TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM & MÔI TRƯỜNG

Giáo Trình Tóm tắt

THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. Lê Thái Hoàng

Tp HCM, ngày 10 tháng 02 năm 2022

 KẾ HOẠCH THỰC HÀNH

Buổi Nội dung thực hành

học
1: Chuẩn bị dụng cụ và môi trường nuôi cấy VSV
-Bài 1: Phương pháp khử trùng
1
-Bài 2: Chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy VSV
-Bài 3: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy VSV

2: Kỹ thuật phân lập và nuôi cấy Vi sinh vật

2 -Bài 4: Kỹ thuật thao tác vô trùng
-Bài 5: Phương pháp phân lập VSV, tạo khuẩn lạc đơn

3: Phương pháp quan sát Vi sinh vật

3 -Bài 6: Phương pháp tạo tiêu bản và quan sát VSV bằng kính hiển vi quang học

4: Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu nước
Bài 7: Phương pháp thu mẫu, bảo quản, mẫu môi trường
4 Bài 8: Các phương pháp định lượng VSV
Bai 9: Định lượng tổng VSV hiếu khí trong mẫu nước bằng phương pháp đếm khuần
lạc
5: Định lượng tổng coliform, coliform chịu nhiệt, và E. Coli trong mẫu nước
5 Bài 10: Phương pháp định lượng tổng coliform, coliform chịu nhiệt, và E. Coli trong
mẫu nước bằng phương pháp MPN

6: Kiểm tra, ôn tập, thi thực hành

6 -Mỗi bạn SV cần nộp các bài báo cáo từ các buổi thực hành
-Thi thực hành và vấn đáp
1. CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VSV ............................................ 5

1.1. Giới thiệu ...............................................................................................................................................................5

1.2. Nội dung thực hành ..............................................................................................................................................5

1.2.1. Chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy VSV ..................................................................................................................... 5
1.2.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy VSV................................................................................................................5

1.3. Báo cáo kết quả: ....................................................................................................................................................6

1.3.1. Số liệu báo cáo .............................................................................................. Error! Bookmark not defined.
1.3.2. Nhận xét kết quả: .......................................................................................... Error! Bookmark not defined.

1.4. Câu hỏi ôn bài: ...................................................................................................................................................... 6

2. KỸ THUẬT PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY VI SINH VẬT .................................................... 7

2.1. Nguyên tắc:............................................................................................................................................................7

2.2. Nội dung thực hành ..............................................................................................................................................7

2.2.1. Kỹ thuật thao tác vô trùng ...............................................................................................................................7
2.2.2. Phương pháp phân lập VSV, tạo khuẩn lạc đơn .............................................................................................7

2.3. Báo cáo kết quả ................................................................................................................................................... 10

2.4. Câu hỏi ôn bài: ....................................................................................................................................................10

3. PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT VI SINH VẬT ..................................................................... 11

3.1. Bài 6: Phương pháp quan sát VSV.................................................................................................................... 11

3.1.1. Nội dung thực hành ....................................................................................................................................... 11
3.1.2. Vật liệu: ........................................................................................................................................................ 11
3.1.3. Thực hành: .................................................................................................................................................... 11

3.2. Báo cáo................................................................................................................................................................. 12

3.4. Câu hỏi ôn bài: ....................................................................................................................................................12

4. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ TRONG MẪU NƯỚC ...................... 13

4.1. Bài 7: Phương pháp thu mẫu, bảo quản mẫu................................................................................................... 13

4.1.1. Nội dung thực hành ....................................................................................................................................... 13
4.1.2. Thực hành ..................................................................................................................................................... 13
4.1.3. Báo cáo ......................................................................................................................................................... 13

4.2. Bài 8: Các phương pháp định lượng VSV ........................................................................................................ 13

4.2.1. Yêu cầu: SV tự đọc ....................................................................................................................................... 13

4.3. Bài 9: Phương pháp định lượng tổng VSV hiếu khí trong thực phẩm bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 13
4.3.1. Nội dung thực hành ....................................................................................................................................... 13
4.3.2. Vật liệu.......................................................................................................................................................... 13
4.3.3. Thực hành ..................................................................................................................................................... 14

4.4. Báo cáo................................................................................................................................................................. 14

5. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG COLIFORM, COLIFORM CHỊU NHIỆT, VÀ E. COLI TRONG
MẪU NƯỚC ................................................................................................................................ 15

5.1. Bài: Phương pháp định lương tổng coliform, coliform chịu nhiệt, và E. coli ................................................ 15
5.1.1. Nội dung thực hành ....................................................................................................................................... 15
5.1.2. Vật liệu.......................................................................................................................................................... 15
5.1.3. Thực hành ..................................................................................................................................................... 17

5.2. Báo cáo................................................................................................................................................................. 18

5.3. Câu hỏi ôn bài: ....................................................................................................................................................18

5.4. 3. Yêu cầu bài học ................................................................................................... Error! Bookmark not defined.

6. NUÔI BÙN HOẠT TÍNH ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI....... ERROR! BOOKMARK
NOT DEFINED.

6.1. Nội dung thực hành ................................................................................................ Error! Bookmark not defined.
6.1.1. Vật liệu.......................................................................................................... Error! Bookmark not defined.
6.1.2. Thực hành ..................................................................................................... Error! Bookmark not defined.
6.1.3. Báo cáo ......................................................................................................... Error! Bookmark not defined.

7. PHỤ LỤC 1: BẢNG MPN...................................................................................................... 19

7.1. Bảng tính MPN sử dụng ba ống nghiệm ........................................................................................................... 19

7.2. Bảng tính MPN sử dụng 5 ống nghiệm ............................................................................................................. 20

8. PHỤ LỤC 2: HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG .................................................................. 23

8.1. HÓA CHẤT......................................................................................................................................................... 23

8.1.1. Cồn – Ether Tỷ lệ về thể tích 3:1. ................................................................................................................. 23
8.1.2. Cồn – acid (dùng để nhuộm Ziehl Neelsen ) ................................................................................................. 23
8.1.3. Dung dịch sunfo – cromic: K2Cr2O7 + H2SO4 .............................................................................................. 23
8.1.4. Cồn 700: ........................................................................................................................................................ 23
8.1.5. Nước muối sinh lý 9‰ vô khuẩn: ................................................................................................................. 23

8.2. THUỐC NHUỘM. .............................................................................................................................................. 23

8.2.1. Crystal violet (C25H30N3Cl. 9H2O = 570,11 ): .............................................................................................. 23
8.2.2. Lugol: ............................................................................................................................................................ 24
8.2.3. Fuchsine kiềm ( C19H18N3Cl = 323,82 ):....................................................................................................... 24
8.2.4. Safranin O ( C20H19N4Cl = 350,80 ):............................................................................................................. 24
8.2.5. Methylene blue ( C37H27N2S2 = 799,80 ): ..................................................................................................... 25

8.3. MÔI TRƯỜNG ................................................................................................................................................... 25

8.3.1. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM MỐC VÀ NẤM MEN. ........................................................................ 25
8.3.2. II. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐỐI VỚI VI KHUẨN. .............................................................................. 25

8.4. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................................................. 28

1. CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VSV

1.1. Giới thiệu

- Nội quy phòng thí nghiệm
- Các quy tắc an toàn
- Hình thức đánh giá môn học
- Tổ chức các nhóm học: Số lượng SV/lớp: 15-20 SV; Số nhóm: 5; Số SV/ nhóm: 3-4 SV
- Phân công trực nhật
- Giảng dạy các nguyên tắc lý thuyết
- Giảng dạy các bước tiến hành thực hành
o Bài 1: Phương pháp khử trùng
o Bài 2: Chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy VSV
o Bài 3: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy VSV

1.2. Nội dung thực hành

1.2.1. Chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy VSV
1.2.1.1. Yêu cầu:
Mỗi nhóm thực hiện:
- Làm nút bông 10 ống nghiệm, 2 bình tam giác (250ml)
- 1 Ống hút 10ml, 1 ống đong 100ml
- Gói 10 hộp petri
- Sấy và hấp khử trùng.
1.2.1.2. Vật liệu
- 2 Bình tam giác (250ml)
- 10 ống nghiệm,
- 5 hộp petri
- 1 ống hút
- Bông không thấm, giấy gói
1.2.1.3. Thực hành
- Rửa sạch các dụng cụ
- Chuẩn bị theo yêu cầu
- Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp (Autoclave) tại điều kiện 121 oC, trong 15 phút.
- Sau khi hấp, đợi nhiệt độ và áp suất về điều kiện phòng
- Lấy dụng cụ cho vào tủ sấy (50-70oC)

1.2.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy VSV

1.2.2.1. Yêu cầu:
Sinh viên thực hành chuẩn bị pha chế một số môi trường để nuôi cấy VSV.
Mỗi nhóm cần thực hiện:
- Pha 100 ml môi trường LB lỏng, đong vào 10 ống nghiệm, 10ml/ống
 - Pha 100ml môi trường LB agar, đổ 5 đĩa petri
- Yêu cầu: Các ống và đĩa môi trường không được nhiễm VSV sau khi ủ ở 37oC, 15-20h

1.2.2.2. Vật liệu.

Mỗi nhóm cần có:
- 1 Bình tam giác 250ml
- 10 ống nghiệm
- 1 Ống hút 10ml, 1 ống đong 100ml
- Cân, nồi hấp áp lực
- Thành phần môi trường LB lỏng: Peptone 10g/L, Yeast Extract 5g/L, Muối NaCl 10g/L
- Thành phần môi trường LB thạch: Peptone 10g/L, Yeast Extract 5g/L, Muối NaCl 10g/L,
agar 15g/L
1.2.2.3. Thực hành
- Các bước chuẩn bị môi trường nuôi cấy VSV: cân, đong, đo chính xác từng thành phần
của môi trường nuôi cấy.
- Dùng cốc thuỷ tinh cho nước cất vào trong cốc, sau đó cân chính xác từng thành phần
hoá chất để pha chế môi trường cho vào trong cốc đã có nước, vừa cho vào vừa khuấy
đều cho chúng tan ra, nếu cần thiết thì đun nóng trên bếp điện có tấm lướiamian.
- Sau đó đo pH của dung dịch vừa pha xong, cho vào bình tam giác rồi thêm nước cất đến
thể tích mong muốn.
- Để điều chỉnh pH, có thể dùng dung dịch acid HCl (1M) để điều chỉnh giảm, hoặc NaOH
(1M) để điều chỉnh tăng.
- Nếu là môi trường lỏng, thì hút vào các ống nghiệm với thể tích thích hợp.
- Nếu là môi trường thạch thì không hút vào trước mà đem đi hấp ống nghiệm không cùng
với môi trường rồi mới hút vào ống nghiệm sau.
- Làm nút bông, gói lại đem khử trùng trong nồi hấp áp lực tại 121oC, 15phút.
- Sau khi hấp, đối môi trường lỏng, để nguội, và lưu trữ ở 4 oC để dùng trong vòng 1 tháng.
Đối với môi trường thạch, để nguội khoảng 50oC, rồi cần chia vào các ống nghiệm hoặc
đĩa petri. Lưu trữ tại 4oC để dùng trong vòng 1 tháng
- Ủ 1 ống / đĩa môi trường tại nhiệt độ 37oC, 24h để kiểm tra có bị nhiễm hay không.

1.3. Báo cáo kết quả:

Ghi nhận, chụp hình và nhận xét kết quả
-Dụng cụ nuôi cấy VSV: Số lượng, hình ảnh, nhận xét
-Môi trường nuôi cấy VSV: Số lượng, hình ảnh, nhận xét
1.4. Câu hỏi ôn bài:
- Tại sao phải vô trùng? Các phương pháp vô trùng và tiệt trùng?
- Tại sao lại mở nắp đĩa petri khi chuẩn bị môi trường thạch? Tại sao phải điều chỉnh độ
pH?
- Có mấy dạng môi trường thạch ống nghiệm? Nêu các đặc trưng cho từng loại môi
trường?
 2. KỸ THUẬT PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY VI SINH VẬT
2.1. Nguyên tắc:
Tham khảo tài liệu
2.2. Nội dung thực hành
2.2.1. Kỹ thuật thao tác vô trùng
2.2.1.1. Yêu cầu:
- Sinh viên thực hiện các bước chuẩn bị trước khi thao tác vô trùng và thực hành các kỹ
thuật vô trùng để cấy VSV.
2.2.1.2. Vật liệu
- Mỗi nhóm (4 SV) được cung cấp:
- 1 Que cấy vòng
- 1 Đèn cồn
- Môi trường: 8 ống lỏng, 4 ống thạch nghiêng
- Giống E. coli: 1 ống lỏng, 1 ống thạch
2.2.1.3. Thực hành
- Bật đèn cực tím 15 phút sau đó tắt đèn và chờ 10 phút trước khi tiến hành nuôi cầy.
- Rửa tay bằng xà bông, lau khô sau đó khử trùng tay bằng cồn 70.
- Khử trùng que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn.
- Trước khi cấy cần ghi chú cẩn thận lên thành bình hoặc ống nghiệm hoặc petri tên giống
VSV, ngày cấy, và tên SV.
- Phương pháp khử trùng que cấy
- Đốt nóng đỏ đầu que cấy trong ngọn lửa và đốt nhẹ phần cán sẽ đưa vào bên trong dụng
cụ chứa VSV. Mở nút bông và đưa ngay que cấy đã khử trùng vào dụng cụ chứagiống.
Làm nguội que cấy bằng cách áp đầu que cấy vào thành ống nghiệm, bình chứathuỷ tinh
hoặc đặt nhẹ lên phần môi trường không chứa VSV cho nguội trước khi thu lấy một
lượng nhỏ sinh khối VSV.
- Mỗi SV cần thực hiện 3 lượt cấy như sau:
o Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng.
o Cấy giống từ ống thạch nghiêng (môi trường rắn) sang môi trường lỏng.
o Cấy giống từ môi trường lỏng (dịch nuôi cấy, huyền phù tế bào) lên bề mặt thạch
nghiêng.

2.2.2. Phương pháp phân lập VSV, tạo khuẩn lạc đơn
2.2.2.1. Yêu cầu
Mỗi SV thực hành tạo khuẩn lạc đơn bằng các phương pháp sau:
- Tạo hộp ria
- Tạo hộp trãi
- Tạo hộp đổ
2.2.2.2. Vật liệu
- Que cấy vòng, đũa tam giác, hộp petri môi trường thạch
- Đèn cồn, cốc thuỷ tinh chứa cồn
- Pipetman và đầu tip 0.2ml vô trùng
- Giống E. coli
- Dung Dịch pha loãng PBS
- Môi trường: 2 đĩa môi trường thạch, và 1 đĩa petri vô trùng
- Giống: 1 đĩa petri giống, 1 ống giống môi trường lỏng

2.2.2.3. Thực hành

2.2.2.3.1. Kỹ thuật hộp ria
- Dùng que cấy vòng lấy mẫu VSV từ một khuẩn lạc đã xuất hiện đĩa peptri sau đó ria trên
bề mặt môi trường thạch theo các đường hình sinh hoặc zic zắc.
-

-
-
-
- Dùng que cấy thao tác vô trùng
- Ria các đường trên hộp petri. Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng que cấy và làm nguội
trước khi thực hiện đường ria tiếp theo.
- Gói hộp petri, ủ ở 37oC trong tủ ấm 2 ngày.
2.2.2.3.2. Kỹ thuật hộp trải

-
- Dùng pipetman và đầu tip vô trùng, thao tác vô trùng, chuyển 0.1ml dịch chứa hỗn
- hợp VSV lên bề mặt môi trường trong hộp petri.
- Dùng đũa tam giác đã khử trùng, trải đều VSV lên trên bề mặt môi trường.
- Gói hộp petri, ủ ở 37oC trong tủ ấm 2 ngày.

2.2.2.3.3. Kỹ thuật hộp đổ

- Dùng pipetman và đầu tip vô trùng, thao tác vô trùng chuyển l ml dịch chứa giông VSV
lên bề mặt môi trường trong đĩa petri.
- Đổ khoảng 15 - 20ml môi trường đã đun chảy và để nguội đến 45- 55°c vào đĩa petri đã
cấy mẫu.
- Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống
được trộn đều trong môi trường cấy.
- Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên.

2.2.2.3.4. Kỹ thuật cấy vào ống thạch nghiêng

- Dùng que cấy vòng đã khử trùng, lấy một ít VSV từ một khuẩn lạc có trên đĩa peptri, sau
đó cấy theo đường hình sin từ dưới lên, đậy nút bông lại và giữ trong tủ ấm. Trước và sau
khi cấy cần phải khử trùng miệng ống nghiệm.
- Ghi chú : Sau khi cấy xong nhớ lật úp đĩa peptri lại sao cho bề mặt có môi trường nằm
 - phía bên trên. Việc này giúp tránh được hiện tượng đọng hơi nước trên môi trường nuôi
cấy
- có thể gây nhiễm. Ghi ngày tháng, ký hiệu mẫu và tên người cấy lên đĩa peptri hoặc ống
nghiệm

2.3. Báo cáo kết quả

- Ghi nhận kết quả, chụp hình các đĩa petri agar có chứa khuẩn lạc đơn, các đĩa có ghi chú
ngày tháng, tên SV. Viết nhận xét cho mỗi kết quả bài .Mẫu báo cáo
2.4. Câu hỏi ôn bài:
- Tại sao phải ria theo hình zic zắc?
- Mục đích của việc phân lập và bảo quản giống vi sinh vật?
 3. PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT VI SINH VẬT
3.1. Phương pháp quan sát VSV
3.1.1. Nội dung thực hành
- Sinh viên thực hành các phương pháp sử dụng kính hiển vi để quan sát: vi khuẩn E coli,
hệ VSV cao rang ở trạng thái sống và trạng thái nhuộm màu.
- Mỗi SV cần thực hiện:
- Tạo tiêu bản tạm thời giọt ép và nhuộm sống vi khuẩn E. coli và quan sát bằng kính hiển
vi
- Tạo tiêu bản cố định nhuộm kép hệ vi sinh cao răng và quan sát bang kính hiển vi

3.1.2. Vật liệu:

Mỗi SV cần có:
- 2 phiến kính, 2 lam kính
- 1 đèn cồn, 1 ống giống E coli
- 1 tăm bông để lấy cao rang
- 1 binh tia nước cất
- 1 kính hiển vi quang học
- 1 bộ thuốc nhuộm, (dùng chung)
3.1.3. Thực hành:
3.1.3.1. Tạo tiêu bản tạm thời giọt ép và nhuộm sống vi khuẩn E. coli và quan sát bằng kính
hiển vi
- Lấy một phiến kính khô và sạch đặt lên cầu rửa trong chậu rửa.
- Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm lên phiến kính
- Dùng que cấy đưa vào đó một ít VSV
- Trộn đều, đậy lá kính nhẹ nhàng, tránh tạo bọt khí, giữ khoảng 1 – 2 phút rồi tiến hành
quan sát
- Thấm nhẹ lớp dịch trào ra xung quanh lá kính bằng giấy thấm.
- Quan sát tiêu bản ở hệ kính khô (x4,x10,x100). Nếu cần soi ở hệ kính dầu thì nhỏ lên lá
kính một giọt dầu sedre (hoặc dầu khoáng).

3.1.3.2. Tạo tiêu bản cố định nhuộm kép hệ vi sinh cao răng và quan sát bang kính hiển vi
Khu hệ vi khuẩn trong cao răng rất đa dạng và phong phú, dễ dàng quan sát bằng nhuộm tiêu bản
cố định.
Cách làm:
- Dùng bút khoanh 1 vòng vị trí tạo vết bôi bên mặt dưới phiến kính
- Lấy một giọt nước cho lên phiến kính, dùng tăm vô trùng lấy một ít cao răng hòa vào giọt
nước
- Dùng que cấy (hơ đèn cồn và để nguội), trải đều toàn vùng vết bôi được khoanh
- Hơ phiến kính trên ngọn đèn cồn bằng cách đưa đi, đưa lại ở khoảng cách 10-15 cm cho
đến khi khô, chú ý nếu hơ nóng quá sẽ làm biến dạng hình thái vi khuẩn.
- Nhỏ dung dịch crystal violet lên tiêu bản 1 phút. Rửa nước cất, thấm khô nước.
 - Nhỏ dung dịch lugol, 1 phút. Rửa nước cất, thấm khô nước.
- Nhỏ cồn cồn 95oC đến khi mất màu. Rửa nước cất, thấm khô nước
- Nhỏ dung dịch safranin (hoặc fucxin), 1 phút. Rửa nước, thấm khô
- Quan sát kính hiển vi
- Quan sát ở hệ kính dầu.

Streptococcus pyogenes Staphylococcus epidermis Rhodospirilum rubrum

3.2. Báo cáo

- Yêu cầu biết cách tạo tiêu bản giọt ép nhuộm sống đối vói E. coli, và tiêu bản cố định
nhuộm kép với hệ vi sinh vật cao răng.
- Ghị nhận, chụp hình các tiêu bản, các trường quan sát kính hiển vi, và nhận xét kết quả.

3.3. Câu hỏi ôn bài:

- Trình bày thao tác sử dụng kính hiển vi quang học? nêu sự khác biệt khi thao tác quan sát
vi nấm và vi khuẩn, tại sao?
- Tại sao phải nhuộm Gram khi quan sát vi khuẩn? Phân loại vi khuẩn bắt màu nhuộm
Gram?
- Trình bày thao tác nhuộm Gram?
4. Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu nước
4.1. Phương pháp thu mẫu, bảo quản mẫu
4.1.1. Nội dung thực hành
Sinh viên được yêu cầu thu thập mẫu nước tại sông, hồ, ao ngoài tự nhiên hoặc mẫu nước máy
tại các chung cư, tòa nhà theo đúng quy trình. Sau đó mẫu được bảo quản đúng quy trình tại
phòng thí nghiệm cho các nội dung phân tích tiếp theo.
Nội dung cụ thể:
Mỗi nhóm thu thập mẫu nước môi trường theo đúng quy trình để tiến hành phân tích tổng VSV
hiếu khí
4.1.2. Thực hành
- Chai lọ lấy mẫu phải được tiệt trùng, sạch
- Lấy ít nhất 100ml cho mỗi chỉ tiêu vi sinh
- Nếu lấy nước từ vòi, cần xả bỏ khoảng 10s, rồi mới cho nước chảy vô chai
- Đối với nước sông hồ, cần tránh lấy lớp nước bề mặt vì nhiều bụi bẩn, mà lấy lớp cách bề
mặt khoảng 20cm
- Tại 1 vị trí, cần lấy 2-3 điểm theo đường chéo, sau đó trộn lại để tăng tính đại diện cho vị
trí lấy mẫu
4.1.3. Báo cáo
Chụp hình hiện trạng các mẫu thu nhận, cân mẫu và ghi nhận

4.2. Các phương pháp định lượng VSV

4.2.1. Yêu cầu: SV tự đọc giáo trình

4.3. Phương pháp định lượng tổng VSV hiếu khí trong thực phẩm bằng phương
pháp đếm khuẩn lạc
4.3.1. Nội dung thực hành
Sinh viên được yêu cầu định lượng VSV hiếu khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
4.3.2. Vật liệu
- Môi trường PCA
- Mẫu nước (SV tự chuẩn bị, khoảng 2-3 con/nhóm)
- Dung dịch đệm PBS tiệt trùng, 200ml
- ống nghiệm hấp tiệt trùng, 5
- đĩa thạch môi trường PCA, 4
- đĩa petri k có môi trường tiệt trùng, 4
- MT thạch PCA hấp sẵn giữ ở 50oC, 80ml
- Que trải tam giác, 1
- Đèn cồn, 1
4.3.3. Thực hành
4.3.3.1. Định lượng tổng VSV hiểu khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Pha loãng theo dãy thập phân:
- Chuẩn bị 1 dãy ống nghiệm chứa 9 mL dịch pha loãng (PBS)
- Cấy chuyển 1 mL mẫu vào ống nghiệm chứa 9 mL dung dịch pha loãng (10 -1).
- Vortex 5 – 10 giây để trộn đều, có được huyền phù đồng nhất ở độ pha loãng10 -1).
- Rút 1 mL huyền phù 10-2 cấy vào 9 mL ống dịch pha loãng 10-2.
- Vortex 5 – 10 giây để trộn đều, có được huyền phù đồng nhất ở độ pha loãng10 -2
- Lặp lại quá trình tương tự cho những độ pha loãng sau (10-3, 10-4,…,10-n).

-
Định lượng kỹ thuật hộp trải:
- Pipet 0.1ml dung dịch ở độ pha loãng 10-2, và 10-3 vào đĩa petri thạch. Mỗi nồng độ lặp
lại 2 lần, (2 đĩa)
- Dùng que cấy tam giác để trải đều bề mặt thạch đến khi khô
- ủ ở 30oC, 48h-72h
Định lượng bằng kỹ thuật hộp đổ
- Pipet 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10-2, và 10-3 vào đĩa petri không, đã được hấp tiệt
trùng.
- Môi trường thạch vừa hấp tiệt trùng, ủ ở nhiệt độ 55oC (Water tank), được dùng để đổ
lên đĩa petri có chứa mẫu
- Xoay nhẹ đĩa vài vòng để phân phối đều mẫu trong môi trường, và để đông tự nhiên ở
nhiệt độ phòng trong 20 phút.
- Mỗi nồng độ lặp lại 2 lần, (2 đĩa)
- Sau khi đông, Úp ngược đĩa, và ủ ở ủ ở 30oC, 48h-72h
4.4. Báo cáo
Ghi nhận, chụp ảnh, và đếm số khuẩn lạc cho 2 phương pháp hộp trải, và hộp đổ.
Tính toán nồng độ tổng VSV hiếu khí cho 1L mẫu nước. So sánh với quy định VSATTP của
Việt nam về chỉ tiêu Tổng VSV hiếu khí của các mẫu.
5. Định lượng tổng coliform, coliform chịu nhiệt, và E. Coli trong
mẫu nước
5.1. Phương pháp định lương tổng coliform, coliform chịu nhiệt, và E. coli
5.1.1. Nội dung thực hành
Sinh viên được yêu cầu tiến hành định lượng tổng coliform và E. coli có trong mẫu nước bằng
phương pháp xác xuất số gần đúng nhất (MPN)
Nội dung cụ thể:
- Tiến hành thu thập mẫu nước đúng quy trình
- Xác định tổng số coliform có trong mẫu bằng phương pháp MPN
- Xác định tổng số E. coli có trong mẫu bằng phương pháp MPN
5.1.2. Vật liệu
- Môi trường LSB (Laryl sulphate) :
o Thành phần
Thủy phân mô thực vật và động vật bằng enzym 20,0 g

Lactoza 5,0 g
Dikali monohydro phosphat (K2HPO4) 2,75 g

Kali dihidro phosphat (KH2PO4) 2,75 g

Natri clorua 5,0 g
Natri lauryl sunfat [CH3(CH2)11OSO3Na] 0,1 g

Nước 1 000 ml
o Chuẩn bị
 Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng
cách đun nóng, nếu cần.
 Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 oC, nếu cần.
 Phân phối từng lượng 9 ml môi trường này vào các ống nghiệm có kích
thước 16 mm x 160 mm (6.4) chứa các ống Durham (6.6) đối với môi
trường nồng độ đơn và 10 ml vào các ống thử có kích thước 18 mm x 180
mm hoặc 20 mm x 200 mm (6.4) chứa các ống Durham (6.6) với môi
trường nồng độ kép.
 Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 oC.
 Các ống Durham không được chứa bọt khí sau khi đã khử trùng

- Môi trường: BGBL (Lactose bile brilliant green broth)

o Thành phần
Dịch thủy phân casein bằng 10 g
enzym
Lactoza (C12H22O11.H2O) 10 g
 Mật bò khô 20 g
Lục sáng 0,0133 g
Nước 1 000 ml
o Chuẩn bị
 Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng
cách đun nóng nhẹ, nếu cần.
 Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,2 ± 0,2 ở 25 oC, nếu cần.
 Phân phối từng lượng môi trường 10 ml vào các ống có kích thước 16 mm
x 160 mm (6.4) có ống Durham (6.5).
 Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở 121 oC. Các ống Durham không
được chứa bọt khí sau khi khử trùng.

- Môi trường EC:

o Thành phần
Dịch thủy phân casein bằng enzym 20,0 g
Lactoza 5,0 g
Muối mật (bile salts) số 3a 1,5 g
Dikali monohydro phosphat (K2HPO4) 4,0 g
Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,5 g
Natri clorua 5,0 g
Nước 1 000 ml
o Chuẩn bị
 Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng
cách đun nóng, nếu cần.
 Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 oC, nếu cần.
 Phân phối từng lượng môi trường 10 ml vào các ống có kích thước 16 mm
x 160 mm (6.4) chứa các ống Durham (6.6).
 Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 oC.
 Các ống Durham không được chứa bọt khí sau khi đã khử trùng.

- Nước Pepton:
o Thành phần
Dịch thủy phân casein bằng enzym 10,0 g
Natri clorua 5,0 g
Nước 1 000 ml
o Chuẩn bị
 Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng
cách đun nóng, nếu cần.
 Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25 oC, nếu cần.
 Phân phối từng lượng môi trường từ 5 ml đến 10 ml vào các ống nghiệm
có kích thước 16 mm x 160 mm (6.4).
 Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 oC.
 - Thuốc thử Indol (Kovacs):
o Thành phần:
4-Dimetylaminobenzaldehyd 5,0 g
2-Metyl butan-1-ol hoặc pentan-1-ol 75,0 ml
Axit clohydric (p20 1,18 đến 1,19 25,0 m
g/ml)
o Chuẩn bị:
 Hoà tan 4-Dimetylaminobenzaldehyd trong cồn bằng cách đun nhẹ trong
nồi cách thủy, duy trì ở nhiệt độ khoảng từ 50 oC đến 55 oC.
 Làm nguội và thêm axit.
 Bảo quản tránh ánh sáng và giữ ở nhiệt độ khoảng 4 oC [xem TCVN 6404
(ISO 7218)].
 Thuốc thử phải có màu vàng nhạt hoặc nâu nhạt.
- Vật liệu cho mỗi nhóm:
 Dung dịch PBS vô trùng, 100ml
 ống nghiệm chứa 10ml LSB lỏng tiệt trùng và ống duhram úp ngược, 15
 ống nghiệm chứa 10ml BGLB và ống duhram úp ngược, 15
 Ống nghiệm chứa canh 10ml EC và ống duhram úp ngược, 10
 ống nghiệm chứa 10ml canh pepton, 10
 Thuốc thử indol, 0.5ml

5.1.3. Thực hành

5.1.3.1. Pha loãng theo dãy thập phân:
- Chuẩn bị 1 dãy ống nghiệm chứa 9 mL dịch pha loãng (PBS)
- Cấy chuyển 1 mL mẫu vào ống nghiệm chứa 9 mL dung dịch pha loãng (10-1).
- Vortex 5 – 10 giây để trộn đều, có được huyền phù đồng nhất ở độ pha loãng10-1).
- Rút 1 mL huyền phù 10-2 cấy vào 9 mL ống dịch pha loãng 10-2.
- Vortex 5 – 10 giây để trộn đều, có được huyền phù đồng nhất ở độ pha loãng10-2
- Lặp lại quá trình tương tự cho những độ pha loãng sau (10-3, 10-4,…,10-n)
5.1.3.2. Định lượng Coliforms
- Chuẩn bị các ống môi trường LSB lỏng có ống duhram úp ngược, hấp tiệt trùng
- Tuần tự cấy l ml dịch mẫu ở nồng độ pha loãng (1, 10-1, 10-2) vào 5 ống nghiệm giống
nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB.
- Đây là trường hợp xác định MPN bằng 5 ống nghiệm lặp lại. Nếu nghi ngờ số lượng
Coliforms trong mẫu quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. Ví dụ 3
độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3
- Ủ các ống nghiệm ở 37°c trong 48 giờ. Ghi nhận số ống có sinh hơi.
- Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh
BGBL và ủ ở 37°c ± l° c trong 48 giờ. Ghi nhận sô ông cho kêt quả (+) (có sinh hơi) ứng
với mỗi độ pha loãng.
- Dựa trên bảng xác xuất MPN cho 5 ổng nghiệm ở phụ lục để tính số lượng Coliform tổng
khả dĩ
5.1.3.3. Định lượng Coliforms chịu nhiệt
- Dùng que cây vòng chuyển một vòng dịch mẫu từ các ông canh LSB ( + ) sang môi
trường canh EC, ủ ở 44,5 ± 0,2°c trong 24 giờ.
- Đếm số' lượng các ông cho kèt quả ( + ) (sinh hơi) ở mỗi độ pha loãng
- Dựa trên bảng xác xuất MPN cho 5 ổng nghiệm ở phụ lục để tính số lượng Coliform chịu
nhiệt khả dĩ

5.1.3.4. Định lượng E. coli

- Dùng que cấy vòng chuyển 1 vòng dịch từ ống sinh khí ở canh EC, cấy vào nước pepton
đã được làm ấm trước đến 44 oC.
- Ủ 48 giờ ± 2 giờ ở 44 oC.
- Thêm 0,5 ml thuốc thử indol vào các ống chứa nước pepton sau khi ủ.
- Trộn kỹ và kiểm tra sau 1 phút. Nếu trong pha cồn có màu đỏ chứng tỏ có indol.
- Môi trường tăng sinh chọn lọc sau khi cấy truyền và ủ theo bước 3.2, 3.2 có sự sinh khí
trong ống nghiệm đựng canh thang EC và sinh indol trong ống nước pepton thì được coi
là dương tính.
- Dựa trên bảng xác xuất MPN cho 5 ổng nghiệm ở phụ lục để tính số lượng E. coli khả dĩ
5.2. Báo cáo
Ghi nhận, chụp hình, và tính toán kết quả định lượng tổng coliform, coliform chịu nhiệt, và ecoli

5.3. Câu hỏi ôn bài:

- Coliform là gì? E.coli là gì? Tại sao phải nhận biết Coliform và E.coli?
- Môi trường và điều kiện nuôi cấy Coliform? Các phương pháp xác định E.coli đã học, ưu
điểm và nhược điểm của mỗi phương pháp?
- So sánh mẫu phân tích theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN)?
6. PHỤ LỤC 1: BẢNG MPN
6.1. Bảng tính MPN sử dụng ba ống nghiệm
Bảng C.5 - Các giá trị MPN trên gam mẫu thử và các giới hạn tin cậy 95 % (sử dụng ba
phần mẫu thử 1 g, ba phần mẫu thử 0,1 g và ba phần mẫu thử 0,01 g)
Các giới hạn tin
Các kết quả dương tính với thể MPN Độ lệch cậy 95%
tích chất cấy, ml hoặc g Chỉ số Loại
/ml hoặc log10M chuẩn
hiếm hiếm
/g củalog10M Dưới Trên
1,00 0,10 0,01
0 0 0 0 NAa NAa 0 1,1 1,00 1
0 1 0 0,31 -0,51 0,43 0,04 2,3 0,09 1
1 0 0 0,36 -0,44 0,44 0,05 2,7 1,00 1
1 0 1 0,72 -0,14 0,31 0,17 3,0 0,02 2
1 1 0 0,74 -0,13 0,31 0,18 3,1 0,21 1
1 2 0 1,1 0,04 0,26 0,35 3,7 0,02 2
2 0 0 0,92 -0,04 0,32 0,21 4,0 1,00 1
2 0 1 1,4 0,15 0,27 0,42 4,9 0,04 2
2 1 0 1,5 0,18 0,27 0,43 5,0 0,43 1
2 1 1 2,0 0,30 0,24 0,70 6,0 0,02 2
2 2 0 2,1 0,32 0,24 0,71 6,2 0,07 1
3 0 0 2,3 0,36 0,31 0,55 9,7 1,00 1
3 0 1 3,9 0,59 0,31 0,93 16 0,08 1
3 1 0 4,3 0,63 0,33 0,95 19 1,00 1
3 1 1 7,5 0,88 0,30 1,9 30 0,21 1
3 1 2 12 1,1 0,26 3,6 37 0,02 2
3 2 0 9,3 0,97 0,32 2,2 40 1,00 1
3 2 1 15 1,2 0,27 4,4 51 0,42 1
3 2 2 22 1,3 0,24 7,2 64 0,07 1
3 3 0 24 1,4 0,32 5,6 100 1,00 1
3 3 1 46 1,7 0,34 9,6 220 1,00 1
3 3 2 110 2,0 0,12 25 490 1,00 1
3 3 3 ∞ NAa NAa 36 ∞ 1,00 1
a
không áp dụng.
6.2. Bảng tính MPN sử dụng 5 ống nghiệm
Bảng A.1 – Bảng MPN đối với 5 x 1 g (ml), 5 x 0,1 g (ml) và 5 x 0,01 g (ml)
Số kết quả dương Chỉ số Cấp hạng a khi số lượng mẫu (đối với lô) được thử Giới hạn tin cậy
tính MPN nghiệm là
1 2 3 5 10 ≥ ≥ 95% ≥ 99% ≥ 99%
95%
0 0 0 <0,18 0,00 0,65 0,00 0,93
0 0 1 0,18 2 2 2 1 1 0,00 0,65 0,00 0,93
0 1 0 0,18 2 2 2 1 1 0,01 0,65 0,00 0,93
0 1 1 0,36 3 3 3 2 2 0,07 0,99 0,02 1,40
0 2 0 0,37 3 2 2 2 1 0,07 0,99 0,02 1,40
0 2 1 0,55 0 0 0 3 3 0,17 1,40 0,09 2,10
0 3 0 0,56 0 3 3 3 3 0,17 1,40 0,09 2,10
1 0 0 0,20 1 1 1 1 1 0,02 0,99 0,01 1,40
1 0 1 0,40 2 1 1 1 1 0,07 1,00 0,02 1,40
1 0 2 0,60 0 0 3 3 3 0,17 1,40 0,09 2,10
1 1 0 0,40 1 1 1 1 1 0,07 1,10 0,03 1,40
1 1 1 0,61 3 2 2 2 1 0,17 1,40 0,09 2,10
1 1 2 0,81 0 0 0 0 3 0,33 2,20 0,20 2,80
1 2 0 0,61 2 1 1 1 1 0,18 1,40 0,09 2,10
1 2 1 0,82 3 3 3 3 2 0,33 2,20 0,20 2,80
1 3 0 0,83 3 3 3 3 2 0,33 2,20 0,20 2,80
1 3 1 1,0 0 0 0 0 3 0,3 2,2 0,2 2,8
1 4 0 1,1 0 0 0 0 3 0,3 2,2 0,2 2,8
2 0 0 0,45 1 1 1 1 1 0,08 1,4 0,04 2,10
2 0 1 0,63 2 1 1 1 1 0,18 1,50 0,09 2,10
2 1 2 0,91 0 3 3 3 3 0,33 2,20 0,20 2,80
2 1 1 0,68 1 1 1 1 1 0,19 1,70 0,10 2,30
2 1 1 0,92 2 2 1 1 1 0,33 2,20 0,20 2,80
2 1 2 1,2 0 0 3 3 3 0,4 2,5 0,2 3,4
2 2 0 0,93 1 1 1 1 1 0,34 2,20 0,20 2,80
2 2 1 1,2 3 3 2 2 2 0,4 2,5 0,2 3,4
2 2 2 1,4 0 0 0 0 3 0,6 3,4 0,4 4,4
2 3 0 1,2 3 2 2 2 1 0,4 2,5 0,2 3,4
2 3 1 1,4 0 3 3 3 3 0,6 3,4 0,4 4,4
2 4 0 1,5 0 3 3 3 3 0,6 3,4 0,4 4,4
3 0 0 0,78 1 1 1 1 1 0,21 2,20 0,12 2,80
3 0 1 1,1 1 1 1 1 1 0,4 2,2 0,2 2,9
3 0 2 1,3 3 3 3 2 2 0,6 3,4 0,4 4,4
3 1 0 1,1 1 1 1 1 1 0,4 2,5 0,2 3,4
3 1 1 1,4 2 1 1 1 1 0,6 3,4 0,4 4,4
3 1 2 1,7 3 3 3 3 2 0,6 3,4 0,4 4,4
3 2 0 1,4 1 1 1 1 1 0,6 3,4 0,4 4,4
3 2 1 1,7 2 2 2 1 1 0,7 3,9 0,5 5,1
3 2 2 2,0 0 3 3 3 3 0,7 3,9 0,5 5,2
3 3 0 1,7 2 2 1 1 1 0,7 3,9 0,5 5,2
3 3 1 2,1 3 3 3 2 2 0,7 3,9 0,5 5,2
3 3 2 2,4 0 0 0 3 3 1,0 6,6 0,7 9,4
3 4 0 2,1 3 3 2 2 2 0,7 4,0 0,5 5,2
3 4 1 2,4 0 3 3 3 3 1,0 6,6 0,7 9,4
3 5 0 2,5 0 0 0 3 3 1,0 6,6 0,7 9,4
4 0 0 1,3 1 1 1 1 1 0,4 3,4 0,3 4,4
4 0 1 1,7 1 1 1 1 1 0,5 3,4 0,4 4,4
4 0 2 2,1 3 2 2 2 2 0,7 3,9 0,5 5,2
4 0 3 2,5 0 0 0 0 3 1,0 6,6 0,7 9,4
4 1 0 1,7 1 1 1 1 1 0,6 3,9 0,4 5,1
4 1 1 2,1 1 1 1 1 1 0,7 4,1 0,5 5,3
4 1 2 2,6 3 3 2 2 2 1,0 6,6 0,7 9,4
4 1 3 3,1 0 0 0 0 3 1,0 6,6 0,7 9,4
4 2 0 2,2 1 1 1 1 1 0,7 4,8 0,5 6,1
4 2 1 2,6 2 1 1 1 1 1,0 6,6 0,7 9,4
4 2 2 3,2 3 3 3 2 2 1,0 6,6 0,7 9,4
4 2 3 3,8 0 0 0 0 3 1,3 10,0 0,9 14,7
4 2 0 2,7 1 1 1 1 1 1,0 6,6 0,7 9,4
4 2 1 3,3 2 2 1 1 1 1,0 6,6 0,7 9,4
4 3 2 3,9 3 3 3 3 2 1,3 10,0 0,9 14,7
4 4 0 3,4 2 2 1 1 1 1,3 10,0 0,9 14,7
4 4 1 4,0 3 3 2 2 2 1,3 10,0 0,9 14,7
4 4 2 4,7 0 0 0 3 3 1,4 11,3 0,9 14,7
4 5 0 4,1 3 3 3 3 2 1,3 10,0 0,9 14,7
4 5 1 4,8 0 0 3 3 3 1,4 11,3 0,9 14,7
5 0 0 2,3 1 1 1 1 1 0,7 6,6 0,5 9,4
5 0 1 3,1 1 1 1 1 1 1,0 6,6 0,7 9,4
5 0 2 4,3 3 2 2 2 1 0,3 10,0 0,9 14,7
5 0 3 5,8 0 0 0 3 3 2,1 14,9 1,4 20,0
5 1 0 3,3 1 1 1 1 1 1,0 10,0 0,7 14,7
5 1 1 4,6 1 1 1 1 1 1,4 11,3 0,9 14,7
5 1 2 6,3 2 2 1 1 1 2,1 14,9 1,4 20,0
5 1 3 8,4 3 3 3 3 2 3,4 11,0 2,1 27,0
5 2 0 4,9 1 1 1 1 1 1,5 14,9 0,9 20,0
5 2 1 7,0 1 1 1 1 1 2,2 16,8 1,4 23,0
 5 2 2 9,4 2 2 1 1 1 3,4 22,0 2,1 28,0
5 2 3 12 3 3 2 2 2 3 24 2 32
5 2 4 15 0 0 0 0 3 6 35 4 45
5 3 0 7,9 1 1 1 1 1 2,3 22,0 1,5 27,0
5 3 1 11 1 1 1 1 1 3 24 2 32
5 3 2 14 1 1 1 1 1 5 35 3 45
5 3 3 17 3 2 2 2 1 7 39 4 51
5 3 4 21 3 3 3 3 2 7 39 4 51
5 4 0 13 1 1 1 1 1 3 35 3 45
5 4 1 17 1 1 1 1 1 6 39 4 51
5 4 2 22 1 1 1 1 1 7 44 4 57
5 4 3 28 2 1 1 1 1 10 70 6 92
5 4 4 35 2 2 2 1 1 10 70 6 92
5 4 5 43 0 0 3 3 3 15 106 9 150
5 5 0 24 1 1 1 1 1 7 70 4 92
5 5 1 35 1 1 1 1 1 10 106 6 150
5 5 2 54 1 1 1 1 1 15 166 10 223
5 5 3 92 1 1 1 1 1 23 253 15 338
5 5 4 160 1 1 1 1 1 40 460 20 620
5 5 5 > 160
CHÚ THÍCH: Các kết quả này được dựa trên Tài liệu tham khảo [2]
a
Về việc giải thích các cấp hạng, xem TCVN 6404 (ISO 7218)
 7. PHỤ LỤC 2: HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG
7.1. HÓA CHẤT.
7.1.1. Cồn – Ether Tỷ lệ về thể tích 3:1.
Đong 750 ml cồn 960 + 250 ml ether, ta được dung dịch cồn – ether tỷ lệ 3:1. Dung dịch
này dùng để tẩy sạch vật kính dầu, hoặc các dụng cụ dính dầu soi.
7.1.2. Cồn – acid (dùng để nhuộm Ziehl Neelsen )
Cách pha: Đong 97 ml cồn 960 + 3 ml acid HCl hoặc H2SO4 đậm đặc.
7.1.3. Dung dịch sunfo – cromic: K2Cr2O7 + H2SO4
Công thức:
K2Cr2O7 60g
H2SO4 đậm đặc 66ml
Nước 1000ml
Cách pha:
Cân 60g K2Cr2O7, hào vào 500ml nước. Thêm từ từ 66ml H2SO4 đậm đặc, cuối cùng lại
thêm 500ml nước nữa. Bicromate kali sẽ tác dụng với acid sulfuric và làm sinh ra acid cromic.
Chất này có tác dụng oxi hóa mạnh do đó có thể tẩy sạch các vết bẩn trên dụng cụ thủy tinh.
Thời gian ngâm dụng cụ thủy tinh từ 1 – 2 ngày, xả thật kỹ bằng nước sạch, rửa bằng
savon bột, rồi rửa lại bằng nước sạch.
Dung dịch này có thể dùng nhiều lần cho đến khi dung dịch từ màu đỏ cam biến thành
màu lục đen thì bỏ đi.
Lưu ý: Dung dịch này rất độc. Do đó khi ngâm phải đậy kín, lúc rửa nên đeo khẩu trang,
mang găng cao su và kính bảo hiểm.
7.1.4. Cồn 700:
Dùng để sát khuẩn tay, bàn , ghế, tủ cấy,…
Cách pha: cồn 700 từ cồn 960. Vì không đòi hỏi chính xác, nên có thể áp dụng công thức:
V1C1 = V2C2
7.1.5. Nước muối sinh lý 9‰ vô khuẩn:
Cân chính xác 9g NaCl tinh khiết cho vào cốc có chứa 991ml nước cất (vừa đủ 1000ml ),
dùng đũa thủy tinh khuấy đều. Đem hấp vô khuẩn ở t 0 = 1210C, 1atm, 15 – 20 phút.

7.2. THUỐC NHUỘM.

7.2.1. Crystal violet (C25H30N3Cl. 9H2O = 570,11 ):
Công thức:
 a) Crystal violet 0,4g
Cồn 960 10ml

b) Phenol 1g
Nước cất 100ml
Cách pha: Trộn hai dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đều rồi đem lọc.
Chú ý: dung dịch thuốc nhuộm này luôn bảo quản trong chai màu, tránh ánh sáng.
7.2.2. Lugol:
Công thức:
KI 2g
Iod tinh thể 1g
Nước cất 300ml
Cách pha: Hòa 2g KI vào 5ml nước cất, sau đó thêm 1g iod. Chờ cho iod tan hết mới
thêm nước vừa đủ 300ml.

7.2.3. Fuchsine kiềm ( C19H18N3Cl = 323,82 ):

Công thức:
a) Fuchsine kiềm 0,3g
Cồn 960 10ml
b) Phenol 5g
Nước cất 35ml
Cách pha:
Trộn dung dịch a và b với nhau, khuấy cho tan đều  đem lọc.
Bảo quản trong chai màu.
Trước khi dùng pha loãng 5 lần (dịch pha loãng không giữ được lâu còn dịch đặc có thể
giữ được trong nhiều tháng ).

7.2.4. Safranin O ( C20H19N4Cl = 350,80 ):

Công thức:
Safranin O ( dung dịch 2,5% trong cồn 960 ) 25ml
Nước cất 75ml
Bảo quản trong chai màu.
7.2.5. Methylene blue ( C37H27N2S2 = 799,80 ):
Công thức:
a) Methylen blue 3g
Cồn 96% 30ml
b) Dung dịch KOH 0.01% 1000ml
Cách pha: Trộn hai dung dịch a và b lại với nhau  khuấy hoà tan đều  đem lọc. Bảo
quản trong chai màu.

7.3. MÔI TRƯỜNG

7.3.1. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM MỐC VÀ NẤM MEN.

7.3.1.1. Môi trường Sabouraud: (để nuôi cấy nấm mốc và nấm men)
Công thức:
Pepton 20g
Mantose hay glucose 40g
Agar 18g
Nước cất vừa đủ 1000ml
( pH: 5,5 – 6,0 khử khuẩn trong nồi áp suất ở t 0 = 1210C (1atm)/ 15- 20 phút).
2. Môi trường PGA
7.3.1.2. Thành phần môi trường PGA:
Khoai tây 300g
Glucose 20g
Agar 15g

Bổ sung khoảng 500ml nước máy vào khoai tây đun sôi kỹ và lọc lấy dịch lọc, sau đó bổ sung
đường và agar vào hấp khử trùng. Sử dụng acid lactic chỉnh pH đến 5,5 để ức chế sự phát triển
của vi khuẩn. Khử trùng ở 1210C trong 15 phút
Môi trường PGA sau khi hấp khử trùng để nguội đến nhiệt độ 40-46 0C và đổ đĩa để nguội.

7.3.2. II. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐỐI VỚI VI KHUẨN.

7.3.2.1. Môi trường Nutrient Broth (NB):
Công thức:
Cao thịt 5g
Pepton bột 10g
NaCl 5g
 Nước cất 1000ml ( pH: 7,4 – 7,6 ).
Cân 13g bột môi trường NB hòa vào 1000ml nước cất, khuấy đều. Đem hấp khử trùng ở
1210C (1am)/ 15 – 20 phút.
7.3.2.2. Môi trường Nutrient Agar (NA):
Thành phần môi trường như môi trường NB nhưng có bổ sung 18g agar trong 1000ml môi
trường.
Cân 13g bột môi trường NB + 18g agar hòa vào 1000ml nước cất, rồi khuấy đều. Khử
khuẩn trong nồi áp suất ở t0 = 1210C (1atm)/ 15 – 20 phút.
7.3.2.3. Môi trường thạch bán lỏng di động:
Công thức:
Nutrient broth 13g
Agar 5g
Nước cất 1000ml pH: 7,2
Pha chế: Đem các thành phần của môi trường trên hòa tan trong nước cất, rồi đun cách
thủy cho agar hòa tan đều. Phân vào trong các ống nghiệm 16 x 120 mm, mỗi ống khoảng 5ml.
Đem hấp khử khuẩn ở 1210C (1atm)/ 15 – 20 phút. Lấy ra để đứng cho môi trường đông lại.

7.3.2.4. Môi trường Plate Count Agar (PCA):

Thành phần:
Trypton 5g
Yeast extract 2.5g
Glucose 1g
Agar 15g
Nước cất 1000ml
Pha chế: Đem các thành phần của môi trường trên hòa tan trong nước cất, rồi đun cách
thủy cho agar hòa tan đều. Đem hấp khử khuẩn ở 1210C (1atm)/ 15 – 20 phút. Phân phối vào các
đĩa petri, mỗi đĩa dầy khoảng 10 - 20mm, Để nguội cho môi trường đông lại.

7.3.2.5. Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL)

Peptone 10g
Lactose 10g
Mật bò 20g
 Brilliant green 0,0133g
Nước cất 1000 ml
Hòa tan peptone va lactose vào trong 500ml nước cất, cho mật bò vào trong khoảng 200ml
và brilliant green vào trong khoảng 100ml nước cất. Trộn đều 3 dung dịch và thêm nước đủ 1000
ml, chỉnh pH khoảng 7,4. Rót vào ống nghiệm có ống Durham 10ml môi trường BGBL. Hấp
1210C, 1atm trong 15 phút.

7.3.2.6. Môi trường Lauryl Sulphate Broth (LSB)

Tryptose 20g
Lactose 5g
Sodium chloride 5g
KH2PO4 2,75g
K2HPO4 2,75g
Lauryl sulphate 0,1g
Nước cất 1000ml
Hòa tan các chất vào 1000 ml, chỉnh pH khoảng 7,4. Rót vào ống nghiệm có ống Durham
10ml môi trường LSB. Hấp 1210C, 1atm trong 15 phút.

7.3.2.7. Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB hoặc VRBA)
Cao nấm men 3g
Peptone hoặc gelysate 7g
NaCl 5g
Muối mật 1,5g
Lactose 10g
Neutral red 0,03g
Crystal violet 0,002g
Agar 15g
Nước cất 1000ml
Hòa tan các thành phần trong nước, điều chỉnh pH 7,4. Đun sôi trong 2 phút, không hấp
khử trùng. Sử dụng vào môi trường đổ đĩa
7.3.2.8. Môi trường Potato Glucose Agar (PCA):
- Thành phần môi trường:
 Khoai tây 300g
Glucose 20g
Agar 15g

Pha chế môi trường: Bổ sung khoảng 500ml nước máy vào khoai tây đun sôi kỹ và lọc lấy
dịch lọc, sau đó bổ sung đường và agar vào hấp khử trùng. Sử dụng acid lactic chỉnh pH đến 5,5
để ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Khử trùng ở 121 0C trong 15 phút.

7.4. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Trần Linh Thước (2005), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và
mỹ phẩm, NXB Giáo dục.
2. Nguyễn Văn Minh, Dương Nhật Linh, Giáo trình THỰC TẬP VI SINH CƠ SỞ, Trường
Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, Khoa Công nghệ sinh học.
3. Nguyễn Thị Sơn, Trần Lệ Minh, Tài liệu hướng dẫn thí nghiệm VI – HÓA SINH ỨNG
DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG, NXB Bách Khoa Hà Nội.