FACULTY OF BIOTECHNOLOGY, CHEMISTRY

AND ENVIRONMENTAL ENGINEERING

PHẦN 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

KHỐI PHỔ
Giới thiệu về khối phổ

Định nghĩa

• Phương pháp phân tích để đo khối lượng phân tử hoặc nguyên tử của mẫu
Giới thiệu về khối phổ

• Các hợp chất khác nhau có thể được xác định duy nhất bằng khối lượng của
chúng

Butorphanol L-DOPA Ethanol

MW = 327.1 MW = 197.2 MW = 46.1
Lịch sử về khối phổ

• Khái niệm MS lần đầu tiên được đưa vào thực tế bởi Francis Aston, một
nhà vật lý làm việc tại Cambridge, Anh vào năm 1919

• Được thiết kế để đo khối lượng của các phần tử

• Aston được trao giải Nobel năm 1922

• Những năm 1920 - Máy phân tích khối lượng vùng từ tính và ion hóa tác
động điện tử được giới thiệu
Lịch sử về khối phổ

• 1948-52 - Giới thiệu máy phân tích khối lượng Time of Flight (TOF)

• Bộ lọc ion tứ cực được giới thiệu bởi Wolfgang Paul, cũng là người phát
minh ra bẫy ion vào năm 1983 (đoạt giải Nobel năm 1989)

• Máy đo khối phổ song song đã được trình bày

• Khối phổ hiện nay là một trong những CÔNG CỤ PHÂN TÍCH MẠNH NHẤT
TRONG HÓA HỌC
 máy phân tích khối Bộ lọc ion tứ cực khối phổ song song
lượng Time of Flight (Tandem mass
(TOF) (Quadrupole ion trap) spectrometry)
Nguyên tắc của khối phổ

• Tìm cách "sạc" nguyên tử hoặc phân tử (ion hóa)

• Đặt nguyên tử hoặc phân tử tích điện trong từ trường hoặc đặt nó vào điện
trường và đo tốc độ hoặc bán kính cong (như dòng điện) của nó so với tỷ lệ
khối lượng trên điện tích (máy phân tích khối lượng)

• Phát hiện các

ion bằng cách
sử dụng tấm vi
kênh hoặc ống
nhân điện tử
Nguyên tắc của khối phổ
Phổ khối lượng điển hình
Độ phân giải

• Chiều rộng của đỉnh cho biết độ phân giải của thiết bị MS

• Độ phân giải hoặc công suất phân giải

càng tốt thì thiết bị càng tốt và độ chính
xác khối lượng càng cao

• Công suất phân giải được định nghĩa là:

M / ΔM

• M là số khối lượng của trung bình quan

sát được của hai khối lượng liền kề và
ΔM là hiệu số giữa hai khối lượng
Độ phân giải

• Hai đỉnh kề nhau có cường độ gần như

bằng nhau

Chiều cao/ valley < 10%

Tại sao HRMS

MW = 28 MW = 28

Exact mass: 28,03130 Exact mass: 27,994915

Độ phân giải

Nếu chúng ta có độ phân giải 5000 cho một máy khối phổ, chúng ta có thể tách
m/z 49.995 khỏi m/z 50.005, hoặc tách m/z 99.990 khỏi m/z 100.010, hoặc tách
m/z 999.990 khỏi m/z 1000.100 hoặc m/z 9999 khỏi m/z 10010 ( tất cả xuống
một thung lũng 10% giữa hai đỉnh).
Độ phân giải
Các thành phần cơ bản của thiết bị phân tích

• nguồn ion;
• phương pháp phân tích các chùm ion theo khối lượng của chúng tỷ lệ với
điện tích;
• các đầu dò có khả năng đo hoặc ghi lại dòng điện của chùm tia.
Thành phần cơ bản của thiết bị phân tích
Các phương pháp ion hóa khác nhau

• Tác động điện tử (EI - Phương pháp cứng)

 phân tử nhỏ, 1-1000 Dalton

 Ion hóa hóa học (CI) và Bắn phá nguyên tử nhanh, các loài có trọng lượng phân tử
cao (FAB - Softer)

 peptide, đường, lên đến 10000 Dalton

• Ion hóa tia điện (ESI - Mềm)

 peptit, protein, lên đến 200.000 Dalton

• Hấp thụ tia laser hỗ trợ ma trận (MALDI-Soft)

 peptit, protein, DNA, lên đến 500 kD

Phân mảnh ion

• Sản phẩm phân ly mang điện của sự phân mảnh ion. Một ion như vậy
có thể phân mảnh thêm để tạo ra các phân tử hoặc nguyên tử mang
điện khác có khối lượng công thức thấp hơn liên tiếp.

Phân mảnh  Phá vỡ liên kết cộng hóa trị

Điện tử tác động nguồn ion hóa (EI)

• EI là một phương pháp ion hóa “cứng”

• Một điện tử bị loại bỏ để tạo thành ion phân tử tích điện đơn, M+·

• M+· mang năng lượng bên trong dư thừa và có xu hướng phân mảnh

• Mang lại phổ tái tạo nhưng giới hạn MW < 1 kDa

• Hiệu suất ion hóa cao; năng lượng điện tử ~ 20-70 eV; áp suất < 10-5 Torr
Điện tử tác động nguồn ion hóa (EI)
Ion hóa hóa học (CI)

Định nghĩa

• Sự ion hóa electron dẫn đến sự phân mảnh của ion phân tử, điều này đôi khi ngăn cản
sự phát hiện của nó

Ion hóa hóa học

• kỹ thuật này cho thấy lợi thế của việc

tạo ra một phổ ít phân mảnh hơn trong
đó các loài phân tử được dễ dàng nhận
ra.

• sự ion hóa hóa học bổ sung cho sự ion

hóa electron.
Ion hóa hóa học (CI)

Chế độ ion dương

• Chuyển điện tích

• Chuyển proton
• Hình thành phối phẩm

Chế độ ion âm

• Chuyển proton
• Bắt giữ điện tử
Ion hóa hóa học (CI)
Khử hấp thụ ion hóa

Bắn phá nguyên tử nhanh (FAB)

• Vật liệu cần phân tích được trộn với một môi trường bảo vệ hóa học không bay hơi
được gọi là chất nền

• Nó bị bắn phá trong chân không với chùm nguyên tử năng lượng cao (4 - 10 keV).

• Nguyên tử thường là một khí trơ (Ar hoặc Xe)

Khử hấp thụ ion hóa
Khử hấp thụ ion hóa

Giải hấp thụ / ion hóa laser hỗ trợ ma trận (MALDI)

• Kỹ thuật ion hóa mềm giữ cho phân tử quan tâm hoàn toàn nguyên vẹn

• Làm cho nó có thể phân tích các phân tử lớn thông qua các máy phân tích khối
lượng rẻ tiền như tứ cực, bẫy ion và TOF
Ion hóa dạng tia điện

• Mẫu hòa tan trong dung dịch đệm

phân cực, dễ bay hơi và được bơm
qua ống mao dẫn bằng thép không gỉ
(70 – 150 µm) với tốc độ 10-100 µL /
phút  hệ thống “nanospray” với lưu
lượng <1 µL / phút

• Điện áp mạnh (3-4 kV) được đặt ở

đầu cùng với dòng khí phun sương
làm cho các giọt tích điện và phun
ra (sol khí)

• Aerosol được dẫn qua các vùng có

chân không cao hơn cho đến khi các
giọt bay hơi đến gần kích thước
• yêu cầu < 1 pmol vật liệu
nguyên tử (vẫn mang điện tích)
• Bị ảnh hưởng mạnh bởi muối và chất tẩy rửa
Ion hóa dạng tia điện
Các phương pháp ion hóa mềm

• Chịu được muối và thành phần không bay hơi • Bị ảnh hưởng mạnh bởi muối và chất tẩy rửa

• yêu cầu 10 µL của 1 pmol/ µL mẫu • yêu cầu < 1 pmol vật liệu, 10-100 µL / phút
ES-MS của Protein
Các bộ phận thiết bị phân tích khối phổ
Các máy phân tích khối lượng khác nhau

• Máy phân tích khu vực từ tính + focus kép

 Độ phân giải cao, khối lượng chính xác, MA gốc

• Máy phân tích tứ cực

 Độ phân giải thấp (1 amu), nhanh, rẻ

• Máy phân tích thời gian bay (TOF)

 Không có giới hạn m/z trên, thông lượng cao

• Khối phổ kế Tandem (MS-MS)

 Độ phân giải tốt

• Máy phân tích khối lượng bẫy ion

 Độ phân giải tốt, đơn giản
• Cộng hưởng Ion Cyclotron (FT-ICR)

 Độ phân giải cao nhất, khối lượng chính xác, đắt tiền
Các máy phân tích khối lượng khác nhau
Máy phân tích khối lượng từ tính

Quỹ đạo ion có

trong đăng ký

Quỹ đạo ion không

có trong đăng ký
(quá nhẹ)

Quỹ đạo ion không có

trong đăng ký (quá
nặng)
Focus kép
Phân tích tứ cực

Nguyên tử và phân Ion với tỉ lệ m/z đặc

tử được ion hóa trưng sẽ được lọc Ion được lọc khối
trong nguồn ion tín bởi sự kết hợp hiệu lượng được thu bởi
hiệu bởi tác động điện thế DC và RF detector kiểu
điện tử (EI) trong tứ cực Faraday cup
Máy phân tích thời gian bay (TOF)

TOF drift
region
Giải hấp phụ
của chất nền
Máy phân tích thời gian bay (TOF)

Nguyên lý hoạt động

Bẫy Ion

• Hai điện cực nắp cuối được nối

đất trong khi điện cực vòng hình
bánh rán được kết nối với nguồn
điện áp RF thay đổi
Cộng hưởng Ion Cyclotron (FT-ICR)

Phương pháp FT
cho phép xác định
đồng thời nhiều khối
lượng ion (hiệu quả)

Có độ phân giải khối

lượng cao hơn bất kỳ
máy phân tích MS nào
khác hiện có
Các bộ phận thiết bị phân tích khối phổ
Detector khối lượng