BÀI 2: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN HÒA TAN THEO

PHƯƠNG PHÁP LOWRY

I. NGUYÊN TẮC
Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa Protein và thuốc thử Folin.
Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ Protein trong 1
phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dung dịch Protein nghiên cứu
với thuốc thử Folin, dựa theo đường chuẩn của Protein tinh khiết với thuốc thử
này, có thể dễ dàng tính được hàm lượng Protein của mẫu vật nghiên cứu.
 Giai đoạn 1: Phản ứng Biure
Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide. Trong môi trường kiềm, các
hợp chất có từ 2 liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với Cu2+ tạo thành phức
chất màu xanh tím. Cường độ màu thay đổi tùy thuộc độ dài của mạch peptide
Protein + Cu2+ -> phức Cu2+ - protein (xanh tím)
 Giai đoạn 2: Phản ứng với thuốc thử Folin
Thuốc thử follin có chứa axit phosphomolipden và phosphowolframate. Các
chất này 1 mặt làm tăng độ nhạy phản ứng biure, mặt khác tham gia phản ứng
gốc Tyrosine và Tryptophan trong protein và các axitamin này tham gia tạo
phức chất màu xanh da trời hấp thụ cực đại bước sóng 750nm.
II. CÁC CHÚ Ý KHI LÀM THÍ NGHIỆM
- Dùng dung dịch kiềm loãng để chiết protein sẽ giúp protein tan tốt hơn, tham
gia phản ứng tốt hơn

- Nên dùng giấy pH làm chất chỉ thị kiểm tra dung dịch chứ không dùng
phenolphtalein sẽ ảnh hưởng đến màu sắc dung dịch trong phản ứng biure.

- Sau khi chiết protein cần trung hòa dung dịch bằng HCl loãng đến pH=7.
- Phản ứng màu phụ thuộc thành phần axit amin trong protein nên phân tích
protein nào thì dung đường chuẩn protein đấy.
- Đường chuẩn chỉ tuyến tính trong 1 giới hạn nhất định, nên khi đo mẫu ta phải
pha loãng mẫu để giá trị OD nằm trong vùng tuyến tính của đường chuẩn.
- Với mỗi 1 lần phân tích với hóa chất mới cần dựng đồ thị đường chuẩn mới
tương ứng.
- Dung dịch phải đảm bảo được lọc trong, loại bỏ cặn và không chứa các thành
phần làm thay đổi màu của dung dịch.
III. CÁCH TIẾN HÀNH

1. Dung dịch gốc protein chuẩn: Albumin huyết thanh bò (BSA): 1 mg/ml
(PTN pha sẵn)

2. Tiến hành:

Chuẩn bị 1 dãy ống falcon 15 sạch (6 ống).

Bổ sung lần lượt các hóa chất với lượng tương ứng như bảng sau tạo hệ nồng độ
BSA (Ci)

Ống falcon 1 2 3 4 5 6
Dung dịch BSA gốc (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Nước cất (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

Trộn đều bằng vortex thu được dãy ống BSA làm việc có nồng độ Ci

Thực hiện phản ứng:

Ống nghiệm 7 8 9 10 11 12
Dung dịch BSA làm việc 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Ci mg/ml (ml)
Dung dịch C (ml) 5 5 5 5 5 5

Trộn đều để yên 10 phút

Dung dịch Folin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Trộn đều bằng vortex, để yên 20 phút rồi đo độ hấp thụ tại bước sóng
750nm (OD750 nm) với mẫu đối sánh là mẫu trong ống nghiệm số
7.

Nồng độ BSA Ci 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

(mg/ml)
OD750nm 0 0,032 0,086 0,128 0,133 0,175

Xây dựng đường chuẩn với OD750nm

 Đường chuẩn albumine
0.2
0.18
f(x) = 0.174285714285714 x + 0.00519047619047619
0.16 R² = 0.968018869560693
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Phần 2: Phân tích mẫu

- Mẫu thí nghiệm: Xúc xích

1. Chuẩn bị dịch protein phân tích

- Dùng ống đong chuẩn bị 20 ml NaOH 0,1N vào trong cốc dung tích 100 ml

- Cân chính xác 0,3 g mẫu; chuyển mẫu vào cối, cho một ít dung dịch NaOH
0,1N từ cốc vào để làm ẩm

- Nghiền nhuyễn mẫu; chuyển toàn bộ mẫu vào bình tam giác dung tích 100 ml.

- Tráng sạch cối chày bằng dung dịch NaOH 0,1N còn lại

- Đặt bình mẫu vào nồi đun cách thuỷ để chiết protein trong 15 phút

- Lấy mẫu ra, làm nguội, trung hoà (tới pH 7) bằng HCl 0,1N (dùng đũa thủy
tinh chấm dịch lên miếng giấy thử pH và so với dải màu chuẩn).

- Chuyển mẫu sang bình định mức 100 ml, định mức bằng nước cất tới vạch.
Trộn đều.

- Lọc trong, thu dịch lọc protein phân tích.

2. Tiến hành phản ứng và đo độ hấp thụ

 Mẫu thí nghiệm

Lấy vào ống nghiệm (khô, sạch):

 0,3 ml dịch lọc protein (dùng micropipet)

3 ml dung dịch C (hỗn hợp dung dịch A:B=50:1 mới pha) (dùng micropipet)

Trộn đều. Để yên 10 phút.

Cho tiếp 0,3 ml dung dịch Folin. Trộn đều (bằng tay hoặc bằng máy trộn Voltex)

Để phản ứng 20 phút.

 Mẫu kiểm chứng (làm song song với mẫu thí nghiệm):

Lấy vào ống nghiệm(khô,sạch):

0,3 ml H2O (dùng micropipet)

3 ml dung dịch C (dùng micropipet)

Trộn đều. Để yên 10 phút.

Cho tiếp 0,3 ml dung dịch Folin. Trộn đều (bằng tay hoặc bằng máy trộn Voltex)

Để phản ứng 20 phút.

 Đo độ hấp thụ ánh sáng

Đo độ hấp thụ của dung dịch màu của các ống thí nghiệm ở bước sóng 750 nm,
với dung dịch đối sánh là mẫu kiểm chứng. Ghi kết quả.

Sử dụng đường chuẩn protein để tính hàm lượng protein của dung dịch nghiên
cứu.

IV. XỬ LÝ SỐ LIỆU

Lượng mẫu: 0.31 g

Giá trị OD đo được: 0,075

Đường chuẩn protein: y = 0,1743x + 0,0052 (Hệ số R² = 0,968)

Ta có y = 0,1743x + 0,0052 = 0,075 => x = 0.4 (mg/ml)

=> Trong 100ml dịch có 40 mg protein

Vậy hàm lượng protein trong mẫu vật

0.04/0,31=12,9%

Nhận xét :
 Kết quả xây dựng đường chuẩn đạt mức ổn đối với phạm vi phòng thí nghiệm nhưng vẫn
có khoảng lệch lớn đối với phạm vi cần tính chính xác cao => Kết quả hàm lượng Protein
có trong mẫu thí nghiệm chưa đạt mực chính xác cao. Cần thực hiện thao tác chính xác để
tránh sai số.

*Phạm vi ứng dụng: Phương pháp Lowry được dùng rộng rãi để xác định nhiều loại
protein khác nhau. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện được protein
trong dung dịch ở nồng độ 1 g/ml. Tuy nhiên cường độ màu còn tuỳ thuộc nhiều vào loại
protei