Zróżnicowanie profilów plazmidowych oraz wydajności symbiotycznej szczepów

Rhizobium leguminosarum izolowanych z użytkowanych rolniczo gleb Lubelszczyzny

Jerzy Wielbo, Monika Marek-Kozaczuk, Anna Skorupska

Zakład Mikrobiologii Ogólnej, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, ul. Akademicka 19,
20-033 Lublin

Wstęp
Rizobia tworzące układy symbiotyczne z roślinami motylkowatymi stanowią bardzo
zróżnicowaną grupę taksonomiczną [Young i Haukka 1996]. Charakterystyczną cechą
genomów R. leguminosarum jest występowanie znacznej części materiału genetycznego w
formie plazmidów [Mercado-Blanco i Toro 1996, Stępkowski i Legocki 2001], wśród których
znajduje się plazmid symbiotyczny pSym, zawierający komplet genów umożliwiających
bakteriom nawiązanie symbiozy z roślinami motylkowatymi [Spaink 2000]. Wzorce
plazmidowe są charakterystyczne dla szczepów, więc mogą być wykorzystywane do ich
identyfikacji i oceny bioróżnorodności kolekcji [Hynes i O`Connel 1990].
Celem pracy było zbadanie profilów plazmidowych oraz oszacowanie aktywności
symbiotycznej izolatów Rhizobium leguminosarum biovar trifolii pochodzących z brodawek
korzeniowych koniczyny czerwonej, oraz izolatów R. leg. bv. viciae pochodzących z
brodawek grochu, peluszki i wyki ozimej.

Materiał i metody
Rośliny przeznaczone do izolacji rizobiów uprawiano na trzech różniących się typach
gleb: bielicowych (okolice Parczewa) – koniczyna i wyka, lessowych (Felin k. Lublina) –
koniczyna, groch i peluszka, oraz rędzinach (Bezek k. Chełma) – koniczyna, groch i peluszka.
Łącznie zbadano 33 izolaty R. leg. bv. trifolii pochodzące z brodawek korzeniowych
koniczyny oraz 40 izolatów R. leg. bv. viciae pochodzących z brodawek korzeniowych wyki,
grochu i peluszki. Plazmidy rizobiów izolowano i rozdzielano zmodyfikowaną metodą
Eckhardta [Eckhardt 1978]. Wydajność symbiotyczną izolatów mierzono w doświadczeniach
wazonowych z użyciem jałowionego piasku nawożonego pożywką Fahreusa. Miernikiem
aktywności szczepu były: zielona masa zakażonych roślin oraz liczba brodawek przypadająca
na roślinę.

Wyniki
Gleby, z których izolowano rizobia różniły się znacząco pod względem zawartości
azotu całkowitego, która wynosiła: 0,05% dla gleby bielicowej, 0,063% dla lessowej oraz
0,309% dla rędziny. Przeprowadzone badania wykazały istnienie bardzo dużej różnorodności
profilów plazmidowych w szczepach izolowanych z danego środowiska glebowego (Rys. 1,
Rys. 2, Tabela 1). Zmienność profilów plazmidowych w obrębie poszczególnych grup
izolatów wyrażona jako stosunek liczby różnych profilów w grupie do liczby izolatów w
grupie wynosiła odpowiednio dla R. leg. bv. trifolii 0,71 : 0,50 : 0,77 (gleba bielicowa :
lessowa : rędzina), natomiast dla R. leg. bv. viciae 0,73 : 0,67 : 0,46.
Ponadto określono wydajność symbiotyczną izolatów (Tabela 2a-d). Zaobserwowano
duży zakres zmienności zdolności do brodawkowania roślinnych gospodarzy i nieco mniejszy
zakres zmienności masy zielonej zakażonych roślin (Tabela 3). Największą zmienność
wydajności brodawkowania zaobserwowano wśród izolatów symbiontów wyki z gleb
bielicowych (min. 23, max. 60 brodawek/roślinę). Z kolei największą zmienność masy
zielonej zakażonych roślin zaobserwowano dla symbiontów koniczyny z gleby lessowej (min.
183 mg, max. 352 mg), symbiontów wyki z gleby bielicowej (min. 0,88 g, max. 2,02 g) oraz
symbiontów peluszki z gleby lessowej (min. 2,02 g, max. 3,65 g).
Wnioski
1. Zarówno izolaty R. leg. bv. trifolii jak i R. leg. bv. viciae pochodzące z gleb bielicowych
były najbardziej zróżnicowane pod względem liczby i wielkości plazmidów.
2. Izolaty R. leg. bv. viciae pochodzące z gleb bielicowych wykazywały najwyższą
zmienność parametrów symbiotycznych.
3. Izolaty z gleb lessowych charakteryzowały się dużym zróżnicowaniem wydajności
symbiotycznej i relatywnie niskim zróżnicowaniem profilów plazmidowych.

Literatura
Eckhardt T.: 1978. A rapid method for the identification of plasmid deoxyribonucleic acid in
bacteria. Plasmid 1, 584-588.
Hynes M.F., O`Connel M.P.: 1990. Host plant effect on competition among strains of
Rhizobium leguminosarum. Can. J. Microbiol., 36, 864-869.
Mercado-Blanco J., Toro N.: 1996. Plasmids in rhizobia: the role of nonsymbiotic plasmids.
Molec. Plant-Microbe Interact., 9, 535-545.
Spaink H.P.: 2000. Root nodulation and infection factors produced by rhizobial bacteria.
Annu. Rev. Microbiol., 54, 257-88.
Stępkowski T., Legocki A.B.: 2001. Reduction of bacterial genome size and expansion
resulting from obligate intracellular lifestyle and adaptation to soil habitat. Acta Biochim.
Polon., 48, 367-381.
Young P., Haukka K.E.: 1996. Diversity and phylogeny of rhizobia. New Phytol. 133, 87-94.
Tabela 1. Zróżnicowanie profilów plazmidowych izolatów rizobiowych pochodzących z gleb bielicowych, lessowych i
rędzin (odpowiednio: liczba typów profilów plazmidowych / liczbę badanych izolatów):

Gleba
bielicowa lessowa rędzina
R. leg. bv. trifolii 10 / 14 5 / 10 7/9
R. leg. bv. viciae 11 / 15 8 / 12 6 / 13
Tab. 2a. Własności symbiotyczne izolatów R. leg. bv. trifolii pochodzących brodawek korzeniowych koniczyny
uprawianej na glebach bielicowych, lessowych i rędzinach

Symbol Zielona masa Ilość Symbol Zielona masa Ilość Symbol Zielona masa Ilość
izolatu całej rośliny brodawek / izolatu całej rośliny brodawek / izolatu całej rośliny brodawek /
(g) roślinę (g) roślinę (g) roślinę
izolaty z gleby bielicowej izolaty z gleby lessowej izolaty z gleby rędzinowej
KO02 0,26 16,8 KO13 0,28 13,8 KO11 0,29 15,5
KO03 0,28 20,7 KO18 0,35 11,8 KO12 0,30 15,5
KO04 0,30 17,0 KO19 0,30 13,6 KO14 0,26 11,8
KO05 0,25 13,7 KO20 0,32 12,8 KO15 0,24 13,5
KO06 0,27 11,7 KO21 0,32 14,4 KO17 0,31 20,6
KO07 0,24 9,7 KO22 0,26 11,8 KO26 0,31 18,8
KO08 0,24 11,2 KO27 0,31 18,2 KO32 0,27 12,3
KO09 0,29 13,6 KO28 0,29 14,7 KO33 0,26 10,9
KO10 0,28 18,2 KO29 0,18 9,5
KO23 0,36 14,7 KO30 0,21 10,2
KO24 0,39 16,8 KO31 0,26 12,2
KO25 0,35 14,6
KO34 0,26 11,0
KO35 0,22 11,3
Tab. 2b. Własności symbiotyczne izolatów R. leg. bv. viciae pochodzących z brodawek korzeniowych wyki
uprawianej na glebach bielicowych

Symbol Zielona masa Ilość

izolatu całej rośliny brodawek /
(g) roślinę
izolaty z gleby bielicowej
WY01 1,24 20,9
WY02 1,38 7,5
WY03 1,53 31,9
WY04 1,86 27,6
WY05 2,17 27,2
WY06 1,88 36,2
WY07 1,90 33,0
WY08 2,13 13,9
WY09 1,82 31,0
WY10 1,88 25,3
WY11 1,83 34,5
WY12 1,51 22,8
WY13 1,50 8,9
WY18 1,15 9,6
WY19 0,88 6,9
Tab. 2c. Własności symbiotyczne izolatów R. leg. bv. viciae pochodzących z brodawek korzeniowych grochu
uprawianego na glebach lessowych i rędzinowych

Symbol Zielona masa Ilość Symbol Zielona masa Ilość

izolatu całej rośliny brodawek / izolatu całej rośliny brodawek /
(g) roślinę (g) roślinę
izolaty z gleby lessowej izolaty z gleby rędzinowej
GR04 3,98 22,0 GR01 3,34 34,8
GR08 4,30 38,8 GR02 3,07 30,3
GR09 4,31 31,3 GR05 3,38 20,6
GR10 3,70 35,6 GR06 3,95 19,0
GR13 3,32 34,7 GR07 3,84 25,6
GR14 3,54 34,3 GR11 3,65 35,3
GR12 3,42 33,7
Tab. 2d. Własności symbiotyczne izolatów R. leg. bv. viciae pochodzących z brodawek peluszki uprawianej na
glebach lessowych i rędzinowych

Symbol Zielona masa Ilość Symbol Zielona masa Ilość

izolatu całej rośliny brodawek / izolatu całej rośliny brodawek /
(g) roślinę (g) roślinę
izolaty z gleby lessowej izolaty z gleby rędzinowej
PE01 2,02 29,8 PE03 2,90 40,1
PE02 2,80 30,9 PE04 2,75 39,6
PE10 2,86 23,0 PE05 3,00 30,0
PE11 3,53 27,0 PE06 3,53 24,2
PE12 3,65 23,0 PE08 3,64 32,9
PE13 3,41 21,0 PE09 3,60 25,3
Tabela 3. Zakres zmienności cech określających wydajność symbiotyczną izolatów R. leg. bv. trifolii oraz R. leg. bv. viciae
izolowanych z gleb bielicowych, lessów i rędzin

Zielona masa (g) Ilość brodawek / roślinę

Gleba Roślina min. max. min. max.
R. leg. bv. trifolii bielicowa koniczyna 0,238 0,334 9,7 18,2
R. leg. bv. trifolii lessowa koniczyna 0,183 0,352 9,5 14,7
R. leg. bv. trifolii rędzina koniczyna 0,236 0,308 10,9 18,8
R. leg. bv. viciae bielicowa wyka 0,88 2,02 23,0 60,0
R. leg. bv. viciae lessowa groch 3,32 4,31 22,0 38,8
R. leg. bv. viciae lessowa peluszka 2,02 3,65 21,0 30,9
R. leg. bv. viciae rędzina groch 3,07 3,95 19,0 35,3
R. leg. bv. viciae rędzina peluszka 2,75 3,64 24,2 40,1