TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

Viện Công nghệ sinh học và Môi trường

……………..

Th.S LêNhãUyên
Th.S Nguyễn Thị Thanh Hải

Tài liệu
THỰC HÀNH VI SINH VẬT THỰC PHẨM
(Lưu hành nội bộ)

Nha Trang, 2019

1
 MỤC LỤC

PHẦN 1: CÁC KỸ THUẬT VI SINH CƠ BẢN .......................................................................... 3

Bài 1: AN TOÀN PHÒNG THÍNGHIỆM .................................................................................. 3
Bài 2: NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI TẾ BÀO VI SINH VẬT .................................................... 5
Bài 3: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT.................... 12
Bài 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY VI SINH VẬT .................................................................. 18
Bài 5: LẤY MẪU THỰC PHẨM VÀ CHUẨN BỊ MẪU.......................................................... 25
PHẦN 2: CÁC NHÓM VI SINH VẬT CẦN KIỂM TRA TRONG MẪU THỰC PHẨM…26
Bài 6: TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ (TPC – Total Plate count) ................................... 27
Bài 7: XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG COLIFORM, FECAL COLIFORM VÀ ESCHERICHIA
COLI .............................................................................................................................................. 29
Bài 8: KIỂM TRA SALMONELLA TRONG MẪU THỰC PHẨM.........................................32
Bài 9: KIỂM TRA VIBRIO TRONG MẪU THỰC PHẨM ..................................................... 35
Bài 10: KIỂM TRA STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG THỰC PHẨM ...................... 38
Bài 11: KIỂM TRA LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG THỰC PHẨM .................... 40
Bài 12: KIỂM TRA CLOSTRIDIUM sp. TRONG THỰC PHẨM…………………………..42
PHẦN 3: MỘT SỐ TEST SINH HOÁ QUAN TRỌNG……………………………………...43
PHẦN 4: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP .......................................................... 54
PHỤ LỤC ...................................................................................................................................... 55

2
 PHẦN 1: CÁC KỸ THUẬT VI SINH CƠ BẢN
Bài 1: AN TOÀN PHÒNG THÍNGHIỆM

1.1. Quy tắc làm việc trong phòng thínghiệm vi sinh

1.1.1. Nội quy phòng thínghiệm
(1) Tham dự đầy đủ các bài thínghiệm theo chương trình quy định. Trước khi đến phòng
thínghiệm, sinh viên cần chuẩn bị đầy đủ nội dung lýthuyết bài thínghiệm sắp làm.
(2) Tuân thủ đúng thời khóa biểu thực hành đã được sắp xếp
(3) Phải mặc áo bảo hộ (blouse) khi làm việc trong phòng thínghiệm. Tóc phải được cột,
bọc gọn tránh nhiễm vi sinh vàsém cháy do lửa đèn cồn
(4) Không ăn uống, hút thuốc trong phòng thínghiệm. Không đưa tay lên sờ miệng
(5) Không được đem canh cấy vi sinh, hoáchất, dụng cụ ra khỏi phòng thínghiệm trừ khi
được phép của giáo viên hướng dẫn.
(6) Cần cóýthức tiết kiệm môi trường, hóa chất, vật liệu khi thực hiện thínghiệm.
(7) Khi làm việc với các trang thiết bị, dụng cụ cần cẩn thận, nhất là đối với kính hiển vi.
Khi chưa biết cách vận hành, sinh viên phải hỏi giáo viên hướng dẫn hoặc người phụ
trách.
(8) Khi thực hiện các bài thínghiệm vi sinh, sinh viên cần tuân thủ đúng các kĩ thuật vô
trùng vàkhử trùng để tránh lây nhiễm vi sinh vật.
(9) Khi thực hiện thínghiệm, sinh viên làm việc theo nhóm, sau đó phân tích kết quả thí
nghiệm.
(10) Dọn dẹp, lau chùi sau khi làm việc. Các trang thiết bị, dụng cụ, hoáchất sau khi
dùng xong phải để đúng nơi quy định
(11) Nhóm trực nhật cótrách nhiệm kiểm tra các vòi nước, kiểm tra tình hình sử dụng
điện của các trang thiết bị, tắt điện, tắt quạt trước khi ra về.
MỘT SỐ LƯU Ý VỚI SINH VIÊN NHẰM ĐẠT KẾT QUẢ TỐT TRONG
THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC.
Trước khi làm thínghiệm:
- Cần tìm hiểu mục đích, yêu cầu vànội dung bài thực hành.
- Nắm vững lýthuyết liên quan đến các thínghiệm.
- Đọc cẩn thận các bước tiến hành thínghiệm và cách đọc kết quả.
Trong quátrình thực hành:
- Cần thực hiện đúng các thao tác và các bước của thínghiệm để đạt được mục đích
vàyêu cầu đã đề ra.
Sau mỗi bài thực hành:
- Phải làm đầy đủ các bài tường trì
nh, trả lời các câu hỏi vàbài tập ở phần cuối bài.
1.1.2. Kĩ thuật vôtrùng, khử trùng:
Một số thuật ngữ cần phân biệt:
Vô trùng là1 quátrình màtất cả các vi sinh vật sống bị pháhuỷ. Các vi sinh vật này bị
giết bởi hơi nóng áp lực hay ở nhiệt độ cao trong điều kiện khô, hay đốt thành tro. Nếu chúng
ta nói một vật vô trùng, chúng ta hiểu rằng vật đó hoàn toàn không có các vi sinh vật sống.
Nói chung khi nói đến sự vô trùng, ý nói đến sự an toàn phòng thínghiệm, chủ yếu chúng ta
3
 nói đến vô trùng bởi hơi nóng áp lực bằng autoclave. Phương pháp khử trùng cơ bản là đốt
cháy các tác nhân khử trùng hoặc đốt thành tro. Tất cả các chất thải sinh học phải được đốt
cháy kỹ trước khi thải bỏ.
Khử trùng là quá trình trong đó các sinh vật không sinh bào tử, sinh dưỡng bị pháhuỷ.
Các tác nhân gây được quátrình này gọi làchất khử trùng hay chất giết khuẩn. Các tác nhân
như vậy chỉ được sử dụng cho các vật dụng do chúng độc với mô người và động vật.
Nhiễm trùng được xác định khi cósự phát triển (nhân lên) của các vi sinh vật trong mô
của cơ thể. Thuật ngữ vô trùng dùng để chỉ bất cứ quá trình nào mà ngăn cản sự xâm nhập
của các tác nhân nhiễm trùng vào mô vô trùng, do vậy ngăn ngừa sự nhiễm trùng. Các kỹ
thuật vô trùng chỉ những thao tác màcác nhàvi sinh vật học dùng để loại tất cả các vi sinh
vật khỏi môi trường nhiễm hay mô sống tiếp xúc. Các chất kháng khuẩn làcác hoá chất
(thường làcác chất khử khuẩn hoàtan) cóthể sử dụng an toàn cho bên ngoài cơ thể nhằm phá
huỷ hay ức chế các vi khuẩn sinh dưỡng.
Khi thực hiện các bài thínghiệm vi sinh, sinh viên cần tuân thủ các thao tác thực hiện đúng
kỹ thuật để không gây tạp nhiễm ảnh hưởng đến thínghiệm hay không gây phân tán vi sinh vật ra
môi truờng xung quanh. Các kĩ thuật đó bao gồm kĩ thuật vô trùng đối với dụng cụ thínghiệm,
môi trường nuôi cấy vi sinh vật; tuân thủ kĩ thuật khử trùng đồi với tay người nghiên cứu, bàn
làm việc để tránh gây nhiễm trùng Việc này liên quan đến thực hiện các kỹ thuật vô trùng, khử
trùng vàthực hành phương tiện an toàn phòng thínghiệm.
Khi bắt đầu làm vệc với các canh cấy vi khuẩn trong các bài thực hành, sinh viên phải học
các kỹ thuật. Một số điều cơ bản chúng ta phải tuân theo:
- Rửa tay
Trước khi bắt đầu làm việc, người làm phải rửa tay, sau đó sử dụng các dung dịch sát
khuẩn vàlau khô bằng giấy lau. Kết thúc công việc, trước khi rời phòng thínghiệm, chúng ta
phải rửa tay bằng xàphòng.
- Khử trùng mặt bàn làm việc
Bắt đầu buổi làm việc, người làm phải lau bàn bằng chất diệt khuẩn nhằm loại bụi bẩn
trên mặt bàn, làm giảm thiểu nguy cơ nhiễm khuẩn vào canh cấy. Kết thúc công việc, trước khi
rời phòng thínghiệm, cần khử trùng lại để bảo vệ cho nhóm thực tập tiếp theo.
- Sử dụng đèn cồn (đèn gas)
Trong phòng thínghiệm vi sinh đèn cồn được sử dụng để khử trùng vòng cấy của que cấy,
miệng bình, miệng ống nghiệm. Để khử trùng vòng cấy cần đốt cho đến khi nóng đỏ sau đó để
cho vòng cấy nguội bằng cách giữ vòng cấy một thời gian ở vùng vôtrùng xung quanh ngọn lửa.
Cần lưu ý, để an toàn khi sử dụng đèn cồn, không di chuyển đèn cồn đang cháy, không
chụm hai đèn cồn với nhau để châm lửa, không dùng miệng thổi tắt đèn cồn, muốn tắt thìphải
dùng nắp chụp đậy lại.
- Pipette.
Pipette dùng để chuyển canh cấy phải sử dụng thiết bị hút cơ học, không sử dụng miệng
để hút.
1.1.3. Xử lýcanh cấy vi sinh vật
Thải bỏ canh cấy
Các dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật trước khi thải bỏ phải được hấp khử trùng (autoclave) ở
1210C / 15 phút để giết chết vi sinh vật.
Xử lý khi làm đổ canh cấy

4
 Tất cả các trường hợp sự cố làm đổ canh cấy vi sinh vật phải báo cáo ngay với giáo viên
hướng dẫn. Mặc dù đa số các vi sinh vật sử dụng trong các bài thực hành làkhông gây bệnh,
nhưng có một số ít gây bệnh. Do vậy, chúng ta phải xử lýtất cả các trường hợp sự cố làm đổ dịch
cấy, phòng khi có liên quan đến vi sinh vật gây bệnh. Biện pháp xử lý:
+ Tất cả áo bảo hộ, vải lau dính dịch cấy phải được đem autoclave.
+ Dùng giấy, vải thấm dịch sát khuẩn đặt vào vùng canh cấy đổ.
+ Đổ thuốc sát khuẩn quanh nơi có canh cấy vi sinh, để hạn chế lây lan ra xung
quanh vàkhông khí.
+ Dùng kẹp (loại cóthể hấp tiệt trùng được) gắp giấy, vải lau bỏ vào dụng cụ chứa
đựng đem autoclave (autoclave cả kẹp gắp)
(Tương tự, đối với hoáchất gây nguy hiểm đến người như gây kích ứng cơ thể, gây tổn
thương da hay gây ung thư ... phải báo cáo ngay với giáo viên hướng dẫn để cóbiện pháp xử lý
thích hợp)
1.2. Sử dụng trang thiết bị, dụng cụ phòng thínghiệm vi sinh
- Thiết bị dập mẫu
- Tủ sấy dụng cụ
- Nồi hấp vôtrùng
- Tủ ủ ấm vi sinh
- Cân phân tích
- Tủ lạnh
- Kính hiển vi
- Máy lắc các loại

Bài 2: NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI TẾ BÀO VI SINH VẬT

2.1. Dụng cụ, môi trường, hóa chất

2.1.1. Dụng cụ:
- Kính hiển vi quang học
- Lame, lamen
- Bình nước rửa
- Giấy thấm
- Que cấy, đèn cồn, hộp quẹt
2.1.2. Môi trường, hóa chất:
- Nước muối sinh lý
- Thuốc nhuộm các loại: tím Violet, lugon, Xanh Methylene, Fucshine, Cồn.
- Dầu soi kính
- Ống giống vi khuẩn lactic, vi khuẩn Gram (-), nấm men, nấm mốc.
2.2. Phương pháp làm tiêu bản
2.2.1. Phương pháp làm tiêu bản soi tươi
. Cách làm tiêu bản giọt ép
- Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi.

5
 - Đặt lákính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí. Muốn
vậy để một mép lákính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lákính xuống.
- Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi.
Cách làm tiêu bản giọt treo
Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và
phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích.
- Dùng phiến kính đặc biệt cóphần lõm hình tròn ở giữa.
- Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính.
- Cho 1 giọt canh trường lên giữa lákính.
- Thận trọng xoay ngược lákính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lên phần
lõm của phiến kính.

Hình 1: Phương pháp làm tiêu bản giọt treo

2.2.2. Phương pháp làm tiêu bản cố định

Phương pháp vôtrùng tạo vết bôi:
- Lắc đều ống nghiệm để vi khuẩn lơ lửng trong ống, chú ý không làm ướt nút ống
nghiệm.
- Hơ đỏ đầu que cấy vàphần kim loại. Hơ nóng phần tay cầm.
- Mở nút ống nghiệm và hơ nóng miệng ống. Không đặt nút xuống bàn.
- Làm nguội đầu que cấy ít nhất 5 giây, lấy một vòng que cấy dịch chứa vi sinh vật, tránh
chạm đầu que cấy vào thành ống nghiệm.
- Hơ nóng miệng ống nghiệm lần nữa.
- Đậy nút ống nghiệm và đặt lên giá.
- Đặt vòng cấy chứa vi khuẩn chính giữa vòng mục tiêu đã được định sẵn thành vòng tròn
trên phiến kính.
- Hơ que cấy lại trước khi chuyển vòng cấy khác từ canh cấy hoặc đặt sang chỗ khác.

Phương pháp cố định tế bào:

6
 Đối với mẫu lấy từ môi trường dịch lỏng:
- Đặt 2 vòng que cấy dịch chứa vi sinh vật vào chính giữa vòng tròn mục tiêu
- Tán đều vi sinh vật khắp vùng của vòng mục tiêu. Vết bôi làm khôở nhiệt độ phòng.
Đối với mẫu lấy từ môi trường rắn: Đặt 2 vòng que cấy nước vào chính giữa vòng tròn
mục tiêu, sau đó đưa sinh khối vi sinh vật vào giữa tán đều và làm tương tự.
Đưa phiến kính qua ngọn lửa vài lần để tiêu diệt vàgắn vi khuẩn vào phiến kính.

Hình 2: Phương pháp làm tiêu bản cố định

Hình 3: Làm tiêu bản cố định từ môi trường lỏng và môi trường rắn

7
Nhuộm đơn:
- Đặt tiêu bản lên cầu thuỷ tinh (đặt nằm ngang miệng một khay nhân, hoặc thuỷ tinh).
- Nhỏ vào vết bôi vài giọt Xanh Methylene, để yên 1 phút.
- Rửa vết bôi bằng cách nghiêng phiến kính, dùng bình xịt cho dòng nước chảy nhẹ qua
vết bôi đến khi nước chảy ra không còn màu nữa.
- Dùng giấy thấm khôtiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn
- Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 40) rồi chuyển sang vật kính (x 100) dùng dầu soi.

Hình 4: Phương pháp nhuộm đơn

Nhuộm Gram
Các kỹ thuật nhuộm dùng trong việc nhận diện vi khuẩn chưa biết. Nhuộm gram làmột
thínghiệm quan trọng trong PTN vi sinh vật. Mặc dùkỹ thuật này khá đơn giản, nhưng cần tiến
hành thínghiệm cẩn thận.
Chúý: (1) không làm vết bôi quádày
(2) Chú ý bước tẩy màu.
(3) Canh cấy của vi khuẩn gram dương già có khuynh hướng mất màu nhanh hơn
canh cấy non, khiến chúng xuất hiện gram âm thay vìvi khuẩn gram dương. Để cókết quả đáng
tin cậy nên sử dụng một canh cấy khoảng 16 giờ. Một điểm khác cần chúý, vài loài Bacillus có
thử nghiệm nhuộm gram thay đối: đôi khi bắt màu gram dương, đôi khi bắt màu gram âm.
Các bước thực hiện nhuộm Gram:
1. Phủ crystal violet lên vết bôi vàgiữ trong 20 giây.
2. Sử dụng bình nước cất rửa sạch vết thuốc nhuộm trong một thời gian ngắn, làm ráo nước
thừa.
3. Phủ vết bôi với dung dịch iodine của gram vàgiữ 30 giây - 1 phút.
4. Đổ hết dung dịch iodine của gram vàgiội tràn vết bôi với ethyl alcohol 95% trong 10-20
giây. Đây là bước quyết định. Vết bôi dày sẽ cần khoảng thời gian lâu hơn vết bôi mỏng.
Sự mất màu xuất hiện khi dòng chảy từ phiến kính hòa tan thuốc nhuộm không còn màu.
5. Dừng hoạt động của alcohol bằng cách rửa phiến kính với nước trong bình rửa vài phút.
6. Phủ safranin trên vết bôi vàgiữ trong 20 giây.
7. Rửa nhẹ nhàng trong vài giây, thấm khôbằng giấy thấm vàkhông khíkhô.
8. Kiểm tra phiến kính dưới dầu soi kính.

8
 Hình 5: Phương pháp nhuộm Gram

Hình 6: Một số hình ảnh các kiểu nhuộm quan sát tế bào vi khuẩn

2.3. Kính hiển vi:

Hiện nay có rất nhiều loại kính hiển vi, một số loại được dùng phổ biến trong phòng thí
nghiệm vi sinh vật: kính hiển vi trường sáng, kính hiển vi trường tối, phản pha, vàhuỳnh quang;
trong bài này chỉ trình bày kính hiển vi trường sáng. Nếu trước đây bạn đã tìm hiểu về kính hiển
vi, thìbài này sẽ không cónhiều thông tin cung cấp cho bạn; tuy nhiên nếu đây là lần đầu tiên tìm
hiểu về vi sinh vật, bạn cần đọc kỹ để sử dụng đúng kính hiển vi.

9
 Trong kính hiển vi trường sáng, tia sáng đi trực tiếp từ nguồn đến mắt người màkhông bị
lệch hướng do tấm mờ nằm giữa tụ quang. Đây là loại kính được học sử dụng đầu tiên dành cho
người bắt đầu học về sinh học, thường đuợc sử dụng trong phòng thínghiệm vi sinh vật.
Tất cả các loại kính hiển vi trường sáng có cấu trúc chung, hơi khác về hệ thống cơ. Bài
tập sẽ giúp bạn hiểu rõvề loại kính hiển vi tại phòng thínghiệm.
2.3.1. Các bộ phận chính của kính hiển vi
Khung đỡ gồm chân vàthân kính
Bàn soi cóbộ phận kẹp lam kính, vít trượt điều chỉnh vị trílam kính trên bàn soi.
Hệ thống thấu kính gồm thị kính, vật kính vàtụ quang.
Ốc chỉnh kính: ốc chỉnh kính thôvàốc chỉnh kính tinh.

Hình 7: Các bộ phận chính của kính hiển vi.

2.3.2. Các thao tác chăm sóc kính hiển vi
Kính hiển vi làdụng cụ cần được chăm sóc đặc biệt để
tránh hư hỏng hệ thống quang học và cơ học. Các thao tác sử
dụng kính cần được thực hiện đúng theo chỉ dẫn sau:
Vận chuyển: Khi chuyển kính hiển vi từ vị trínày sang vị trí
khác trong phòng thínghiệm, phải đỡ dụng cụ bằng cả hai tay.
Nếu chỉ cầm 1 tay thìrất dễ va chạm vào vật dụng khác. Mỗi
lần di chuyển chỉ được phép cầm 01 kính hiển vi
Ngăn nắp: Giữ nơi soi kính ngăn nắp, cất sách vở, dụng cụ
không cần thiết. Vùng soi kính gọn gàng, ngăn nắp sẽ ít xảy ra
sự cố hơn. Hình 8: Hai tay đỡ dụng cụ một
Dây điện: Dây dẫn điện bóng đèn kính hiển vi rất dễ làm sinh cách chắc chắn trong khi di
viên vấp, kéo kính hiển vi rơi xuống đất. Chú ý dây điện sao chuyển kính hiển vi.
cho mọi người đi lại trong phòng thínghiệm không bị vấp.

10
Lau chùi thấu kí nh: Bắt đầu buổi thínghiệm kiểm tra xem các thấu kính đã sạch hay chưa. Khi
sử dụng dầu để soi kính, cuối buổi thínghiệm phải lau vật kính bằng các dụng dịch lau kính
(nước ấm xà phòng, xylene, alcohol, cũng có thể dùng acetone nhưng chú ý acetone là dung môi
mạnh cóthể làm tan keo gắn các thấu kính). Giấy lau sử dụng loại chuyên dùng, không tạo xơ bụi
khi lau, giấy sạch không bám bụi vìcóthể làm trầy sướt kính. Bạn phải tuân theo sự chỉ dẫn của
Giáo viên phụ trách.
Bảo vệ chống bụi: Hầu hết các dụng cụ trong phòng thínghiệm đều cótấm che phủ nhằm bảo vệ
dụng cụ khỏi bụi. Cuối buổi làm việc, cần đậy lại để chống bụi.
2.3.3. Cách điều chỉnh kính hiển vi
Độ phóng đại: Độ phóng đại cuối cùng của ảnh soi
được bằng độ phóng đại của thị kính nhân với độ phóng đại
của vật kính.
Soi kí nh ở vật kính có độ phóng đại thấp: thường
dùng vật kính 10x. Gồm các bước sau:
- Kẹp tiêu bản lên bàn soi đúng vị trí, chú ý mẫu
cần soi ở mặt trên.
- Bật nguồn sáng, chỉnh ở mức ánh sáng vừa phải
(chỉnh nguồn, tụ quang),
- Chỉnh mẫu soi đến vị trítrung tâm nguồn sáng.
- Quay vật kính có độ phóng đại cần Hình 9: Kẹp tiêu bản
soi vào đúng vị trí (lưu ý chốt định
vị vào đúng vị trí)
- Hạ vật kính xuống hoặc nâng bàn
soi lên vị trínhất định tuỳ theo kính
hiển vi (vị trí này đã được định
trước không quágần lam kính)
- Mắt nhìn vào thị kính, từ từ hạ vật
kính (hoặc nâng bàn soi) cho đến
khi ảnh xuất hiện.
- Dùng ốc tinh chỉnh để có được ảnh
rõnhất.
- Dùng ốc điều chỉnh thanh trượt bàn Hình 10: Đường đi của ánh sáng
soi để di chuyển lam kính tìm hình
cần soi.
Soi kí nh ở vật kính có độ phóng đại cao hơn: thường dùng vật kính 40x.
- Sau khi chỉnh ở vật kính 10x cóảnh rõ, bạn xoay vật kính 40x đến vị trícần soi.
- Chỉ dùng ốc chỉnh tinh để chỉnh cho ảnh rõ (không được dùng ốc thỉnh thô)
Soi kí nh ở vật kính dầu: vật kính 100x
- Giữa vật kính vàtiêu bản códầu soi kính (chiết suất dầu soi kính bằng chiết suất thuỷ
tinh)
- Lưu ý: Khoảng cách giữa vật kính vàtiêu bản rất nhỏ nên rất dễ bị vỡ tiêu bản do vật
kính chạm vào tiêu bản, gây hỏng vật kính.

11
 Hình 11: Sơ đồ giải thích lýdo dùng dầu soi kính.

Khi sử dụng xong kính hiển vi:

1. Lấy lam kính ra khỏi bàn soi.
2. Nếu dùng vật kính dầu, lau dầu khỏi vật kính bằng giấy lau vàdung dịch lau theo quy
định của phòng thínghiệm.
3. Xoay vật kính có độ phóng đại nhỏ nhất về vị trísoi kính.
4. Các bộ phận di chuyển được đưa về vị trícao nhất.
5. Điều chỉnh thanh trượt trên bàn soi về vị tríở giữa.
6. Phủ tấm chống bụi.
7. Cất vào đúng nơi quy định.

Bài 3: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

3.1. Dụng cụ, môi trường, hóa chất

- Ống nghiệm (ф16mm, ф 20mm dài 15cm), đĩa petri, pipet, bình tam giác.
- Cốc đong, bình định mức, que khuấy thủy tinh, bình cồn 700, đèn cồn, giá đỡ.
Các dụng cụ thủy tinh cần được làm sạch, dùng cây cọ ống nghiệm chùi rửa với chất tấy
rửa. Súc rửa hai lần, đầu tiên với nước vòi, cuối cùng với nước cất để giũ sạch các dấu vết của
chất tẩy rửa. Đặt dốc ngược chúng lên giá để khô. Không dùng khăn lau khô dụng cụ.
- Môi trường:
Lượng môi trường pha chế cần dùng nên xác định rõ, tránh dư thừa hoặc phải thời gian
bảo quản dài.
Đo lường một lượng nước đủ để làm môi trường. Các thể tích môi trường yêu cầu trong
một ống nghiệm như sau:
Ống môi trường để rót vào đĩa Petri: 12 ml
Ông thạch đứng 6 ml
Ống thạch nghiêng 4 ml
Ống canh trường 5 ml
Ống canh trường lên men 5-7 ml
3.2. Cách chuẩn bị dụng cụ
3.2.1. Bao gói dụng cụ
a/ Nguyên tắc
- Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch vàkhô.
- Bao gói phải kín vàcẩn thận để sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vôtrùng của dụng cụ trong
lớp giấy gói vàlấy ra sử dụng dễ dàng.
b/ Phương pháp bao gói dụng cụ:
12
Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu:
- Làm nút bông: cho các ống nghiệm, bình tam giác, pipet.
- Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ khác.
Cách làm nút bông
- Với các ống nghiệm:
+ Lấy một ít bông không thấm nước cuộn lại.
+ Dùng que tre ấn vào giữa cuộn bông.
+ Đẩy cuộn bông này gập đôi và từ từ vào miệng ống nghiệm.
Yêu cầu:
Nút có kích thước và độ chặt vừa phải.
Đầu nút tròn, gọn, phần ngoài lớn hơn phần trong.
Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng
- Với các chai, lọ, bình tam giác có kích thước lớn: cách làm tương tự nhưng sử dụng
lượng bông nhiều hơn
- Với các pipet: dùng một sợi dây thép nhỏ nhét một ít bông vào đầu lớn của pipet để hạn
chế không khíbên ngoài khi hút vào pipet
Cách bao gói dụng cụ
Với các dụng cụ sau khi làm nút bông cần bao gói phần có nút bông bằng giấy báo để khi
khử trùng nút bông không bị ướt và đảm bảo điều kiện vôtrùng tốt hơn. Cách làm như sau:
- Cắt các đoạn băng giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói.
- Quấn quanh phần đầu cónút bông.
- Cột lại thật chặt
Yêu cầu:
- Phần giấy bao bên ngoài phải chặt vàkín
- Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt
- Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô.
Với các dụng cụ như pipet, que trang phải dùng giấy bao kín toàn bộ. Cóthể dùng hộp nhôm để
đựng các dụng cụ trên để khử trùng.
3.2.2. Các phương pháp vô trùng dụng cụ
a/ Nguyên tắc
- Sau khi vôtrùng cần đảm bảo:
+ Sự vôtrùng tuyệt đối cho dụng cụ vàvật phẩm
+ Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật
- Bảo đảm an toàn tuyệt đối cho con người
Khi khử trùng bằng nhiệt, các tế bào sinh dưỡng của VSV bị tiêu diệt dễ dàng trong khi các bào
tử vẫn còn tồn tại ở ngay nhiệt độ đó
Khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật phụ thuộc vào:
- Tính chất môi trường
- Số lượng tế bào
- Độ pH của vật cần khử trùng
Do vậy để khử trùng bằng nhiệt hiệu quả cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp nhất vàkhoảng thời
gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt toàn bộ VSV vàbào tử của chúng cótrong dụng cụ cần khử
trùng.
b/ Phương pháp vô trùng dụng cụ:
* Phương pháp nhiệt khô
(1) Khử trùng bằng tủ sấy:
- Được thực hiện trong tủ sấy
- Cách tiến hành:
13
 + Đặt các dụng cụ đã được bao gói vào tủ sấy
+ Bật công tắc tủ hoạt động
+ Điều chỉnh thời gian vànhiệt độ thích hợp (1600C trong 2h hoặc 1800C trong 30
phút)
+ Tắt tủ sấy, để nguội tới 600C rồi mở tủ lấy dụng cụ ra. Tránh mở tủ lấy dụng
cụ khi nhiệt độ tủ còn cao sẽ làm dụng cụ thủy tinh dễ vỡ
+ Các dụng cụ sau khi sấy màgiấy bao có màu hơi vàng là đạt yêu cầu. Nếu giấy
bao cómàu nâu chứng tỏ nhiệt độ khử trùng cao làm bông vàgiấy biến thành gondron (hợp chất
cótính sát trùng) thìkhông thể sử dụng dụng này để nuôi cấy VSV được.
(2) Khử trùng bằng cách đốt que lửa nóng đỏ:
- Phương pháp này dùng để khử trùng que cấy, ống hút, đầu ống nghiệm, miệng bình tam
giác sau khi lấy nút bông ra.
- Cách khử trùng:
+ Hơ dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại đến 3 – 4 lần. Với các dây
mayxo ở đầu que cấy phải nung cho thật đỏ hết chiều dài dây cấy.
+ Đợi dụng cụ nguội mới được sử dụng để tránh vỡ vàvi khuẩn không bị tiêu diệt
khi lấy giống.
* Khử trùng bằng sức nóng ướt
(1) Đun cách thủy ở nhiệt độ thấp (phương pháp khử trùng Pasteur)
Phương pháp này thường được dùng để khử trùng nhanh các thực phẩm dễ biến tính ở
nhiệt độ cao. Phương pháp này chỉ cótác dụng ức chế VSV không cóbào tử.
Cách tiến hành: Đun nóng môi trường lên 65 – 700C trong 15 – 30 phút
(2) Hấp cách quãng 1000C (phương pháp Tyndal)
Phương pháp này dùng để khử trùng một số loại môi trường nuôi cấy men bánh mì, men
gia súc, mốc làm nước chấm....chứa nhiều đường. Kết quả: môi trường vừa được khử trùng vừa
được đảm bảo không thay đổi chất lượng.
Cách khử trùng:
- Hấp ở 1000C trong 30 phút.
- Lấy ra để tủ ấm 24 giờ để cho bào tử vi khuẩn phát triển
- Hấp môi trường lần thứ hai ở 1000C trong 30 phút tiêu diệt các bào tử vừa nẩy mầm.
- Lặp lại quátrình này 3 lần
(3) Khử trùng bằng hơi nước bão hòa áp suất cao (Autoclave)
Phương pháp này được thực hiện trong nồi hấp vôtrùng ở áp suất cao. Đó là thiết bị làm
bằng kim loại cótính chịu nhiệt cao cókhả năng tự động điều chỉnh nhiệt độ vàthời gian
Nguyên tắc hoạt động của thiết bị làlàm tăng nhiệt để khử trùng các vật bằng hơi nước dưới áp
suất lớn hơn áp suất khíquyển. Khi áp suất tăng, nhiệt độ trong nồi cũng tăng, an toàn thiết bị
được kiểm soát hệ thống van rất chặt chẽ.
Phương pháp khử trùng bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao là phương pháp phổ biến và
hiệu quả nhất trong các phương pháp khử trùng nhờ khả năng tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng và
bào tử của vi sinh vật.
3.3. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:
Hầu hết các thínghiệm vi sinh đều cần sử dụng các môi trường cho quátrình nuôi cấy vi
sinh vật. Thông thường các thínghiệm sử dụng môi trường tổng hợp dạng khô đã được chuẩn bị
sẵn. Tuy nhiên, cóthể trong một số trường hợp bạn cần một vài môi trường đặc biệt mà đã không
được chuẩn bị sẵn, sinh viên trong nhóm phải cùng nhau chuẩn bị.
3.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng cần thiết của vi khuẩn

14
 Bất cứ môi trường nào phùhợp cho một nhóm vi sinh vật cụ thể đều bao gồm 7 yếu tố sau:
nước, carbon, nguồn năng lượng, nitrogen, khoáng, yếu tố sinh trưởng, pH. Vai trò của mỗi yếu
tố như sau:
Nước: Nguyên sinh chất chứa 70-85% nước. Nước trong sinh vật đơn bào gắn liền với
nước trong môi trường, các phân tử này ra vào qua màng tế bào cùng với việc vận chuyển các
chất dinh dưỡng vàbài tiết các chất ra khỏi tế bào. Hoạt động của enzyme kiểm soát các phản
ứng xảy ra trong tế bào phụ thuộc hàm lượng nước trong tế bào.
Chất lượng nước dùng trong chuẩn bị môi trường rất quan trọng. Nước cứng có hàm
lượng ion canxi và magiê cao không được sử dụng. Phosphate của canxi vàmagiêkhông hòa tan
cóthể kết tủa khi cómặt của peptone vàcao thịt bò. Tốt nhất luôn sử dụng nước cất.
Carbon: Có2 nhóm vi sinh vật tuỳ theo nguồn carbon sử dụng gồm: Nhóm vi sinh vật tự
dưỡng (sử dụng carbon dioxide tổng hợp tất cả chất cho tế bào); Nhóm vi sinh vật dị dưỡng (sử
dụng hợp chất hữu cơ cho quátrình tổng hợp). Ngoài nguồn carbon hữu cơ, vi sinh vật tự dưỡng
cũng có thể sử dụng carbon dioxide. Nếu khínày hoàn toàn loại trừ ra khỏi môi trường của chúng,
sự phát triển của chúng bị chậm lại, đặc biệt trong giai đoạn sớm của bắt đầu một canh cấy.
Nguồn năng lượng: Gồm 2 nhóm: Vi sinh vật quang năng (photoautotrophs) cósắc tố sử
dụng nguồn năng lượng mặt trời vàvi sinh vật hóa năng (chemoautotroph) oxi hóa hợp chất vô
cơ đơn giản tạo năng lượng. Chất sinh năng lượng cần thiết cho các vi sinh vật này cóthể làcác
chất như nitrite, nitrate hoặc sulfide.
Hầu hết các vi khuẩn thuộc vào nhóm dị dưỡng hóa năng cần nguồn năng lượng hữu cơ
như glucose hoặc amino acids.
Một lượng nhỏ vi khuẩn làdị dưỡng quang năng. Các vi sinh vật đó có sắc tố quang hợp
cho phép chúng sử dụng ánh sáng mặt trời cho năng lượng. Nguồn năng lượng carbon cần làhợp
chất hữu cơ như alcohol.
Nitrogen: Vi sinh vật tự dưỡng cóthể sử dụng nguồn nitrogen vô cơ, vi sinh vật dị dưỡng
lấy nguồn nitrogen từ amino acid vàhợp chất trung gian như peptid proteoses và peptone. Dịch
chiết thịt bò vàpeptone sử dụng trong canh dinh dưỡng cung cấp nitrogen cần thiết cho vi sinh
vật tự dưỡng phát triển trong môi trường.
Khoáng: Tất cả các vi sinh vật yêu cầu một vài nguyên tố kim loại như sodium,
potassium, calcium, magnesium, sắt, kẽm, đồng phosphor và coban cho sự sinh trưởng bình
thường. Vi khuẩn không ngoại lệ. hàm lượng yêu cầu khánhỏ.
Các yếu tố phát triển: bất cứ hợp chất cần thiết nào của vật chất tế bào màmột vi sinh
vật không thể tổng hợp từ nguồn carbon và nitrogen được phân loại làmột yếu tố phát triển. Yếu
tố phát triển có thể bao gồm amino acid hoặc vitamin. Nhiều vi sinh vật dị dưỡng thỏa mãn với
yếu tố sinh trưởng hiện diện trong dịch chiết thịt bò của canh thang dinh dưỡng. Hầu hết các vi
khuẩn gây bệnh khó tính yêu cầu môi trường giàu dinh dưỡng như thạch máu giàu yếu tố phát
triển.
pH: Sự phát triển của vi sinh vật trong một môi trường cụ thể cóthể hoàn toàn bị ức chế
nếu pH môi trường không nằm trong vùng giới hạn. Các enzyme vi sinh vật bị ảnh hưởng lớn bởi
yếu tố này. Hầu hết các vi khuẩn phát triển tốt nhất xung quanh pH 7, pH của canh thang dinh
dưỡng nên điều chỉnh đến pH 6,8. Mặt khác, vi khuẩn gây bệnh thường thích ứng pH kiềm hơn.
Trypticase soy broth làmột môi trường phùhợp cho nhiều vi khuẩn gây bệnh khó tính nên điều
chỉnh đến pH 7,3.
3.3.2. Các loại môi trường:
Một môi trường nuôi cấy vi sinh vật làthực phẩm cho canh cấy vi khuẩn, nấm mốc, và
các vi sinh vật khác.
15
 (1) Phân chia theo trạng thái của môi trường cóthể chia 3 dạng: lỏng, đặc vàbán
rắn.
Môi trường lỏng: được sử dụng cho việc nhân giống một lượng lớn vi sinh vật, nghiên
cứu sự lên men, vànhiều thử nghiệm khác.
Môi trường rắn: là môi trường thêm vào một tác nhân tạo đông như agar, gelatin, hoặc
silica gel vào môi trường lỏng. Một tác nhân tạo đông tốt làmột chất màkhông bị sử dụng bởi vi
sinh vật, không ức chế sự phát triển của vi khuẩn vàkhông hóa lỏng ở nhiệt độ phòng. Agar và
silica gel không hóa lỏng ở nhiệt độ phòng và không bị sử dụng bởi nhiều sinh vật. Trái lại,
gelatin bị thủy phân bởi khánhiều vi sinh vật vàhóa lỏng ở nhiệt độ phòng.
Môi trường rắn làcần thiết cho sự phát triển các khuẩn lạc trên bề mặt môi trường khi
phân lập vi sinh vật từ canh cấy hỗn hợp.
Môi trường bán rắn: là dạng môi trường chứa tác nhân tạo đông với tỷ lệ thấp. Môi
trường này hữu ích trong việc xác định sự di chuyển của vi khuẩn.
(2) Phân chia theo thành phần môi trường:
Môi trường tổng hợp: Các môi trường cần có các thành phần được biết chính xác đến
chi tiết. Các môi trường thông thường làm từ các chất hóa học có độ tinh sạch cao vàthành phần
chính xác.
Môi trường tự nhiên: Các môi trường như canh thang dinh dưỡng chứa các thành phần
không chính xác được gọi là môi trường tự nhiên. Thành phần hai loại dịch chiết thịt bò và
peptone đều không chính xác trong canh dinh dưỡng.
(3) Căn cứ vào mục đích sử dụng: Môi trường cơ sở (minimum medium), Môi
trường làm giàu (enrichment medium), Môi trường giám biệt (differential medium), Môi trường
chọn lọc (selective medium), môi trường sinh hóa
Hai loại môi trường đặc biệt sẽ được mở rộng sử dụng trong chỉ dẫn thực hành làmôi
trường chọn lọc vàphân biệt.
Môi trường chọn lọc là môi trường chỉ có loại vi sinh vật chính xác phát triển trên hoặc
trong môi trường đó bởi vì(1) không có mặt một số chất dinh dưỡng quan trọng làm cho nó
không thích hợp cho hầu hết các vi sinh vật nhưng không phải tất cả hoặc (2) cósự hiện diện của
chất ức chế ngăn cản sự phát triển của các vi sinh vật nhất định nào đó.
Môi trường phân biệt là môi trường chứa các chất tạo ra một số vi khuẩn để cómột dạng
khác nhau từ các loài khác, cho phép phân biệt một trong những loài khác.
Trong một số trường hợp môi trường đưa vào công thức cả hai yếu tố chọn lọc vàphân
biệt. Vídụ môi trường EMB agar, sử dụng để xác định E.coli trong phân tích nước.
3.3.3. Cách chuẩn bị môi trường: Bao gồm các bước
Bước 1: Pha môi trường
1/ Đo lường một lượng nước đủ để làm môi trường vào bình tam giác. Chúýbình phải có
thể tích lớn hơn lượng môi trường cần pha.
2/ Xem trên nhãn hộp môi trường để xác định lượng môi trường cần pha trong 1000ml,
sau đó tính lượng môi trường sử dụng tương ứng cần pha. Cân môi trường vàcho vào bình pha
môi trường. Lắc đều làm tan môi trường. Làm nút bông cho bình tam giác.
3/ Nấu tan môi trường trên bếp điện. Chú ý, môi trường có thể sôi trào ra khỏi dụng cụ
chứa đựng. Cẩn thận lắc nhẹ, tránh môi trường bị cháy dưới đáy bình chứa đựng.
4/ Giữ nhiệt độ môi trường khoảng 600C để tránh bị đông đặc. Môi trường sẽ đông đặc
khoảng 400C.

16
Chúý: Cần đọc kỹ yêu cầu về chế độ khử trùng môi trường trên nhãn hộp.
Bước 2: Điều chỉnh pH:
Mặc dù môi trường khôchứa tác nhân đệm giữ pH của môi trường ở khoảng mong muốn,
pH môi trường cóthể thay đổi so với trạng thái trên nhãn chai. Trước khi được rót ống, nên kiểm
tra pH môi trường và điều chỉnh pH nếu có.
Nếu cósẵn dụng cụ đo pH và đã chuẩn, dùng nó để đo pH của môi trường. Nếu cần điều
chỉnh pH dùng HCl hoặc NaOH. Nếu không có dụng cụ đo pH, có thể dùng giấy đo pH. Cách
điều chỉnh pH:
Vật liệu: cốc đong chứa môi trường, chai 1N và0,1N của HCl vàNaOH, que khuấy thủy
tinh, giấy đo pH, dụng cụ đo pH (không bắt buộc).
1/ Xác định pH môi trường bằng giấy đo pH
2/ Nếu pH quácao, thêm HCl để giảm pH. Nếu lượng môi trường quánhiều dùng 1N HCl.
Nếu pH sai khác ít, dùng 0,1N HCl. Khuấy trộn giọt thêm vào để hòa tan vào môi
trường bằng que khuấy thủy tinh.
3/ Nếu pH quá thấp, thêm NaOH từng giọt để tăng pH. Nếu pH sai khác ít dùng
0,1NNaOH, sai khác nhiều dùng 1NNaOH. Khuấy trộn đều giọt thêm vào bằng đũa
thủy tinh.
Bước 3: (Nếu có)
Rót ống nghiệm:
1/ Rót vào một ống nghiệm lượng môi trường được đo chính xác. Ống này làm mốc để rót
các ống nghiệm khác.
2/ Rót phễu vàquátrình rót ống kiểm tra mức độ phù hợp, giữ ống hướng dẫn bên cạnh
các ống sẽ rót tiếp theo để giúp bạn xác định lượng môi trường vào trong mỗi ống
nghiệm.
3/ Nếu môi trường chứa agar cần giữ cốc chứa môi trường nóng ở trạng thái lỏng.
4/ Nếu ống nghiệm được sử dụng trong lên men kiểm tra đặc tính sinh hơi, thêm một
durham vào mỗi ống ở thời điểm này, miệng ống quay xuống dưới.
Đậy nắp ống nghiệm:
Thông thường nắp plastic thích hợp cho mọi trường hợp. Tất cả các nắp đậy đầu ống
nghiệm córãnh nhỏ bên trong tạo khoảng trống cho phép hơi nước thoát ra trong quátrình thanh
trùng. Nếu dùng nắp vặn plastic, nắp không được vặn chặt, trước khi thanh trùng nới nắp vặn một
phần vòng xoay. Cóthể dùng nút bông làm đúng kỹ thuật cho các ống nghiệm.
Bước 4: Thanh trùng:
Các môi trường chuẩn bị xong cần thanh trùng ngay lập tức. Vi sinh vật trên thành ống,
trong nước cất, trong môi trường làm khô sẽ bắt đầu phát triển trong khoảng thời gian ngắn ở
nhiệt độ phòng, pháhủy môi trường.
Trước khi thanh trùng, các ống nghiệm cần đặt trong dụng cụ chứa dạng lưới cóghi nhãn
bên ngoài. Nhãn cần thể hiện loại môi trường, ngày thanh trùng, người làm.
Thanh trùng thực hiện trong nồi thanh trùng.
Hướng dẫn sử dụng nồi thanh trùng:
- Kiểm tra thực hành với dạng nồi thanh trùng cụ thể. Hoàn thành quátrình thanh trùng ở
1210C. Để đạt được nhiệt độ đúng cần chuẩn bị không gian cho sự thoát khí . Một số thiết
bị cũ cần cho hơi nước thoát ra cửa sổ.

17
 - Không để quátải lỗ thoát khí.Không nên thử nhìn môi trường trong nồi. Cần giữ khoảng
cách giữa các dụng cụ chứa đựng cho sự lưu thông hơi nóng.
- Điều chỉnh thời gian thanh trùng với kích cỡ bình chứa. Các bình chứa nhỏ cóthể thanh
trùng 10-15 phút. Một nồi thanh trùng đầy cóthể mất 30 phút hoàn tất.
Bước 5: Sau khi thanh trùng:
Thạch nghiêng: Cần đặt gần như nằm ngang ống ngay khi lấy trong nồi thanh trùng ra.
Quá trình đông đặc xảy ra trong vòng 30 -60 phút.
Môi trường khác: Các dạng môi trường trong ống nghiệm lỏng, thạch đứng ... cần để
nguội ở nhiệt độ phòng sau khi lấy ra khỏi nồi thanh trùng.
Cách đổ môi trường vào đĩa petri: Toàn bộ quá trình đổ thạch vào đĩa petri được thực hiện trong
tủ cấy vôtrùng vàgồm các thao tác sau:
- Khử trùng bàn làm việc, tay với cồn 700
- Đốt đèn cồn. Chúýmọi thao tác thực hiện gần đèn cồn tránh nhiễm khuẩn.
- Mở bao giấy gói các đĩa petri.
- Tay phải cầm bình chứa môi trường cónhiệt độ khoảng 450C. Tay trái mở nút bông của bình.
- Hơ miệng bình trên ngọn lửa đèn cồn.
- Mở hénắp đĩa petri. Nghiêng bình và rót môi trường vào đĩa petri.
- Đậy nắp đĩa lại, xoay tròn nhẹ đĩa để môi trường được phân phối đều bên trong đĩa.
- Để yên cho môi trường đông đặc.
- Lật ngược đĩa lại vàbảo quản.
Chú ý:
- Thao tác đổ môi trường phải nhanh vàkhéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn.
- Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2mm. Thông thường cứ khoảng 100 ml môi
trường sẽ phân phối được 7 - 8 đĩa.
- Sau khi phân phối môi trường vào đĩa petri, kiểm tra lại xem môi trường cóbị nhiễm khuẩn sau
1 – 2 ngày.
- Ghi chú môi trường (tên môi trường, ngày khử trùng, hạn sử dụng)
Bước 6: Bảo quản:
Sau khi môi trường đông đặc, bảo quản trong tủ lạnh hoặc chỗ mát. Khi bảo quản thời
gian dài ở nhiệt độ phòng môi trường sẽ bị mất nước. Môi trường có thể giữ ở nhiệt độ tủ lạnh
hàng tháng.
Trước khi sử dụng, cần kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường bằng cách đặt môi trường
vào tủ ấm 370C trong thời gian nhất định. Loại bỏ môi trường bị nhiễm khuẩn vàchỉ sử dụng môi
trường đạt yêu cầu.

Bài 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY VI SINH VẬT

4.1. Dụng cụ - Hóa chất, nguyên vật liệu

2. Dụng cụ
- Que cấy đầu tròn, đầu nhọn, que cấy móc.
- Que trang, ống hút chia độ 1ml.
- Ống nghiệm, giá để ống nghiệm, đĩa petri.
- Đèn cồn, hộp quẹt
1. Hóa chất, nguyên liệu
- Môi trường thạch đứng, thạch đĩa, thạch nghiêng để nuôi cấy vi sinh vật.
18
- Các ống giống nấm men, nấm mốc, vi khuẩn.
4.2. Kĩ thuật vôtrùng, khử trùng
Các thủ tục hướng dẫn chi tiết đảm bảo việc duy trìmột môi trường vôtrùng khi thao tác
cấy vi sinh vật. Cấy chuyển vô trùng từ canh cấy này sang canh cấy khác thành công khi không
lây nhiễm vi sinh vật trong quátrình. Quátrình cấy chuyển cóthể từ khuẩn lạc trên hộp lồng sang
ống nghiệm chứa canh trường hoặc cấy chuyển từ canh trường nuôi cấy sang nhiều loại môi
trường (rắn hoặc lỏng) cho nhiều loại xét nghiệm.
Trang thiết bị:

Hình 12: Một số dụng cụ vi sinh cơ bản

Thao tác chung:
Khử trùng khu làm việc: Đầu tiên xử lýkhu vực làm việc với một chất tẩy trùng để diệt
vi sinh vật hiện có. Bước này pháhủy được tế bào sinh dưỡng vàvirus; tuy nhiên không pháhủy
được bào tử. Chất khử trùng thường dùng làcồn 700.
Que cấy vòng và que cấy thẳng: Việc cấy chuyển các vi sinh vật được thực hiện bằng
que cấy vòng hoặc thẳng. Phải khử trùng chúng trước khi lấy vi sinh vật bằng cách nung nóng
bằng đèn cồn đến nóng đỏ.
Hơ nóng miệng ống nghiệm: Trước khi đưa que cấy đã làm nguội vào ống nghiệm chứa
môi trường, mở nắp ống nghiệm và hơ nóng miệng ống nghiệm. Sau khi lấy vi sinh vật ra khỏi
ống nghiệm, phải hơ nóng miệng ống lần nữa.
Cấy trên môi trường lỏng: Nếu cấy vi sinh vật vào ống môi trường lỏng, miệng ống cần
hơ nóng trước khi đưa que cấy vào trong ống. Để cấy vi sinh vật vào môi trường, cần xoay que
cấy vài vòng trong môi trường.
Sau khi cấy xong, que cấy được rút ra khỏi ống nghiệm, khử trùng như lúc đầu. Các dụng
cụ này không được đặt trên mép bàn. Khử trùng miệng ống nghiệm trước khi đậy nắp.
Cấy đĩa Petri: Để cấy trên đĩa, không dùng nhiệt tác dụng lên đĩa, cần dùng que cấy vòng
trong quátrì nh cấy chuyển. Khi cấy vạch trên bề mặt môi trường cần giữ nắp đậy che phía trên,
tránh lây nhiễm vi sinh vật từ không khí.
Khử trùng cuối cùng: Khi công việc kết thúc, vùng làm việc cần được xử lý với chất
khử trùng để chắc chắn vi sinh vật tích tụ trong quátrình làm việc đều bị loại bỏ.
4.3. Các phương pháp cấy vi sinh vật:

19
4.3.1. Cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác:
- Dán nhãn ghi: Tên giống vi sinh vật; ngày cấy vào thành ống nghiệm, dưới nút bông một
chút.
- Tay trái cầm ống giống vàống môi trường. Tay phải cầm que cấy vàkhử trùng trên ngọn
đèn cồn cho đến khi nóng đỏ vòng cấy
- Dùng ngón út vàngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút ống giống.
- Hơ nóng để khử trùng không khíở miệng ống nghiệm
- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống.
- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa ống vào môi
trường để thực hiện các thao tác cấy truyền.
(1) Khử trùng không khívàmiệng 2 ống nghiệm, đậy nút bông. Khử trùng lại que cấy.
Phương pháp cấy trên thạch nghiêng: dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí.
- Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên
- Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác:
+ Hoàgiống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm.
+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các cách khác nhau.
(2) Phương pháp cấy trên thạch đứng: dùng để cấy các vi sinh vật kị khí.
- Sử dụng que cấy kim lấy giống vi sinh vật, đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ.
- Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát thành
ống tuỳ yêu cầu.
- Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường.

Hình 13: Các bước thực hiện lấy vi sinh vật từ ống canh thang

20
 Hình 14: Cấy vi sinh vật trên ống thạch nghiêng từ đĩa thạch.

Hình 15: Cấy vi sinh vật trên ống thạch nghiêng từ ống thạch nghiêng
4.3.2. Phương pháp cấy trên đĩa pettri:
Cóthể cấy trên đĩa pettri theo 2 cách sau:
(1) Dùng que cấy đầu tròn phân lập chủng thuần khiết:
Nguyên tắc phân lập
- Gieo cấy vi khuẩn đã pha loãng trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng (2% thạch).
- Nuôi dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc tách biệt nhau.
21
 - Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch nghiêng để
thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết (do Robert Koch đề ra).
Phương pháp cấy:
- Để đĩa petri lên bàn.
- Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự vàyêu cầu ở phương pháp chung.
- Tay trái hémở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào.
- Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo một trong các kiểu sau (xem
hình 16)
+ Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch.
+ Theo những đường song song.
+ Theo 4 hình chữ chi 4 góc.

Hình 16: Các cách cấy phân lập khác nhau trên đĩa thạch

Hình 17: Phương pháp phân lập vi khuẩn bằng que cấy vòng
(2) Dùng pipet: Thường áp dụng để định lượng vi sinh vật vàcấy một lượng khánhiều
giống. Để có mật độ vi sinh vật phù hợp cho quá trình đếm khuẩn lạc, mầu thường được pha
loãng với nồng độ phùhợp.
Phương pháp pha loãng mẫu: Chuẩn bị để có dãy pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 .... và
các nồng độ thích hợp khác, cấy chuyển 1 ml dịch pha loãng ở nồng độ trước vào 9 ml dung dịch
pha loãng. Đầu tiên dịch mẫu đồng nhất được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng
pipet vôtrùng (hoặc pipetman với đầu típ vôtrùng) chuyển 1 ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa
9ml dung dịch pha loãng. Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung (vortex) hay
dùng pipet hút đảo dịch mẫu lên xuống 5-10 lần. Dung dịch mẫu này có độ pha loãng là10-1. Sau
22
đó sử dụng pipet hoặc pipetman có đầu tip khác chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ 2
chứa dung dịch pha loãng và thao tác tương tự để có dịch mẫu với độ pha loãng 10-2. Tiếp tục
thực hiện tương tự để có các độ pha loãng thập phân theo cho đến độ pha loãng cần thiết. Lưu ý
nếu pipet hoặc đầu tip pipetman nguy cơ bị nhiễm trong quátrình thao tác (chạm tay, chạm mặt
ngoài ống nghiệm, mặt ngoài bình chứa...), cần phải thay pipet hoặc đầu tip vôtrùng khác.

Hình 18: Phương pháp pha loãng mẫu

Sau khi tiến hành pha loãng mẫu theo phương pháp đã nêu trên, cần làm nhãn ghi vào đáy
đĩa Petri có môi trường thạch các thông tin: mẫu, nồng độ pha loãng, ngày cấy trước khi thực
hiện các thao tác cấy.
Cách 1: Phương cấy trộn
+ Trộn dịch cấy vào thạch bằng cách hút 1 ml dịch nghiên cứu ở nồng độ pha loãng phù
hợp cho vào ống nghiệm có môi trường thạch ở nhiệt độ 45-500C.
+ Đậy nút bông lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối đều trong môi trường.
+ Đổ thạch này vào đĩa pêtri đã khử trùng.
+ Xoay tròn đĩa petri cho thạch dàn đều ở đáy hộp.
+ Để yên cho thạch đông đặc lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp.
Cách 2: Phương pháp cấy trang
- Dùng pipet đã vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phùpha loãng cho lên bề mặt đĩa thạch.
Lưu ý: có thể dùng thể tích mẫu cấy từ 0,05 - 0,5 ml. Tuy nhiên, thể tích mẫu cấy càng
nhỏ thìsai số cóthể xảy ra càng lớn. Số tế bào cấy trên bề mặt thạch phải được dàn đều vàkhông
nên vượt quá300.
- Sử dụng que cấy gạt bằng thuỷ tinh để dàn đều dịch mẫu trên bề mặt thạch. Lưu ý rằng
que cấy gạt thuỷ tinh phải được vô khuẩn trước khi được đưa vào đĩa Petri tiếp theo,
bằng cách nhúng vào trong cồn, vẩy nhẹ để loại đi lượng cồn dư bám bằng que cấy, đốt
cháy phần cồn còn lại trên que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Làm nguội que cấy trước khi
rồi dàn đều mẫu. Nếu thể tích chất lỏng đem cấy quánhiều, các tế bào sẽ trôi dạt trong
chất lỏng, vàsau khi tế bào phân chia, hai khuẩn lạc xuất phát từ một tế bào cóthể hình
thành gây loang bề mặt. Các đĩa thạch được chuẩn bị một ngày trước khi cấy thường hấp
thu nhanh lượng chất lỏng đem cấy. Lớp chất lỏng trên thạch càng mỏng, sự hấp thu xảy
ra càng nhanh.
4.3.3. Phương pháp MPN: ( Most probable number)
- Phương pháp MPN ( phương pháp số có xác suất cao nhất, số tối khả) còn được gọi là
phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh
giásố lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật cóxác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị
23
thể tích mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một lọat các thí
nghiệm lặp lại ở 1 số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện
lập lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3x3 = 9 ống nghiệm.
- Quy trình thực hiện định lượng theo phương pháp này là như sau: cho vào các ống nghiệm
cóchứa các môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của vi sinh vật cần định lượng một thể tích
chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp( vídụ 1/10, 1/100, 1/1000.). Ủ ở
nhiệt độ vàthời gian thích hợp.
- Dựa vào kết quả biểu kiến ( dương tính) chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần
kiểm định trong từng ống nghiệm ( thường là các hiện tượng như sinh hơi, chuyển màu môi
trường, ..) sau đó ghi nhận hiện tượng dương tính ở từng nồng độ. Sử dụng các số liệu này và
bảng tra của Mac Crandy suy ra mật độ vi sinh vật có trong mẫu đang kiểm tra được trình bày
dưới dạng MPN/100ml, hay MPN/g mẫu.
- Độ chính xác của phương pháp MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong
mỗi độ pha loãng: số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của trị số MPN càng lớn.
- Phương pháp MPN có thể dùng để định lượng mọi nhóm vi sinh vật cóthể được nuôi cấy
trong môi trường lỏng chọn lọc vàcho kết quả biểu kiến (dương tính thích hợp).
- Vídụ: sử dụng môi trường BGBL 2% ở 37oC cóthể định lượng nhóm Coliorms, cùng môi
trường này ở 45oC,cho phép định lượng Coliforms phân hay môi trfường MSB cóthể dùng định
lượng Staphylococcus .
- Cần lưu ý rằng đa số các bảng tra MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100 ml
dung dịch được sử dụng để phân tích ở các liều lượng là10ml, 1ml, 0.1ml. Trên thực tế phân tích,
chúng ta không sử dụng các liều lượng khác nhau của mẫu như trên do nồng độ các thành phần
môi trường sẽ khác nhau nhiều ở các ống nghiệm ảnh hưởng rất lớn đến kết quả phân tích. Thông
thường người ta sử dụng đồng loạt 1 dung tích mẫu nhất định cho các mẫu đã pha loãng ở các
nồng độ thập phân khác nhau, vídụ, dùng 1ml cho mẫu đã pha loãng 10-1,10-2, 10-3. Lượng mẫu
với các độ pha loãng này tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml tính
theo lượng mẫu là10ml, 1ml,và 0.1ml như đã nêu trên.
- Điều đó có nghĩa là số liệu của bảng MPN ở các dung tích mẫu 10ml, 1ml, và0.1ml là
tương đương với MPN/ ml mẫu chưa pha loãng khi 1ml của dung dịch có độ pha loãng 10-1,10-2,
10-3, được dùng để phân tích.
- Trường hợp mật độ vi sinh vật quácao, cần phải sử dụng loạt pha loãng tiếp theo cần phải
nhân trị số tra bảng MPN nêu trên với hệ số pha loãng.
- Vídụ sử dụng 1ml cho độ pha loãng 10-2, 10-3 và10-4 tức làchỉ sử dụng 1/10 lượng mẫu ở
mỗi nồng độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu ở các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Do vậy trị số tra
bảng MPN nêu trên cần được nhân thêm hệ số pha loãng là10.
4.4. Nuôi dưỡng vi khuẩn:
Nguyên tắc: Nuôi dưỡng là quá trình đảm bảo vàduy trìnhững điều kiện thuận lợi nhất cho sự
hoạt động vàsinh sản của vi khuẩn.
Tiến hành : Úp ngược các hộp Petri rồi đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ vàthời gian phù hợp cho sự
phát triển của vi khuẩn cần kiểm tra. Sau thời gian trên, ở bề mặt thạch đĩa sẽ mọc các khuẩn lạc
riêng biệt màmắt thường quan sát được.
Thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết
+ Cấy vi khuẩn từ khuẩn lạc mọc tách rời vào ống môi trường thạch nghiêng.
+ Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ vàthời gian thích hợp.
+ Loại bỏ các ống bị nhiễm, chọn ra các ống cócác chủng thuần khiết.
Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết của một chủng vi khuẩn mới phân lập
Cónhiều cách kiểm tra:

24
* Kiểm tra vết cấy trên môi trường thạch đĩa: nếu vết cấy cóbề mặt vàmàu sắc đồng đều, thuần
nhất chứng tỏ chủng mới phân lập thuần khiết thìgiữ lại. Nếu vết cấy không thuần nhất thìloại
bỏ.
* Kiểm tra độ thuần khiết của các khuẩn lạc:
+ Khuẩn lạc cómàu sắc, bề mặt, hình dạng đặc trưng giống như khuẩn lạc chủng mẫu.
+ Không cócác màu sắc vàsắc tố lạ.
+ Làm tiêu bản soi tươi dưới kính hiển vi thấy cóhình dạng đặc trưng như chủng mẫu.
+ Tiến hành phân lập lại trong điều kiện vôtrùng vẫn cho hình dạng khuẩn lạc tương tự.
+ Làm một số phản ứng sinh hóa định tính đặc trưng.
4.4. Các phương pháp giữ giống vi khuẩn sau phân lập
+ Cấy truyền định kỳ trên môi trường thạch nghiêng mới (1 tháng/1lần).
+ Giữ vi khuẩn ở nhiệt độ 4-50C trong tủ lạnh hoặc phòng lạnh.
+ Trộn vi khuẩn với glycerol vôtrùng với tỉ lệ 1 : 20 vàgiữ ở nhiệt độ 3-50C.
+ Bảo quản vi khuẩn trong cát sạch đối với những chủng cóbào tử.
+ Phương pháp đông khô v.v...

Bài 5: LẤY MẪU THỰC PHẨM VÀ CHUẨN BỊ MẪU

.
5.1. Dụng cụ- Môi trường vàhóa chất
1. Dụng cụ:
Cân phân tích, bị chứa mẫu vô trùng, dụng cụ lấy mẫu vô trùng (muỗng, kéo, pank gắp...),
keo dán nhãn..
Thiết bị, dụng cụ đồng nhất mẫu.
Tủ lạnh bảo quản mẫu.
2. Môi trường, hóa chất:
- Dung dịch đệm phosphate
- Nước muối sinh lý
5.2. Phương pháp lấy mẫu vàbảo quản mẫu
Lượng mẫu và điều kiện lấy mẫu đem kiểm tra đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá
các chỉ tiêu vi sinh của một lô thực phẩm. Nếu mẫu lấy không thích hợp vàxử lý không đúng
hoặc không đại diện cho lô thực phẩm, kết quả thínghiệm sẽ trở nên vô nghĩa. Do một lô hàng
thực phẩm lớn đem phân phối dựa trên kết quả thínghiệm trên một mẫu tương đối nhỏ so với cả
lô, nên cần phải dựa vào các thủ tục lấy mẫu theo quy định. Cần cómột mẫu đại diện do tác nhân
gây bệnh hoặc độc tố phân bố rải rác trong thực phẩm hoặc tuỳ theo sự sắp xếp thực phẩm khi
vận chuyển theo đường biển phụ thuộc vào lượng vi khuẩn cótrong thực phẩm so với tiêu chuẩn
cho phép. Một số điểm cần lưu ý:
1. Lấy mẫu:
- Số lượng mẫu lấy đại diện cho lô hàng thực phẩm cần kiểm tra. Nếu có thể thu nhận tối
thiểu 100g cho mỗi đơn vị mẫu.
- Mẫu gởi đến PTN cần giữ nguyên trạng thái ban đầu, không mở bao bì đóng gói.
- Các dụng cụ lấy mẫu cần được vô trùng trong nồi hấp hoặc tủ sấy. Không nên sử dụng
cồn đốt cóthể gây nguy hiểm và không đủ để vôtrùng dụng cụ.
- Thùng chứa mẫu phải khôsạch, không ròrỉ. Cần dán nhãn mẫu rõràng, chính xác.
- Chuyển mẫu tới PTN ngay và duy trì các điều kiện bảo quản gần giống mẫu ban đầu. Ghi
lại thời gian lấy mẫu và nhận mẫu tại PTN. Đối với mẫu đông lạnh cần làm lạnh trước thùng
đựng mẫu. Các mẫu đông cần giữ trong trạng thái đông cứng liên tục. Các mẫu bảo quản lạnh cần
giữ trong đá ở 0 – 40C cho đến khi về đến PTN.
25
 - Cần phân tích mẫu bảo quản lạnh trước 36h kể từ khi lấy mẫu. Đối với động vật thân
mềm vàgiáp xác cần phân tích mẫu trong vòng 6h kể từ khi lấy mẫu, không được quá24h.
2. Nhận mẫu:
Mẫu chính thức được người kiểm tra nhận. Mẫu nếu không được phân tích ngay thìcần
được bảo quản như sau:
- Kiểm tra kỹ bao bìmẫu xem cóbị rách hay rạn vỡ gây nhiễm chéo không, nếu cókhông
sử dụng mẫu này cho việc kiểm tra.
- Dán nhãn vàghi chép: Ghi số mẫu, tên mẫu, ngày lấy mẫu
- Nếu các mẫu thực phẩm không đủ tiêu chuẩn thông báo cho nơi lấy mẫu để lấy mẫu khác
đúng quy định, tránh lặp lại sai sót.
3. Tan giámẫu: Trước khi xử lýhoặc phân tích mẫu, cần làm sạch vùng làm việc bằng kỹ
thuật vô trùng. Tan giá được thực hiện ngay trong túi chứa đựng ban đầu, tránh di chuyển mẫu
sang túi chứa đựng thứ hai. Thông thường tan giáở nhiệt độ 2–50C trong 18 giờ. Nếu muốn tan
giánhanh cóthể tan giáở nhiệt độ dưới 450C không quá15 phút. Khi tan giáở nhiệt độ cao cần
lắc mẫu liên tục để kiểm soát nhiệt độ.
4. Đồng nhất mẫu: Mẫu cần đồng nhất để vi sinh vật phân bố đều trong mẫu. Lắc kỹ mẫu
lỏng, trộn mẫu khôbằng muỗng vôtrùng. Nếu thực phẩm đem đóng gói không đồng đều (vídụ:
một bữa ăn đông lạnh), tùy mục đích kiểm tra, phân tích riêng từng loại thực phẩm khác nhau.
5. Cân: Cân vôtrùng chính xác (±0,1g) lượng mẫu chưa rã đông. Nếu lượng mẫu nhỏ hơn
so với yêu cầu, lấy phần khối lượng tương đương nửa mẫu và điều chỉnh lượng dịch pha loãng
cho phùhợp. Xác định TPC hoặc coliform dùng 50g mẫu. Nên dùng cỡ đơn vị phân tích vàdung
tích phùhợp theo quy trình sẽ nêu.
6. Xay và pha loãng mẫu dùng để đếm vísinh vật: Thêm 450ml dung dịch đệm
phosphate vào 50g mẫu và đồng nhất trong 2 phút. Kết quả được độ pha loãng 10-1. Tiếp tục pha
loãng với các pipet thích hợp. Tiếp tục pha loãng đến các độ pha loãng khác nhau. Thời gian pha
loãng mẫu không quá15 phút.
5.3. Phương pháp bảo quản mẫu:
Nên kiểm tra mẫu ngay sau khi nhận mẫu. Tuy nhiên nếu không phân tích ngay, phải bảo
quản đông lạnh mẫu ở -200C cho tho tới khi kiểm tra. Làm lạnh không đông các mẫu dễ hư hỏng
ở 0 – 40C không quá36 giờ. Bảo quản các thực phẩm khó hư hỏng, thực phẩm đóng hộp hoặc có
độ ẩm thấp ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích.

PHẦN 2: CÁC NHÓM CHỈ TIÊU VI SINH VẬT CẦN KIỂM TRA
TRONG MẪU THỰC PHẨM

26
 Bài 6: TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ
(TPC – Total Plate count)
Ý nghĩa chỉ tiêu: Đây là một trong số các chỉ tiêu vi sinh vật được cho làgóp phần đánh giá mức
độ an toàn vệ sinh trong quátrình chế biến vàbảo quản thực phẩm
6.1. Dụng cụ- Môi trường, hóa chất
1. Dụng cụ (dùng cho 01 mẫu kiểm tra)
- Đĩa petri, pipet 10 ml, pipet 1- 2 ml, bình tam giác 250ml, ống đong 250ml
- Tủ ấm, tủ sấy, nồi thanh trùng, tủ lạnh
2. Môi trường, hóa chất (dùng cho 01 mẫu kiểm tra)
- Dung dịch pha loãng: 4 ống nước muối sinh lý(9ml/ống)
- Dung dịch đệm phosphate: 250ml
- Môi trường PCA: 100ml
6.2. Quy trình phân tí ch: Chỉ tiêu vi sinh ‘Tổng số vi khuẩn hiếu khí’ được dùng để đánh giá
mức độ nhiễm vi sinh vật trong một sản phẩm thực phẩm. Quy trình được đề nghị bởi OAOC
(Association of Official Analytical Chemists) vàAPHA (American Public Health Association).
6.2.1. Lấy mẫu tuân theo nguyên tắc ghi trong bài 5.
6.2.2. Các bước thực hiện thao tác kiểm tra
Pha loãng mẫu theo dãy thập phân (pha loãng bậc 10) 10-2, 10-3… Chú ý sử dụng pipet vô
trùng riêng biệt cho mỗi nồng độ pha loãng. Lắc tất cả các nồng độ pha loãng 25 lần trong 7 giây.
Làm nhãn cho tất cả các đĩa petri. Chọn 3 nồng độ pha loãng phùhợp liên tiếp nhau để kiểm tra.
Hút 1ml mẫu vào đĩa đã đánh dấu, mỗi nồng độ 2 đĩa. Nếu sau 3 phút để yên mà chưa hút dịch
mẫu cần lắc lại 25 lần trong 7 giây. Thêm môi trường PCA (để nguội 450C) vào các đĩa trong
vòng 15 phút kể từ khi pha loãng. Ngay lập tức trộn đều mẫu và môi trường bằng cách lắc đĩa
theo 2 chiều trên mặt phẳng. Để thạch đông lại, lật ngược đĩa và đem ủ ở 350C trong 24 -48 giờ.
Không được chồng các đĩa khi đang đổ môi trường hoặc khi thạch đang đông.
6.2.3. Nguyên tắc đếm vàghi kết quả APC trong trường hợp phổ biến:
Ghi kết quả số lượng các khuẩn lạc trên các đĩa từng cặp theo nồng độ. Ghi nhận kết quả ước
lượng khi số lượng khuẩn lạc ngoài khoảng 25 và250. Sử dụng nguyên tắc sau:
1. Các đĩa bình thường (cósố khuẩn lạc trong khoảng 25–250): lựa chọn các đĩa không bị
loang, đếm tất cả các đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming units - CFU). Ghi lại độ pha
loãng vàsố khuẩn lạc đếm được.
2. Các đĩa có nhiều hơn 250 khuẩn lạc: Khi các độ pha loãng đều có số khuẩn lạc > 250.
Ghi nhận kết quả quánhiều không đếm được, ghi kết quả là ước đoán (EAPC).
3. Trường hợp bị loang: Các khuẩn lạc bị loang cóthể do 3 trường hợp sau: (1) Một chuỗi
các khuẩn lạc không tách biệt rõràng, cóthể do cụm tế bào vi khuẩn tách ra. (2) Tế bào phát triển
trên màng nước giữa môi trường vàmặt đáy của đĩa. (3) tế bào phát triển trên màng nước ở rì a
đĩa hoặc trên bề mặt môi trường, Nếu đĩa bị loang nhiều hơn 25% thì ghi nhận kết quả bị loang.
Nếu cần thiết phải đếm các đĩa bị loang thì vùng loang được tính như 1 khuẩn lạc. Sau đó kết hợp
các đĩa bị loang và các đĩa bình thường để ước đoán kết quả.
4. Không đĩa nào có khuẩn lạc: Khi tất cả các đĩa của các nồng độ đều không cókhuẩn lạc
thìghi nhận kết quả APC nhỏ hơn 1 tương ứng với nồng độ pha loãng thấp nhất. Ghi chú đối với
kết quả ước tính. Khi kết quả do lỗi sai sót của người kiểm định thi phải ghi kết quả làsai sót của
PTN.
7. Tính toán vàghi lại kết quả:
Để tránh tạo ấn tượng không tốt của phép đo, cần làm tròn số, trong phần kết quả chỉ ghi 2 số
có nghĩa đầu tiên.
27
1. Các đĩa có số khuẩn lạc 25 – 250 CFU:
Tính theo công thức: N = ∑ C/ [(1 x n1) + (0,1 x n2)] x d
N: Số khuẩn lạc trong 1 ml hay 1g sản phẩm
∑C: Tổng số khuẩn lạc trong tất cả các đĩa đếm được
n1: Số đĩa của nồng độ đầu tiên - n2: Số đĩa của nồng độ pha loãng tiếp theo
d: nồng độ pha loãng đầu tiên.
2. Tất cả các đĩa có số khuẩn lạc nhỏ hơn 25 CFU, ghi chính xác số khuẩn lạc trên các đĩa
nhưng kết quả được tính nhỏ hơn 25 x 1/d với d lànồng độ pha loãng tương ứng.
3. Tất cả các đĩa đều lớn hơn 250 CFU (nhưng ít hơn 100 CFU/cm2): ước tính kết quả gần
nhất rồi nhân với nồng độ pha loãng.
4. Tất cả các đĩa đều loang hoặc do sai sót của PTN: Ghi nhận kết quả bị loang hoặc sai sót.
5. Tất cả các đĩa có số khuẩn lạc trung bình > 100 CFU/cm2. Ước tính APC lớn hơn 100 lần
nồng độ pha loãng cao nhất, nhân với diện tích đĩa.

Quy trình tóm tắt định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí

Chuẩn bị mẫu: Cân 25g 450ml dung dịch đệm phosphate.

50g mẫu + 225ml
Đồng nhất mẫu
28

10-3-3, 10-4-4…
Pha loãng mẫu: 10-1-1, 10-2-2,,10
 Bài 7: XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG COLIFORM, FECAL COLIFORM
VÀ ESCHERICHIA COLI
1. Ý nghĩa
Coliform lànhóm vi khuẩn có mặt trong nhiều môi trường như: đất, nước, chất thải vàthực
phẩm ônhiễm. Coliform không phân loại theo hệ thống phân loại màchỉ dùng để xác định nhóm
29
trực khuẩn Gram âm kị khí tùy ý, lên men lactose sinh acid và hơi trong vòng 48h ở 350C. Năm
1914, Bộ Y tế Mỹ chấp nhận tiêu chuẩn xác định coliform như một tiêu chuẩn vệ sinh thích hợp.
Fecal coliform làmột chỉ thị mức độ ô nhiễm nguồn phân. Fecal coliform lànhóm coliform
chịu nhiệt, việc phân tích chúng thực hiện ở nhiệt độ 44,50C.
E.coli làphần khuẩn chí đường ruột thiết yếu nhằm duy trìchức năng sinh lý của ruột người
và động vật máu nóng. E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, họ này gồm nhiều giống, trong đó có
nhiều tác nhân gây bệnh như Salmonella, Shigella, Yersinia. Mặc dù hầu hết các E. coli không
được xem làtác nhân gây bệnh nhưng chúng có thể làtác nhân gây bệnh cơ hội, gây nhiễm trùng
ở vật chủ suy giảm miễn dịch. Một số chủng E. coli gây bệnh qua đường tiêu hoá, khi ăn phải gây
bệnh dạ dày – ruột ở người khỏe mạnh.
Sự hiện diện của E. coli trong thực phẩm vànguồn nước cho biết có sự ô nhiễm phân vàcó
thể hiện diện các tác nhân gây bệnh, do E. coli chỉ tìm thấy trong phân và đường ruột, không tìm
thấy ở các nơi khác. E. coli dễ dàng phân lập vàphát hiện nhờ khả năng lên men đường. Mặc dù
E. coli được xem làvi sinh vật chỉ thị gián tiếp đánh giá nguy cơ sức khỏe, nhưng khó phân biệt
E. coli với các vi sinh vật đường ruột khác cũng có khả năng lên men đường vàkiểu hình tương
tự. Do đó, thuật ngữ coliform được đặt ra để xác định chung sự hiện diện của nhóm vi sinh vật
này.
Hiện nay tất cả 3 nhóm trên đều được sử dụng làvi sinh vật chỉ thị nhưng trong các ứng dụng
khác nhau. Sự hiện diện của coliform dùng làm vi sinh vật chỉ thị chất lượng vệ sinh của nước
hay vi sinh vật chỉ thị thông thường của điều kiện vệ sinh trong quátrình chế biến thực phẩm.
Fecal coliform làvi sinh vật chỉ thị tiêu chuẩn cho sự lựa chọn kiểm tra đối với sòvànguồn nước
đánh bắt sò. E. coli dùng để chỉ thị nhiễm phân hoặc dây chuyền chế biến không hợp vệ sinh.
7.1. Dụng cụ- Môi trường, hóa chất
1. Dụng cụ
- Đĩa petri, pipet 10 ml, pipet 1- 2 ml, bình tam giác 250ml, ống đong 250ml
- Tủ ấm, tủ sấy, nồi thanh trùng, tủ lạnh, cân
2. Môi trường, hóa chất
- Dung dịch pha loãng
- Dung dịch đệm phosphate: 250ml
- Canh thang Brilliant green lactose bile (BGLB), 2%
- Canh thang Lauryl tryptose (LSB)
- Canh thang EC
- Môi trường thạch Levine's eosin-methylene blue (L-EMB)
- Canh thang Tryptone (tryptophane)
- Canh thang MR-VP
- Canh thang Citrate Koser
- Thuốc thử Kovacs
- Thuốc thử Voges-Proskauer (VP)
- Thuốc nhuộm Gram
- Chỉ thị đỏ methyl
7.2. Phương pháp kiểm tra Coliform, Fecal coliform vàE. coli.
7.2.1. Thử nghiệm sơ bộ kiểm tra Coliform, Fecal coliform vàE. coli:
Cân 50g mẫu thực phẩm, làm nhuyễn. Thêm 450ml đệm phosphate và lắc đều trong 2
phút. Nếu mẫu <50g thìchia mẫu ra một nửa vàthêm dung dịch đệm tương đương tỷ lệ 1/9.
Pha loãng bậc 10 bằng dung dịch đệm vô trùng. Lượng pha loãng phụ thuộc mật độ
coliform dự đoán. Lắc đều dịch huyền phù 25 lần trong 7 giây. Chuyển 1ml mẫu ở mỗi độ pha
loãng vào 3 ống nghiệm chứa canh thang LSB (trong ống cósẵn ống Durham), thực hiện 3 nồng

30
độ pha loãng liên tiếp nhau. Không sử dụng pipet để hút lượng dịch <10% thể tích pipet. Thời
gian thực hiện kể từ khi cân mẫu không quá15 phút.
Nuôi cấy ở 350C. Kiểm tra các ống nghiệm vàghi lại đặc tính sinh hơi trong 24h và 48h.
Tiến hành các thử nghiệm xác nhận ở các ống dương tính (sinh hơi)
7.2.2. MPN- Xác nhận coliform
Trong các ống canh thang LSB sinh hơi, cấy chuyển một vòng huyền dịch vào ống canh
thang BGLB, tránh tạo màng. Nuôi cấy ở 350C vàkiểm tra sự sinh hơi sau 48h. Tính toán số
MPN của coliform dựa vào tỷ lệ các ống sinh hơi đã xác nhận ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp.
7.2.3. MPN- Thử nghiệm xác nhận fecal coliform, E. coli.
Từ ống sinh hơi LSB trong thử nghiệm sơ bộ, cấy chuyển một vòng cấy huyền dịch vào
canh thang EC nuôi cấy ở 450C trong 24h vàkiểm tra khả năng sinh hơi. Nếu âm tính tiếp tục
kiểm tra trong 48h. Sử dụng kết quả này tiếp tục tính toán số MPN cho fecal coliform.
7.2.4. MPN – Thử nghiệm xác nhận E. coli
Để kiểm tra E. coli, lắc nhẹ canh EC sinh hơi và cấy phân lập trên EMB vànuôi cấy ở
35 C trong 24h. Kiểm tra các đĩa có khuẩn lạc phẳng, vàsẫm ở giữa, cóhoặc không cóánh kim.
0

Cấy chuyển 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang ống thạch nghiêng PCA, nuôi cấy ở 350C trong 24h vàsử
dụng các kiểm tra tiếp theo.
- Nhuộm Gram xem hình dạng E. coli làcác trực khuẩn Gram âm, ngắn.
- Kiểm tra phản ứng IMViC:
Phản ứng sinh Indol: Cấy VSV vào canh thang trypton nuôi ở 350C trong 24h. Thêm
thuốc thử Kovacs. Kết quả dương tính nếu có màu đỏ rõràng trên bề mặt môi trường.
Phản ứng Voges – Proskauer (VP): Cấy VSV vào canh MR – VP, nuôi ở 350C trong
48h. Thêm 0,6 ml α –naphton và0,2 ml KOH 40% vàlắc. Cho vài hạt tinh thể creatin. Lắc và để
yên trong 2h. Kết quả dương tính nếu cómàu hồng xuất hiện.
Phản ứng Methyl Red: Cấy VSV vào canh MR – VP, nuôi ở 350C trong 48h. Thêm 5
giọt Methyl Red vào mỗi ống nghiệm. Kết quả có màu đỏ là dương tính, màu vàng âm tính.
Citrate: Cấy lượng nhỏ vi khuẩn vào thạch nghiêng SCA, ủ 350C trong 24h. Nếu môi
trường đổi màu thì citrate dương tính.
Ghi chú: Nếu thử nghiệm IMViC có kết quả ++- - hoặc +-+- thìchấp nhận đó là
E. coli. Tính số MPN dựa vào các ống EC cóE. coli ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp.
7.2.5. Phương pháp môi trường đặc – kiểm tra coliform:
Chuẩn bị môi trường VRBA theo hướng dẫn của nhà sản xuất và làm nguội 480C
trước khi sử dụng. Chuẩn bị pha loãng mẫu. Mỗi nồng độ cấy trộn trên 2 đĩa. Để tránh khuẩn lạc
mọc lan phủ trên bề mặt 5ml môi trường VRBA và để đông. Lật đĩa và ủ ở nhiệt độ 350C trong
24h. Đếm các khuẩn lạc có màu đỏ tía, đường kính > 0,5 mmvàvùng xung quanh cókết tủa acid
mật. Đếm các khuẩn lạc điển hình trong khoảng 25 -250. Để xác định các khuẩn lạc đó là
coliform, lấy 10 khuẩn lạc điển hình vàcấy mỗi khuẩn lạc vào một ống canh thang BGLB. Nuôi
các ống nghiệm ở 350C. Kiểm tra khả năng sinh hơi sau 24 và48h.
Ghi chú: Nếu ống canh thang BGLB sinh hơi có màng mỏng trên bề mặt, tiến hành nhuộm
Gram để khẳng định sự sinh hơi đó không phải do trực khuẩn Gram dương và lên men đường
lactose.
Số lượng coliform/g = Số KL nghi ngờ x tỷ lệ khẳng định trên BGLB x hệ số pha loãng
Quy trình tóm tắt xác định số lượng Colifom, Fecal coliform, E. coli

Chuẩn bị mẫu: Cân 50g mẫu + 450ml dung dịch đệm phosphate.
Đồng nhất mẫu

31
 Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4…

Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống chứa 10ml LSB
(mỗi nồng độ pha loãng cấy 3 ống lặp lại)

Ủ ở 350C / 24 -48giờ

Ghi nhận ống dương tính (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng

Cấy ống dương tính vào ống BGBL Cấy ống dương tính vào canh EC,
ủ ở 350C / 48giờ ủ ở 450C / 24giờ

Số ống dương tính (sinh hơi) ở mỗi nồng Số ống dương tính (sinh hơi) ở mỗi nồng
độ pha loãng độ pha loãng

Cấy ống dương tính lên EMB

Ủ ở 350C / 24 -48giờ

Chọn khuẩn lạc điển hình làm thử

nghiệm IMViC

Test IMViC ++--

Đếm số ống EC dương tính với E. coli

Coliform Fecal coliform E.coli

32
 Bài 8: KIỂM TRA SALMONELLA TRONG MẪU THỰC PHẨM
Ý nghĩa
VK gram âm, hô hấp tùy ý. Di động, không tạo bào tử, lên men glucose vàmannitol sinh acid,
Không lên men saccharose vàlactose, không sinh indol, không phân giải ure, không cókhả năng
tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S.
Các loại thực phẩm có nguy cơ cao: thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng vàcác sản phẩm từ trứng,
thủy sản. Nguồn gây nhiễm là phân người và động vật, nhiễm trực tiếp hay gián tiếp.
Salmonella làloại vi khuẩn nguy hiểm. Chỉ tiêu trong thực phẩm: không được phép phát hiện
trong 25g thực phẩm.
8.1. Dụng cụ- Môi trường, hóa chất
1. Dụng cụ
- Đĩa petri, pipet 10 ml, pipet 1- 2 ml, bình tam giác, ống đong 250ml
- Tủ ấm, tủ sấy, nồi thanh trùng, tủ lạnh
2. Môi trường, hóa chất
- Dung dịch đệm phosphate: 250ml
- Môi trường RV
- Môi trường XLD, SS, HE, BS
Môi trường vàthuốc thử:
8.2. Phương pháp phân tích
1. Chuẩn bị mẫu:
- Trứng: Loại bỏ các dính bám trên bề mặt vỏ trứng. Khử trùng bằng cồn 70% vàdung
dịch I/KI. Nhấn chìm trứng trong dung dịch rửa ít nhất 10 giây rồi lấy ra làm khô. Tay đeo găng
đập vỡ trứng cho vào túi chuẩn bị mẫu. Trộn mẫu đầu bằng tay cho đến khi lòng trắng và đỏ trộn
đều hoàn toàn vào với nhau. Lấy 25 ml mẫu vàbổ sung 225 ml canh thang TSB bổ sung sunfat
sắt, lắc đều. Ủ ở 350C trong 24h.
- Thịt vàcác sản phẩm thực phẩm khác: Cân vôtrùng 25g mẫu, bổ sung 225ml dung dịch
BPW vàtrộn đều trong 2 phút. Đậy kín và để ở nhiệt độ phòng 24h.
2. Phân lập Salmonella:
- Lắc nhẹ mẫu cấy. Chuyển 0,1ml hỗn hợp mẫu vào 10ml canh thang RV rồi vortex.
- Nuôi cấy trên môi trường làm giàu chọn lọc: Nuôi cấy trên RV ở nhiệt độ 420C trong
24h
- Khuấy đều vàcấy ria vi khuẩn từ các môi trường RV lên các đĩa XLD, HE, BS. Ủ ở
nhiệt độ 350C trong 24h.
- Kiểm tra các đĩa tìm khuẩn lạc nghi ngờ làSalmonella.
Khuẩn lạc đặc trưng
+ Trên HE: Khuẩn lạc màu xanh dương hoặc dương – lục, có hoặc không có tâm đen.
Tâm đen có thể bao trùm hết khuẩn lạc.
+ Trên XLD: Khuẩn lạc cómàu hồng trong suốt, cóhoặc không có tâm đen. Tâm đen có
thể bao trùm hết khuẩn lạc.
+ Trên BS: Khuẩn lạc có màu nâu, xám hoặc đen. Môi trường quanh khuẩn lạc thường
nâu, sau chuyển sang đen trong quá trình nuôi cấy tạo quầng quanh khuẩn lạc.
Khuẩn lạc không đặc trưng:
+ Trên HE vàXLD: Vài chủng không điển hình của Salmonella cóthể cho màu vàng, có
hoặc không có tâm đen.
+ Trên BS: Một số chủng có thể cho màu xanh lục, môi trường xung quanh có thể hơi
sậm màu.
- Chọn 2 hay nhiều hơn các khuẩn lạc trên các đĩa đã nuôi cấy sau 24h. Dùng que cấy
thằng vôtrùng chạm nhẹ vào ngay tâm khuẩn lạc đã chọn rồi cấy ria trên bề mặt thạch TSI vàcấy
33
sâu trong môi trường thạch nghiêng. Không khử trùng lại que cấy, tiếp tục cấy trên LIA bằng
cách cấy sâu vào môi trường và cấy trên thạch nghiêng. Ủ ở 350C trong 24h. Salmonella điển
hình làm TSI có màu đỏ/ vàng, có hoặc không có màu đen. Trên LIA có màu đỏ ở đáy ống và
sinh H2S.
Chú ý: Các vi khuẩn sinh acid ở đáy ống (màu vàng) môi trường LIA, acid ở phần
nghiêng và đáy ống TSI (vàng/vàng) thìcóthể loại bỏ bởi đó không phải làSalmonella.
Các chủng xác định sơ bộ dương tính cần thử nghiệm sinh hóa vàhuyết thanh học.
3. Các phản ứng sinh hóa vàhuyết thanh học của Salmonella:
Thử nghiệm hay Kết quả Phản ứng của các
cơ chất Dương tính Âm tính loại Salmonella
Glucose (TSI) Phần đáy ống có Phần đáy ống cómàu +
màu vàng đỏ
Lysine Phần đáy ống có Phần đáy ống cómàu +
decarboxylase (LIA) màu tía vàng
H2S (TSI vàLIA) Ống có màu đen Không có màu đen +
Urease Ống cómàu tía Ống cómàu vàng -
Canh thang Lysine Ống cómàu tía Ống cómàu vàng +
decarboxylase
Canh thang dulcitol Ống cómàu vàng, Không đổi màu, không +
– đỏ phenol có/ không cósinh sinh hơi
hơi
Canh thang KCN Cósự phát triển Không phát triển -
Canh thang Ống cómàu xanh Không đổi màu -
Malonate
Thử nghiệm Indole Màu tím trên bề mặt Màu vàng trên bề mặt -
Kiểm nghiệm KN – Ngưng kết Không ngưng kết +
H đa giá
Kiểm nghiệm KN – Ngưng kết Không ngưng kết +
O đa giá
Canh thang lactose Ống màu vàng, có/ Không sinh hơi, không -
đỏ phenol không sinh hơi đổi màu
Canh thang sucrose Ống màu vàng, có/ Không sinh hơi, không -
đỏ phenol không sinh hơi đổi màu
Kiểm nghiệm Voges Ống màu hồng đến Không đổi màu -
– Proskauer đỏ
Thử nghiệm đỏ Màu đỏ Màu vàng +
Methyl
Simon citrate Phát triển, ống màu Không phát triển, Thay đổi
xanh không đổi màu

4. Kết luận: Phát hiện/ không phát hiện Salmonella/25g mẫu

34
 Quy trình tóm tắt xác định Salmonella

Chuẩn bị mẫu: Cân 25g mẫu + 225ml dung dịch BPW

Đồng nhất mẫu

Ủ ở 30 – 350C/ 24 giờ

Cấy 0,1 ml dịch tăng sinh sang ống 10ml môi trường RV.
Ủ 420C/ 24 giờ

Cấy ria trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc (XLD, HE, SS, BS).
Ủ ở 350C / 24 – 48 giờ

Chọn khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường chọn lọc cấy sang BHI
Ủ ở 350C / 24 giờ

Test sinh hóa

Kết luận: Salmonella dương tính/ âm tính trong 25g mẫu

Bài 9: KIỂM TRA VIBRIO TRONG MẪU THỰC PHẨM

Vibrio làcác vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, dạng hình que thẳng hoặc hơi cong,
cókhả năng di động hầu hết cócực mao khi sinh trưởng trên môi trường lỏng. Hầu hết chúng đều
tạo oxydase và catalase, lên men glucose nhưng không sinh hơi. Các loài Vibrio chiếm tỷ lệ lớn
trong việc gây nhiễm bệnh cho người qua đường tiêu hóa từ các nhuyễn thể cóvỏ còn sống hoặc
chưa chín kỹ.
Các loài Vibrio sinh trưởng trên môi trường có nồng độ muối khácao. Chúng làloài kị
khí tùy ý và sinh trưởng tốt nhất trong điều kiện kiềm. Sử dụng môi trường kiềm sẽ dễ phân lập
vi khuẩn này hơn. Nước pepton kiềm (APW) được dùng phổ biến để phân lập vài loài liên quan.
Môi trường kiểm tra phản ứng sinh hóa của V. parahaemolyticus nên chứa 2 – 3% NaCl.
Dung dịch cấy chuyển huyền dịch tế bào hoặc pha loãng thường là đệm phosphate PSB. Thạch
TCBS là môi trường để phân lập V. cholerae, V. parahaemolyticus vàcác loài khác từ hải sản.
Môi trường này hỗ trợ tốt cho sự phát triển của Vibrio trong khi đó lại ức chế hiệu quả các vi
khuẩn khác không phải Vibrio.
Sau khi thu thập mẫu cần được bảo quản ở 7–100C, sau đó đem phân tích càng nhanh
càng tốt. Nên tránh tiếp xúc trực tiếp với đá để khả năng sống sót vàphục hồi của Vibrio làcao
nhất. Vibrio có thể bị tổn thương do làm lạnh nhanh nhưng lại sinh trưởng nhanh ở nhiệt độ
phòng, chúng sống sót tốt hơn khi làm lạnh vừa phải. Khi bảo quản lạnh đông mẫu, nhiệt độ cần
đạt đến – 800C. Các động vật 2 mảnh vỏ nên được xử lý theo hướng dẫn của OAOC. Khoảng 10-
12 con được lột vỏ vôtrùng rồi làm nhỏ tốc độ cao trong vòng 90 giây. Hỗn hợp này được chuẩn
bị pha loãng với PSB.
9.1. Dụng cụ - Môi trường, hóa chất
35
 1. Dụng cụ
- Đĩa petri, pipet 10 ml, pipet 1- 2 ml, bình tam giác 250ml, ống đong 250ml
- Tủ ấm, tủ sấy, nồi thanh trùng, tủ lạnh
2. Môi trường, hóa chất
- Dung dịch pha loãng: 4 ống nước muối sinh lý(9ml/ống)
- Dung dịch đệm phosphate: 250ml
- Nước pepton kiềm APW
- Môi trường TCBS
- Môi trường TSA
- Môi trường test sinh hóa
9.2. Phương pháp kiểm tra Vibrio
9.2.1. Phương pháp định tí
nh Vibrio:
1. Chuẩn bị mẫu:
- Cân 25 g mẫu (mẫu rắn cóthể cắt hoặc xay nhỏ)
- Thêm 225 ml APW vàtrộn đều với tốc độ cao trong 2 phút.
2. Làm giàu vàcấy:
- Nuôi cấy APW ở 350C trong 6 – 8 giờ và18 - 24 giờ.
- Chuẩn bị các đĩa thạch TCBS. Cấy chuyển một vòng cấy từ bề mặt APW lên TCBS, cấy
ria để cókhuẩn lạc rời.
- Nuôi cấy TCBS qua đêm ở 350C trong 24 giờ.
- Các khuẩn lạc V. cholerae vàmột số Vibrio khác trên TCBS lớn (1- 3 mm), trơn, màu
vàng hơi dẹt với tâm đục, rìa mờ.
Khuẩn lạc V. parahaemolyticus dạng tròn, đục mờ màu xanh lácây hoặc xanh nước biển.
- Để xác định sinh hóa các khuẩn lạc đặc trưng cần cấy trên TSA – 2% NaCl nuôi cấy ở
350C trong 24 giờ.
9.2.2. Phương pháp xác định số lượng Vibrio:
1. Chuẩn bị mẫu:
- Cân 50 g mẫu hải sản. Đối với mẫu cálấy môbề mặt, mang vàruột cá. Đối với thủy sản
có vỏ, phải lấy cả phần dịch vàthịt (thường dùng 12 con cho một mẫu). Đối với tôm sử dụng
nguyên con, nếu quálớn kiểm tra phần ruột vàmang.
- Thêm 450ml PBS và đồng nhất trong 1 phút ở tốc độ cao.
2. Làm giàu vàcấy:
- Pha loãng mẫu vàchọn 3 nồng độ pha loãng liên tiếp
- Mỗi nồng độ pha loãng cấy 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 10ml APW, mỗi nồng độ cấy
3 ống. Ủ ở 350C trong 18 - 24 giờ.
- Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch nuôi cấy bề mặt APW ria sang TCBS vàủ ở 350C
trong 18 - 24 giờ. Nhận diện các khuẩn lạc Vibrio đặc trưng.
- Xác định số các ống dương tính ban đầu vàtra bảng MPN cho trường hợp 3 ống nghiệm
để cókết quả.
3. Nhận dạng các chủng nghi ngờ dựa vào đặc điểm sinh hóa các chủng phân lập:

36
Một số đặc trưng tối thiểu để định danh các chủng V. cholerae, V. parahaemolyticus
Phản ứng dương tính Phần trăm
Gram âm, hình que, không
+ 100
sinh bào tử
Oxydase + 100
Kéo sợi ± 100
L – lysine decarboxylase + 100
L – arginine dihydrolase - 0
L – ornithine decarboxylase + 98,9
Phát triển trong canh thang
+ 99,1b/ 0c
tryptone 1% a
a b
Không bổ sung NaCl V. cholerae (vàV. minicus) c V. parahaemolyticus

Quy trình tóm tắt kiểm tra V. cholerae/ V. parahaemolitycus

Chuẩn bị mẫu: Cân 25g mẫu + 225ml dung dịch APW.

Đồng nhất mẫu

Ủ ở 350C/ 6 -8 giờ Ủ ở 350C/ 24 giờ

Phân lập trên TCBS

Ủ ở 350C/ 24 giờ

Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy ria sang TSA – 2% NaCl.
Ủ ở 350C / 24 giờ

Test sinh hóa khẳng định

Kết luận: Vibrio cholerae/ V. parahaemolitycus

37
 Quy trình tóm tắt xác định số lượng Vibrio

Chuẩn bị mẫu: Cân 50g mẫu + 450ml dung dịch PBS

Đồng nhất mẫu

Pha loãng mẫu 10-1, 10-2, 10-3

Cấy 1ml mẫu ở mỗi nồng độ pha loãng vào 10 ml APW. Mỗi
nồng độ cấy 3 ống nghiệm. Ủ ở 350C/ 24 giờ

Nhận diện và đếm số ống APW dương tính (đục)

Cấy ria các ống dương tính trên môi trường chọn lọc TCBS.
Ủ ở 350C / 24 giờ

Nhận diện Vibrio đặc trưng và làm test sinh hóa khẳng định

Xác định số ống dương tính và tra bảng Mac Crandy.

Bài 10: KIỂM TRA STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG THỰC PHẨM

Staphylococcus aureus làvi sinh vật nhạy cảm cao với sự xử lýnhiệt vàhầu hết các chất làm vệ
sinh vàdiệt khuẩn. Vìvậy sự cómặt của vi khuẩn này hoặc độc tố ruột của nótrong thực phẩm
thể hiện quátrình vệ sinh kém.
10.1. Dụng cụ - Môi trường, hóa chất
1. Dụng cụ
- Đĩa petri, pipet 10 ml, pipet 1- 2 ml, bình tam giác, ống đong 250ml
- Tủ ấm, tủ sấy, nồi thanh trùng, tủ lạnh
2. Môi trường, hóa chất
- Dung dịch pha loãng: 4 ống nước muối sinh lý(9ml/ống)
- Dung dịch đệm phosphate: 250ml
- Môi trường BP
- Môi trường TSA
- Môi trường BHI
- Huyết tương thỏ trong EDTA
- Đệm phosphate
- H202 3%
10.2. Phương pháp kiểm tra
1. Chuẩn bị mẫu:
Xem phần chuẩn bị mẫu
38
 2. Phân lập và định lượng
- Pha loãng các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, pha loãng tiếp nếu cần thiết.
- Đối với mỗi nồng độ pha loãng, thao tác vôtrùng hút 1ml huyền dịch mẫu cho vào 3 đĩa
thạch BP, phân bố 1ml mẫu vào 3 đĩa (ví dụ: 0,4; 0,3; 0,3ml). Trang đều huyền dịch trên bề mặt
thạch và để ngửa đĩa cho đến khi bề mặt thạch ráo. Lật úp đĩa và ủ ở 350C trong 48 giờ. Chọn đĩa
có chứa 20 – 200 khuẩn lạc, nếu không chỉ chọn các đĩa có độ pha loãng nhỏ nhất (có hơn 200
khuẩn lạc) códạng khuẩn lạc đặc trưng. Khuẩn lạc S. aureus đặc trưng có dạng tròn, lồi, xám đến
đen đậm, thường cóvòng trong bao quanh.
- Đếm số khuẩn lạc vàghi lại kết quả.
- Lấy 5 khuẩn lạc nghi ngờ để test sinh hóa xác định S. aureus. Tính toán dựa trên tỷ lệ S.
areus trên số khuẩn lạc kiểm tra.
3. Test sinh hóa: Thử nghiệm Coagulase vàmột số thử nghiệm khác:
Thử nghiệm Coagulase:
Cơ sở sinh hóa: Coagulase cókhả năng tác động lên một số hợp phần cótrong huyết tương
chuyển fibrinogen thành fibrin tạo khối đông kết dạng sợi. Điểm khác biệt chủ yếu giữa đông kết
thông thường và đông kết do coagulase làphức coagulase – CRF không cần ion calci để tạo khối
đông và nó không nhạy cảm với chất chống đông heparin.
Phép thử: Dùng huyết tương thỏ dạng tươi hoặc đông khô. Huyết tương đông khô đã pha
nên dùng ngay trong ngày.
Cần kiểm tra chất lượng HT bằng các chủng dương tính (S. aureus) và âm tính
(S. epidermidis)
Tiêu chuẩn của HT dùng trong phép thử:
- Phải chứa đủ nồng độ CRF (Coagulase reacting factor) vàfibrinogen
- Không cóhoạt tính phân giải fibrin
- Không chứa các chất ức chế.
Hiện nay, EDTA thường được dùng làm chất chống đông trong các HT đông khô thương
mại để thử vi sinh vật nhằm loại trừ phản ứng dương tính giả do vi sinh vật sử dụng citrate gây ra.
Phương pháp thử:
- Phương pháp thử trên lam: Nhỏ một giọt nước cất lên lam sạch, dùng que cấy chuyển lượng
lớn vi khuẩn từ khuẩn lạc cần kiểm tra tạo huyền phùnồng độ vi khuẩn cao. Thêm vào một vòng
cấy HT mới pha tạo hỗn hợp đồng nhất. Thực hiện đối chứng đồng thời trên lam kính đó và quan
sát sự hình thành tức thời chất kết tủa dạng đám ngưng kết màu trắng. Phane ứng dương tính xuất
hiện trong 5 -20s. Nếu phản ứng không xảy ra sau 4 phút, phản ứng coi như âm tính.
- Phương pháp thử trong ống nghiệm: Cho vào ống nghiệm 0,5 ml HT thỏ không pha loãng,
thêm chủng thuần cần kiểm tra. Xoay nhẹ ống trộn đều, ủ 370C quan sát sau 30 phút liên tục
trong 4h. Nếu chưa đông, ủ tiếp đến 24h. Kết quả: Dương tính nếu tạo khối đông; Âm tính nếu
không hình thành khối đông, dịch mẫu giữ nguyên dạng lỏng.
Một số thử nghiệm khác:
Các đặc điểm đặc trưng của S. aureus vàS. epidermidis
Đặc điểm S. aureus S. epidermidis
Hoạt tính Catalase + +
Sản xuất Coagulase + -
Sản xuất Thermonuclease + -
Nhạy cảm với Lysostaphin + +
Sử dụng kỵ khí:
Glucose + +
Mannitol + -

39
 Quy trình tóm tắt kiểm tra S. aureus

Chuẩn bị mẫu: Cân 25g mẫu + 225ml dung dịch đệm phosphate
Đồng nhất mẫu

Pha loãng mẫu 10-1, 10-2, 10-3…

Cấy 1ml mẫu ở mỗi nồng độ pha loãng cấy vào 3 đĩa BP. Trang
đều dịch mẫu trên bề mặt thạch. Ủ ở 350C/ 24 giờ

Chọn đĩa có chứa 20 – 200 khuẩn lạc đặc trưng và đếm số lượng
khuẩn lạc

Cấy ria 5 khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường TSA.
Ủ ở 350C / 24 giờ

Test
BÁO sinhCÁO
hóa khẳng định. Xác
KẾT QUẢ KIỂMđịnh tỷ lệS.S.AUREUS
TRA aureus.

Tính toán mật độ S. aureus (CFU/g-ml)

Bài 11: KIỂM TRA LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG THỰC PHẨM

Listeria làvi khuẩn Gram dương, kỵ khítùy ý, không sinh bào tử, vi khuẩn hình que với
(G + C) thấp. Giống này gồm cósáu loài: Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria
seeligeri, Listeria innocua, Listeria welshimeri và Listeria grayi. Trong đó
Listeria monocytogenes làmột tác nhân gây bệnh nội bào cơ hội đã trở thành một nguyên nhân
quan trọng của nhiễm trùng lây qua thực phẩm ở người trên toàn thế giới.
Bệnh nhiễm Listeria lây qua thực phẩm, gây ra bởi vi khuẩn Listeria monocytogenes, làmột
bệnh tương đối hiếm gặp nhưng nghiêm trọng với tỷ lệ tử vong cao (20-30%) so với các tác nhân
gây bệnh lây qua thực phẩm do vi sinh vật khác, chẳng hạn như vi khuẩn Salmonella (FAO /
WHO, 2005). Về cơ bản, L. monocytogenes thường ảnh hưởng nhất đến những người cóbệnh
tiềm ẩn nghiêm trọng. Không giống với hầu hết các loại vi khuẩn khác, Listeria có thể sống và
nhân lên trong môi trường cónhiệt độ dưới 5oC, do đó có thể tồn tại vàphát triển trong hầu hết
các sản phẩm được bảo quản trong tủ lạnh.
11.1. Dụng cụ- Môi trường, hóa chất
1. Dụng cụ

40
- Đĩa petri, pipet 10 ml, pipet 1- 2 ml, bình tam giác, ống đong 250ml.
- Que cấy, đèn cồn, hộp quẹt.
- Tủ ấm, tủ sấy, nồi thanh trùng, tủ lạnh
2. Môi trường, hóa chất
- Dung dịch pha loãng
- Dung dịch đệm phosphate.
- Môi trường BLEB
- Tác nhân chọn lọc (acriflavin, nalidixate natri, tuỳ chọn 1 chất kháng nấm, ví dụ như
cycloheximide).
- Môi trường thạch chọn lọc phân biệt OXA, ALOA hoặc BCM.
- Môi trường TSBye
- Một số loại đường (Mannitol, Rhamnose, Xylose)
- Môi trường thạch máu
11.2. Phương pháp xác định
11.2.1. Phương pháp định tí nh Listeria monocytogenes
- Lấy mẫu thử các lôthực phẩm nghi ngờ bị nhiễm.
- Làm giàu L. moncytogenes trong các phần mẫu phân tích (25 g) bằng cách nuôi cấy trong
canh thang tăng sinh Listeria (BLEB) ở 300C trong 4 giờ. Sau đó thêm vào các tác nhân chọn lọc
(acriflavin, 10 mg/l (4,40); nalidixate natri, 40 mg/l; tuỳ chọn 1 chất kháng nấm, vídụ như
cycloheximide 50 mg/l).
- Tiếp tục nuôi cấy tăng sinh chọn lọc ở 300C trong 48 giờ. Ở thời điểm 24 và48 giờ, cấy
phân lập trên một trong các môi trường thạch chọn lọc phân biệt đã nêu để phân lập các loài
Listeria.
11.2.2. Phương pháp định lượng Listeria monocytogenes
Đếm số lượng L. moncytogenes trong mẫu dương tính được thực hiện trên mẫu dự trữ
bằng phương pháp đếm dưới kính hiển vi, hoặc đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch chọn lọc
phân biệt L. moncytogenes hoặc phương pháp MPN (Most Probable Number) dùng môi trường
làm giàu chọn lọc BLEB có cấy chuyển trên môi trường thạch chọn lọc phân biệt ALOA hoặc
BCM.
Cách 1. Định lượng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc:
- Chuẩn bị dịch đồng nhất và cấy trang 0,1 ml mẫu trên môi trường agar chọn lọc L.
monocytogenes.
- Nuôi cấy ở 35 °C/ 24-48 giờ. Cấy lặp lại ở nhiều đĩa và nhiều độ pha loãng trong môi
trường TSBye không bắt buộc để thu được một số lượng chính xác hơn.
- Kiểm tra 5 khuẩn lạc đại diện về khả năng lên men một số loại đường để khẳng định dứt
khoát sự xuất hiện của L. monocytogenes trong thực phẩm
Cách 2. Phương pháp MPN:
- Sử dụng 3 hoặc nhiều ống nghiệm chứa BLEB (nuôi cấy 30°C, 48h, không bổ sung các
tác nhân chọn lọc),
- Sau đó là cấy ria trên môi trường thạch chọn lọc đã được chọn.
- Nếu tất cả các ống MPN đều có Listeria dương tính, sử dụng mẫu dự trữ để lặp lại sự
xác định MPN.

41
 Bảng : Test sinh hóa phân biệt loài Listeria
Sinh acid từ
Loài Β-hemolysisa Mannitol Rhamnose Xylose độc lựcb

L. moncytogenes + - + - +
L. ivanovii + - - + +
L. innocua - - Vd - -
L. welshimeri - - Vd + -
L. seeligeri + - - + -
L. grayi - + Vd - -

a Cấy đâm vào môi trường thạch máu cừu

b Thử nghiệm trên chuột
c Chủng lên men đường ribose đã được phân loại làL. ivanovii subsp. ivanovii vàkhông lên men
đường ribose làL. ivanovii subsp. londiniensis.
dV, các type sinh học thay đổi
e bao gồm 2 dưới loài- L. Grayi subsp. murrayi sinh nitrate vàL. Grayi subsp. grayi không sinh
nitrate.

Quy trình tóm tắt định lượng L. monocytogenes theo phương pháp MPN

Mẫu thực phẩm 25 g

+ 225 ml nước muối

sinh lý vô trùng
Đồng nhất

Cấy 1ml vào 1 ống nghiệm

3 dãy 5 ống nghiệm

Nhiệt độ phòng/48 giờ

Xác định số ống dương tính bằng cách cấy

phân lập trên MT chọn lọc và test hóa sinh

Tính số lượng

Bài 12: KIỂM TRA CLOSTRIDIUM sp. TRONG THỰC PHẨM

42
 12.1 Định nghĩa và nguyên tắc:
Giống Clostridium là các vi khuẩn Gram (+), hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần lớn di
động, cóthể thủy giải saccharise vàprotein trong các hoạt động thu nhận năng lượng. Những loài
thủy giải saccharise cóthể lên men các loại đường polysaccharise tạo thanh acide acetic, butyric
và rượu. Nhiều loài có thể thủy giải protein vàchuyển hóa không hoàn toàn các acide amin tạo
thành mùi khó chịu trong sản phẩm. Hầu hết nhóm Clostridium thuộc nhóm ưa nhiệt vừa, tuy
nhiên cómột số loài thuộc nhóm ưa nhiệt vàmột số loài ưa lạnh.
Các loài Clostridium hiện diện trong đất, một số loài trong nhóm này gây bệnh cho người
và động vật, một số loài khác gây hư hỏng thực phẩm, khử sulfite thành sulfur vàgây mùi khó
chịu. Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng làC. botulinum vàC.perfringens. Ngoài ra
một số loài như: C. tetani là tác nhân gây bệnh uốn ván, các loài khác như: C.nouyi, C.
perfringens, C.septicum, C.sordellii…gây hoại tử cho các mô bị nhiễm, gây biến chứng tại các
vết thương nhưng cho đến nay vẫn chưa xác định được bệnh lý. Đặc điểm của các loài thuộc
giống Clostridium thường gặp:
- C.botulinum là loài sống kỵ khíbắt buộc, chỉ tăng ttrưởng được trong môi trường
trung tính, không cósự cạnh tranh với các vi sinh vật khác. Các dòng khác nhau trong loài này có
đặc điểm nuôi cấy khác nhau vàcó6 kiểu kháng nguyên kýhiệu từ A- F. Kiểu kháng nguyên A,
B vàF có hoạt tính thủy giải protein tạo nên 1 vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc trên môi
trường Willis vàHobbs, trong khi đó kiểu kháng nguyên C,D, E không có các đặc tính này. Kiểu
kháng nguyên A thường được tìm thấy trong các mẫu thịt, kiểu E thường được phân lập từ cá.
- C. terani làloại kị khíbắt buộc, bị chết ngay khi tiếp xúc với không khí. Loài này có
đặ điểm tạo khối kết tụ khi được nuôi cấy trong môi trường lỏng. Loài này thường được tìm thấy
trong đất, trong phân các loài động vật và người, làloài gây bệnh uốn ván rất nguy hiểm.
- C. perfringens làloại kị khíkhông bắt buộc, rất ít khi tạo bào tử trên các môi trường
nuôi cấy nhân tạo, nhưng có thể quan sát được bào tử khi nuôi cấy trên môi trường Ellner, môi
trường cóbổ sung muối mật vàbicarbonat hay quinoline. Loài này có6 kiểu kháng nguyên được
kíhiệu từ A-F. Kiểu kháng nguyên A thường gây hoại tử ở các vết thương và gây ngộ độc thực
phẩm.
Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường có chứa ferri
amonium citrate vàdisodium sulfite ủ ở 37oC trong 2 ngày. Nếu nghi ngờ có Clostridium chịu
nhiệt cóthể ủ thêm ở 50oC. Trên môi trường này các khuẩn lạc Clostridium có màu đen do phản
ứng giữa ion sulfite (S2-) vàion sắt (Fe2+) có trong môi trường.
12.2. Môi trường vàhóa chất:
- Pepton đệm Buffered Peptone Wate ( BPW)
- Iron Sulfite Agar (ISA)
- Perfringens Selective agar ( hay Shahidi Ferguson Perfringens, SFP)
12.3 Quy trình phân tí ch:
Mẫu được rã đông ở nhiệt độ không quá 45oC và được phân tích ngay sau khi rã đông.
Cân 10g hay 25g trong túi PE vô trùng, bổ sung thêm 90 hay 225ml BPW và đồng nhất
mẫu bằng máy dập mẫu. Pha loãng mẫu với nồng độ tùy theo sự hiện diện của Clostridium có
trong mẫu. Trước khi cấy cần xử lýnhiệt độ 70-80 oC để loại bớt tế bào sinh dưỡng của các vi
sinh vật khác.
Cấy vào đĩa petri vô trùng 1ml mẫu đã được pha loãng thích hợp, cho 15ml môi trường ISA
hay SFP để ở 45oC, lắc đều, sau khi môi trường đã đông cho thêm ttrên bề mặt khoảng 10ml ISA
hay SFP
Một phương pháp khác là cho 1ml mẫu ở nồng độ thích hợp vào trong ống nghiệm vôtrùng,
đổ 15ml ISA hay SFP , trộn đều mẫu, sau khi môi trường đã đông, đổ thêm trên bề mặt môi
trường 3ml ISA hay SFP. Đĩa petri hay ống nghiệm đã cấy mẫu ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24-48h
43
trong các bình kỵ khí. Nếu nghi ngờ Clostridium chịu nhiệt, thực hiện ủ song song ở 37oC và
50oC. Thông thường việc đọc kết quả ttrên đĩa là dễ hơn trong ống nghiệm.
ISA là môi trường không chọn lọc nên các loài vi khuẩn sinh H2S khác không phải là
Clostridium cũng tăng trưởng vàtạo khuẩn lạc màu đen trên môi trường này. Để khẳng định là
Clostridium cần thực hiện thêm những quy trình tiêu chuẩn để giúp khẳng định kết quả.
12.4 Báo cáo kết quả:
Đếm tất cả các khuẩn lạc đen, hay có thể bao quanh bởi vòng đen. Mật độ Clostridium
trong mẫu được tính từ số khuẩn lạc đếm được nhân với hệ số pha loãng mẫu vàbiểu diễn kết
quả dưới dạng CFU/g hay CFU/ml.

PHẦN 3: MỘT SỐ TEST SINH HOÁ QUAN TRỌNG

Bài 13: CÁC TEST SINH HÓA QUAN TRỌNG THƯỜNG GẶP

Sau khi nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc, môi trường phân biệt, chúng ta có thể thu
được cấc khuẩn lạc đơn, thuần khiết bằng các kỹ thuật phân lập như đã trình bày trong mục 1 của
chương này.Chủng thuần làyêu cầu cần cho việc định danh các vi sinh vật. Việc định danh này
được thực hiện dựa vào các đặc điểm về kiểu hình, đặc biệt làcác phản ứng sinh hóa thực hiện
bởi các chủng vi sinh vật. Có 3 cách tiếp cận để thực hiện các phép thử nghiệm sinh hóa dùng
cho mục đích định danh làcách truyền thống, sử dụng các bộ KIT vàdùng thiết bị tự động.
Các kết quả thử nghiệm sinh hóa của hàng trăm loài vi sinh vật tại nhiều phòng thí
nghiệm khác nhau tên thế giới được tổng hợp thành những Bảng Sinh hóa định danh vi sinh vật.
Bảng Sinh hóa bao gồm các đặc điểm sinh hóa đặc trưng nhất để phân biệt các loài vi sinh vật
gây bệnh thường gặp. Mỗi đặc điểm sinh hóa được biểu thị bằng một trị số làtỉ lệ phần trăm thử
nghiệm sinh hóa cho kết quả dương tính theo thống kêở 1 loài vi sinh vật. Như vậy, trị số 100 có
nghĩa là 100% trường hợp của loài này đã được thử đều cho kết quả dương tính, ngược lại trị số 0
có nghĩa là 0% trường hợp thử nghiệm cho kết quả dương tính hay nói cách khác 100% trường
hợp thử nghiệm đặc điểm sinh hóa tương ứng trên loài này đều cho kết quả âm tính. Các đặc
điểm sinh hóa cótrị số dao động ở mức 50% không cógiátrị trong việc định danh.
Trong thực tế kiểm nghiệm, các kết quả thử nghiệm sinh hóa biểu thị quy uớc bằng các ký
hiệu như: (+), (-), (+/-) làkhỏang trên 70% là dương tính và (-/+) làkhỏang trên 70% làâm tính.
1. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG LÊN MEN:
a. Nguyên tắc:
Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng sử dụng một nguồn carbon nhất định bởi vi sinh
vật để tăng trưởng.
Vi sinh vật cókhả năng khác nhau trong việc sử dụng các nguồn carbon khác nhau để tăng
trưởng. Các nguồn carbon này cóthể được chia thành 3 nhóm là: đường đơn ( monosaccharide),
đường đa ( oligo-hay poly saccharide và rượu (alcolhol). Các nguồn carbon thường được sử dụng
trong thử nghiệm khả năng lên men gồm:

44
 Glucose Arabinose Trehalose Sorbtol
Galactose Raffinosse Melibiose Adonitol
Fructose Rhaffinosse Salicin Dulcitol
Lactose Xylose Mannitol Inulin
Saccharose Cellobiose Inositol
Trong số này các nguồn carbon cótên tận cùng bằng –ose là đường (kể cả salicin), tận cùng
bằng –ol làcác nhóm chức rượu –OH. Tuy nhiên trong thực tế các nhóm chức này thường được
gọi chung là đường.
Khi sử dụng các nguồn carbon để lên men, tùy phương thức lên men sản phẩm được tạo ra
sẽ khác nhau bao gồm rượu, các acide hữu cơ, CO2… trong tất cả các trường hợp, các sản phẩm
tạo thành đều làm giảm pH của môi trường. Do vậy khả năng lên men được đánh giá sự làm giảm
pH của môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường. Ngoài ra CO2 được
tạo thành sẽ được bẫy lại tạo thành bọt khítrong ống Durham vànổi ống này hay làm vỡ thạch
trong ống nghiệm thạch sâu. Môi trường lỏng thường được dùng trong hầu các thử nghiệm lên
men.
Thử nghiệm khả năng lên men thường được dùng để định danh các vi sinh vật đường ruột,
vídụ như nhóm Enterobacteriaceae đều có khả năng lên men glucose: E. coli, Klebsiella và
nhóm Enterobacter lên men được glucose vàlactose. Ngoài ra thử nghiệm này còn giúp phân
biệt một số giống vi sinh vật, vídụ Listeria monocytogens có salicin (+) trong khi đó các loài
Corynebacterium có salicin (-); S. aureus có mannitol (+), trong khi đó S. epidermidis có
mannitol (-)
b. Phương pháp tiến hành:
Môi trường sử dụng là môi trường Phenol red broth base có pH 7,4. Chỉ thị của môi
trường này là đỏ phenol, màu đỏ của phenol sẽ chuyển vàng khi pH của môi trường là dưới 6,8.
Một chỉ thị pH khác làandrade ( dung dịch 0,5% fuschin trong NaOH 0,6%, sử dụng ở
nồng độ cuối cùng là0,1%) có màu nâu ở pH 7,1 chuyển thành màu đỏ khi pH dưới 5,0 vàcó
màu vàng trong môi trường kiềm.
Nguồn carbon: tùy vi sinh vật cần kiểm định, thường sử dụng các tổ hợp khác nhau của
8-10 loại nguồn carbon nêu trên ở nồng độ 1%( trừ trường hợp salicin là0,5%). Các loài cơ chất
này thường được pha chế thành dung dịch mẹ cónồng độ gấp 10 nồng độ sau cùng ( thường được
ghi là10X, tức là10% cho các loại nguồn carbon và 5% cho salicin) và được bảo quản trong tủ
lạnh. Khi sử dụng bổ sung một lượng thích hợp dung dịch mẹ vào môi trường để đạt được nồng
độ cuối cùng cần thiết( pha loãng 1/10).
Môi trường đã bổ sung chứa trong các bình tam giác và được hấp khử trùng.
Sau khi khử trùng vàlàm nguội, môi trường được phân phối vào các ống nghiệm vôtrùng
với thể tích là5ml/ ống nghiệm vô trùng, các ống nghiệm này có thể dùng ngay hay bảo quản
trong tủ lạnh cho đến khi dùng.
Tiến hành cấy chủng vi sinh vật đã được làm thuần bằng que cấy tròn vào các ống
nghiệm môi trường, cóthể dùng 1 que cấy cho các lần cấy chung 1 loại vi sinh vật.
Sau khi cấy, ủ các ống môi trường ở 37oC trong 18-20h, trong trường hợp khẳng định
kết quả âm tính, thời gian ủ cóthể kéo dài đến 30 ngày.
c. Đọc kết quả:
Khả năng lên men của chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid và sinh hơi.
Sinh acid là(+) khi môi trường chuyển màu chỉ thị đỏ phenol thành màu vàng, ngược lại
nếu màu chỉ thị là đỏ thìacid (-). Nếu chỉ thị làandrade, kết quả là (+) khi môi trường là đỏ, là(-)
khi môi trường màu vàng hay không màu.

45
 Sinh hơi là (+) khi có bọt khítrong ống durham, vàchuyển màu môi trường, ở 1 số vi
sinh vật lên men chậm, sự đổi màu và sinh hơi không rõ ràng, trường hợp nghgi ngờ cần so sánh
với ống đối chứng.
2. THỬNGHIỆM KHẢ NĂNG OXI HÓA- LÊN MEN:
a. Nguyên tắc:
Các vi sinh vật dị dưỡng cần được cung cấp nguồn carbon dưới dạng tự do, thường là
carbohydrate từ môi trường. Các carbohydrate này được vi sinh vật sử dụng làm nguồn năng
lượng thông qua 1 trong 2 phương thức biến dưỡng làlên men hay hôhấp
Lên men là1 quátrình biến dưỡng năng lượng trong điều kiện kị khí, năng lượng được
tạo ra bởi cơ chế phosphoryl hóa cơ chất, không có sự tham gia của chuỗi chuyền điện tử và
nhận điện tử sau cùng từ bên ngòai tế bào. Quátrình lên men glucose sẽ chia phân tử này thành 2
phân tử đường triose ( đường 3 C). Sản phẩm cuối cùng của quátrình lên men tùy thuộc vào từng
loại vi sinh vật và điều kiện môi trường.
Tuy vậy điểm cốt yếu của con đường lên men làphân tử glucose bi phosphoryl hóa ở
bước đầu tiên để trở thành glucose-6-phosphate. Quátrình lên men cần 1 chất nhận điện tử cuối
cùng là1 hợp chất hữu cơ. Glucose tham gia trong quá trình lên men thường được trao đổi theo
con đường Embden-Meyerhof, cũng có trường hợp trao đổi theo con đường Entner- Doudoroff
và con đường theo hướng trao đổi pentose.
Ngược lại hô hấp là1 quátrình biến dưỡng năng lượng, trong đó điện tử được chuyền
tuần tự từ chất cho đến chất nhận điện tử, trong quá tình này ATP được tạo ra theo cơ chế
phosphpryl hóa oxi hóa.. Cuối chuỗi chuyền điện tử làchất nhận điện tử sau cùng cần được cung
cấp từ môi trường. Quátrì nh này làhôhấp hiếu khíkhi chất nhận diện tử sau cùng làoxi phân tử,
chỉ diễn ra trong môi trường có oxi. Ngược lại quátrình này làhôhấp kị khíkhi chất nhận điện
tử cuối cùng không phải làoxi mànitrate, sulfate.
Trong quátrì nh hô hấp hiếu khí, phân tử glucose không bị tách thành 2 phân tử triose
như trong quá trình lên men mà bị oxihoas nhóm chức aldehyde, tạo thành acid gluconic và cũng
không bị phosphoryl hóa ở giai đoạn đầu của quátrình phân giải như trong quá trình lên men.
Quá trình lên men thường tạo môi trường có tính acid cao hơn so với oxihóa.
Thử nghiệm oxi hóa- lên men còn được gọi làthử nghiệm Hugh- Leifson nhằm xác định
vi sinh vật đang thử nghiệm biến dưỡng carbohydrate theo oxihoas hay lên men. Cách này được
thực hiện bằng cách nuôi cấy chủng thử nghiệm trong môi trường Hugh-Leifson chứa glucose là
nguồn carbon duy nhất vàchỉ thị pH làbromothymol blue. Các sản phẩm acid của quátrình lên
men sẽ làm biến đổi màu của chỉ thị pH
Chủng làm đối chứng của phương thức oxi hóa làAcinetobacter calcoaceticus, cho lên
men làE.coli, cho không khả năng biến dưỡng glucose làAlcaligenes faecalis.
b. Phương pháp tiến hành:
Cấy đâm sâu vi sinh vật thử nghiệm vào 2 ống nghiệm môi trường Hugh-Leifson có
chứa 2-5g agar/lit. 1 trong 2 ống được phủ lên trên bề mặt dầu khoáng paraffin vô trùng để ngăn
tiếp xúc với oxi không khí.Ủ cả 2 ống ở cùng điều kiện 24-48h/37oC.
Trường hợp các chủng thử nghiệm là cầu khuẩn Streptococci hay Micrococci, môi
trường Hugh-Leifson được thay bằng môi trường BP cải biên trong đó chất chỉ thị thay bằng
bromocresol blue.
c. Đọc kết quả:
Phương thức biến dưỡng carbohydrate làlen men khi cả 2 ống đều bị acid hóa ở trên bề mặt
vàtrong phần sâu của môi trường. Ngược lại khi ống kị khíbị acid hóa khắp mặt thạch sâu, trong
khi đó ống hiếu khíkhông bị acid hóa trên mặt màchỉ bị acid hóa ở phần đáy ống nghiệmthìkết
luận vi sinh vật biến dưỡng carbohydrate theo oxi hóa.
46
 3. THỬ NGHIỆM BILE ESCULIN:
a.Nguyên tắc:
Thử nghiệm này phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên kết
glycosidetrong Esculin thành Esculetin vàglucose khi cósự hiện diện của muối mật. Esculin là
một dẫn xuất của acetaldehyde của một monosaccharide. Trong phản ứng này, liên kết β-
glucoside trong esculin bị thủy phân, phóng thích glucose vàesculin. Esculin kết hợp với muối
sắt trong môi trường tạo thành phức hợp màu đen hay nâu đen.
Chủng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm này là: Serratia marcescens, (-) là
Edwardsiella tarda.
b. Phương pháp tiến hành
Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường Aesculin Medium hay môi
trường Edwards. Sau khi cấy chủng, nếu chủng có hoạt tính thủy phân esculin thì làm đen môi
trường.
c. Đọc kết quả:
Thử nghiệm là (+) khi màu của môi trường chuyển thành màu đen hay nâu đen, thử
nghiệm là(-) khi mfu của môi trường không đổi.
4. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG BIẾN DƯỠNG CITRATE:
a.Nguyên tắc:
Một số vi sinh vật có khả năng sử dụng Citrate làm nguồn carbon duy nhất để thu lấy
năng lượng và vật chất. Sự biến dưỡng Citrate thường thông qua sự kết hợp với acetyl- CoA
thành oxaloacetate để vào chu trình Krebs hay chu trình tricarboxylic acid. Sản phẩm biến dưỡng
Citrate thay đổi tùy pH của môi trường. Khi pH tăng, môi trường chuyển sang kiềm, lượng
acetatevàformate tạo thành sẽ tăng trong khi lactate và CO2 giảm. Ở pH trung tính sản phẩm chủ
yếu làCO2 vàacetate. Ở pH acid, sản phẩm tạo ra chủ yếu là aceton và lactate. Như vậy sự biến
dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường. Mặt khác mọi vi sinh vật
dùng citrate làm nguồn carbon duy nhất đều có khả năng dùng muối amonium làm nguồn đạm
duy nhất. Sự phân giải của muối amonium dùng làm nguồn đảmtong môi trường sẽ sinh NH3,
làm kiềm hóa môi trường. Như vậy trong thử nghiệm khả năng dùng citrate làm nguồn carbon
duy nhất có chứa đạm ở dạng amonium, khả năng tăng trưởng của chủng sẽ thể hiện qua khả
năng biến dưỡng nguồn carbon citrate và nguồn đạm amonium làm tăng giá trị pH của môi
trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.
Thử nghiệm này được dùng để phân biệt nhóm Klebsiella, Entrobacter (+) với E.coli (-)
trong thử nghiệm IMViC hay để phân biệt Edwardsiella (-) với Salmonella (+).
Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm này là proteus rettgeri , (-) là
Staphylococcus epidermidis.
b. Phương pháp tiến hành:
Môi trường sử dụng cho khả năng biến dưỡng citrate là môi trường rắn Simone citrate
agar (SCA) hay môi trường Christensens citrate sulfite agar (CCSA).
Môi trường SCA chứa sodium citrate hay potassium citrate làm nguồn carbon duy nhất,
chỉ thị bromoyhymol blue, pH 6,9. Chỉ thị này có màu vàng khi pH dưới 6,0, màu xanh lục với
pH trung tính và màu xanh dương ở pH lớn hơn 7,6.Chủng thuần trên môi trường KIA hay môi
trường thích hợp khác được cấy ria trên bề mặt môi trường SCA rắn trong ống thạch nghiêng, ủ ở
35oC/24-48h hay kéo dài đến 4 ngày khi cần thiết.
Môi trường CCSA chứa nguồn đạm là cystein, chỉ thị màu là phenol red, pH 6,7.Môit
trường chưa sử dụng có màu kem đến nâu. Ở pH acid (<6,8) màu chỉ thị trở thành vàng, pH kiềm
(>8,4) trở thành màu đỏ. Chủng vi sinh vật được cấy vàủ trong điều kiện như trên môi trường
SCA.

47
 c. Đọc kết quả:
- Trường hợp môi trường SCA, thử nghiệm là(+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường
chuyển màu xanh dương, ngược lại, môi trường vẫn giữ nguyên trạng thái ban đầu.
- Trường hợp môi trường CCSA , thử nghiệm là (+) khi môi trường chuyển sang màu đỏ,
ngược lại, môi trường không đổi màu.
5. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG SINH INDOL:
a. Nguyên tắc:
Tryptophan là mọt acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh có hệ enzyme
tryptophanase tạo nên các sản phẩm cóchứa gốc indol. Sản phẩm trung gian chính của phản ứng
oxi hóa tryptophan là indolpyruvic acid IPA. Phân tử này sau đó bị biến đổi theo hướng loại
nhóm amin thành indol hay theo hướng loại nhóm carboxyl thành skatol. Tryptophanase xúc tác
phản ứng loại nhóm amin tạo thành indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng
của phân tử này với các thuốc thử chứa Dimethylaminobenzaldehyde( p- DMABA). Nhân pyrol
của indol chứa nhóm CH2 sẽ kết hợp với nhân benzen của p-DMABA tạo nên một phức chất
dạng quinone có màu đỏ.
b. Phương pháp tiến hành:
Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là nước tryptone hay các môi trường kết hợp như
MIU( motility indol urea), SIM( sulphite indol motility)... khi cần kiểm tra cùng lúc nhiều đặc
tính sinh hóa cần thiết. Hai loại thuốc thử cóthể sử dụng cho thử nghiện này làthuốc thử Erlich
vàthuốc thử Kovac’s. Sinh khối chủng thuần được cấy vào các ống môi trường lỏng thuộc một
trong các loại thuốc thử nêu trên, ủ ở nhiệt độ 37oC/24-48h. Trước khi bổ sung thuốc thử cóthể
bổ sung 1ml eter hay xylene vào ống nghiệm, lắc đều để tách chiết indol lên lớp dung môi hưũ cơ.
Nhỏ 5 giọt thuốc thử vào dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu đỏ trong dung môi
hữu cơ.
c. Đọc kết quả:
Thử nghiệm là dương khi có màu đỏ xuất hiện trên lớp dung môi hữu cơ, là âm khi không
cósự thay đổi màu trong lớp dung môi hữu cơ. Đôi khi có xuất hiện màu cam làdo skatol, làtiền
chất của methyl hóa của indol tạo ra.
6.THỬ NGHIỆM MR ( METHYL RED):
a. Nguyên tắc:
Thử nghiệm MR nhằm phân biệt vi sinh vật dựa trên sự khác biệt về khả năng tạo ra vàduy
trìcác sản phẩm biến dưỡng cótính acid bền trong môi trường trong quátrình lên men glucose.
Chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ ion H+ hiện diện trong môi trường sau khi vi sinh
vật lên men glucose. Chỉ thị này có màu thay đổi khác tùy dãy pH hay nồng độ ion H+: đỏ khi pH
thấp hơn 4,4, màu cam trong vùng pH 5,0- 5,8, màu vàng khi pH trên 6,0. hàm lượng ion H+ này
phụ thuộc vào tỉ lệ CO2 vàH2 và con đường chuyển hóa đường của từng vi sinh vật.
Đối với các vi sinh vật đường ruột, thời gian nuôi cấy để thử nghiệm phản ứng MR thường
được xác định trong khoảng 18-24h. Tuy nhiên các sinh vật này tạo acid trong môi trường ngay
từ khi chúng bắt đầu tăng trưởng. Khi bắt đầu thời gian nuôi cấy, các vi sinh vật có phản ứng
MR(+) có đặc tính là tích lũy acid trong môi trường ngày càng nhiều và độ pH trong môi trường
ngày càng giảm, ngược lại các vi sinh vật cho phản ứng MR(-), sẽ tiếp tục chuyển hóa các sản
phẩm có tính acid đã được tạo ra thàng các sản phẩm trung tính. Thử nghiệm MR phụ thuộc rất
lớn vào thời gian nuôi cấy và được tiến hành trong thời gian 1- 3 ngày ở 37oC.
b. Phương pháp tiến hành:
Thử nghiệm được tiến hành trong các ống nghiệm chứa môi trường lỏng glucose
photphate( MR-VP Broth). Dùng que cấy vòng lấy một lượng nhỏ sinh khối từ khuẩn lạc thuần
chủng trên môi trường KIA, ở 37oC trong khoảng 2-5 ngày. Thêm vào vài giọt thuốc thử đỏ
methyl red vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả ngay.
48
 c. Đọc kết quả:
Thử nghiệm MR là (+) khi môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử, là(-) khi có
màu vàng, trường hợp cómàu cam, cần tiếp tục ủ ống môi trường cógiống trong 4 ngày vàthực
hiện lại thử nghiệm.
7. THỬ NGHIỆM VP( VOGES- PROSKAUER)
a. Nguyên tắc:
Ở vi sinh vật, biến dưỡng năng lượng bằng phương thức lên men từ Gluose qua con đường
đường phân sẽ tạo ra chất trung gian chủ yếu là pyruvic acid. Để khôi phục dự trữ NAD+ trong tế
bào phục vụ cho con đường đường phân, ở các loài vi sinh vật, sau đó acid pyruvic tiếp tục được
chuyển hóa theo các con đường chuyển hóa khác nhau tạo ra các srn phẩm lên men cuối cùng
khác nhau. Họ Enterobacteriaceae có đặc tính chung là lên men sinh hỗn hợp acid như acid
formic, acid acetic, acid succinic, ethanol, H2 vàCO2. họ này cóthể được chia làm 2 nhóm không
sinh 2,3-butanediol( vídụ như E.Coli) và nhóm sinh 2,3-butanediol( vídụ như Klebsiella,
Enterobacter). Phân tử 2,3- butanediol có thể được chuyển hóa qua lại thành acetoin: trong điều
kiện cóoxi và môi trường cótính kiềm, 2,3- butanediol bị oxi hóa thành acetoin nhờ xúc tác của
enzyme 2,3- butanediol dehydrogenase; ngược lại, acetoin cóthể bị khử thành 2,3- butanediol do
hoạt tính của enzyme diacetyl reductase. Ngoài ra, acetoin còn bị oxi hóa thành diacetyl. Như vậy,
khi cóoxi vàpH kiềm, 2,3- butanediol bị chuyển hóa thành acetoin, đến lượt mình, acetoin bị oxi
hóa thành diacetyl, chất này tham gia vào phản ứng tạo màu trong thử nghiệm VP. Như vậy thử
nghiệm VP cóthể giúp phân biệt các loài trong Enterobacteriaceae dwuja trên sự oxi hóa acetoin
( acetylmethylcarbinol, AMC) từ 2,3- butanediol thành diacetyl. Sự oxi hóa acetoin thành
diacetyl được tăng cường nhờ xúc tác của α-naptol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine cótrong
pepton kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ. Trong thuốc thử Kloblentz và O’ Meara
cóchứa creatine cótác dụng bổ sung nuồn guanidine.
b. Phương pháp tiến hành:
Môi trường được thử nghệm cho phản ứng VP làmôi trường lỏng Clark-Lubs ( môi trường
MR-VP), cópH 6.9. Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối từ
khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24h trên môi trường KIA hay TSI. Ủ yên các ống môi trường
này ở 37oC trong 24-48h hay đến 10 ngày khi cần thiết. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực
tiếp vào môi trường. Có3 loại thuốc thử VP là:
- Thuốc thử Barritt: dung dịch A là 5% α-naptol trong cồn tuyệt đối, dung dịch B là
KOH40% hay NaOH
- Thuốc thử Kloblentz: gồm dung dịch A là α-naptol trong cồn 95%, dung dịch B là
0,3%creatin 40%KOH hay NaOH.
- Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0,3 %creatin 40%KOH hay NaOH.
Khi sử dụng các loại thuốc thử cóhai thành phần trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch thuốc thử
A sau đó cho 2 giọt thuốc thử B. Đối với các thuốc thử 1 thành phần, bổ sung 1ml thuốc thử vào
ống môi trường, lắc nhẹ ống 1phút để oxi hóa acetoin. Đọc kết quả sau 20 phút hay chậm nhất là
4h.
c. Đọc kết quả:
Thử nghiệm VP là(+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường, là(-) khi bề mặt môi trường
không đổi màu.
8. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG TÍNH DI ĐỘNG:
a. Nguyên tắc:
Vi sinh vật di động nhờ khả năng có cấu trúc protein gọi làtiên mao, có ở nhiều vi khuẩn
hình que, một số vi khuẩn cóhình cầu. Khả năng di động làmột trong những căn có thể dùng để
phân biệt các vi sinh vật. Khả năng này có thể được quan sát nhờ vào sự tăng trưởng và di động
của vi sinh vật vào bên trong môi trường thạch mềm. Ngoài ra, triphenyltetrazolium chloride
49
( TTC) cóthể được bổ sung vào môi trường để giúp phát hiện dễ dàng vị tríhiện hiện diện của tế
bào vi sinh vật trong môi trường do hợp chất này khi vào bên trong tế bào sẽ bị khử thành
formazan có màu đỏ.
b. Phương pháp tiến hành:
Sử dụng môi trường thạch mềm chứa 0,5% agar. Môi trường được đun tan, phân phối vào
các ống nghiệm dung tích 5ml đã được vô trùng. Trường hợp sử dụng TTC tong môi trường để
phát hiện vị trítế bào, dung dịch 1%TTC được vôtrùng bằng màng lọc 0,45µm, sau đó được bổ
sung vào môi trường thạch mềm đã hấp khử trùng thành nồng độ 0,05g/l trước khi làm đông môi
trường.
Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần sau khi ủ ở nhiệt độ
thích hợp 18-24h trên môi trường KIA hay môi trường thích hợp khác. Chủng được cấy bằng
cách đâm sâu đầu que cấy xuyên vào giữa môi trường trong ống nghiệm đến độ sâu khoảng 2cm.
Các ống môi trường được ủ ở 37oC trong 24-48h, nếu (-) thì được ủ tiếp ở 21-25oC trong 5 ngày.
Thực hiện song song việc ủ ở điều kiện tương tự một ống đối chứng. Do nhiệt độ cóảnh hưởng
rất quan trọng đế khả năng di động của vi khuẩn nên khi cần thiết nên thực hiện đồng thời việc ủ
môi trường đã cấy ống chủng ở hai điều kiện nhiệt độ khác nhau như trên.
c. Đọc kết quả:
Trường hợp môi trường thạch mềm: thử nghiệm là(+) khi vi sinh vật mọc lan khỏi đường
cấy và làm đục môi trường xung quanh; là(-) khi vi sinh vật chỉ mọc theo đường cấy trong khi
môi trường xung quanh vẫn trong. Ở ống đối chứng không cóvi sinh vật tăng trưởng, môi trường
vẫn trong.
Trường hợp môi trường thạch mềm có bổ sung TTC; thử nghiệm là(+) khi vi sinh vật tạo
một vùng đục màu đỏ lan tỏa vào môi trường hai bên đường cấy; là(-) khi vi sinh vật tạo thành
một vùng màu đỏ dọc theo đường cấy. Ở ống đối chứng không có vi sinh vật tăng trưởng, môi
trường vẫn trong.
9. Thử nghiệm sinh H2S:
a. Nguyên tắc:
Một số vi sinh vật tổng hợp được enzyme desulphurhydrase xúc tác sự chuyển hóa trong
điều kiện kỵ khí các acid amine chứa lưu huỳnh như cysteine, cystin, methionine và giải phóng
H2S. Thành viên quan trọng nhất của nhóm enzyme này làcysteine desulphurhydrase. Các acid
amin này làsản phẩm của quátrình thủy phân protein thành acid amine. KhíH2S sinh ra sẽ tạo
màu đen với chỉ thị sulphite chứa trong môi trường nuôi cấy. Ngoài nguồn đạm hữu cơ, H2S còn
cóthể được tạo ra do phản ứng khử thiosulphate Na2S2O3 bởi enzyme thiosulphate reductase của
vi sinh vật để tạo ra sulphite vàH2S.
Các hợp chất được sử dụng trong môi trường làm chỉ thị H2S cóthể làcác hợp chất của sắt
như FeSO4 amonium sulphate sắt II hay sắt III. KhíH2S phản ứng với ion sắt sẽ tạo thành
sulphate sắt FeS không tan có màu đen. Ngoài ra, acetate chì Pb(C2H3O2)2 cũng có thể được dùng
làm chỉ thị của sulphite do hợp chất này cũng phản ứng với H2S tạo sulphate chìPbS không tan
màu đen. Chỉ thị acetate chì có độ nhạy cao cho phép phát hiện lượng nhỏ H2S được tạo ra ở
những loài vi khuẩn không thuộc họ Enterobacteriaceae, vídụ như Brucella.
Thử nghiệm khả năng sinh H2S thường được sử dụng để phân biệt một .số loài thuộc họ
Enterobacteriaceae vàgiống Proteus.
b. Phương pháp tiến hành:
Các loại môi trường cóthể được sử dụng cho thử nghiệm sinh H2S làKIA, TSI, SIM, BSA...
tất cả các môi trường này được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút và được phân phối vào các
ống nghiệm vô trùng và sau đó được giữ thành ống thạch nghiêng.. Dùng que cấy vòng cấy vòng
cấy sinh khối của chủng thuần cấy sâu vào đáy của ống thạch nghiêng. Sau khi cấy xong, các ống
cógiống vi khuẩn được ủ ở điều kiện 37oC/ 24-48h hay đến 7 ngày khi cần thiết.
50
 Ngoài ra, thử nghiệm này có thể được hiện bằng cách dùng acetate chì5% gắn lên thành
ống môi trường lỏng. Phương pháp này dùng để hạn chế độc tính của ion sắt, chìlên chủng vi
sinh vật cần kiểm định, mặt khác có độ nhạy cao ( phát hiện H2S ở mức 0,01M). Trong trường
hợp này, việc kết hợp giữa cấy lượng sinh khối lớn vào ống môi trường và sử dụng giấy tẩm
acetate chìlàm chỉ thị cóthể cókết quả trong vòng 30 phút hay 1-2h đối với hầu hết vi sinh vật
sinh H2S.
c. Đọc kết quả:
Thử nghiệm khả năng sinh H2S là(+) khi xuất hiện màu đen trong các môi trường KIA, TSI,
SIM, khuẩn lạc màu đen trong môi trường BSA hay xuất hiện màu nâu đen trong giấy tẩm
acetate chì.Thử nghiệm là(-) khi môi trường không xuất hiện hay chuyển màu đen.
10. THỬ NGHIỆM DECARBOXYLASE:
a. Nguyên tắc:
Các loài vi khuẩn đường ruột khác nhau trong mức độ cảm ứng tạo thành các enzyme
carboxylase cóvai tròxúc tác phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl ở một số acid amin tạo ra amine
hay diamine vàCO2 trong điều kiện kỵ khí.Các enzyme này chỉ được cảm ứng tổng hợp khi môi
trường cótính acid vàchứa chất cảm ứng đặc hiệu. Họ decarboxylase gồm nhiều thành viên, mỗi
loại chỉ tác động lên một cơ chất nhất định. Có 3 loại decarboxylase quan trọng trong kiểm
nghiệm vi sinh vật là lysine decarboxylase (LDC), orthinine decarboxylase (ODC) và arginine
decarboxylase (ADC) có cơ chất tuần tự làlysine, orthinine, arginine. Phản ứng xúc tác bởi LDC
sẽ loại bỏ CO2 khỏi lysine, phóng thích CO2 vàdẫn đến sự hình thành cadaverine. Trường hợp
ODC vàADC sản phẩm tạo ra làCO2 vàputrescine. Ngoài ra, arginine còn cóthể được chuyển
hóa thành citruline nhờ xúc tác của enzyme arginine dihydrolase (ADH) trước khi chuyển hóa
tiếp thành putrescine và CO2. Do vậy, thử nghiệm argine decarboxylase (ADC) cũng được ký
hiệu làADH. Trong tất cả các trường hợp nêu trên, CO2 làm tăng giá trị pH của môi trường và
được ghi nhận qua sự biến đổi màu của chỉ thị pH.
Các thử nghiệm decarboxylase thường được dùng để phân loại và định danh các loài vi
khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae.
b. Phương pháp tiến hành:
Môi trường được sử dụng làDecarboxylase Basal Medium, chứa chỉ thị bromocresol purple,
pH 6,0. Chỉ thị màu thay đổi từ pH 5,2- 6,8.
Môi trường lỏng được pha chế vàhấp khử trùng theo phương pháp thông thường. Sau khi
làm nguội môi trường được phân vào các ống nghiệm có dung tích 4-5ml đã được vô trùng.
Chủng thuần được cấy với mật độ thấp vào các ống môi trường, sau đó mỗi ống được bổ sung 2-
3ml dầu khoáng hay parafin ủ ở 37oC/ 24h-4 ngày. Ooxxi tan trong môi trường sẽ được vi khuẩn
sử dụng cho tăng trưởng và làm môi trường trở nên cạn kiệt ooxxi. Trong điều kiện này các
enzyme decarboxylase được cảm ứng do cóhiện diện của cơ chất vàphản ứng chuyển hóa cóthể
xảy ra.
c. Đọc kết quả:
Thử nghiệm là (+) khi môi trường trở nên đục vàcómàu tím, là(-) khi môi trường trong có
màu vàng.
11. Thử nghiệm coagulase:
a. Nguyên tắc:
Một số vi sinh vật đặc biệt làcác loài thuộc giống Staphylococcus có khả năng tiết ra môi
trường enzyme coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần của huyết tương, tạo thành các
khối đông làm đông kết huyết tương. Có nhiều giả thuyết khác nhau được đề xuất để giải thích cơ
chế làm đông huyết tương bởi coagulase nhưng không được đề cập ở đây.Coagulase có bản chất
làprotein nên nhanh chóng bị bất hoạt vàthủy phân bởi protease. Tuy nhiên enzyme này khábền
với nhiệt ở nhiệt độ 60oC trong 30 phút màkhông mất hoạt tính.
51
 b. Phương pháp tiến hành:
Trường hợp dùng huyết tương nên dùng huyết tương người hay thỏ dạng đông khô thương
phẩm. Tuy nhiên cũng có thể tự điều chế huyết tương bằng cách ly tâm máu chứa chất chống
đông để loại bỏ các tế bào máu, thu nhận huyết tương. Trường hợp sử dụng fibrinogen, cóthể tự
điều chế fibrinogen bằng cách trộn huyết tương và nước muối bão hòa theo tỉ lệ 1:1 để tủa
fibrinogen, sau đó thu nhận fibrinogen bằng ly tâm. Tủa này được hòa tan vào nước cất vôtrùng
theo tỉ lệ 1:4, được bảo quản ở 4oC trong thời gian ngắn hay -20oC trong thời gian dài. Cần kiểm
tra chất lượng huyết tương hay fibrinogen bằng các chủng dương tính (S.aureus) và âm tính
(S.epidermis) trước khi sử dụng. Ngoài ra, khi sử dụng citrate làm chất chống đông máu để thu
lấy huyết tương fibrinogen, khi sử dụng cần bổ sung 5 đơn vị heparin/ml huyết tương, dịch
fibrinogen để tránh kết quả dương tính giả thường gặp đối với vi sinh vật cókhả năng biến dưỡng
citrate. Hiện nay, EDTA thường được dùng làm chất chống đông thay cho citrate để loại trừ hiện
tượng coagulase dương tính giả bởi các chủng biến dưỡng citrate.
Hoạt tính coagulase cóthể được thử bằng hai phương pháp:
- Thử trên phiến kính: nhỏ lên phiến kính một giọt nước cất hay nước muối sinh lý,
dùng que cấy vòng thu lấy một lượng lớn sinh khối từ khuẩn lạc hay dịch nuôi cấy chủng thuần
vào giọt nước để tạo thành một huyền phùcómật độ tế bào cao. Thêm vào đó một vòng que cấy
huyết tương mới pha, hòa đều tạo huyền phù đồng nhất. Nếu phản ứng (+) tính sẽ xuất hiện sự
ngưng kết trong vòng 20 giây, nếu (-) nếu sau 20 phút không cósự ngưng kết xảy ra.. Kết quả (-)
cần được thử nghiệm tiếp bằng việc nuôi cấy trong ống nghiệm.
- Thử trong ống nghiệm: cho vào ống nghiệm 0,5ml huyết tương người hay thỏ không
pha loãng, bổ sung 0,5ml dịch nuôi cấy chủng thuần hay một lượng lớn sinh khối khuẩn lạc, xoay
nhẹ ống để trộn đều khuẩn lạc, ủ 37oC/4h, quan sát ghi nhận kết quả sự ngưng kết mỗi 30 phút,
tiếp tục ủ 24 h nếu không thấy xuất hiện khối kết tụ.
c. Đọc kết quả:
Nếu thử trên phiến kính : (+) khi cósự tụ rõtrong vòng 20 giây, (-) nếu không cpos kết tụ,
phải thử nghiệm lại trong ống nghiệm.
Nếu thử trong ống nghiệm: là(+) khi cósự kết tụ, là(-) khi không cósự kết tụ.
12. THỬ NGHIỆM UREASE:
a. Nguyên tắc:
Một số vi sinh vật tổng hợp enzyme urease xúc tác sự thủy phân của urea. Urea làdiamide
của acid carbonic. Urease thuộc nhóm các amidase xúc tác sự thủy phân của các liên kết amide
giữa C-N trong phân tử urea để giải phóng hai phân tử NH3 vàCO2. Enzyme này hoạt động tối
ưu ở pH 7,0, thuộc nhóm enzyme cấu trúc, hiện diện thường xuyên trong tế bào không phụ thuộc
vào sự hiện diện hay không của urea. Sự phóng thích NH3 vàCO2 làm tăng pH của môi trường và
cóthể được theo dõi của chất chỉ thị pH.
Thử nghiệm urease là đặc trưng cho các loài Proteus spp, và thường được dùng để phân biệt
các dạng Proteus với các thành viên khác của nhóm Enterobacteriaceae.
b. Phương pháp tiến hành:
Thínghiệm urease được thực hiện trên hai môi trường:
- Môi trường lỏng Rustigian- Stuart’s Urea Broth, chứa chỉ thị đỏ phenol, chuyển màu từ
vàng sang đỏ ( vùng chuyển màu làpH 6,8- 8,4). Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ
khuẩn lạc của chủng thuần vào ống chứa 3ml môi trường vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi
khuẩn vàủ ở 37oC/48h. Quan sát sự chuyển đổi màu vào các thời điểm 8,12,24,48h ủ.
- Môi trường rắn Christensen Urea, chứa chỉ thị đỏ phenol như trên môi trường lỏng
trên, dùng que cấy vòng cấy một lượng lớn sinh khối khuẩn lạc chủng thuần lên bề mặt các ống
thạch nghiêng chứa môi trường Christensen Urea, ủ 37oC/24h. Môi trường Christensen Urea
cũng có thể được dùng ở dạng môi trường lỏng như môi trường Rustigian- Stuart’s Urea Broth.
52
 c. Đọc kết quả:
Trường hợp sử dụng môi trường lỏng Rustigian- Stuart’s Urea Broth thử nghiệm là(+) khi
môi trường trở thành màu đỏ tím, là(-) khi môi trường có màu vàng cam không đổi.
Trường hợp sử dụng các ống thạch nghiêng Christensen Urea, thử nghiệm là(+) khi màu
môi trường chuyển thành màu đỏ tím. Bề dày của môi trường bị chuyển màu chỉ thị mức độ thủy
phân urea (++++: toàn bộ thạch đổi màu, ++ chỉ mặt thạch đổi màu, +: mặt thạch ở đỉnh đổi màu,
phần môi trường còn lại không đổi màu). Ngoài ra, còn phân biệt (+) nhanh khi màu đổi trong
vòng 6h; (+) chậm khi màu đổi sau 1-6 ngày. Trường hợp màu môi trường làvàng hay vàng nhạt
hoàn toàn không đổi : thử nghiệm là(-).
13. THỬ NGHIỆM GELATINASE:
a. Nguyên tắc:
Một số vi sinh vật có thể tổng hợp enzyme gelatinase ngoại bào xúc tác sự thủy phân của
gelatinase thành polypeptide và acid amin. Để nhận biết khả năng làm tan gelatin của vi sinh vật,
cơ chất này được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Sau khi cấy chủng cókhả năng tiết gelatinase
sẽ làm tan chảy môi trường thành dạng lỏng.
b. Phương pháp tiến hành:
Môi trường sử dụng là môi trường dinh dưỡng chứa gelatin Nutrient Gelatin trong các ống
thạch sâu. Tiến hành cấy một lượng lớn sinh khối chủng thuần sâu vào trong ống môi trường, ủ
nhiệt độ phòng trong 14 ngày. Thực hiện song song với một ống đối chứng.
Một phương pháp thực hiện khác làcấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng chứa gelatin
trên đĩa petri, ủ 3 ngày ở nhiệt độ phòng. Bổ sung trên bề mặt môi trường 5-10ml dung dịch
trichloacetic acid (TCA) để làm kết tủa gelatin.
c. Đọc kết quả:
Trong ống thạch sâu thử nghiệm là (+) khi môi trường bị tan chảy ở ống cócấy chủng trong
khi ống đối chứng vẫn ở trạng thái đông đặc. Thử nghiệm là(-) khi môi trường ở cả 2 ống không
bị tan chảy.
Trường hợp sử dụng đĩa petri, môi trường dunh dưỡng chứa gelatin, các khuẩn lạc có
gelatinase dương tính sẽ tạo vòng phân giải gelatin trong rõ, trong khi ống đối chứng trở nên đục
khi nhuộm bởi TCA.

53
 PHẦN 4: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP

Bài 14: MỘT SỐ ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN THỰC PHẨM

14.1. Lên men lactic

* Cách 1:
- Nguyên liệu: Dưa cải, nước muối 3 - 3,5% 500 ml, đường: 2 thìa càphê
- Cách làm:
+ Dưa cải bẹ để héo, rửa sạch, cắt khúc, để ráo.
+ Pha 500ml dung dịch NaCl 3 - 3,5% vàbổ sung thêm vào đó 2 thìa cà phê đường.
+ Xếp dựa vào lọ thuỷ tinh vàém chặt. Để nước muối từ từ cho ngập dưa.
+ Lên men ở nhiệt độ 28 – 300C trong 2 - 3 ngày.
+ Vi khuẩn lactic sống trên bề mặt rau quả làtác nhân của quátrình này.
* Cách 2:
- Cho vào bình tam giác + 150 ml sữa tươi đã khử trùng.
+ 3 thìa càphêsữa chua đã khuấy cho thật nhuyễn
- Lắc bình để men giống tan đều
- Để tủ ấm 30 – 350C trong 3 - 4h ta được sữa (chua) đã đông tụ.
Xác định các đặc trưng của quátrình
Xác định các đối tượng vi sinh vật tham gia:
- Làm tiêu bản giọt ép từ nước dưa cải chua để quan sát được hình dạng, sự sắp xếp tế
bào của các vi khuẩn lên men lactic.
- Làm tiêu bản giọt treo để quan sát sự chuyển động của những vi khuẩn lactic từ dịch
trong của sữa chua.
- Yêu cầu nhận biết được 2 dạng cầu khuẩn vàtrực khuẩn của các vi khuẩn lactic.
14.2. Lên men bánh mỳ
Nguyên liệu: Bột mỳ, đường, nước sạch , nấm men Saccharomyces cerevisiae

Hình 21: Nấm men Saccharomyces cerevisiae dưới kính hiển vi quang học (a)
vàkính hiển vi điện tử (b)
Cách làm:
- Cho bột mỳ, đường, nấm men vào trong thố. Nhồi bột với một lượng nước vừa phải
- Để tủ ấm 300C/ 30phút
Quan sát khối bột nhào vàgiải thích bản chất hiện tượng.
54
 PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Phương pháp MPN (Most Probable Number):
- Phương pháp MPN (Phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ) là
phương pháp dùng để ước lượng số lượng vi sinh vật hiện diện trong một đơn vị thể tích dựa vào
bảng Mac Crandy.
- Thínghiệm thực hiện ở 3 độ pha loãng liên tiếp nhau. Mỗi độ pha loãng cóthể sử dụng để
cấy trong 3, 5, 10 ống nghiệm.
- Các bước thực hiện: Cho vào trong ống nghiệm môi trường nuôi cấy phùhợp cho sự sinh
trưởng vàphát triển của vi sinh vật cần kiểm tra. Định lượng một thể tích chính xác dung dịch
mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp nhau, mỗi nồng độ pha loãng cấy vào 3, 5, 10 ống
nghiệm.
- Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm tra trong
từng ống nghiệm để xác định ống dương tính. Tra bảng Mac Crandy để cókết quả.
Bảng Mac Crandy cho loạt 3 ống nghiệm mỗi nồng độ
Lượng mẫu cấy/ống Lượng mẫu cấy/ống
MPN/g MPN/g
0,1 0,01 0,001 0,1 0,01 0,001
0 0 0 <3.0 2 2 0 21
0 0 1 3 2 2 1 28
0 1 0 3 2 2 2 35
0 1 1 6.1 2 3 0 29
0 2 0 6.2 2 3 1 36
0 3 0 9.4 3 0 0 23
1 0 0 3.6 3 0 1 38
1 0 1 7.2 3 0 2 64
1 0 2 11 3 1 0 43
1 1 0 7.4 3 1 1 75
1 1 1 11 3 1 2 120
1 2 0 11 3 1 3 160
1 2 1 15 3 2 0 93
1 3 0 16 3 2 1 150
2 0 0 9.2 3 2 2 210
2 0 1 14 3 2 3 290
2 0 2 20 3 3 0 240
2 1 0 15 3 3 1 460
2 1 1 20 3 3 2 1100
2 1 2 27 3 3 3 >1100

55
Phụ lục 2:
Biểu mẫu kiểm tra vệ sinh thực phẩm
Công Ty Trách Nhiệm Hữu Hạn ..........
ĐC: ...........................................................
ĐT: ...................... - Fax: .........................
**********************************

KẾT QUẢ PHÂN TÍCH VI SINH SẢN PHẨM

MICROBIOLOGICAL ANALYSIS REPORT OF PRODUCT
Số/ No: .... / VS/ 09
Ngày lấy mẫu/ Date of sampling: 07/04/2009
Nơi lấy mẫu/ Place of sampling: Kho thành phẩm
Ngày phân tích/ Date of analysis: 07/04/2009
Ngày sản xuất/ Productiondate: 05/04/2009

KẾT QUẢ PHÂN TÍCH / RESULT

Tiêu chuẩn/ Mãsố/ CHỈ TIÊU / CRITERIA
Standard Code of

V. paraheamolyticus
samples

V. cholerae
Salmonella
Định tí

S. aureus
Coliform

Shigella
E. coli
TPC

nh

Tên mẫu /
Name of samples
1x106 2x102 Neg 1x102 Neg Neg Neg Neg
Nhám slice 040701 1.4x104 1.2x102 (-) <10 (-) (-) (-) (-)

Đơn vị/ Unit CFU/g CFU/g /1g CFU/g /25g /25g /25g /25g
Phương pháp kiểm TCVN TCVN TCVN TCVN TCVN TCVN FDA FDA
Testing method 5287 - 5287 - 5287 - 5287 - 5287 - 5287 - 8th-95 8th-95
94 94 94 94 94 94
Nhận xét/ Remark Đ Đ Đ Đ Đ Đ Đ Đ
Ghi chú/ Notes: Đ: Đạt; KĐ: Không đạt; (-): Không phát hiện; (+): phát hiện.
Nhận xét/ Remarks: Đạt tiêu chuẩn vi sinh sản phẩm theo quy định của .................

...................., ngày 12 tháng 04 năm 2009

Phêduyệt Quản đốc Phòng HACCP Phòng kiểm nghiệm
56
 Biểu mẫu kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật nước

Công Ty Trách Nhiệm Hữu Hạn .......

ĐC: ............................ ...........................
ĐT: .................... - Fax: ........ ...............
********************************

KẾT QUẢ PHÂN TÍCH VI SINH NƯỚC

MICROBIOLOGICAL ANALYSIS REPORT OF WATER
Số/ No: 021/VS/ 09

Ngày lấy mẫu/ Date of sampling: 04/04/2009

Nơi lấy mẫu/ Place of sampling: Nước vòi, đá vảy.
Ngày phân tích/ Date of analysis: 04/04/2009
Tình trạng mẫu/ State of sample: Nước trong, được bảo quản lạnh

KẾT QUẢ PHÂN TÍCH/ RESULT

Tên mẫu/ Mãsố/ CHỈ TIÊU / CRITERIA
Name of samples Code of TPC Coliform E. coli Enterococci
samples định lượng
Nước đầu nguồn (ĐN) 040401 <10 <1 <1 (-)
Nước sau xử lý(SL) 040402 <10 <1 <1 (-)
Đá vảy 2 040403 20 <1 <1 (-)
Nước vòi IIA2 040404 <10 <1 <1 (-)

Đơn vị/ Unit CFU/ml MPN/100ml MPN/100ml Phát hiện/100ml

Phương pháp kiểm/ TCVN TCVN TCVN 3351
Testing method 5287 - 94 6187 – 2 : 96 6187 – 2 : 96 QĐ - BYT
Nhận xét/ Remark Đ Đ Đ Đ
Ghi chú/ Notes: Đ: Đạt; KĐ: Không đạt; (-): Không phát hiện; (+): phát hiện.
Nhận xét/ Remarks: Mẫu nước đạt tiêu chuẩn vi sinh theo quy định của ....................

................, ngày 09 tháng 04 năm 2009

Phêduyệt Quản đốc Phòng HACCP Phòng kiểm nghiệm

57
 TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Harold J. Benson, 2001, Microbiological Applications: Laboratory Manual in General

Microbiology, McGraw Hill.
2. FDA, 2009, Bacteriologycal Analytical Manual (BAM).
3. Trần Linh Thước, 2002, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ
phẩm, Nhàxuất bản Giáo dục.
4. Trần Thanh Thủy, 1999, Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nhàxuất bản Giáo dục.

58