació entre cromosomes
inv inversió + augment nº cromosomes
mar cromosoma marcador - dismimució nº cromosomes
/ Separació entre línies cel·lulars de mosaics o quimeres
Anomalies estructurals:
S’escriuen després de les numèriques (si n’hi ha) o després dels
cromosomes sexuals, separades per una coma.
Quan afecten un cromosoma (deleció, duplicació, inversió i
cromosoma en anell):
abreviatura-(nºcromosoma)-(bandes afectades)
 46, XX,del(9)(q22)
 46,XY,del(2)(q21q32)
Quan afecten dos cromosomes (translocacions):
 Translocacions no recíproques:es consideren insercions
 46,XY,ins(10;3)(q22;p13p23)
 Translocacions recíproques: 1r cromosomes sexuals i després
autosomes de petit a gran
 46,Y,t(X;17)(q23;q21)
 46,XX,t(9;10)(q32;p14)
 3.4. CARIOTIP D’ALTA RESOLUCIÓ

És el que s’obté a partir de cromosomes en profase tardana o

prometafase.
Cromosomes en menor condensació: 550-850 bandes G
Permet detecció d’alteracions cromosòmiques estructurals a
partir de 5Mb
Sincronització del cultiu de limfòcits:
 Metotrexat: Inhibeix dihidrofolat reductasa  bloqueig en fase S
 Timidina (o anàleg sintètic)  reinici de la síntesi de DNA
 Colchicina  Evita la foramció del fus acromàtic
PROCEDIMENT CARIOTIP ALTA RESOLUCIÓ

1.Cultiu de limfòcits
2.Incuba a 37ºC 48-56 hores
3.Afegeix metotrexat
4.Incuba a 37ºC durant 12-16 hores
5.Afegeix timidina o bromodesoxiuridina (BrdU)
6.Incuba a 37ºC durant 5 hores
7.Afegeix 1 o 2 gotes de colchicina o colcemid
8.Incuba a 37ºC 30 minuts
9.Sacrifici del cultiu
 3.5. CITOGENÈTICA I DIAGNÒSTIC
PRENATAL
Indicacions:
Resultat alterat del triple cribatge (bioquímic i ecogràfic) en el
primer terç de gestació
Retard en el creixement uterí
Observació d’anomalies ecogràfiques en el fetus
Antecedents de cromosomatia en un porgenitor

Tipus:
Cariotip de vellositat coriònica
Cariotip de líquid amniòtic
Vellositat coriònica:
1. Biòpsia
2. Rentar i seleccionar la mostra
1. Tubs RPMI 1640+Ab+heparina
2. Placa petri
3. MO
3. Cultiu
1. Curt (mitosis espontànies)
2. Llarg (cultiu de fibroblasts)
4. Preparar extensions en metafases

Inconvenients:
 Risc mosaicisme
 Poques metafases i de mala qualitat
LÍQUID AMNIÒTIC
Amniòcits i fibroblasts en el líquid amniòtic, procedents de la
descamació de les membranes que envolten el fetus i del propi
fetus.
 Punció transabsominal (16-18 setmanes gestació)
 Cultiu del líquid amniòtic
 3.6. CITOGENÈTIC I CÀNCER

Moltes neoplàsies tenen el seu origen en alteracions

cromosòmiques, tant numèriques com estructurals
Les alteracions, en les cèl·lules tumorals, aporten informació
sobre el diagnòstic, pronòstic, evolució i tractament de les
malalties tumorals.
Mecanismes pels quals les alteracions produeixen càncer:
Alteracions estructurals com translocacions i inversions
Delecions i aneuploidies