Machine Translated by Google

Công nghệ nguồn sinh học 101 (2010) 925–930

Danh sách nội dung có sẵn tại ScienceDirect

Công Nghệ Nguyên Liệu Sinh Học

trang chủ tạp chí: www.elsevier.com/locate/biortech

Ethanol sinh học từ sinh khối lục bình: Đánh giá chiến lược đường
hóa bằng enzym

US Aswathy, Rajeev K. Sukumaran *, G. Lalitha Devi, KP Rajasree, Reeta Rani Singhania, Ashok Pandey
Phòng Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Liên ngành Quốc gia (CSIR), Trivandrum 695019, Ấn Độ

thông tin bài viết trừu tượng

Lịch sử bài viết: Nguyên liệu sinh khối ít cạnh tranh hơn với cây lương thực là mong muốn để sản xuất etanol sinh học và các
Nhận ngày 23 tháng 1 năm 2009 nguồn nguyên liệu này có thể không được bản địa hóa về mặt địa lý. Do đó, chiến lược sản xuất phân tán phù
Đã nhận ở mẫu sửa đổi ngày 23 tháng 7 năm 2009 hợp hơn đối với nguồn nguyên liệu như bèo tây với sự sẵn có phi tập trung. Trong nghiên cứu này, chúng tôi
Được chấp nhận ngày 6 tháng 8 năm 2009
đã xác minh tính phù hợp của nguyên liệu này để sản xuất đường có thể lên men bằng cách sử dụng xenlulaza
Có sẵn trực tuyến ngày 30 tháng 9 năm 2009
được sản xuất tại chỗ. Thử nghiệm các phương pháp tiền xử lý bằng axit và kiềm chỉ ra rằng tiền xử lý bằng
kiềm có hiệu quả hơn trong việc làm cho mẫu dễ bị thủy phân bằng enzym. Quá trình tải cellulase và b-
từ khóa:
glucosidase và ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đã được nghiên cứu và tối ưu hóa để cải thiện quá trình
Sinh khối lignocellulosic
đường hóa. Việc thiết kế lại hỗn hợp enzyme dẫn đến cải thiện quá trình đường hóa từ 57% lên 71%. Một thử
Lục bình
Eichhornia
nghiệm thô trên quá trình lên men thủy phân bằng enzym sử dụng nấm men làm bánh thông thường Saccharomyces

Etanol sinh học cerevisiae đã thu được nồng độ etha nol là 4,4 g / L.
đường hóa 2009 Elsevier Ltd. Bảo lưu mọi quyền.

1. Giới thiệu
Ethanol xenlulo đã trở nên quan trọng to lớn trong thập kỷ qua do nó
được coi là một giải pháp thay thế khả thi cho nhiên liệu vận chuyển dựa
trên dầu mỏ. Việc lựa chọn nguyên liệu để sản xuất etanol sinh học là một
mối quan tâm lớn vì các yêu cầu về sinh khối cạnh tranh trực tiếp hoặc gián
tiếp với cây lương thực về tài nguyên đất canh tác. Bã nông sản khi được sử
dụng để sản xuất etha nol có thể giải quyết vấn đề này ở một mức độ nào đó,
nhưng hoạt động của các nhà máy quy mô lớn để sản xuất ethanol xenlulo vẫn
còn một số hạn chế bao gồm đầu tư vốn cao, kỹ thuật cao và trên hết là chi
phí vận chuyển nguyên liệu cao. . Hệ thống sản xuất sinh khối-etanol phân
tán có thể hiệu quả hơn nhiều, đặc biệt là ở các quốc gia nơi nông nghiệp
được phân cấp và phân phối sẵn có sinh khối. Một hệ thống như vậy sẽ cho
phép sử dụng các loại sinh khối sẵn có trong khu vực làm nguyên liệu thô;
sẽ bao gồm các lợi ích kinh tế và xã hội cho cộng đồng rur al và sẽ ít thâm
dụng vốn hơn và có thể có các công nghệ dễ vận hành đòi hỏi ít kỹ năng hơn.
Sinh khối lục bình (Eichhornia crassipes) (WHB) rất thích hợp cho sản
xuất etanol sinh học (Abraham và Kurup, 1996; Mishima và cộng sự, 2008).
Sinh khối từ bèo tây có khoảng 48% hemixenluloza, 18% xenluloza 3,5% lignin
(Nigam, 2002).
Mặc dù có một lượng đáng kể sự thay đổi về thành phần được báo cáo bởi các
phòng thí nghiệm khác nhau, nói chung sinh khối được coi là
giàu hemicellulose và có hàm lượng lignin rất thấp. Năng suất sinh khối của
loại cây này rất cao (Mitchell, 1976), và loại cây này có sẵn ở một số nơi
trên thế giới khiến nó trở thành nguyên liệu phù hợp để sản xuất ethanol
phân tán. Ngoài ra, sinh khối thủy sinh còn có thêm lợi thế là không cạnh
tranh với cây lương thực để lấy tài nguyên đất canh tác (Mishi ma et al.,
2008). Loài cây này là mối đe dọa điển hình xâm nhập vùng nước sau của bang
Kerala ở phía nam Ấn Độ (Praveena và Naseema, 2004). Các công nghệ hiệu quả
để sản xuất ethanol từ sinh khối lục bình có thể phục vụ mục đích loại bỏ
cỏ dại cũng như tạo việc làm và thu nhập ở khu vực nông thôn. Các nhà máy
quy mô lớn để xử lý sinh khối lục bình có thể không kinh tế do các vấn đề
về thu gom, vận chuyển và các yêu cầu về cơ sở hạ tầng. Ngoài ra, những
thách thức kỹ thuật tồn tại trong quá trình tiền xử lý sinh khối và quá
trình đường hóa enzyme, đặc biệt là nguồn cung cấp enzyme. Việc áp dụng các
phương pháp tiền xử lý, khử độc, đường hóa và lên men, cũng như tạo ra các
enzym tại chỗ một cách hiệu quả và đơn giản hơn là điều cần thiết cho một
công nghệ sản xuất phân tán hiệu quả. Mặc dù có một số báo cáo về việc sử
dụng WHB để sản xuất ethanol (Abraham và Kurup, 1996; Kahlon và Kumar,
1987; Mishima và cộng sự, 2008; Nigam, 2002), những báo cáo này đã đề cập
một cách sơ sài đến các khía cạnh trên ở góc độ rộng lớn hơn. của chiến
lược sản xuất ethanol sinh học đại trà phân tán. Trong nghiên cứu hiện tại,
chúng tôi đã cố gắng thực hiện theo các phương pháp ít thâm dụng công nghệ
hơn để sản xuất enzyme tại chỗ, tiền xử lý sinh khối và đường hóa để tạo ra
đường khử có thể được lên men thành ethanol. Chúng tôi cũng đã thực hiện
các nghiên cứu sơ bộ về sự phù hợp của dầu thô

* Đồng tác giả. Điện thoại: +91 471 2515368.

Địa chỉ email: rajvaryaveedu@gmail.com (RK Sukumaran).

0960-8524 / $ - xem vấn đề phía trước 2009 Elsevier Ltd. Mọi quyền được bảo lưu.
doi: 10.1016 / j.biortech.2009.08.019
Machine Translated by Google
926 Mỹ Aswathy et al. / Công nghệ nguồn sinh học 101 (2010) 925–930
thủy phân làm cơ chất cho sản xuất ethanol bằng nấm men Saccharomy ces cerevisiae.
Dữ liệu chỉ ra rằng hiệu quả đường hóa bằng cách sử dụng hỗn hợp enzyme được tối
ưu hóa là tốt và dịch thủy phân có thể được lên men để sản xuất etanol.
2. Phương pháp
2.1. Nguyên liệu sinh khối và tiền xử lý
Cây lục bình được thu thập từ những vùng nước đọng không bị ô nhiễm ở quận
Kottayam ở Kerala, Ấn Độ. Lá và thân cây được phơi khô dưới ánh nắng mặt trời,
mang đến phòng thí nghiệm và sấy khô thêm qua đêm ở nhiệt độ 70 độ C trong lò sấy
không khí nóng để loại bỏ độ ẩm còn sót lại. Sinh khối khô được nghiền để giảm
kích thước xuống còn khoảng 1–2 mm trước khi tiền xử lý. Tiền xử lý được thực hiện
với axit loãng hoặc kiềm sử dụng các điều kiện được tối ưu hóa trong phòng thí
nghiệm của chúng tôi. Tóm lại, các mẫu ở tải lượng sinh khối 10% được phản ứng
với H2SO4 0,88% hoặc NaOH 2% trong 1 giờ ở 95 C. Sau khi làm mát, các mẫu được
rửa nhiều lần trong nước máy để trung hòa độ pH, sau đó tráng lần cuối bằng nước
cất , sau đó chúng được làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng bằng cách trải
trên giấy. Nguyên liệu thức ăn đã xử lý trước hoặc được sử dụng ngay cho các thí
nghiệm thủy phân hoặc được bảo quản trong hộp kín khí ở 4 C cho đến khi sử dụng.
2.2. Vi sinh vật, chuẩn bị chất cấy và sản xuất enzyme
Nấm Trichoderma reesei RUT C30 là một món quà từ GS George Scakacs, Đại học
Kỹ thuật Budapest. Aspergillus niger MTCC 7956 được phân lập từ gỗ mục nát trong
phòng thí nghiệm của chúng tôi và được xác định tại Bộ sưu tập nuôi cấy loại vi
sinh vật (MTCC), Chandigarh, Ấn Độ. Cellulase và b-glucosidase (BGL) để đường hóa
sinh khối được tạo ra bằng cách lên men ở trạng thái rắn sử dụng T. reesei và A.
niger, tương ứng như đã mô tả trước đó (Sukumaran và cộng sự, 2008). Men làm bánh
thông thường Saccharomy ces cerevisiae được tinh chế từ một chế phẩm thương mại
được sử dụng để sản xuất rượu. Nuôi cấy nấm men được nuôi trong môi trường YEP
trong 12 giờ với tốc độ khuấy 180 vòng / phút trên máy lắc quay và dịch cấy được
sử dụng ở 5% v / v làm chất cấy để lên men rượu thủy phân.
2.3. Đường hóa sinh khối
Quá trình đường hóa sinh khối bằng enzym được thực hiện bằng cách ủ 1 g trọng
lượng khô của WHB đã xử lý trước với các hỗn hợp khác nhau của T. reesei cellulase
và A. niger BGL ở 45 C, trong các bình 150 ml có nút đậy và khuấy nhẹ (100 vòng/
phút) trong bể nước lắc. Quá trình thủy phân được thực hiện trong dung dịch đệm
citrate 50 mM (pH 4,8) và thể tích được điều chỉnh để đạt được lượng sinh khối
cần thiết (5% trọng lượng khô/thể tích đối với lục bình được xử lý bằng axit (WHB-
Ac) và 6,5% đối với lục bình được xử lý bằng kiềm ( WHB-Al) đã được sử dụng vì
đây là những tải trọng tối đa có thể cho phép có mặt nước tự do cần thiết cho
hoạt động của enzym). Các kết hợp khác nhau giữa thời gian tải và ủ cellulase và
BGL đã được thử cho quá trình thủy phân sinh khối. Sự giải phóng đường được theo
dõi dưới dạng tổng lượng đường khử bằng phương pháp DNS (Miller, 1959). Hiệu suất
đường hóa bất cứ nơi nào được đề cập đã được tính bằng phần trăm chuyển đổi sinh
khối được xử lý trước thành đường khử với giả định năng suất lý thuyết là 1,12 g
đường/g sinh khối được xử lý trước.
2.4. Tối ưu hóa quá trình đường hóa sinh khối
Việc nạp xenlulaza, BGL, và nồng độ tantoza (Tween 80) được tối ưu hóa để
nâng cao năng suất đường khử bằng cách sử dụng thiết kế thí nghiệm Box-Behnken
trên bề mặt phản ứng (Box và Behnken, 1960). Ma trận thiết kế với 17 thử nghiệm
chạy trong hai khối với 5 lần lặp lại của điểm giữa đã được sử dụng cho thí
nghiệm. Các biến được chọn để tối ưu hóa, tức là - Nồng độ Cel lulase, nồng độ
BGL, và nồng độ của chất hoạt động bề mặt được mã hóa lần lượt là X1 và X2 và
X3 . Incuba tions được thực hiện như mô tả ở trên trong 48 giờ.
Mô hình, được xây dựng như một hàm phản hồi của các biến trong quá trình sản
xuất cellulase là một đa thức bậc hai như sau:
Y ¼ b0 þXn biXi þXn biX2 tôi þXn Xn biXiXj ð1Þ
i¼1 i¼1 i¼1 j¼1
trong đó Y là phản ứng đo được (hiệu suất đường khử); b0, bi và bii
là các hệ số hồi quy, và X1 – X3 là các hệ số đang được nghiên cứu.
Đối với hệ thống ba biến, phương trình mô hình được đưa ra dưới đây:
Y ¼ b0 þ b1X1 þ b2X2 þ b3X3 þ b11X12 þ b22X22 þ
b33X32 þ b12X1X2 þ b13X1X3 þ b23X2X3 ð2Þ
Phân tích hồi quy và ước lượng các hệ số được hình thành bằng phần
mềm Design Expert (Stat easy Corp, USA). Sự đóng góp của các thông
số riêng lẻ và tác động tương tác và bậc hai của chúng đối với việc
sản xuất cellulase đã được xác định. Sự kết hợp tốt nhất của các
tham số để thu được năng suất su gar giảm tối đa được xác định bằng
cách sử dụng hàm tối ưu hóa số trong Chuyên gia thiết kế.
2.5. Sản xuất etanol bằng cách sử dụng WHB hydrolysate
Quá trình sản xuất etanol được nghiên cứu bằng cách sử dụng enzym thủy phân
WHB-Al. Sinh khối tiền xử lý được thủy phân trong các điều kiện được tối ưu hóa
để thu được sản lượng đường cao hơn. Chất béo thủy phân được cô đặc bằng cách làm
bay hơi đến nồng độ đường khử là 10%. Điều này đã được cấy với 5% v/v của một nền
văn hóa hạt giống 12 giờ của Saccharomyces cerevisiae. Quá trình ủ được thực hiện
trong các bình có nút ở nhiệt độ phòng (28 ± 2 C) mà không cần khuấy trộn. Các
mẫu 1 ml được rút ra đều đặn và ly tâm trong 10 phút ở 4 C với tốc độ 13.000
vòng / phút. Phần nổi phía trên được lọc bằng bộ lọc 0,45 lm và hàm lượng etanol
được phân tích bằng sắc ký khí.
2.6. Phương pháp phân tích
Hoạt độ cellulase trong chế phẩm enzyme thô được xác định theo phương pháp
IUPAC (Ghose, 1987). Hoạt tính b-Glucosidase được xác định bằng cách sử dụng p-
nitrophenyl bD-glucopyranoside làm cơ chất theo phương pháp IUPAC (Ghose và
Bisaria, 1987). Việc ước tính tổng lượng đường khử trong quá trình thủy phân sinh
khối bằng enzyme được thực hiện bằng phương pháp DNS (Miller, 1959) và việc ước
tính lượng ethanol được thực hiện bằng sắc ký khí như đã nêu trong giao thức Phân
tích của Phòng thí nghiệm NREL # 011 (Templeton, 1994).
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Sản xuất enzyme
Một phần đáng kể chi phí cho sản xuất etanol lignoxenluloza là chi phí của
enzym xenlulaza được sử dụng để thủy phân sinh khối. Sản xuất xenlulaza tại chỗ
bằng cách sử dụng chất thải nông nghiệp có thể giảm chi phí sản xuất enzym và chi
phí vận chuyển. Các chế phẩm cellulase thô và BGL được sử dụng trong nghiên cứu
này được sản xuất bằng cách lên men ở trạng thái rắn với nỗ lực giảm chi phí sản
xuất etha nol. Quá trình lên men ở trạng thái rắn cần ít cơ sở hạ tầng hơn và
nhân lực tương đối ít kỹ năng hơn bên cạnh việc có thể sử dụng nguyên liệu thô rẻ
hơn để sản xuất enzyme (Pandey et al., 2000; Raimbault, 1998). SSF cũng tạo ra
một
Machine Translated by Google

Aswathy Hoa Kỳ và cộng sự. / Công nghệ nguồn sinh học 101 (2010) 925–930 927

sản phẩm, trong trường hợp này là rất nhiều lợi thế. Lulase cel thô được
sản xuất bằng cách sử dụng T. reesei RUT C30 trên cám lúa mì như
chất nền như đã mô tả trước đây (Singhania et al., 2007; Sukuma ran et
al., 2008). BGL được sản xuất bằng A. niger MTCC 7956 sử dụng
điều kiện tối ưu hóa trong phòng thí nghiệm của chúng tôi (kết quả chưa được công bố). t.
enzyme reesei có hoạt tính cellulase là 0,77 FPU/ml, hoạt tính BGL
là 82 U/ml và hoạt tính xylanase là 1024 U/ml. Enzym A. niger
có hoạt độ BGL và xylanase cao là 984 U / ml và 249,7 U / ml,
tương ứng trong khi nó chỉ có 0,23 U hoạt động của giấy lọc. Chúng ta đã có
cũng được tìm thấy trong một nghiên cứu trước đó rằng việc chuẩn bị BGL thô từ
A. niger chứa nhiều protein BGL được biểu hiện khác biệt ở
đáp ứng với các điều kiện tăng trưởng và ít nhất một trong số chúng có khả
năng dung nạp tối đa với glucose hiện đại với hoạt tính duy trì 20% ở 0,5 M
glu cose (kết quả chưa được công bố). Trước đó đã có thông tin cho rằng T. reesei
tạo ra lượng BGL ít hơn so với A. niger (Reczey và cộng sự,
1998) và loại thứ hai có khả năng sản xuất BGL dung nạp glucose
(Gunata và Vallier, 1999; Yan và Lin, 1997).
639,42 mg / g. Điều này dẫn đến hiệu suất đường hóa khoảng 57% giả sử mẫu
được xử lý trước chủ yếu là hemixenluloza và xenluloza. Dữ liệu chỉ ra rõ
ràng tính ưu việt của
tiền xử lý kiềm trong việc làm cho chất nền dễ bị thủy phân bằng enzym
matic. Ở đây có thể coi WHB là thức ăn dự trữ chứa nhiều hemicellulose
hơn cellulose (Nigam,
2002).
Xử lý sơ bộ sinh khối bằng axit loãng được biết là thủy phân
hemicellulose để lại phần lớn cellulose nguyên vẹn trong khi xử lý trước
bằng kiềm bảo tồn ít nhất một phần hemicellulose và hoạt động
chủ yếu để loại bỏ hàm lượng lignin (Sun và Cheng, 2002).
Do đó, WHB-Al chứa nhiều hemicellulose hơn so với
WHB-Ac và sự thủy phân của cả cellulose và hemicellulose
trong WHB-Al sẽ dẫn đến sản lượng đường giảm tốt hơn.
Các chế phẩm xenlulaza được sử dụng cho quá trình đường hóa chứa một lượng
đáng kể hoạt tính xylanase có thể tác động lên phần xenlulô hemi của sinh
khối và giải phóng đường. Tốt nhất
sự kết hợp giữa cellulase và BGL dường như là 12 FPU và

2400 U, tương ứng trên mỗi gam WHB-Al. Trong các thử nghiệm sử dụng
3.2. Đường hóa sinh khối
12 FPU khi tải xenlulaza, có sự gia tăng lượng đường khử
năng suất với sự gia tăng tải BGL cho thấy rằng yếu tố chính
Sáu sự kết hợp khác nhau của cellulase và tải BGL là
hạn chế sự thủy phân có thể là lượng beta glucosi dase có sẵn. Nó cũng
đã thử đường hóa WHB bằng axit hoặc kiềm đã được xử lý trước.
có thể được lưu ý rằng sự gia tăng trong việc giảm năng suất đường
Mỗi mẫu được ủ trong 48 giờ với lắc ở 45 C. Các mẫu
không tuyến tính cho thấy sự ức chế sản phẩm. Nồng độ đường giảm tối đa
được thực hiện trong khoảng thời gian 12 giờ được phân tích để giảm hàm lượng đường
đạt được là 4,4%, gần bằng
và tổng sản lượng đường khử trên mỗi gam sinh khối đã được tính toán. Các
0,25 M nếu giả sử đường khử là glucozơ. Vì T. ree sei BGL bị ức chế bởi
điều kiện được sử dụng cho quá trình thủy phân WHB và sản lượng đường khử
nồng độ glucose 0,01 M (Woodward
được trình bày trong Bảng 1.
và Arnold, 1981) , có thể giả định rằng việc bổ sung
Có thể thấy từ kết quả xử lý trước bằng axit WHB
A. niger BGL có thể nâng cao đáng kể mức tối đa có thể đạt được
không hiệu quả trong việc cải thiện hiệu suất đường khử. Sản lượng đường
nồng độ đường. Sử dụng chế phẩm dung nạp glucose tốt hơn
khử tối đa thu được từ quá trình thủy phân WHB-Ac là
có thể đã cải thiện năng suất đường hơn nữa mà không cần phải
chỉ khoảng 136 mg / g trong đó giá trị này cho WHB-Al là

Bảng 1

Ảnh hưởng của phương pháp tiền xử lý, lượng enzyme và thời gian ủ đến quá trình đường hóa WHB.

Thời gian (h) Cellulase (FPU / g) BGL (U/g) Giảm đường Conc. (mg / ml) Tổng đường khử (mg / g)

WHB-Ac WHB-Al WHB-Ac WHB-Al

0 6 300 0.00 0,00 0,00 0,00

6 600 0.00 0,00 0,00 0,00
6 1200 0.00 0,00 0,00 0,00
12 600 0.00 0,00 0,00 0,00
12 1200 0.00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
12 2400 0,00 0,00 0,00 0,00

12 6 300 0,00 7,04 0,00 104,88

6 600 1,96 4,31 38,83 64,17
6 1200 1,06 7,34 21,01 109.37
12 600 2,94 32,78 58,25 488.39
12 1200 4,21 35,38 83,27 527,21
12 2400 6,88 36,98 136,32 551.02

24 6 300 ND 5,68 ND 81,83

6 600 0,34 4,66 6,73 67,16
1200 0,16 10,6 152,63
6 600 NĐ 35,99 518.26
12 1200 2,54 38,55 3,07ND 555.09
12 12 2400 1,77 44,4 49,79NĐ 639.42

36 6 300 NĐ 5,78 NĐ 80,31

6 600 2,44 4,97 47,28 69.12
6 1200 1,3 2,56 25,2 35,55
12 600 0,99 36,44 19,22 506,55
12 1200 5,73 37.1 111,13 515.64
12 2400 7,03 41,86 136,33 581.83

48 300 0,3 5,16 5,75 69,13

6 6 600 1,1 3,95 21,21 52,93
6 1200 0,56 3,89 10,78 52.13
12 600 1,3 30,85 24,96 413.4
12 1200 2,3 39,74 44,2 532,48
12 2400 2,65 42,29 50,87 566,64

ND – Không xác định.

Tải trọng sinh khối: WHB-Ac: 5% w/v, WHB-Al: 6,5%.

Machine Translated by Google

928 Aswathy Hoa Kỳ và cộng sự. / Công nghệ nguồn sinh học 101 (2010) 925–930

thêm nhiều BGL. Ảnh hưởng của thời gian ủ cũng đã được nghiên cứu và nó bàn số 3

Có thể thấy từ dữ liệu rằng năng suất giảm đường cao nhất Phân tích phương sai cho mô hình bậc hai đã chọn.

(639,42 mg/g) thu được sau 24 giờ ủ. Sản lượng cho Nguồn Tổng bình phương DF Bình phương trung bình F Giá trị Prob> F
36 giờ và 48 giờ cũng có thể so sánh được (581,83 và 566,64 mg / g, Người mẫu 224279.10 9 24919.9 27,23 0,0001
tương ứng) mặc dù ít hơn sau 24 giờ và mức giảm này X1 3542,71 1 3542.72 3,87 0,0898

có thể là do sự thay đổi giữa các bình. x2 50255,60 1 50255.60 54,91 0,0001

X3 39621,13 1 39621.13 43,29 0,0003

x21 5150,16 1 5150.16 5,63 0,0495

3.3. Tối ưu hóa quá trình đường hóa sinh khối x22 18095.25 1 18095,25 19,77 0,0030

x23 11589,24 1 11589,24 12,66 0,0092

Các thử nghiệm được thực hiện trên đường hóa WHB chỉ ra rằng sản lượng của X1X2 31906,89 1 31906.89 34,86 0,0006

X1X3 57768.12 1 57768.12 63.11 <0,0001

giảm lượng đường tốt hơn với lượng cellulase và BGL cao hơn và
X2X3 6468,99 Dư 6407,20 1 6468.99 7,07 0,0325
người ta suy đoán rằng sự gia tăng tải lượng enzyme có thể chứng minh
Thiếu phù hợp 4968,81 Sai
số thuần 7 915.31
hiệu quả đường hóa. Một thiết kế Box Behnken là túy 1438,40 Cor. tổng số 1656,27 4,61 0,0871
được sử dụng để tối ưu hóa nồng độ cellulase và BGL. Việc bổ sung chất 230686.30 3 359,60

hoạt tính bề mặt vào hỗn hợp thủy phân được biết là làm tăng 4 16

hiệu quả của quá trình đường hóa (Eriksson và cộng sự, 2002; Sun và Cheng, 2002;
Năm 2002; Kristensen và cộng sự, 2007). Tween 80 được thêm vào hỗn hợp
sis thủy phân và ảnh hưởng của việc thêm chất hoạt động bề mặt này là
Các biến vidual có thể được đánh giá từ các giá trị P của chúng, càng có
đã học. Sự kết hợp khác nhau của Cellulase, BGL và Tween
nhiều thuật ngữ quan trọng hơn có giá trị P thấp hơn. Các giá trị của P> F nhỏ hơn
80 đã thử đường hóa WHB và giảm tương ứng
0,05 chỉ ra rằng các điều khoản mô hình là đáng kể và trường hợp này
sản lượng đường được đưa ra trong Bảng 2.
Nồng độ BGL và Tween 80 và các hiệu ứng bậc hai và tương tác của tất cả
Dữ liệu được phân tích bằng phân tích hồi quy nhiều lần và
ba thông số được thử nghiệm được tìm thấy là đáng kể. Các đường cong bề
phương trình đa thức bậc hai (Phương trình (3)) được suy ra để biểu diễn
mặt phản hồi được vẽ để hiểu
lại quá trình sản xuất xenlulaza như là một hàm của các biến độc lập
tác động tương tác của các biến và để xác định giá trị tối ưu của mỗi
được thử nghiệm.
thông số để đạt được sản lượng cellulase tối đa. Hình
1A – C đại diện cho các bề mặt phản ứng thu được đối với ba
Y ¼ 577: 21 þ 21: 04X1 þ 79: 26X2, 70: 38X3 þ 34: 97X12
các thông số về hiệu suất đường hóa.
65: 56X22 52: 46X32 89: 31X1X2 120: 18X1X3
Tất cả ba hiệu ứng tương tác đều có ý nghĩa. Ảnh hưởng của
+ 40:21X2X3 ð3Þ sự tương tác giữa cellulase và BGL được thể hiện trong Hình. 1A. Nó có thể
được thấy rằng ở mức tải cellulase thấp hơn, hiệu quả đường hóa tăng khi
trong đó Y là phản ứng dự đoán (giảm sản lượng đường), X1, X2
tăng tải BGL, trong khi ở mức tải cel lulase cao hơn, mặc dù năng suất
và X3 lần lượt là các giá trị được mã hóa cho nồng độ Cellulase, BGL và
giảm đường tăng lên khi
Tween 80. Việc kiểm định mô hình được thực hiện bởi
tăng mức BGL ban đầu, nó trở nên ít hơn với sự gia tăng hơn nữa về mức
Kiểm định thống kê của Fisher để phân tích phương sai (ANOVA) bằng cách sử dụng
độ BGL cho thấy hiệu ứng bão hòa có thể xảy ra.
Phần mềm Design Expert và kết quả được thể hiện trong Bảng 3.
Sản lượng đường khử cao nhất thu được khi sử dụng xenlulaza
ANOVA của mô hình hồi quy bậc hai gợi ý rằng
nạp khoảng 8 FPU / g sinh khối và với tải BGL nhiều hơn
mô hình có ý nghĩa với giá trị F được tính là 27,22 và P > F
hơn 2400 U / g. Tương tự, tác động tương tác của việc tải Cellulase
thấp hơn 0,05. Giá trị của hệ số tương quan bội (R)
và nồng độ Tween 80 được đưa ra trong Hình 1B. Cellulase thấp hơn
là 0,9860 cho thấy mối tương quan tốt hơn giữa các
tải, hiệu quả của quá trình đường hóa tăng lên khi tăng
và các giá trị dự đoán. Giá trị thấp hơn cho hệ số biến thiên
ở mức Tween 80, trong khi ở mức tải cellulase cao hơn, năng suất của
cho thấy độ tin cậy cao hơn của thử nghiệm và trong trường hợp này,
giảm lượng đường ban đầu tăng khi tăng Tween 80 con
thu được giá trị CV là 5,62% chứng tỏ độ tin cậy cao hơn của
các thử nghiệm. Bảng 3 cũng đưa ra các giá trị P của từng tham số
và các số hạng bậc hai và tương tác của chúng. Ý nghĩa của indi

ban 2

Ma trận thiết kế thí nghiệm Box Behnken để tối ưu hóa quá trình đường hóa với
các phản hồi thu được (giảm năng suất đường) cho các thử nghiệm khác nhau.

Std Xenlulaza BGL (U / Giữa (% v / Giảm sản lượng đường

gọi món (FPUs / g) g) Trong) (mg / g)

1600 0,1 329,19

1 8 1600 0,1 583.57
2 3 16 8 3200 0,1 688,31
4 16 3200 0,1 585.44
5 số 8 2400 0,05 379.69
6 16 2400 0,05 628,46
2400 0,15 731,33
8 2400 0,15 499.40
7 16 1600 0,05 346.03
8 9 10 12 12 3200 0,05 402.14
11 12 1600 0,15 435,81
12 12 3200 0,15 652.78
13 12 2400 0,1 570.48
14 12 2400 0,1 568,61
15 12 2400 0,1 598.53
16 12 2400 0,1 553.64
17 12 2400 0,1 594.79
Hình 1A. Bề mặt phản hồi cho thấy tác dụng tương tác của cellulase và BGL.
Machine Translated by Google
Aswathy Hoa Kỳ và cộng sự. / Công nghệ nguồn sinh học 101 (2010) 925–930
Hình 1B. Biểu đồ bề mặt phản ứng cho thấy tác động tương tác của Cellulase & Tween 80.
Hình 1C. Biểu đồ bề mặt phản hồi cho thấy tác động tương tác của BGL và Tween 80.
trung tâm lên đến 0,1% v / v và giảm sau đó. Điều này có thể cung cấp
khả năng cung cấp enzyme tốt hơn khi có chất hoạt động bề mặt.
Kết quả về tác động tương tác của tải BGL và Tween 80
nồng độ cũng cho thấy xu hướng tương tự với đường khử
năng suất tăng khi tăng nồng độ Tween 80 đến mức cer tain ban đầu và
giảm hoặc vẫn ổn định ở đó sau khi thử tất cả các tải BGL. Cơ chế mà
chất hoạt động bề mặt làm tăng hiệu quả đường hóa của xenlulaza là
điều chưa được biết rõ, nhưng người ta đã suy đoán rằng việc bổ sung
chất hoạt động bề mặt làm giảm sự gắn kết phi sản xuất của xenlulaza trên
bề mặt sinh khối và do đó làm tăng tính sẵn có của en zyme (Eriksson
và cộng sự, 2002; Kristensen và cộng sự, 2007). Cái này sẽ
là lý do cho yêu cầu tải ít enzym hơn
để đạt được mức độ thủy phân tương tự so với các thử nghiệm trong
mà Tween 80 không được thêm vào. Vì vậy, đường khử tối đa
năng suất 731 mg / g WHB đạt được với lượng enzyme
so sánh chỉ có 8 FPU và 2400 Đơn vị BGL trên mỗi gam sinh khối
với giá trị cao nhất trước đó là 639,42 mg / g đường khử khi kết thúc
với lượng enzyme 12 FPU và 2400 U cellulase
và BGL, tương ứng. Rõ ràng, việc bổ sung chi phí hiệu quả
929
chất hoạt động bề mặt ở mức thấp trong hỗn hợp đường hóa có thể chứng
minh tính kinh tế của quy trình do tiết kiệm chi phí enzyme.
Vai trò của beta glucosidase cũng được nhấn mạnh. Nó có thể được quan sát
rằng với tải BGL tăng lên, chắc chắn sẽ có sự cải thiện trong quá
trình thủy phân nhưng đến một ngưỡng có thể được xác định bởi
nồng độ glucose mà enzym bị ức chế.
Việc sử dụng BGL dung nạp glucose nhiều hơn có thể cải thiện đáng kể
hệ thống. Điều kiện để đạt hiệu suất đường khử cao nhất
đã được tối ưu hóa bằng cách sử dụng chức năng tối ưu hóa số trong
Chuyên gia ký hiệu De. Trong số nhiều giải pháp được đề xuất, giải pháp
cho năng suất đường khử tối đa là cellulase và
Tải FPU tương ứng là 8 và 3130 U / g và nồng độ Tween 80 là 0,14%.
Lợi nhuận dự đoán cho sự kết hợp này là
825 mg/g WHB và các thử nghiệm được tiến hành ở nồng độ này cho kết quả
đường khử trong khoảng 790–850 mg / g (817 + 23 mg / g).
3.4. Sản xuất etanol bằng cách sử dụng WHB hydrolysate
Thủy phân bằng enzyme đậm đặc của WHB có chứa
Đường khử 10% được sử dụng làm cơ chất cho quá trình lên men ethanol.
Từ kết quả nghiên cứu quá trình lên men ethanol thể hiện ở
Hình 2, rõ ràng là hiệu quả của sản xuất etanol
từ sản phẩm thủy phân WHB rất ít và tối đa là etanol
năng suất là 4,25 g/L (0,54% v/v). Tuy nhiên, có thể lưu ý rằng WHB
chứa khoảng 48% hemixenluloza và chỉ có khoảng 18% xenluloza như
ước tính bởi Nigam (2002) và mặc dù quá trình thủy phân bằng enzym
sẽ giải phóng cả hexoses và pentoses do hoạt tính xylanase cao của cả
T. reesei và A. niger enzyme
chế phẩm, Saccharomyces cerevisiae chỉ có thể lên men hexose
có lẽ chiếm tỷ lệ thấp trong sản xuất etanol. Lên đến 18 g / L
etanol đã được sản xuất bởi nấm men lên men pentose trên nước
thủy phân axit hyacinth (Nigam, 2002) và việc sử dụng pentose
lên men có thể giúp cải thiện sản lượng ethanol. Tuy nhiên, hiệu suất
đường hóa xấp xỉ 73%
(sản lượng đường khử = 817 mg/g sinh khối tiền xử lý). Báo cáo
đã chỉ ra khoảng 60% thủy phân đường phân hủy trong nước
lục bình (Mishima và cộng sự, 2008) và 62% trong sinh khối thân gỗ (Lee
et al., 2009) trong khi hiệu suất chuyển hóa cellulose thành đường là 71%
được báo cáo cho cellulose (Ghose, 1972). Hiệu suất đường hóa trong
nghiên cứu hiện tại được tính bằng phần trăm chuyển đổi
từ sinh khối đã được xử lý trước để giảm lượng đường giả định là lý thuyết
năng suất 1,12 g đường / g sinh khối tiền xử lý. Giá trị thực tế có thể là
thậm chí cao hơn, vì bất kỳ lignin còn lại hoặc các hợp chất khác
không được phân tích và năng suất lý thuyết tối đa sẽ thấp hơn
hơn giá trị giả định.
Sản xuất etanol đã được cố gắng trong nghiên cứu này chỉ như một
nỗ lực trước một phần nghìn và cải thiện đáng kể sản lượng etanol có thể
Hình 2. Sản xuất etanol từ sản phẩm thủy phân WHB bởi Saccharomyces cerevisiae.
Machine Translated by Google
930 Mỹ Aswathy et al. / Công nghệ nguồn sinh học 101 (2010) 925–930
được thực hiện bằng cách đồng lên men sử dụng nấm men lên men pentose cùng
với Saccharomyces. Bây giờ chúng tôi có kế hoạch tiến hành các nghiên cứu về
quá trình đường hóa bằng cách sử dụng BGL dung nạp glucose nhiều hơn cho
cation saccharifi và sử dụng nấm men lên men pentose để lên men rượu.
4.Kết luận
Lục bình có rất nhiều trong các vùng nước ở vùng nhiệt đới và sinh khối
được phân bố khá nhiều trong các khu vực địa lý của nó. Sản xuất etanol từ
nguyên liệu này có một số thách thức kỹ thuật bao gồm thu thập sinh khối và
tiền chế biến và các nhà máy phi tập trung để sản xuất etanol có thể được sử
dụng nhiều hơn cho nguyên liệu này. Ở đây chúng tôi đã chứng minh rằng có thể
đạt được hiệu suất gần 71% trong quá trình đường hóa sinh khối lục bình với
các phương pháp rất thô sơ và hiệu quả về chi phí để tiền xử lý và sản xuất
enzyme tại chỗ. Ngoài ra, chúng tôi cũng biết rằng dịch thủy phân của WHB có
thể được lên men thành etanol bằng cách sử dụng nấm men làm bánh phổ biến
Saccharomyces cerevisiae mặc dù với hiệu suất thấp hơn. Sử dụng các sinh vật
thích hợp hơn để tation fermen có thể cải thiện sản lượng etanol. Hầu hết tất
cả các chuyên gia công nghệ mà chúng tôi đã sử dụng để sản xuất ethanol sinh
học từ WHB đều ít chuyên sâu hơn về mặt kỹ thuật và có thể được vận hành bởi
những người lao động không có tay nghề cao.
Người giới thiệu
Abraham, M., Kurup, GM, 1996. Chuyển đổi sinh học của chất thải từ cây khoai mì (Manihot esculenta)
và bèo tây (Eichhornia crassipes) - Ảnh hưởng của các yếu tố hóa lý khác nhau. J. Lên men.
Bioeng. 82, 259–263.
Box, GEP, Behnken, DW, 1960. Một số thiết kế ba cấp độ mới cho việc nghiên cứu các biến định lượng.
Kỹ thuật 2, 455–475.
Eriksson, T., Borjesson, J., Tjerneld, F., 2002. Cơ chế tác dụng của chất hoạt động bề mặt trong quá
trình thủy phân lignocellulose bằng enzym. Enzym vi sinh vật Technol. 31 (3), 353– 364.
Ghose, TK, 1972. Enzym Saccharification of Cellulose, United States Patent No.
3.642.580, ngày 15 tháng 2 năm 1972.
Ghose, TK, 1987. Đo lường các hoạt động của cellulase. Appl nguyên chất. Chèm. 59 (2),
257–268.
Ghose, TK, Bisaria, VS, 1987. Đo lường các hoạt động của hemicellulase, Phần I - Xylanases. Appl
nguyên chất. Chèm. 59 (12), 1739–1752.
Gunata, Z., Vallier, MJ, 1999. Sản xuất b-glucosidase ngoại bào có khả năng dung nạp glucose cao bởi
ba chủng Aspergillus. công nghệ sinh học. Hãy để. 21(3), 219–223.
Kahlon, SS, Kumar, P., 1987. Mô phỏng điều kiện lên men để sản xuất etanol từ bèo tây. Ind. J. Ecol.
14, 213–217.
Kristensen, J., Borjesson, J., Bruun, MH, Tjerneld, F., Jørgensen, H., 2007. Sử dụng các chất phụ
gia hoạt tính bề mặt trong quá trình thủy phân bằng enzym lignocellulose rơm lúa mì.
Enzym vi sinh vật Technol. 40, 888–895.
Lee, SH, Teramoto, Y., Endo, T., 2009. Enzyme đường hóa sinh khối gỗ nhỏ / sợi nano được tạo ra bằng
quá trình đùn ép liên tục I - Ảnh hưởng của phụ gia với ái lực xenluloza. nguồn sinh học.
Technol. 100, 275–279.
Miller, GM, 1959. Sử dụng thuốc thử axit dinitrosalicylic để xác định đường khử. Hậu môn. Chèm. 31,
426–428.
Mishima, D., Kuniki, M., Sei, K., Soda, S., Ike, M., Fujitha, M., 2008. Sản xuất etanol từ các loại
cây năng lượng tiềm năng: lục bình (Eichhornia crassipes) và rau diếp nước (Pistia) các tầng
lớp L.). nguồn sinh học. Technol. 99(7), 2495–2500.
Mitchell, DS, 1976. Sự tăng trưởng và quản lý của Eichhornia crassipes và Salvinia spp. trong môi
trường bản địa của họ và trong các tình huống xa lạ. In: Varshney, CK, Rzoska, J. (Eds.),
Aquatic Weeds in Southeast Asia. Tiến sĩ W. Junk BV
Các nhà xuất bản, The Hague, tr. 396.
Nigam, JN, 2002. Chuyển đổi sinh học của bèo tây (Eichhornia crassipes) thủy phân axit hemicellulose
thành etanol nhiên liệu động cơ bằng men lên men xylose. J. Công nghệ sinh học. 97, 107–116.
Pandey, A., Soccol, CR, Mitchell, D., 2000. Những phát triển mới trong quá trình lên men ở trạng
thái rắn. I Quy trình và sản phẩm. Quy trình sinh hóa. 35, 1153–1169.
Praveena, R., Naseema, A., 2004. Nấm xuất hiện trên lục bình [Eichhornia crassipes (Mart.) Solms] ở
Kerala. J. Trop. Nông nghiệp. 42 (1–2), 21–23.
Raimbault, M., 1998. Các khía cạnh chung và vi sinh của quá trình lên men cơ chất rắn. Bầu cử. J.
Công nghệ sinh học. (Trực tuyến) - Số phát hành ngày 15 tháng 12 năm 1998. [Đã trích dẫn ngày
15 tháng 3 năm 2007] <www.ejbiotechnology.info/content/vol1/issue3/full/9/ index.html>.
Reczey, K., Brumbaur, A., Bollok, M., Szengyel, Z., Zacchi, G., 1998. Sử dụng dịch thủy phân
hemicellulose để lên men beta glucosidase. ứng dụng Hóa sinh.
Công nghệ sinh học. 70–72, 225–235.
Singhania, RR, Sukumaran, RajeevK, Pandey, Ashok, 2007. Cải thiện sản xuất cellulase bởi Trichoderma
reesei RUT C-30 dưới SSF thông qua tối ưu hóa quy trình. ứng dụng Hóa sinh. Công nghệ sinh học.
142 (1), 60–70.
Sukumaran, RK, Singhania, RR, Mathew, GM, Pandey, A., 2008. Sản xuất cellulase bằng cách sử dụng
nguyên liệu sinh khối và ứng dụng của nó trong quá trình đường hóa lignocellulose để sản xuất
cồn sinh học: Renew. Năng lượng. doi: 10.1016 / j.renene.2008.05.008.
Sun, Y., Cheng, J., 2002. Thủy phân vật liệu lignocellulosic để sản xuất etanol: một đánh giá. nguồn
sinh học. Technol 83, 1–11.
Templeton, DW, 1994. Xác định nồng độ etanol trong sinh khối đối với dịch nổi lên men etanol bằng
sắc ký khí. Quy trình Phân tích Phòng thí nghiệm-Phòng thí nghiệm Năng lượng Tái tạo Quốc gia #
011 (bản sửa đổi 05.05.94).
Woodward, J., Arnold, SL, 1981. Sự ức chế hoạt động beta-glucosidase trong Trichoderma reesei C30
cellulase bởi các dẫn xuất và đồng phân của glucose.
Công nghệ sinh học. Bioeng. 23 (7), 1553–1562.
Yan, TR, Lin, CL, 1997. Tinh sạch và xác định đặc điểm của một glucosidase b dung nạp glucose từ
Aspergillus niger CCRC 31494. Biosci. Công nghệ sinh học. Hóa sinh. 61 (6), 965–970.